База ГОСТовallgosts.ru » 65. СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО » 65.120. Корма для животных


ГОСТ Р ИСО 30024-2012 Корма для животных. Определение активности фитазы

Обозначение: ГОСТ Р ИСО 30024-2012
Наименование: Корма для животных. Определение активности фитазы
Статус: Действует

Дата введения: 07/01/2013
Дата отмены: -
Заменен на: -
Код ОКС: 65.120
Скачать PDF: ГОСТ Р ИСО 30024-2012 Корма для животных. Определение активности фитазы.pdf
Скачать Word:ГОСТ Р ИСО 30024-2012 Корма для животных. Определение активности фитазы.doc


Текст ГОСТ Р ИСО 30024-2012 Корма для животных. Определение активности фитазы



ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ


ГОСТ Р исо 30024-2012


НАЦИОНАЛЬНЫЙ

СТАНДАРТ

РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

КОРМА ДЛЯ ЖИВОТНЫХ

Определение активности фитазы

ISO 30024:2009

Animal feeding stuffs — Determination of phytase activity

(IDT)

Издание официальное

Москва

Стенда ртмнформ 2014


Предисловие

1    ПОДГОТОВЛЕН ОАО «Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации» (ОАО «8НИИС») на основе аутентичного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 4

2    ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 004 «Комбикорма, белково-еитамин* но-минеральные концентраты, премиксы»

3    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии отдавгуста 2012 г. №222-ст

4    Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 30024:2009 «Корма для животных. Определение активности фитаэы» (ISO 30024:2009 «Animal feeding stuffs — Determination of phytase activity»)

5    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Правила применения настоящего стандарта установлены в ГОСТ Р 1.0—2012 (раздел в). Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе «Национальные стандарты». а официальный текст изменений и поправок—в ежемесячном информационном указателе « Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано е ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (gost.ru)

© Стандартинформ.2014

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

Содержание

in

Введение

Настоящий национальный стандартбыл разработан сцелью количественного определения актив* ности фитаэы а пробах кормов, с тем чтобы предоставить возможность контроля содержания фигаэы в кормовых продуктах для животных.

Вместе с тем данный метод не допускается применять для оценки эффективности фитазы в живых организмах.

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КОРМА ДЛЯ ЖИВОТНЫХ Определение активности фитаэы

Animal feeding stuffs. Determination of phytase activity

Дата введения — 2013—07—01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения активности фитаэы в кормах.

Метод не позволяет отдельно идентифицировать фитазу. добавленную в качестве кормовой добавки.

Метод не применяют для оценки или сравнения эффективности фитаэы в живых организмах.

Примечаии е — Метод разработан на основе имеющихся в настоящее время видов фитаэы [El600(KOt) 3.1.3.8.3-фитаза).Е1614(КФ 3.1.3.26.4-фитаэа) и Е1640(КФ 3.1.3.26.4-фитаэа>|.

2    Термины и определения

8 настоящем стандарте применен следующий термин соответствующим определением:

2.1 единица активности фитаэы (ед.) (phytase unit (U)): Количество фермента, которое высвобождает 1 мкмоль неорганического фосфата из фитата за 1 мин в условиях реакций, установленных в настоящем стандарте.

3    Сущность метода

Фитаза высвобождает фосфат из субстрата мио-инозитолгвксаксифосфата (фитата). Освободившийся неорганический фосфат определяют путем образования желтого комплекса с кислотным реактивом молибдата/ванадата. Оптическую плотность желтого комплекса измеряют при длине волны 415 нм. выделившийся неорганический фосфат количественно определяют при помощи градуировочной кривой. построенной на основе эталонных растворов фосфата.

4    Реактивы

8 процессе анализа, если не указано иное, используют реактивы только признанной аналитической степени чистоты и дистиллированную или деминерализованную воду, либо воду эквивалентной степени чистоты, не содержащую фосфатов.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Настоящий метод предусматривает использование опасных веществ. Следует соблюдать действующие нормы для потенциально опасных химических веществ с целью минимизации рисков для организационной, технической и личной безопасности.

Классификация ферментов

Издание официальное

4.1    Аммиака раствор, с массовой допей 25 %. NH3.

4.2    Аммония гептамолибдата тетрагидрат. (NH4)$Mo702420.

4.3    Аммония монованадат.МН4У03.

4.4    Кислота соляная, с массовой долей 25 %. HCI.

4.5    Кислота азотная, с массовой долей 65 %, HNOa.

4.6    Калия дигидрофосфат. КН2Р04.

4.7    Фитат. фитиновой кислоты додеканатриевая соль. CeHfiNa,2024Pe • хН20. из риса. Sigma® Р0109Ч

4.8    Натрия ацетата тригидрат. CH3COONa • ЗН20.

4.9    Полисорбат20Ч

4.10    Разбавленная азотная кислота

Разбавляют один объем азотной кислоты с массовой долей 65 % (4.5) двумя объемами воды. Хранят при комнатной температуре. Максимальный срок хранения не ограничен.

4.11    Реактив аммония гептамолибдат

Растворяют 100,0 г аммония гептамолибдата тетрагидрата (4.2) в 800 см3 воды. Добавляют 10 см3 раствора аммиакас массовой долей 25%{4.1) и доводятобъем водой до 1000см3. Хранят при комнатной температуре в темноте. Максимальный срок хранения — 2 мес.

4.12    Реактив аммония ванадат

Полностью растворяют 2.35 г аммония монованадата (4.3) в 400см3 воды при температуре от 50 *С до 60 вС. Добавляют 20 см3 разбавленной азотной кислоты (4.10) и доводят объем водой до 1000 см3. Хранят при комнатной температуре в темноте. Максимальный срок хранения — 2 мес.

4.13    Стоп-реагент молибдат/еанадат

Смешивают один объем реактива аммония ванадата (4.12) иодин объем реактива аммония гепта-молибдата (4.11) и добавляют два объема разбавленной азотной кислоты (4.10). Перемешивают и хранят при комнаткой температуре. Максимальный срок хранения — один день.

4.14    Полисорбат 20. с массовой долей 10 %

10.0    г полисорбата 20 (4.9) растворяют в воде и доводят объем водой до 100 см3. Хранят при комнатной температуре. Максимальный срок хранения — 6 мес.

4.15    Ацетатный буфер, pH 5,5, концентрацией 0,25 моль/дмэ

34.0    г натрия ацетата тригидрата (4.8) растворяют приблизительно в 900 см3 воды. Доводят pH до

5.5010.02    при помощи раствора соляной кислоты с массовой долей 25 % (4.4) и доводят раствор водой до 1000 см3. Хранят при комнатной температуре. Максимальный срок хранения—две недели.

4.16    Ацетатный буфер с полисорбатом 20 с массовой долей 0,01 %, pH 5,5, концентрацией 0,25 моль/дм3

34.0    г натрия ацетата тригидрата (4.8) растворяют приблизительно в 900 см3 воды. Доводят pH до

5.5010.02    при помощи раствора соляной кислоты с массовой долей 25 % (4.4). Добавляют 1 см3 раствора полисорбата 20 с массовой долей 10 % (4.14) и доводят объем водой до 1000 см3. Хранят при комнатной температуре. Максимальный срок хранения — две недели.

4.17    Ацетатный буфер с полисорбатом 20 с массовой долей 0,01 %, pH 5,5, концентрацией 0,50 моль/дм3

68.0    г натрия ацетата тригидрата (4.8) растворяют приблизительно в 900 см3 воды. Доводят pH до 5.50 ± 0.02 при помощи раствора соляной кислоты с массовой долей 25 % (4.4). Добавляют 1 см3 раствора полисорбата 20 с массовой долей 10 % (4.14) и доводят объем водой до 1000 см3. Хранят при комнатной температуре. Максимальный срок хранения—две недели.

4.18    Раствор субстрата фитата, концентрацией 7,5 ммоль/дмэ (конечная концентрация в реакции — 5 ммоль/дм3)

2.00    г додеканатрия фитата (4.7), содержание неорганического фосфора в котором £0,1 % по массе (см. 9.3). растворяют приблизительно в 200 см3 ацетатного буфера (4.15). Доводят pH до 5.50 ± 0.02 при помощи раствора соляной кислоты с массовой долей 25 % (4.4) и доводят раствор ацетатным буфером (4.15) до 250 см3. Максимальный срок хранения—две недели при температуре 4 *С.

11 Это пример подходящего продукта, имеющегося в продаже. Данная информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не накладывает обязательстве применять данный продукт.

4.19    Исходный эталонный раствор фосфата, концентрацией 50 ммоль/дм3

высушивают приблизительно 10 г калия дигидрофосфата (4.6) при температуре 105 *С в течение

2 ч и помещают в эксикатор. Взвешивают приблизительно 662 мг высушенного калия дигидрофосфата, количественно переносят его в мерную колбу вместимостью 100 см1 и доводят объем до 100 см3 ацетатным буфером концентрацией 0.25 моль/дм3 с лолисорбатом 20 с массовой долей 0,01 % (4.16). Рассчитывают точную концентрацию исходною эталонного раствора фосфата. Хранят при комнатной температуре. Максимальный срок хранения—две недели.

4.20    Исходный эталонный раствор фитаэы

взвешивают от 100.0 до 300.0 мг образца фитазы. количественно переносят ее в мерную колбу вместимостью 100 см3 и растворяют в 100 см3 ацетатного буфера концентрацией 0.25 моль/дм3 с лолисорбатом 20 с массовой долей 0.01 %(4.16). Перемешивают в течение 15—45 мин. Хранят при комнатной температуре. Максимальный срок хранения — один день.

5    Оборудование

Ислольэуютобычное лабораторное оборудование, вчастности нижеприведенное.

5.1    Баня водяная, с регулируемой температурой (со вставными секциями для пробирок вместимостью 2 см3).

5.2    pH-метр. сеоэможиостьюсчитывания показаний по меньшей мере до двух десятичных знаков.

5.3    Мешалки магнитные (мощностью* 20 Вт).

5.4    Вертушки магнитные овальные (40 мм х 20 мм).

5.5    Весы аналитические, с возможностью считывания показаний как минимум до 0.1 мг.

5.6    Весы, с возможностью считывания показаний как минимум до 0.01 г.

5.7    Мешалка вихревая.

5.8    Центрифуга для микроцентрифужных пробирок (5.12). способная обеспечить ускорение от НОООддо 20000д.

5.9    Дозатор электронный.

5.10    Пипетки (электронные или ручные), способные отбирать объем в диапазоне от 0,01 до 2.00 см3.

5.11    Спектрофотометр двухлучевой или планшет-ридер.

5.12    Пробирки микроцентрифужные вместимостью 2 см3.

6    Отбор проб

В лабораторию необходимо доставить представительную пробу. Она не должна быть повреждена или изменена в процессе транспортирования или хранения.

Отбор проб не является частью метода, установленного в настоящем стандарте. Рекомендуемая методика отбора проб приведена в [1].

7    Приготовление пробы

Для каждой пробы проводят два взвешивания.

взвешивают две порции гранул или порошка, по 50 г каждой, в конических колбах вместимостью 500 см3. Добавляют 500см3 воды и 0.5 см3 раствора полисорбата 20 с массовой долей 10% (4.14) к корму и интенсивно перемешивают в течение 45 мин на магнитной мешалке (5.3) с овальными вертушками (5.4). Переносят2 см3 экстракта корма в микроцентрифужную пробирку (5.12) и центрифугируют (5.8) в течение 3 мин при ускорении 1 1000д—20000д.

Неоднородность пробы может привести к высоким коэффициентам вариации (CV). Для проб корма. демонстрирующих CV > 15 %. эта неоднородность может возникать из-за неравномерного распределения частиц по размерам в продуктах при приготовлении кормов. Если пробы корма демонстрируют высокие коэффициенты вариации, пробы измельчают при помощи ультрацектробежной мельницы1*, имеющей ситосноминальным размером отверстий 1 мм. Измельчают 150гкормаиэкстрагируют. какого описано в данном пункте.

Это пример подходящего оборудования, имеющегося в продаже. Данная информация приводится дпя удобства пользователей настоящего стандарта и не содержит обязательств, накладываемых ИСО. применять данное оборудование.

8 Методика работы

8.1    Растворы контрольной пробы

Неорганический фосфате пробе содействует формированию окраски. Таким образом, для каждой пробы предусмотрены растворы контрольной пробы. Для расчета активности фитаэы контрольные зка-чения вычитают из испытуемых значений.

8.2    Эталонные растворы

8.2.1 Эталонные растворы фосфата

Исходный эталонный раствор фосфата (4.1Э) разбавляют ацетатным буфером с концентрацией 0.25 моль/дм3. содержащим полисорбат20смассовой долей 0.01 % (4.16). всоответствиистаблицей1.

Таблице 1 — Порядок проведения разбавлений с целью получения эталонных колориметрических растворов для построения кривой фосфата

Эталонный раствор

Количество обьеыов исходного эталонного раствора фосфата (4.19)

Количество объемов ацетатного буфера концентрацией 0,25 моль/дм’. содержащею полисорбат 20 с массовой долей 0.01 % (4.16)

Коэффициент

раэбааления

Концентрация.

мхмоль/см**

А

1

1

2

25

В

1

3

4

12.5

С

1

7

6

6.2S

О

1

15

16

3,125

* Рассчитывают точные концентрации (4.Id).

8.2.2 Контроль уровня фитазы

В каждом случае, когда пробы выдерживают, предусмотрен контроль уровня фитазы. Исходный эталонный раствор фитазы (4.20) с известной активностью разбавляют до конечной активности 0.15—0.25 ед./см3 и точную активность определяют согласно 8.4.

8.3 Градуировочная кривая

Проводят три определения для каждого разбавления фосфата и двух контрольных проб, результаты усредняют. Методика приведена в таблице 2.

В случае эталонных растворов фосфата отбирают пипеткой 0,360 см3 ацетатного буфера концентрацией 0,25 моль/дм3, содержащего полисорбат 20 с массовой долей 0,01 % (4.16), в пробирку вместимостью 2 см3 (5.12). Добавляют 0.04 см3 эталонного раствора фосфата (таблица 1).

В случае контрольной пробы фосфата отбирают пипеткой 0.4 см3 ацетатного буфера с концентрацией 0.25 моль/дм3, содержащего полисорбат 20 с массовой долей 0.01 % (4.16). в пробирку вместимостью 2 см3 (5.12).

Вобоих случаяхдобавляютО.всм3 раствора субстрата фитата (4.18)и 0.8см3 стол-реагента (4.13). Перемешивают содержимое пробирок и выдерживают их в течение 10 мин при комнатной температуре. Центрифугируют (5.8) пробирки в течение 3 мин при 11000—20000д и измеряют оптическую плотность прозрачной надосадочной жидкости при длине волны 415 нм. D (415).

Таблице 2 — Методика построения градуировочной кривой

Стадия анализа

Эталонный колориметрический растеор

Контрольная проба

Ацетатный буфер концентрацией 0,25 моль/дм’. содержащий лолисорбат 20 с массовой долей 0.01 % (4.16)

0.360 см3

0.400 СМ3

Эталонный рвствор фосфата (6.2.1)

0,04 см3

0.00 см3

Окончание твбпииы 2

Стадия анализа

Эталонный колориметрический раствор

Контрольная проба

Раствор субстрата фитата (4.16)

0.8 см3

0.8 СМ3

Стоп-реагент (4.13)

0.8 см3

0.8 см3

Перемешивание

Дв

Да

Комнатная температура

10 мин

Юмин

Центрифугирование

3 мин при 11 ООО—20000д

3 мин при 11000—20000Q

Спектрофотометр (5.11)

415 нм (по сравнению с водой)

415 нм (по сравнению с водой)

8.4 Контроль уровня фитаэы

Проводят три определения для каждого разбавления и двух контрольных проб, результаты усредняют. Методика приведена в таблице 3.

8 случае определяемых растворов для контроля уровня фитаэы. отбирают пипеткой О.Зв см3 ацетатного буфера с концентрацией 0.25 моль/дм3. содержащего полисорбат 20 с массовой долей 0.01 % (4.16). в пробирку вместимостью 2 см3 (5.12). Добавляют 0.04 см3 разбавленного раствора для контроля уровня фитазы(8.2.2). Перемешивают пробу. Выдерживают растворы в течение 5 мин при температуре 37 *С. Добавляют 0.8 см3 раствора субстрата фитата (4.18). предварительно нагретого до 37 *С. Выдерживают ровно 30 мин при температуре 37 вС. Через 30 мин добавляют 0.8 см3 стоп-реаген-та (4.13) и перемешивают. Выдерживают растворы в течение 10 мин при комнатной температуре и затем центрифугируют их в течение 3 мин при 11000—20000д. Измеряют оптическую плотность 0(415) прозрачной надосадочной жидкости.

В случае растворов контрольных проб для контроля уровня фитазы. отбирают пипеткой 0.36 см3 ацетатного буфера (4.15) в пробирку вместимостью 2 см3 (5.12). Добавляют 0.04 см3 разбавленного раствора для контроля уровня фитазы (8.2.2). Порядок добавления растворов отличается от порядка, используемого для определений. Выдерживают растворы контрольных проб в течение 5 мин при температуре 37 *С. Затем, в качестве стадии 1 .добавляют стол-реагент (4.13); в качестве стадии 2 добавляют раствор субстрата фитата (4.18). предварительно нагретый до 37 вС. Далее действуют в соответствии с таблицей 3. колонка 3. строка 9 и т. д.

Таблица 3 — Методика контроля уровня

Стадия анализа

Проба контроля уровня

Контрольная проба

Ацетатный буфер концентрацией 0.25 моль/дм1. содержащий полисорбат 20 с массовой долей 0.01 % (4.16)

0.36 СМ3

0.36 СМ3

Разбавленный раствор для контроля уровня фитазы (8.2.2)

0.04 см3

0,04 см3

Перемешивание

Дв

Дв

Предварительная выдержке при 37 *С

5 мин

5 мин

Раствор субстрата фитата (4.16) при 37 *С

0.6 см3

0.8 см3: ствдия 2

Перемешивание

Нет

Нет

Выдержка при 37 'С

30 мин

Нет

Стоп-реагент (4.13)

0.6 см3

0.8 см3: стадия 1

Перемешивание

Дв

Дв

Комнатная температура

10 мин

10 мин

Центрифугирование

3 мин при 11000—200000

Э мин при 11000—200000

Спектрофотометр (5.11)

415 нм (по сравнению с водой)

415 нм (по сравнению с водой)

S

8.5 Анализируемые пробы кормов

Проводят три определения для каждого экстракта (см. раздел 7) и двух контрольных проб, результаты усредняют. Методика приведена в таблице 4.

При проведении анализа отбирают пипеткой 0.3 см3 ацетатного буфера с концентрацией 0.25 моль/дм3. содержащего лолисорбат 20 с массовой долей 0.01 % (4.16). в пробирку вместимостью 2 см3 (5.12). Добавляют 0.1 см3 экстракта корма (раздел 7) в качестве испытуемой пробы. Содержимое пробирки перемешивают. Предварительно выдерживают в течение 5 мин при температуре 37 °С. Добавляют 0.8 см3 раствора субстрата фитата (4.18). предварительно нагретого до 37 *С. Выдерживают ровно 30 мин при 37 *С. Добавляют 0.8 см3 стол-реагента (4.13) и перемешивают. Выдерживают пробирку с ее содержимым в течение 10 мин при комнатной температуре и центрифугируют в течение 3 мин при 11000—20000д. Измеряют оптическую плотность 0(415) прозрачной надосадочной жидкости.

В случае растворов контрольных проб отбирают пипеткой 0.3 см3 ацетатного буфера с концентрацией 0,25 мсль/дм3. содержащего полисорбат 20 с массовой допей 0.01 % (4.16). в пробирку вместимостью 2 см3 (5.12). Добавляют 0.1 см3 экстракта корма (раздел 7). Порядок добавления растворов отличается от порядка, используемого для испытуемой пробы. Предварительно выдерживают контрольные пробы в течение 5 мин при 37 °С. Затем, в качестве стадии 1. добавляют стол-реагент (4.13); в качестве стадии 2 добавляют раствор субстрата фитата (4.18), предварительно нагретый до 37 *С. Далее действуют в соответствии с таблицей 4. колонка 3. строка 9 и т. д.

Таблица 4 — Методика для испытуемых проб корма

Стадия анализа

Проба корма

Контрольная проба

Ацетатный буфер концентрацией 0.25 моль/дм5. содержащий полисорбат 20 с массовой долей 0.01 % (4.16)

0.3 СМ3

0.3 СМ3

Испытуемая проба*

0.1 см3

0.1 см3

Перемешивание

Да

Да

Предварительная выдержке при 37 *С

5 мин

5 мин

Раствор субстрате фитата (4.18) при 37 *С

0.8 см3

0.8 см3 (стадия 2)

Перемешивание

Нет

Нет

Выдержка при 37 *С

30 мин

Нет

Стоп-реагент (4.13)

0.8 см3

0.8 см3 (стадия 1)

Перемешивание

Да

Да

Комнатная температура

10 мин

10 мин

Центрифугирование

3 мин при 11000—20000д

3 мин при 11000—200009

Спектрофотометр (5.11}

415 нм (по сравнению с водой)

415 нм (по сравнению с водой)

* Дпя испытания испопьзовапи испытуемые пробы с активностью не более 200 единиц активности фитазы на 1 кг корма, экстракт пробы 0.2 см3 и 0.2 см3 ацетатного буфера концентрацией 0.50 моль/дм3, содержащего полисорбат 20 с массовой долей 0.01 % (4.17} (разбавление 1 к 2). Пробы с активностью более 2000 единиц активности фитазы на 1 кг корма необходимо надлежащим образом разбавить ацетатным буфером с концентрацией 0.25 моль/дм5. содержащим полисорбвт 20 с массовой долей 0.01 % (4.16).

9 Обработка результатов

9.1 Градуировочная кривая

Строят градуировочную кривуюсд£)(415)(£)(415)в—0<415)ь1. где D(415)s и 0(415)ь—средние значения оптической плотности эталонных растворов и контрольной пробы соответственно, полученные с помощью эталонных растворов фосфата (8.2.1 и 8.3). на оси ординат и рассчитанными значениями концентрации фосфата—на оси абсцисс (в процессе расчета при разбавлении 1 к 10 в микроцентрифужной пробирке [0.04 см3 разбавленного эталонного раствора (таблица 1) плюс 0.36 см3 буфера] для реакции следует принять во внимание концентрацию фосфата в эталонном растворе). Наиболее подходящую

линию рассчитывают с использованием линейной регрессии. Л0(415) = кс(Р03'). (отрезок, отсекаемый

на оси ординат, задают равным 0).

Пример приведен на рисунке 1.

О (41S)— оптическая плотность при длине волны 41S нм.

О <41S) * 0,4008 с(РО« ); с (Р03~) — концентрация фосфата: г2с(РО^ 10(415)“ 0-8996-

Рисунок 1 — Пример графика зависимости оптической плотности от концентрации фосфата эталонных колориметрических растворов, разбавленных ацетатным буфером с концентрацией 0.25 моль/дм3. содержащим поли-

сорбат 20 с массовой долей 0.01 %(4.16)

9.2 Вычисление активности фитазы

Активность фитазы ар вычисляют по следующему уравнению:

где Д0(415) — фактическая оптическая плотность при длине волны 415 нм. рассчитанная из разности

D(415),-D(415)b.

где 0(415), и 0(415)ь — средние значения оптической плотности анализируемой пробы и контрольной

пробы (8.5) соответственно;

А—тангенс угла наклона градуировочной кривой, в обратных микромолях-милли-литрах, при 0(415);

Vd—объем, скорректированный для разбавления (объем экстракта, умноженный на разбавление экстракта), см3; т — масса пробы, г или кг;

{—время выдержки, мин.

Пример 1 — Контроль уровня фитазы Л 0(415) *0,216. к в 0,3757мнмоль'1 см3.

Va в 30000 см3 (100 ел*3 объема экстракта х 30 (разбавление 1 к 30 исходноао эталонного раствора фитазы (4.20)] х 10(0,04 см3 разбавленного исходного эталонного раствора фита• зы (4.20) * 0,36 см3 буфера * f к 10]). т а 0,1074г. t * 30 мин.

0,216x30000 0,3757 x 0,1074 x 30


(2)


* 5353 мкмоль мин'1 г~1 * 5353 ед. г'1.

Пример 2—Анализируемая проба корма

АО(415) « 0,183.

к * 0,3757 мкмоль"1 см3.

Vd « 2000 см3 (500 см3 объема экстракта х4[0,1 см3 экстракта * 0,3 см3 буфера « 1 к 4]).

т а 0,О5Охг.

t * 30 мин.

* *—0,183 х 2000— я 650 мкмоль мин-' хз'1 « 650 ед. кг'1.    (3)

р 0,3757x0,050x30

9.3    Поправка, учитывающая чистоту фитиновой кислоты и содержание воды

Чистоту фитиновой кислоты и содержание в ней воды варьируют в зависимости от партии и. таким образом, их необходимо включить в расчеты для приготовления субстрата.

Пример — Фитиновой кислоты додеканатриевая соль (массовая доля неорганического фосфора 0,008 %)*К

Поправку рассчитывают по уравнению

с(фитата) М    (4)

wp(1-wH;[0) ’

где М— молярная масса додеканатрия фитата. г/моль;

wp — чистота додеканатрия фитата. выраженная в массовых долях; kvHj0— содержание воды в додеканатрия фитате, выраженное в массовых долях.

3 Если с (фитата) * 7.5 ммоль/дм3; М - 923,8 г/моль; wp - 97 % и tvH?0 = 12.6 %. поправка составит 8.17 г/дм3.

9.4    влияние контрольных значений

Высокое содержание, например монокальция фосфата [Са(Н2Р04)2]. в пробах кормов может при* вести к высоким значениям оптической плотности контрольной пробы (0(415^ > 1.6). Некоторые спектрофотометры могут не иметь линейность при высоких значениях оптической плотности (близких к 2). Значения для фитазы. полученные для проб кормов стакими высокими контрольными значениями, следует интерпретировать с осторожностью, поскольку высокие значения оптической плотности могут привести к недооценке или переоценке содержания фитазы. Снижения значений оптической плотности можно добиться разбавлением экстракта корма в соотношении 1:2 или 1:4 по объему. Вместе с тем значения AD(415) до л жны бы т ь бо л ьше 0.04.

10 Прецизионность

10.1 Предел обнаружения и предел количественного определения

В соответствии с номенклатурой ИЮПАК (ссылка [2]) предел обнаружения определяют как L0 - 3$ и предел количественного определения — как L0 = 10 S. где а и 5— расчетное и абсолютное средние квадратические отклонения, соответственно.

В случае <N0(415) предел обнаружения рассчитывают по уравнению

Ц = 0.011 д0(415).    (5)

11 Р0109. Sigma® lot 0S7KO049 — пример подходящего продукта, имеющегося е продаже. Данная информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не содержит обязательств применять данный продукт.

или 20 ед./кг корма;

предел количественного определения рассчитывают ло /равнению

Lq * 0,036 40(415).    (6)

или 60 ед./кг корма.

10.2    Межлабораторное испытание

Значения, полученные на основе межлабораторного испытания, могут быть неприменимы к диапазонам концентраций и матрицам, отличным от приведенных.

10.3    Сходимость

Коэффициент вариации сходимости CV{r) — среднее значение коэффициента вариации двух независимых результатов, полученных на основе одной пробы, в тот же день, одним и тем же оператором. с применением одного и того же оборудования и метода.

Расчетный коэффициент вариации сходимости CV(r) равен 10%.

10.4    Воспроизводимость

Коэффициент вариации воспроизводимости CV(R) — среднее значение коэффициента вариации результатов, полученных на основе одной пробы при использовании одного и того же метода, но в разных лабораториях, в различные дни. с применением различного оборудования и при участии разных операторов.    _

Расчетный коэффициент вариации воспроизводимости СV(R) равен 12 %.

11 Протокол испытаний

Протокол испытаний должен содержать следующую информацию:

a)    всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;

b)    используемый метод отбора проб, если он известен;

c)    используемый метод испытаний со ссыпкой на настоящий стандарт;

d)    все подробности проведения испытаний, не установленные в настоящем стандарте или рассматриваемые в качестве альтернативных, вместе с информацией о любых факторах, которые могли повлиять на результаты;

e)    полученные результаты испытаний;

f)    в случае проверки сходимости — окончательные полученные результаты.

Приложение А (справочное)

Результаты межлабораторных исследований

Международное совместное испытание (см. [3]) с участием 14 лабораторий шести стрвн {шести Национальных испытательных лабораторий (Австрии. Дании. Франции. Германии (2). Венгрии], одной вне зоны Европейского союза — Агентстве по контролю за качеством пищевых продуктов (Оттава. Канада), двух частных лабораторий во Франции и Швейцарии и пяти лабораторий компаний), проводилось с использованием пяти (жидких и твердых) проб корма. Данные пробы представляли собой комбикорм, состоящий из типичных компонентов с применением распространенного рецепта, обогащенный ферментом фитаза из различных источников и в различной форме, т. е. фитвзв была произведена различными компаниями и была добавлена как в твердой, так и а жидкой форме.

Были проанализированы восемь проб корма (А—Н). каждая из которых содержала один из четырех различных видов фитазы. е жидком и твердом виде. Каждый материал был проанализирован а анонимных дубликатах.

Данные прецизионности для метода, приведенного а [3]. представлены в таблице А. 1. Данные прецизионности (10.3 и 10.4) рассчитаны на основе итоговых результатов исследования, приведенных в |3).

Таблица А.1— Данные прецизионности для метода

Параметр

Жидкий

продукт

1

S00 ад /кг. А

Жидкий

продукт

2

750 од/кг. в

Жидкий

продукт

3

1000 ед/кг. С

Жидкий

продукт

4

1250 ед./и, D

Твердый

продукт

1

1500 ед/кг. Е

Твердый

продукт

2

1500 ед./кг. F

Твердый

продукт

3

1500 ед./кг. G

Твердый

продукт

4

1500 ед/кг, Н

Среднее значение. ед7кг

619

726

772

1219

1498

1621

1364

1199

Число лабораторий с резко отклоняющимися значениями

0

3

1

0

0

2

2

2

Число лабораторий после исключения лабораторий с резко отклоняющимися значениями, п

14

11

13

14

14

12

12

12

Среднее квадратичное отклонение сходимости, а,. ед./кг

43

43

62

88

159

164

119

26

Коэффициент вариации сходимости. CV(r), %

6.3

6.0

6.0

7.2

10.6

10.1

8.8

2.2

Среднее квадратичное отклонение меж-лаборвторной воспроизводимости. А,. ед./кг

66

51

89

127

164

164

131

39

Коэффициент вариации межлабораторной воспроизводимости. CV(ir). %

12.7

7.0

11.5

10.4

11.0

10.1

9.6

3.3

Среднее квадратичное отклонение воспроизводимости. вк. ед/кг

76

59

115

1SS

182

164

153

65

Коэффициент вариации воспроизводимости. CV(A), %

15.0

8.1

14.9

12.8

12.2

10.1

11.2

5.4

Библиография

(1)    ИСО 6497. Корме для животных. Отбор проб1)

(2)    CURRIE. LA. for the IUPAC ANALYTICAL CHEMISTRY DIVISION COMMISSION ON ANALYTICAL

NOMENCLATURE. Nomenclature In evaluation of analytical methods including detection and quantification capabilities. Pure Appl. Chem. 1995.    67. pp. 1699—1723. Available (2009—01—19) at

(3)    GlZZl. G.. THYREGOD. P.. VON HOLST. C.. 8ERTIN. G.. VOGEL. K.. FAURSCHOU-ISAKSEN. M.. 8ETZ. R.. MURPHY. R.. ANOERSEN. B.B. Determination of phytase activity in feed: Inte/laboratory study. J. AOAC Int. 2008. 91. pp. 259—267

,}Ha территории Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 6497—2011 «Корма для животных. Отбор проб».

УДК 637.11.001:006.354    ОКС 65.120    С19    ОКСТУ 9209

9709

Ключевые слова: корма, фитаза. активность фитаэы. реактивы, отбор проб, эталонные растворы, неорганический фосфат, градуировочная кривая, вычисление активности фитаэы. контроль уровня фита* эы. анализируемая проба корма, предел обнаружения, предел количественного определения, прецизионность, сходимость, воспроизводимость, оптическая плотность при длине волны 415 нм

Редактор Л.в. Коратникоеа Технический редактор О.И. власом Корректор 8.£ Нестерова Компьютерная верстка Ю.8. ДемениноО

Сдано а набор 07.02.2014. Подписано а печать 24.02.2014. Формат 60 < 84    Гарнитура Ариап.

Уел. печ. п. 1.86. Уч.-иад. п. 0.93. Тираж 123 эо. Зах 303.

Издано и отпечатано ао ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ*. 123995 Москва. Гранатный пер.. 4.