База ГОСТовallgosts.ru » 65. СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО » 65.120. Корма для животных


ГОСТ Р 53244-2008 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот

Обозначение: ГОСТ Р 53244-2008
Наименование: Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот
Статус: Действует

Дата введения: 01/01/2010
Дата отмены: -
Заменен на: -
Код ОКС: 65.120
Скачать PDF: ГОСТ Р 53244-2008 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот.pdf
Скачать Word:ГОСТ Р 53244-2008 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот.doc


Текст ГОСТ Р 53244-2008 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот



ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

НАЦИОНАЛЬНЫЙ

СТАНДАРТ

РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

ГОСТР

53244-

2008

(ИСО 21570:2005)

Продукты пищевые

МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ И ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ НИХ

ПРОДУКТОВ

Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот

ISO 21570:2005

Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Quantitative nucleic acid based methods

(MOD)

Издание официальное

8

i

s

i

(*>

lil

Москва

Стаидартииформ

2009

ГОСТ Р 53244—2008

Предисловие

Цели и принципы стандартизации е Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0—2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения»

Сведения о стандарте

1    РАЗРАБОТАН Институтом физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук при участии Ассоциации «Биологическая, экологическая и продовольственная безопасность» на основе аутентичного перевода международного стандарта, указанного в пункте 4

2    ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 447 «Биологическая безопасность ли» щевых продуктов, кормов и товаров народного потребления и методы ее контроля»

3    УТВЕРЖДЕН И 8ВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому ре» гулированию и метрологии от 25 декабря 2008 г. № 781 »ст

4    Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному стандар» ту ИСО 21570:2005 «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот» (ISO 21570:2005 «Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Quintitative nucleic acid basid methods»).

При этом в него не включены приложение С в част СЗ. С6 и С7 и приложение D в части D1 примененного международного стандарта, которые преждевременно применять в национальной стандартизации в связи с тем, что линии кукурузы Eventl 76 и Bt11 не входят в перечень генно-инженерно»модифицированных организмов, разрешенных для реализации населению и использования в пищевой промышленности в Российской Федерации (2008 г.).

При этом дополнительные положения и требования, включенные в текст стандарта для учета потребностей национальной экономики Российской Федерации и особенностей российской национальной стандартизации, выделены курсивом.

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать сведения о соответствии ссылочных международных стандартов национальным стандартам Российской Федерации, использованным в настоящем стандарте в качестве нормативных ссылок, указанные в приложении Е

5    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменении и поправок —■ в ежемесячно издаваемых информационных указателях ^Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствуй ющая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ. 2009

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

ГОСТ Р 53244—2008

Содержание

1    Область применения............................................1

2    Нормативные ссылки............................................1

3    Термины и определения..........................................2

4    Принцип...................................................2

4.1    Общие положения...........................................2

4.2    Амплификация, обнаружение и подтверждение продуктов ПЦР..................2

4.3    Количественное определение продуктов ПЦР............................2

5    Реактивы..................................................2

6    Приборы и оборудование.........................................3

7    Руководство, касающееся процедуры..................................3

7.1    Общие положения...........................................3

7.2    Стабильность целевой последовательности............................3

7.3    Калибровка анализа..........................................3

7.4    Особенности количественного определения............................3

7.5    Требования к обеспечению качества.................................3

в Интерпретация результатов........................................4

9    Выражение результата...........................................4

10    Протокол испытания...........................................5

Приложение А (рекомендуемое) Метод, специфический для целевого таксона.............6

Приложение В (рекомендуемое)    Методы    скрининга...........................11

Приложение С (рекомендуемое)    Методы, специфические для конструкций..............17

Приложение D (рекомендуемое) Метод, специфический для трансформационного события .... 52 Приложение Е (справочное) Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов

национальным стандартам Российской Федерации, использованным в настоящем

стандарте в качестве нормативных ссылок.......................57

Библиография................................................58

ГОСТ Р 53244—2008

Введение

Поиск ингредиентов полученных генетически модифицированных организмов осуществляется путем следующих последовательных (или одновременных) стадий. После отбора анализируемой пробы из лабораторной пробы экстрагируются нуклеиновые кислоты. Экстрагированные нуклеиновые кислоты могут далее очищаться в процессе экстракции или после него. Затем производят его количественное определение (при необходимости), разбавление (при необходимости), и он подвергается аналитическим процедурам (таким как ПЦР). Эти стадии подробно изложены в настоящем Международном стандарте и в следующих Международных стандартах:

ИСО 21569 Продукты пищевые. Методы анализа, предназначенные для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на качественном определении нуклеиновых кислот [1];

ИСО 21571 Продукты пищевые. Методы анализа, предназначенные для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот (2).

Международная организация по стандартизации (ИСО) обращает внимание на тот факт, что заявлено. что соблюдение настоящего документа может включать использование патента, касающегося технологии ПЦР.

ИСО было проинформировано, что Applied Biosystems. Roche Molecular Systems. Inc. и Hoffman-La Roche являются держателями патентных прав, касающихся технологии ПЦР. Компании гарантировали ИСО. что они намерены вести переговоры о лицензиях на приемлемых и не дискриминационных уело* вияхе заявителями по всему миру. В этой связи заявления держателей этих патентных прав зарегистрированы ИСО. Информация может быть получена от:

Licensing Department Applied Biosystems 850 Lincoln Centre Drive Foster City, CA 94404. USA и

Roche Molecular Systems. Inc.

Licensing Department 1145 Atlantic Avenue Alameda. CA 94501, USA.

Обращается внимание на возможность того, что некоторые элементы настоящего документа могут быть предметом латентных прав иных, чем определенные выше. ИСО не может нести ответственность за идентификацию какого-либо одного или всех патентных прав.

IV

ГОСТ Р 53244—2008 (ИСО 21570:2005)

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Продукты пищевые

МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ

И ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ НИХ ПРОДУКТОВ

Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот

Foodstuffs. Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products.

Quantitative nucleic acid based methods

Дата введения — 2010—01—01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, а также корма и растительные об» разцы, отобранные из окружающей среды.

Настоящий стандарт устанавливает количественные методы определения генетически модифи» цированных организмов (далее — ГМО) в пищевых продуктах, а также в кормах и растительных образ» цах. отобранных из окружающей среды с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). и общие требования к специфической амплификации целевых последовательностей деэоксирибунокле» иновой кислоты (ДНК) с целью количественного определения содержания ДНК из ГМО. а также для подтверждения идентичности амплифицированиой последовательности ДНК.

Основные принципы, минимальные требования и критерии исполнения, изложенные в настоящем стандарте, предназначены для обеспечения сравнимости, точности и воспроизводимости результатов, получаемых в разных лабораториях.

Методы количественного определения содержания ДНК из ГМО и подтверждения идентичности амплифицированиой последовательности ДНК приведены в приложениях А—О.

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р ИСО 5725-1—2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ Р ИСО 5725-6—2002 Точность (правильность и прецизионность) методое и результаты е измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025—2006 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ Р 50779.11—2000 (ИСО 3534-2—93) Статистические методы. Статистическое управление качеством. Термины и определения

ГОСТ Р 52173—2003 Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения

ГОСТ Р 52174—2003 Биологическая безопасность. Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа

ГОСТ Р 53214—2008 (ИСО 24276:2006) Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Общие требования и определения

Издание официальное

1

ГОСТ Р 53244—2008

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — не официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен}, то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей ату ссылку.

3    Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ Р 50779.11 и ГОСТ Р 53214.

4    Принцип

4.1    Общие положения

Каждый количественный метод, приведенный е приложениях A— D. определяет конкретную целевую поспедоеатепьность(и) ДНК*.

Результат количественного определения должен явно выражать (в процентах) содержание целевой последовательности относительно количества специфического стандарта, соответствующих калибровок и контролен и быть внутри динамического диапазона применяемого аналитического метода и анализируемой пробы.

Количественное определение** состоит:

•    из амплификации одной или большего числа специфических целевых последовательностей:

- обнаружения и подтверждения специфичности продукта(ов) ПЦР и

•    определения содержания амплифицированных фрагментов (продуктов ПЦР) относительно калибровок.

Отбор проб — по ГОСТ Р 52173. ГОСТ Р 52174.

4.2    Амплификация, обнаружение и подтверждение продуктов ПЦР

Принципы амплификации, обнаружения и подтверждения последовательностей ДНК — в соответствии с ИСО 21569 [1J.

4.3    Количественное определение продуктов ПЦР

Принцип количественного определения состоит в определении соотношения (выраженного в процентах) двух целевых последовательностей ДНК. т. е. последовательности, представляющей интересующий генетически модифицированный организм и последовательности (эндогенной), специфической для целевого таксона.

Материалы, применяющиеся для калибровки, которые используют для количественного определения. должны быть пригодными для контроля с сертифицированными эталонными материалами (СЭМ), если таковые имеются. Если такие материалы отсутствуют, следует использовать другие подходящие эталонные материалы***.

5    Реактивы

Все реактивы и материалы, используемые для анализа, должны быть идентичны или эквивалентны определенным в методе. В противном случае все реактивы и материалы должны иметь квалификацию «для молекулярно-биологических работ» (molecular biology grade). Эти реактивы следует хранить и использовать, как рекомендовано производителем или в соответствии с техническими требованиями обеспечения качества лабораторных работ в соответствии с ГОСТ Р ИСО/МЭК17025.

’ Количественное определение допускается проводить с использованием конкурентной ПЦР (3],(4) ипи ПЦР в реальной времени (5), (б).

*’ В случав использования ПЦР а реальном времени амплификация, обнаружение и подтверждение происходят одновременно

Примерное руководство приведено е (7]. Информация об исследованиях подтверждения достоверности и погрешности измерений собраны в международных исследованиях (в), (9|. (ГО). (Г Г).

2

ГОСТ Р 53244—2008

6    Приборы и оборудование

См. приложения A—D и ГОСТ Р 53214.

7    Руководство, касающееся процедуры

7.1    Общие положения

Общие требования, имеющие отношение к ПЦР-амплификации для обнаружения ГМО. описаны в ИСО 21569II].

8    приложениях A— D описаны методы ПЦР-детектироеания наряду с деталями их возможностей и применения. Для каждого метода подробно описаны демонстрируемые рабочие характеристики.

Концентрация анализируемой последовательности ДНК должна находиться внутри динамического диапазона метода.

Примечание — Для определения достаточно ли качество кодирующей нити ДНК (по длине и структурной целостности). в также достаточны ли ее чистота и количество для обеспечения обнаружения и количественного определения ГМО. принадлежащего к целевому таксону, может быть проведен контроль, специфический для целевого таксона. Он может быть тем более обоснован, когда ДНК экстрагирована из композитного или подвергнувшегося глубокой обработке материала.

ДНК. экстрагированная из каждой анализируемой пробы, должна быть проанализирована не менее чем в двух повторностях.

Должны быть использованы соответствующие контроля [см. ГОСТР 53214 (таблица 1)].

7.2    Стабильность целевой последовательности

Для сортов различного географического и филогенетического происхождения следует учитывать стабильность целевой последовательности как аллельную, так и по числу копий.

7.3    Калибровка анализа

Следует применять соответствующее число калибровочных точек и повторностей, охватывающих диапазон количественного определения [например, четыре калибровочных точки в двух повторностях (всего четыре* два значения) или шесть калибровочных точек с одним измерением в каждой точке (всего шесть значений)]. Качество калибровки влияет на погрешность измерения [11].

8 качестве альтернативы геномной ДНК в качестве эталонного материала для калибровки допускается использовать, например, серию разбавлений плазмиды или синтетической двухцепочечной ДНК. содержащих целевую последовательность, при условии, что она демонстрирует при калибровке поведение, аналогичное эталонному материалу геномной ДНК и геномной ДНК. экстрагированной из анализируемой пробы.

7.4    Особенности количественного определения

Методы ПЦР должны быть соответствующим образом разработаны с целью минимизации вариабельности.

Примечание—В зависимости от применяемого метода иУипи анализируемого материала присутствие конструкций, включающих несколько целевых генов, может привести к преувеличению фактического содержания ГМО.

Предел количественного определения (LOQ) — в соответствии с ГОСТР 53214.

На расчет содержания ГМО. основанный на числе копий целевых последовательностей в гаплоидном геноме, влияет гомо- и гетероэиготность изучаемых проб (см. приложения A—D).

Применение метода ддС, (порогового цикла) обосновано только в том случае, если эффективности амплификации пробы, специфической для целевого таксона, и пробы, специфической для ГМО. очень близки.

7.5 Требования к обеспечению качества

Для установления достоверности изменений необходимо знание относительного стандартного отклонения воспроизводимости метода в соответствии с ГОСТ Р 5725-1 и ГОСТ Р 5725-6. Если наличие происходящей из ГМО ДНК (в процентах) запротоколировано, необходимы:

а) согласованность результатов для каждой лабораторной пробы, достигающаяся:

• через отбраковку измерений меньших, чем предел количественного определения, и

э

ГОСТ Р 53244—2008

•    через максимальное отклонение, наблюдаемое между разбавлениями и индивидуальными измерениями, равное значению, ожидаемому, исходя из соответствующего фактора разбавления. 133 %;

Ь) согласованность между тестируемыми частями лабораторной пробы:

•    определенные относительные концентрации происходящей из ГМО ДНК. полученные с учетом перечисленного в пункте а), для каждой анализируемой пробы не должны различаться на значение более чем от минус 50 % до плюс 100 % значения обнаруженного количества (равного дС, 1 при ПЦР в реальном времени) (т. е. для двух анализируемых проб приемлемы результаты измерений 1,0 % и 2.0 %. в то время как 0.9 % и 2,1 % — неприемлемы).

Для того чтобы гарантировать точность измерений для количества происходящей из ГМО ДНК следует выбирать и анализировать стандартный материал (СМ), предпочтительно сертифицированный (ССМ). с соответствующим уровнем метрологической надежности и с надлежащим сходством вещества продукта. В отсутствие ССМ может быть приготовлен СМ собственного производства с помощью процедуры. обеспечивающей стабильность, однородность и единство измерений и гарантирующей отсутствие систематической погрешности. Оцененная количественно погрешность допжна удовлетворять требуемой для калибровки {см. ИСО Руководство 32) [12].

8 Интерпретация результатов

Результаты ПЦР могут быть либо

a)    пригодными для количественной оценки целевой последовательности при условии, что

-    результат положительный в соответствии с ИСО 21569 (подраздел 8.1) [1] и таблицей 2 ГОСТ Р 53214;

-    наблюдаемое ингибирование реакции незначительно:

-    аналитические процедуры дают недвусмысленные значения измерений;

• количество целевой последовательности находится внутри динамического диапазона метода и

-    проведена калибровка аналитической процедуры в соответствии с 7.3,

либо

b)    не пригодными для количественной оценки целевой последовательности, если любое из перечисленных выше условий не было соблюдено.

Для того чтобы лаборатория могла дать обоснованное заключение, погрешность измерения должна быть достаточно мала.

В приложениях A— D приведены измерения количества целевой ДНК. Эти количества могут быть использованы для расчета количества ГМО. Эти расчеты обычно принимают во внимание такие биологические факторы, как гомо- и гетерозиготность целевых последовательностей.

Если количество целевой ГМ-последовательности или последовательности, специфической для целевого таксона, установленное в ходе испытания, ниже предела количественного определения (LOQ). результат следует выражать только качественно {в анализируемой пробе ДНК из ГМО прису• тстеует).

Примечание — Утверждение, что количество происходящей из ГМО ДНК ниже пределе количественного определения, сопровождающееся спецификацией этого предела количественного определения, рассматривают как качественное выражение результата.

9 Выражение результата

Результаты должны ясно констатировать количество целевой ГМ-последовательности относительно последовательности, специфической для целевого таксона. Результаты должны также содержать значения погрешности измерения, такие как стандартное отклонение или относительное стандартное отклонение. Кроме того, следует приводить значения предела детектирования и предела количественного определения метода и фактические пределы детектирования и количественного определения.

Целевая последовательность может быть, а может и не быть обнаружена, или количество, по крайней мере, одной из них может быть ниже предела количественного определения. В таблице 1 описаны четыре альтернативных случая и соответствующее им выражение результата, которые должны быть включены в протокол испытания.

4

ГОСТ Р 53244—2008

Таблице 1 — Выражение результатов

Результат

выражение результата

Последовательность, специфическая для целевого таксона, не обнаружена

См. ИСО 21569 (Г].

•Для вида х*» ДНК не обнаружена»

Последовательность, специфическая для целевого таксона, обнаружена, но не обнаружена целевая последовательность. происходящая из ГМО

В соответствии с ИСО 21S69 |JJ.

•Для вида х» ДНК. происходящая из ГМО. не обнаружена».

В надлежащих случаях, кроме того, добавляется «Фактический предел детектирования составляет X Ч* (указывают используемые единицы измерения)

Обнаружены хек последовательность, специфическая для целевого твксона. так и целевая последовательность. происходящая из ГМО. однако, количество, по крайней мере, одной из целевых последовательностей ниже предела количественного определения

Для каждого ГМО констатируется:

•ДНК. происходящая из ГМО (специфицируется ГМО). обнаружена с помощью (специфицируется целевая последовательность), полученной из (специфицируется вид)».

В надлежащих случаях, кроме того, добавляется «Фактический предел количественного определения составляет X Ч» (указывают используемые единицы измерения)

Обнаружены хек последовательность, специфическая для целевого таксона, так и целевая последовательность. происходящая из ГМО. и количество обеих целевых последовательностей выше предела количественного определения

Для каждого ГМО констатируется:

•Содержание ДНК. происходящей из ГМО (специфицируется ГМО). обнаруженное с помощью {специфицируется целевая последовательность) полученной из (специфицируется вид), составляет X ± погрешность. %» (указывают используемые единицы измерения)

* Указывают таксономическую принадлежность анализируемого растения. Например. «ДНИ сои не обнаружена»

Допускается также указывать содержание ДНК. происходящей из ГМО. с учетом погрешности из-мерения как в том случае, когда оно превышает конкретное значение, так и когда не достигает его.

10 Протокол испытания

Протокол испытания — в соответствии с ГОСТ Р 53214 и ИСО 21569 [1] и должен содержать еле* дующую дополнительную информацию:

a)    предел количественного определения (LOQJ метода и материал, с помощью которого он был установлен:

b)    фактический предел количественного определения;

c)    ссылку на метод, который был использован для экстракции ДНК;

d)    ссылку на использованные материалы:

e)    результаты, выраженные в соответствии с разделом 9.

5

ГОСТ Р 53244—2008

Приложение А (рекомендуемое)

Метод, специфический для целевого таксона

А.1 Метод определения абсолютного количественного содержания ДНК гена adh1 из кукурузы (специфический для целевого таксона) с использованием метода ПЦР в реальном времени

А.1.1 Введение

в этом приложении описан метод специфической амплификации и количественного определения (вспомогательного) гена atfftf (кодирующего влкогольдегидрогеназу 1) из кукурузы (Zee mays) для определения содержания ДНК кукурузы или для обнаружения присутствия/огсутствия в растворах ДНК. экстрагированной из продуктов, содержащих кукурузную ДНК. например, из пищевых продуктов, детектируемых количеств ингибиторов ПЦР.

Ограничения см. в А. 1.8.

А.1.2 Статус подтверждения достоверности и характеристики рабочих параметров

А.1.2.1 Общие положения

Метод был оптимизирован для ДНК. экстрагированной из чистых рвзмолотых кукурузных зерен, листьев кукурузы и сертифицированных стандартных материалов (серий IRMM-411. IRMM-412. IRMM-413 (13]. (14)}.

Воспроизводимость описанного метода была проверена с помощью совместных испытаний лабораторий с использованием неизвестных образцов (от U1 до U6), состоящих из ДНК кукурузы дикого типе с различным числом копий соответствующей цепевой последовательности (см. А.1.2.2). а также в других совместных испытаниях лабораторий в комбинации с методами, специфическими для трансформационных событий ГМ-кукуруаы.

Число копий целевой последовательности на гаплоидный геном должно быть равно единице (14].

Должна быть установлена аллельная стабильность целевой последовательности (14].

А.1.2.2 Совместные испытания лабораторий*

Для построения калибровочной кривой для определения абсолютного количества гаплоидных геномов кукурузы в неизвестных образцах были использованы шесть образцов (S1—S6) ДНК кукурузы дикого типа (экстрагированной из материала листьев (16]. содержащей известное абсолютное число копий (183466. 61162. 20387, 6766. 226S и 765) гаплоидных геномов кукурузы. Абсолютное число копий в известных образцах было определено путем деления массы ДНК (определенной методом флуориметрического количественного определения двухцепочечной ДНК производства фирмы РюоОгееп. Molecular Probee. Cal. Number P-7589) на опубликованное среднее значение 1C для геномов кукурузы (2.725 пг) (17].

Шесть образцов (U1—U6) ДНК кукурузы дикого типа (экстрагированной из материала листьев (16)) были использованы в качестве неизвестных образцов. Ожидаемое число копий в неизвестных образцах было определено тем же методом, что и в известных образцах.

Результаты подтверждения достоверности метода, полученные в ходе совместных испытаний лабораторий, суммированы в таблице А.1.

валидация метода была также проведена а комбинации с методами, специфическими для трансформационных событий для нескольких образцов ГМ-кукурузы. например, для сладкой кукурузы 8111. Подробности комбинированных испытаний (относительного количественного определения) см. в (18] и (19].

Таблица А.1 — Данные валидации

Наименование показателя

Образец

Ut

U2

из

U4

U5

U6

Число участвовавших лабораторий

12

12

12

12

12

12

Число лабораторий, имевших возвратные результаты

10

10

10

10

10

10

Число неработоспособных (invalid) лабораторий

1

1

1

1

1

1

* Подтверждение достоверности (валидация) метода было проведено в ходе совместных испытаний лабораторий. организованных Объединенным исследовательским центром Еврокомиссии (EC-JRC) и Институтом защиты здоровья и потребителей (IHCP) в соответствии с Международным протоколом гармонизации (15).

6

ГОСТ Р 53244—2008

Окончание таблицы А.1

Наименование показателя

Образец

U1

U2

из

U4

U5

U6

Число поддержанных лабораторий

9

9

9

9

9

9

Число образцов на лабораторию

4

4

4

4

4

4

Число выбросов по Кохрану

1

1

1

1

Число выбросов по Груббсу

1

1

1

1

1

Число принятых образцов

35

34

34

34

3S

35

Ожидаемое число копий

7339

15349

36697

55046

91743

146785

Среднее число копий

9955

23855

46915

75161

100541

122080

Отклонение от истинного значения. %

36.1

30.2

27.9

36. S

9.6

-16.8

Стандартное отклонение повторяемости s’

1318.59

1463.60

5796.55

4539.57

11306.59

14843.41

Относительное стандартное отклонение повторяемости. % ь

13.21

6.13

12.35

6.04

11.25

12.16

Стандартное отклонение воспроизводимости ая

2013.12

2083.57

6145.39

6806.55

14592.04

17777.70

Относительное стандартное отклонение воспроизводимости. % "

20.16

8.72

13.10

9.06

14.51

14.56

*    Выражается как число копий.

*    Выражается как процент от среднего значения.

А.1.2.3 Молекулярная специфичность

А.1.2.3.1 Общие положения

Метод был разработан для использования а качестве целевой части последовательности, описанной в EMBUGenBank/DDBJ. регистрационный номер Х04050. Эта последовательность является уникальной для Zee mays (кукуруза/маис) и Zee mays subsp. diploparennis (теосинте мексиканского) (14|.

А.1.2.3.2 Теоретическая специфичность

Теоретическая специфичность праймеров и зондов была оценена путем поиска в базах данных EMBL/GenBank/DOBJ с использованием нуклеотидных последовательностей в качестве запросных последовательностей с помощью программы BLASTN на сайте Национального института здравоохранения США (9 октября 2003 г.). Результат поиска подтвержден полной идентичностью только с ожидаемыми целевыми последовательностями.

А.1.2.3.3 Экспериментальное определение специфичности

Специфичность метода была проверена в отношении широкого диапазона нецелевых таксонов и 20 различных линий кукурузы, представляющих географическое и филогенетическое разнообразие образцов [14]. Не было обнаружено перекрестной реактивности с нецелевыми таксонами (за исключением теосинте мексиканского Zee mays subsp. diploparennis. дикого предка культурной кукурузы) |14]. (20). Были установлены число копий и аллельная стабильность целевой последовательности у различных линий кукурузы (14|.

А.1.2.4 Оптимизация

Оптимизация была проведена для системы детектирования последовательностей (СДП) ABl PRISM 7700* и набора ТадМвп* химия. Расчет праймеров и зондов был проведен с помощью программного обеспечения Рпшег Express* (Applied Bioeystems)

А.1.2.5 Предел детектирования (LOO)

В соответствии с рекомендациями разработчика метода LOD составляет Ю копий целевой последовательности |?4]. Наименьшее число копий целевой последовательности, включенных в совместные испытания лабораторий. составляло 7399 копий целевой последовательности.

А.1.2.6 Предел количественного определения (LOQ)

В соответствии с рекомендациями разработчика метода LOQ составляет 100 копий целевой последовательности |74]. Наименьшее число копий целевой последовательности, включенных а совместные испытания лабораторий. составляло 7399 копий целевой последовательности.

7

ГОСТ Р 53244—2008

А.1.3 Адаптация

Специфическая информация отсутствует.

А.1.4 Принцип

Фрагмент гена edft 1 а 134 п. о. амплифицироаали с использованием двух кукурузных ad»1-специфических праймеров (см. таблицу А.2). Накопление продуктов ПЦР измеряли в конце каждого цикла ПЦР (в реальном времени} с помощью кукурузного adftl -специфического олигонуклеотидного зонда (AOH1-MDO. см. таблицу А.2), меченного двумя флуоресцентными красителями — РАМ в качестве релортерного красителя и TAMRA в качестве гасителя. Для этих целей применялся набор TaqMan* химия.

Измеренный сигнал флуоресценции пересекал определяемое пользователем пороговое значение после нескольких циклов. Число этих циклов было названо 0,-значвнием. Для количественной оценки количества кукурузной adftl-ДНК в неизвестном образце значение С, преобразовано в соответствующее число копий путем сравнения с калибровочной кривой, значения С, на которой напрямую связаны с известным числом копий (регрессионный анализ).

A.1.S Реактивы

A.1.S.1 Общие положения

Для получения информации о качестве реактивов, которые могут использоваться, см. ГОСТ Р 53214 (подраздел 6.6).

А. 1.5.2 Вода.

А.1.5.3 Буфер для ПЦР (без MgCl.,). 10*.

А.1.5.4 Раствор MgCl,. c(MgCl)) « 25 ммоль/dw*.

А.1.5.5 Раствор дНТФ. с(дНТФ) * 2.5 ммоль/дм1 (каждый).

А.1.5.6 Олигонуклеотиды

Характеристики применяемых олигонуклеотидов приведены в таблице А.2.

Таблица А.2 — Олигонуклеотиды

Наименование ол и г онуп л вот и д в

Последовательность олигонуклеотидной ДНК

Окончательная концентрация при ПЦР

ADH-FF3

5-CgT СдТ ТТС CCA ТСТ СТТ ССТ СС-3'

300 нмоль/дм*

A0H-RR4

S-CCA СТС СдА дАС ССТ САд ТС-31

300 нмоль/дм’

ADH1-MDO

5-FAM-AAT САд ддС ТСА ТТТ ТСТ СдС ТСС TCA-TAMRA-3-*

200 нмоль/дм*

* FAM: 6-карбоксифлуоресцеин: TAMRA; б-карбокситетраметилродвмин.

Длина ампликона adftl составляет 134 п. о.

А.1.5.7 Термостабильная ДНК-лолимераза ДНК-лолимервза AmpHTaq Gold*.

А.1.5.8 Урацил-Ы-гликозилаза (необязательно)

А.1.5.9 Реакционная смесь для амплификации

Подробно о реакционной смеси для амплификации см. в таблице А.З.

Таблица А.З — Реакционная смесь для амплификации, окончательные объем/концентрвция на одну реакционную пробирку

Суммарный реакционный объем

25 мхл

Кодирующая нить ДНК (максимум 250 нг>

5 мкл

Taq-ДНК-полимераза

TaqMan® Universal Master Mix 2'

12.5 мкл

Деконтаминационнвя системе (дУТФ. включая урацил-N-гликозилазу)

Реакционный буфер (содержащий пассивный стандартный ROX)*

Смесь дНТФ

Праймеры

См. таблицу А.2

См. А.1.5.6

Зонд

См. таблицу А.2

См. А.1.5.6

s ROX—карбокси-Х-родамин.

8

ГОСТ Р 53244—2008

А.1.6 Прибор

А.1.6.1 Общие положений

Следует использовать стандартный лабораторный прибор, если не определено иначе

А.1.6.2 Термоциклер

Отмеченный температурно-временной профиль изнвчвльно был оттестирован при помощи прибора СДП ABI PRISM* 7700 (Applied Besyatems). Допускается использовать другие системы ПЦР в реальном времени после адаптации реакционных условий.

А.1.6.3 Реакционные пробирки

Реакционные пробирки должны быть подходящими для ПЦР-вмплификвции в термоциклере реального времени. например. ABI PRISM4 96-Well Optical Reaction Plate, или MIcroAmp* Optical Capa (восемь крышек на полоску, плосквя) (Applied 8losystems).

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования и реактивов с техническими характеристиками не ниже вышеуказанных, если может быть показано. что их применение приводит к тем же результатам.

А.1.7 Процедура: порядок проведения ПЦР

А.1.7.1 Общие положения

Порядок проведения ПЦР для целевой последовательности референсного гена и для целевой последовательности ГМО следует проводить в отдельных пробирках, если иное не указано в соответствующем приложении для ГМ-специфических целевых последовательностей.

Метод изложен для суммарного объема реакционной смеси ПЦР 25 мкл с реактивами, список которых приведен в таблице А.З.

А.1.7.2 КонтролиПЦР

Если контроля не дают ожидаемого результата, результаты анализа должны быть аннулированы, а сам анализ должен быть повторен.

В качестве положительного контроля и/или стандартного материала для калибровки может быть использована высококачественная чистая геномная ДНК. экстрагированная из кукурузы (например. ССМ от JRC. IRMM (76). Должны быть проведены все соответствующие контроли. как это описано а ГОСТ Р 53274.

А.1.7.3 Температурно-временная программа

Температурно-временная программа, приведенная в таблице А.4. была оптимизирована для СДП ABI PRISM* 7700 (Applied Bioaystenrs). В исследовании по подтверждению достоверности метода A6I PRISM4 7700 использовался совместное AmphTaq Gold* ДНК-полимеразой. Использование других термоциклеров может потребовать специальной адаптации. Температура и время, необходимые для активации фермента, зависят от особенностей используемой полимеразы. Условия реакции приведены в таблице А.4.

Таблица А.4 — Процедура: условия реакции

Этапы определения

Вреыя. с

Температура. *С

Пред-ЛЦР: деконтаминация

120

50

Пред-ПЦР: активация ДНК-полимеразы и денатурация кодирующей нити ДНК

600

95

ПЦР (50 циклов)

Стадия 1

Денатурация

15

95

Стадия 2

Отжиг и элонгация

60

60

А.1.8 Ограничения и интерпретация результатов

Присутствие ингибиторов ПЦР может оказать сильное влияние на точность оценки числа копий adftl -последовательности в анализируемых образцах. Поэтому необходимо проверять присутствие или отсутствие детектируемого количества ингибиторов ПЦР (см. также ИСО 21571. приложение А. [2]). например, путем проведения серии разбавлений кодирующей нити ДНК и проверки соответствия между разбавлениями и различиями значений С, (порогового цикла), т. е. одной единице С, соответствует удвоение концентрации кодирующей нити ДНК.

Для использования этого метода в комбинации с методом количественного определения происходящей из ГМО ДНК важно, чтобы абсолютное количество кодирующей нити ДНК (нг) было таким же. как при adftl-ПЦР. так и при ГМО-слецифической ПЦР. Если это будет не твк, то абсолютное число копий, полученное в ходе этих реакций, не может быть сравнено непосредственно и будет необходимо приведений этих чисел в соответствие. В противном случае относительная концентрация ГМО не может быть рассчитана.

9

ГОСТ Р 53244—2008

А.1.9 Калибровка и результаты расчетов

Калибровочные точки получают с ДНК. содержащей определенное количество (в абсолютных числах копий) гвллоидной геномной ДНК кукурузы, включающей целевую последовательность.

Калибровочную кривую получают путем построений графика зависимости значения С, относительно логарифме числа копий целевой последовательности для калибровочной точки. Это может быть осуществлено, например. путем использования программного обеспечения (электронной таблицы), такого как Microsoft Excel, или непрямую с помощью опций, доступных в программном обеспечении системы детектирования последовательностей.

Калибровочную кривую используют для определения абсолютного числа гаплоидных геномных копий кукурузной ДНК неизвестных образцов. Несмотря на то. что ДНК образца может быть деградироеана вследствие процесса приготовления продукта, либо может содержать ингредиенты, иные, чем кукуруза, это не будет влиять на рассчитываемое число гаплоидных геномных копий неизвестных образцов.

10

ГОСТ Р 53244—2008

Приложение В (рекомендуемое)

Методы скрининга

8.1 Метод скрининге для определения относительного количественного содержения ДНК 35S-npOMO-торе сои линии GTS 40-3-2 с использованием методе ПЦР в реальном времени

В.1.1 введение

В этом приложении приведен метод спеиифической амплификации и обнаружения тахсон-слецифического гена сои (ген лектина, tel) и ДНК 35S-npOMOTopa. происходящего из вируса мозаики цветной капусты, и для количественного определения содержания ДНК 35£-лромоторв в соевых ингредиентах, содержащих генетически модифицированную сою линии GTS 40-3-2 (Roundup Ready*).

Ограничения см. в 8.1.8.

в.1.2 Статус подтверждения достоверности и характеристики рабочих параметров

В.1.2.1 Общие положения

Метод был оптимизирован для сертифицированных стандартных материалов (ССМ IRMM-410) [21]. состоящих из высушенной муки соевых бобов, включающих смеси сои GTS 40-3-2 и обычной сои.

Воспроизводимость приведенных методов была проверена в ходе совместных испытаний лабораторий с использованием неизвестных образцов (образцы, помеченные как SA—SE. см. таблицу В.1), состоявших из смеси стандартных материалов, тип которых упомянут выше (22]. Кроме того, были протестированы коммерчески доступные пищевые продукты (23).

Число копий каждой из целевых последовательностей на геном подробно оценено не было (24). |25].

Метод был опубликован в (26].

8.1.2.2 Совместные испытания лабораторий

Пять неизвестных образцов, содержащих от 0.7 % до 3 % (по массе) высушенной соевой муки из сои GTS 40-3-2. были проанализированы одиннадцатью участниками.

Метод, специфичный для детектирования 358-промогора. дал относительное стандартное отклонение воспроизводимости в диапазоне от 17 % до 34 % (см. таблицу В.1). В ходе начальных экспериментов совместных испытаний лабораторий было определено, что 1 %-ный соевый ССМ не соответствовал заявленному значению. Исследования показали, что различавшиеся стандартные материалы были изготовлены разными способами в разное время, что и привело к разному уровню деградации ДНК. Участники совместного испытания лабораторий были поставлены в известность о необходимости в ходе этого совместного испытания применять 2 %-ный ССМ и разбавлять его для получения раствора 1 %-ной стандартной ДНК для использования при количественном определении.

Для экстракции ДНК использовалась процедура, описанная е (26|. 200 мг материала образца было лизировано в 1 cmj буфера гуанидингидрохлорид/протеиназа К (0.5 ммоль/дм»: 0.8 мг/см’) при температуре S6 *С в течение 3 ч. После стадии обработки РНазой S00 мкл очищенного экстракта смешивалось с 1 см1 силиконовой смолы Wizard*, и смола со связанной ДНК возвращалась путем отсасывания через колонку с фильтром Wizard*. После промывания изопропанолом ДНК элюировали с силиконовой смолы 10 ммоль/дм*; Трис-буфером pH 9.0 при температуре 70 *С. Концентрацию ДНК оценивали с помощью измерения оптической плотности при 260 нм и приводили к уровню 20 мкг/см*. Для последующего ЛЦР-внвлиза 200 нг ДНК из каждого образца были проанализированы в двух независимых реакциях.

Образцы анализировались в двух повторностях.

Так как образцы, помеченные SA—SE. представляли собой смеси этих различных стандартов, результаты, полученные с помощью этих образцов, не могут быть использованы для оценки истинности предложенного метода ПЦР в реальном времени. Однако эти результаты могут быть использованы для оценки точности этого метода, в силу чего описанные обстоятельства отражают нвихудший вариант, ведущий к недооценке точности прикладного методе ПЦР в реальном времени (22).

Исключение лабораторий основано на использовании приборов ПЦР в реальном времени и на статистическом расчете «выбросов». Метод был разработан для блочных термоциклеров. Поэтому две лаборатории, использовавшие системы LightCycler*. были исключены еще до расчета «выбросов». Причина исключения определенных приборов для ПЦР состояла в наблюдении, что прикладной метод нуждается в тщательной адаптации и оптимизации в том случае, если он проводится на приборе для ПЦР в реальном времени, отличном от того, который изложен в методе. Оставшиеся лаборатории были, кроме того, проверены на выбросы по Груб-бсу (27|. Однако не было обнаружено ни одного выброса. Подробности совместного испытания лабораторий приведены в таблице В.1.

11

ГОСТ Р 53244—2008

Таблица В.1 — Данные валидации ЗбЭ-проыотор-спецт

зического обнаружения ГМО в 1999 г.

Наименование показатепя

Образцы

SA

SB

SC

SO

SE

Число лабораторий, имевших возвратные результаты

11

11

11

11

11

Число образцов на лабораторию

1

1

1

1

1

Число исключенных лабораторий

2

2

2

2

2

Число лабораторий, оставшихся после исключения

9

9

9

9

9

Число принятых образцов

9

9

9

9

9

Ожидаемое значение, 14 ГМО

1.4

1.8

3

0.7

1

Среднее значение. 14 ГМО

1.63

1.76

4.04

0.88

1.73

Среднее линейное значение. 14 ГМО

1.62

1.70

3.46

1.00

1.60

Стандартное отклонение воспроизводимости $*14 ГМО

0.28

0.39

1.36

0.21

0.35

Относительное стандартное отклонение воспроизводимости. %

17

22

34

24

20

Предел воспроизводимости R (Я » 2.8 $*)

0.60

1.08

3.82

0.58

0.97

Кроме того, четырьмя участниками межлабораторных испытаний были проанализированы четыре неизвестных коммерчески доступных образца пищевой продукции, содержавшей от 0.3% до 36 % (по массе: средние значения) генетически модифицированной сои линии GTS 40-3-2. Метод, специфический для детектирования 3SS-npoMOTOpa. показал относительное стандартное отклонение воспроизводимости в диапазоне от 17 % до 28 % [23J.

В.1.2.3 Молекулярная специфичность

В.1.2.3.1 Общие положения

Метод был разработан для использования в качестве целевой части последовательности, описанной, например. в GenBank*. регистрационный номер V00141.

Список генетически модифицированных растений, содержащих CaMV 35S-npOMOTOp. приведен в (26).

Может быть получен ложноположительный результат вследствие того, что вмплифицированнвя последовательность происходит из цветной капусты и других представителей семейства Brasstcaceae (Cruaferae), в также Resedaceae и ЗоГвласеее. инфицированных вирусом мозаики цветной капусты |29|. [30]. Поэтому положительные результаты, касающиеся Srassicaceae. Resedaceae и Solanaceaa. должны тщательно рассматриваться. Положительные результаты могут указывать на присутствие продуктов, происходящих из ГМ-растений. но не должны интерпретироваться как доказательство присутствия продуктов, происходящих из ГМ-растений. без дополнительного подтверждения.

Для того, чтобы отличить вирусную инфекцию от ГМ-материала. допускается использовать методы обнаружения вируса мозаики цветной капусты [31].

8.1.2.3.2    Теоретическая специфичность

Теоретическая специфичность праймеров и зондов была оценена путем поиска в базах данных GenBank/EMBL/DDBJ с использованием нуклеотидных последовательностей в качестве запросных последовательностей с помощью программы BLASTN 2.2.3 (24 апреля 2002 г.]. Результат поиска подтвержден полной идентичностью только с ожидаемыми целевыми последовательностями.

6.1.2.3.3    Экспериментальное определение специфичности

Экспериментальная специфичность метода была оценена путем анализа COM IRMM-410 из высушенной соевой муки производства IRMM. содержащей от 0 % до 5 % сои линии GTS 40-3-2 и стандартного материала фирмы Leatnerhead Food Research Association international — соевой муки с полным содержанием масла {Lot No. 2/99-01). содержащей 0 14, 0.3 %. 1.25 14 и 2 Ч сои линии GTS 40-3-2. соответственно.

Исследованным коммерческим пищевым материалом были соевая мука, белковые иэоляты сои. композитные пищевые продукты, содержащие соевую муку и соевый белок.

В.1.2.4 Оптимизация

Оптимизация была проведена для системы детектирования последовательностей (СДП) ABl PRISM 7700* и набора TaqMan* химия.

12

ГОСТ Р 53244—2008

Расчет праймеров и зондов был проведен с помощью программного обеспечения Pnmer Express* (Applied Biosystems).

В.1.2.5 Предел детектирования (LOO)

Поскольку метод является количественным. LOD прямо не оценивался. LOD должен быть лучше или равным пределу количественного определения, т. е. 60 геномных копий сои линии GTS 40-3-2 в 82000 геномных копиях обычной соевой муки.

В.1.2.6 Предел количественного определения (LOQ)

LOQ был определен путем измерения серии разбавлений целевой ДНК. как описано в [23|. В соответствии с рекомендациями разработчика метода LOQ составляет SO геномных копий сои линии GTS 40-3-2 в 82000 геномных копиях обычной соевой муки. Величину 1С см. в |23). В соответствии с этими данными оцененный относительный LOQ составляет 0.06 (> 50 копий/82000 копий * 100 %).

Концентрации, исследованные в совместном испытании лабораторий, приведены в таблице 8.1.

Примечание — Число копий в совместном испытании лабораторий не определялось.

В.1.3 Адаптация

Специфическая информация отсутствует.

8.1.4 Принцип

Фрагмент последовательности CaMV 35S-npOMOTOpa размером 82 п. о. был вмллифицироеен с помощью ПЦР двух 35В-лромотор-слецифических праймеров. ЛЦР-продукты измерялись в ходе каждого цикла ПЦР (в реальном времени) с помощью 35$-промотор-специфического олигонуклеотид кого зонда, меченного двумя флуоресцентными красителями — FAM в качестве репортерного красителя и TAMRA в качестве гасителя. Для этих целей применялся набор TaqMan* химия.

Фрагмент последовательности гена лектина сои размером 81 л. о. был амллифицирован с помощью ПЦР в отдельной реакции ПЦР в реальном времени с использованием двух праймеров, специфических к гену соевого пектина. и продукты ПЦР измерялись а течение каждого цикла ПЦР с применением зондов, специфических к гену соевого лектина, производства TaqMan®.

Количественное определение проводили с использованием метода лдС, или метода двойной калибровочной кривой (см. 8.1.9).

B.1.S Реактивы

В.1.5.1 Общие положения

Для получения информации о качестве используемых реактивов см. ГОСТ Р 53214 (подраздел 6.6).

B.1.S.2 Вода.

В.1.5.3 Буфер для ПЦР (без MgCl,). 10'.

В.1.5.4 Раствор MgCl.,. c(MgCl2) « 25 ммоль/дм*.

В.1.5.5 Раствор дНТФ. с(дНТФ) * 2.5 ммоль/дм* (каждый).

В. 1.5.6 Олигонуклеотиды

Характеристики применяемых олигонуклеотидов приведены в таблице В.2.

Таблица 6.2 — Олигонуклеотиды

Наименование

ДНК-последовательность олигонуклеотида

Окончательная

олигонуклеотида

концентрация при ЛЦР

Целевая последовательность референсного гена

Лектин-F

5--ТСС ACC ССС АТС САС ATT Т-3'

900 нмопь/дм3

Лектин -R

S'-ggC АТА дАА ддТ дАА дТТ дАА ддА-3'

900 нмоль* ДМ1

Лектин -ТМР

S'-FAM-AAC Сдд ТАд СдТ ТдС САд СТТ Cg-TAMRA-3’*

100 нмоль/дм3

Целевая последовательность ГМО

35S-F

5'-дСС ТСТ дСС дАС АдТ ддТ-3'

300 нмоль/дм3

35S-R

5 -ААд АСд Тдд ТТд дАА СдТ СТТ С-3'

900 нмоль/дм3

35S-TMP

S'-FAM-CAA АдА Тдд АСС ССС АСС САС g-TAMRA-3-*

100 нмоль/дм3

* FAM; 6-кврбоксифлуоресцеин. TAMRA: 6-карбокситетраметилродвмин.

Длина пектинового ПЦР-лродукта составляет 81 л. о.; длина 35S ПЦР-продукта составляет 82 п. о. В.1.5.7 Термостабильная ДНК-полимвраза ДНК-полимераза AmpuTaq Gold*.

13

ГОСТ Р 53244—2008

б. 1.5.8 Урацил-Ы-гликозилаза (необязательно).

8.1.6    Прибор

8.1.6.1    Общие положения

Следует использовать стандартный лабораторный прибор, если не определено иначе.

8.1.6.2    Термоциклер

Отмеченный температурно-временной профиль изначально был оттестирован с приборами СДП A8I PRISM* 7700 (Applied 8losy»tems) и СДП GeneAmp* 5700 (Applied Blosystems). Допускается использовать другие системы СДП ПЦР в реальном времени после адаптации реакционных условий.

8.1.6.3    Реакционные пробирки

Реакционные пробирки должны быть подходящими для ПЦР-амплификации в термоциклере, например. ABI PRISM* 96-Well Optical Reaction Plate или MicroAmp* Optical Cape (восемь крышек на полоску, плоская) (Applied Biosyeteme).

Допускается применение других средств измерений с метропогическими характеристиками, а также оборудования и реактивов с техническими характеристиками не ниже вышеуказанных, если может быть показано. что их применение приводит к тем же резупьтатам.

8.1.7    Процедуре: порядок проведения ПЦР

в. 1.7.1 Общие положения

Порядок проведения ПЦР для целевой последовательности референсного гене и целевой последовательности ГМО следует проводить в отдельных пробирках. Мультиплексная ПЦР (с использованием различных флуоресцентных меток для зондов) не была протестирована или валидироевнв.

Метод изложен для суммарного объема реакционной смеси ПЦР 50 мкл с реактивами, приведенными в таблице 8.3.

Таблица В.З — Окончательный объем реакционной смеси амплификации (концентрация на одну реакционную пробирку)

Целевая последовательность референсного гена

Суммарный объем

50 мкл

Кодирующая нить ДНК (максимальное количество 200 нг)

10 мкл

ДНК-лолимераза

AmpliTaq Gold*

1.25 ед.

Деконтаминвционнвя

система

ДУТФ

Урацил-М-гликоэилазв AmpErase*

400 мкмольГдм9 0.5 ед.

Реакционный буфер

Буфер A TaqMan* (содержащий пассивный стандартный ROX)*

1-

MflCl,

S ммоль/дм*

Праймеры

Лектин-F и Лвктик-R (см. таблицу 8.2)

См. таблицу 8.2

ДНТФ

дАТФ.дЦТФ.дГТФ

200 мкмоль/дм3 каждого

Зонд

Лектин-ТМР (см. таблицу 8.2)

См. таблицу 8.2

Целевая последовательность ГМО

Суммарный объем

50 мкл

Кодирующая нить ДНК (максимальное количество 200 кг)

10 мкл

ДНК-лолимераза

AmpliTaq Gold*

1.25 ед.

Деконтаминвционнвя

система

ДУТФ

Урацил-АГ-гликозилвза AmpErase*

400 мкмоль/дм* 0.5 ед.

Реакционный буфер

Буфер A TaqMan* (содержащий пассивный стандартный ROX)*

1-

MflCl,

5 ммоль/дм*

Праймеры

35S-F и 35S-R (см. таблицу 8.2)

См. таблицу 8.2

ДНТФ

дАТФ.дЦТФ.дГТФ

200 мкмоль/дмэ каждого

Зонд

35S-TMP (см. таблицу 8.2)

См. таблицу 8.2

* ROX—карбокси-Х-родамин.

14

ГОСТ Р 53244—2008

8.1.7.2    Контроля ПЦР

В качество положительного контроля и стандартного материала для калибровки могут быть использованы сертифицированные стандартные материалы GTS 40-3-2 (материалы, содержащие от 0.1 Ч до 514 генетически модифицированной сои), производимые IRMM. Gael. Бельгия (серии IRMM-410}[2?}.

Следует провести все соответствующие контроля, как ото описано в ГОСТ Р 53214.

8.1.7.3    Температурно-временная программа

Температурно-временная программа, приведенная в таблице 8.4. была оптимизирована для СДП ABI PRISM* 7700 (Applied Biosystems). В исследовании по подтверждению достоверности метода A8I PRISM* 7700 использовался совместно с AmpliTaq Cold* ДНК-лолимеразой. Использование других термоциклеров может потребовать специальной адаптации. Температура и время, необходимые для активвции/иницивции денатурации, зависят от особенностей используемой полимеразы.

Условия реакции приведены в таблице 8.4.

Таблица 8.4 — Процедура: условия реакции

Этапы определения

Время, с

Температура. *С

Пред-ЛЦР: деконтаминация

120

50

Пред-ПЦР: активация ДНК-лолимврвзы и денатурация кодирующей нити ДНК

600

95

ПЦР (45 циклов)

Стадия 1

Денатурация

15

95

Стадия 2

Отжиг и элонгация

60

60

8.1.8    Ограничения и интерпретация результатов

Так как некоторые ГМО. а не только соя линии OTS 40-3-2. могут содержать последовательность ДНК 35Б-промоторв. метод пригоден только для количественного определения ДНК сои линии CTS 40-3-2 в отсутствии ГМО. иных, чем соя CTS 40-3-2. Во всех других случаях метод может быть применен только для скрининга и целей контроля.

Приведенный метод пригоден для измерения соотношения ДНК Збв-промотора и соевой ДНК в отсутствие других ГМО и вируса мозаики цветной капусты. Это соотношение отражает количество сои линии GTS 40-3-2 в соевом ингредиенте исследуемого пищевого продукта. Содержание 1 % сои линии GTS 40-3-2 может быть определено, если количество соевого ингредиенте в исследуемом пищевом продукте превышает 5 V

Примечание — Если обработка пищевого продукта в ходе его приготовления привела к деградации или удалению ДНК (например, при получении рафинированного соевого масла или рафинированных соевых лектинов), описанный метод не дает достоверных результатов.

8.1.9    Калибровка и расчет результатов

После определения порогового значений (например, от 0.01 до 0.1 нормализованной флуоресценции репор-тарного красителя (/?^| система детектирования последовательностей рассчитывает значения С, (число пороговых циклов) для каждой ПЦР (метод ддС,). Рассчитывают различия между значениями С, 35Б-специфического и лек-тин-специфического образцов (дС, и стандартных образцов (дС, <t). Относительное количество 3SS-AHK в образце (tv). %. относительно стандартного материала рассчитывают по формуле

iv »    '- с    (8.1)

CV

где сС1 — концентрация стандартного образца.

Альтернативным образом калибровочная кривая рассчитывалась (log |с] относительно С,) системой детектирования последовательностей на основе стандартов, состоящих из смесей ГМО известных концентраций генетически модифицированной сои линии GTS 40-3-2 (например. 0.1 Ч; 0.5 Ч. 1 %; 2 Ч и 5 Ч) или стандартов, состоящих из подходящих разбавлений стандартных растворов, полученных из смесей ГМО с определенной концентрацией сои линии GTS 40-3-2 (например. 5 Ч) — метод двойной калибровочной кривой. Эта калибровочная кривая применяется для определения концентрации сои линии GTS 40-3-2 в неизвестном образце. Поскольку ДНК образца может быть дегрвдирована вследствие процесса приготовления пищевого продукта или из-за того, что образец может содержать ингредиенты иные, чем соевые бобы, рассчитанная концентрация GTS 40-3-2 должна быть нормализована в соответствии с количеством амплифицируемой соевой ДНК. присутствующей в образце. Это количество определяют с помощью ПЦР в реальном времени, специфической для гена соевого лектина, с использованием в качестве стандартной ДНК смесей ДНК определенной концентрации (например. 100 Ч. 50 %. 25 Ч. 10 Ч и 1 Ч по

15

ГОСТ Р 53244—2008

массе) соевой ДНК из серии IRMM 410. разбавленных подходящим ДНК-носителем. Для нормализации измеренное количество ДНК сои линии GTS 40-3-2 делится на измеренное количество соевой ДНК.

Для этой альтернативной процедуры при расчете результатов важно, чтобы абсолютное количество кодирующей нити ДНК (нг) было одинаковым для каждой ПЦР. использованной для калибровки.

Другая альтернативная процедура описана в С.2.

16

ГОСТ Р 53244—2008

Приложение С (рекомендуемое)

Методы, специфические для конструкций

С.1 Метод количественного определений содержания сои линии OTS 40-3-2 (специфический для конструкции) с использованием ПЦР в реальном времени (метод 1)

С.1.1 введение

В этом приложении приведен метод специфической амплификации и обнаружения тахсон-слецифического гена сои (ген лектина. /е1) и ДНК. происходящей из специфической генной конструкции, присутствующей в генетически модифицированной сое линии GTS 40-3-2. Этот метод пригоден для количественного определения количестве ДНК. происходящей из генетически модифицированной сои линии GTS 40-3-2. в соевых ингредиентах, содержащих генетически модифицированную сою линии GTS 40-3-2 (Roundup Ready*).

Ограничения см. в С.1.7.

С.1.2 Статус подтверждения достоверности и характеристики рабочих параметров

С.1.2.1 Общие положения

Метод был оптимизирован для сертифициоавнных стандартных материалов (ССМ IRMM-410) (21). состоящих из высушенной муки соевых бобов, включающих смеси сои GTS 40-3-2 и обычной сои.

Воспроизводимость приведенных методов была проверена в ходе совместных испытаний лабораторий с использованием неизвестных образцов (образцы, помеченные как SA—SE. см. таблицу С.1), состоявших из смеси стандартных материалов, тип которых упомянут выше (22]. Кроме того, были протестированы коммерчески доступные пищевые продукты (23].

Число копий каждой из целевых последовательностей на геном подробно оценено не было (24]. (25].

Метод был опубликован в (26].

С.1.2.2 Совместные испытания лабораторий

Пять неизвестных образцов, содержащих от 0.7 % до 3 % (по массе) высушенной соевой муки из сои линии GTS 40-3-2, были проанализированы одиннадцатью участниками.

Метод, специфичный для детектирования конструкции GTS 40-3-2. дал относительное стандартное отклонение воспроизводимости в диапазоне от 16 % до 28 % (см. таблицу С.1). 8 ходе начальных экспериментов совместных испытаний лабораторий было определено, что 1 %-ный соевый ССМ не соответствовал заявленному значению. Исследования показали, что различавшиеся стандартные материалы были изготовлены разными способами в разное время, что и привело к разному уровню деградации ДНК. Участники совместного испытания лабораторий были поставлены в известность о необходимости в ходе этого совместного испытания применять 2 %-ный ССМ и разбавлять его для получения раствора 1 %-ной стандартной ДНК для использования при количественном определении.

Для экстракции ДНК использовалась процедура, предусмотренная в (26]. 200 мг материала образца было лизировано а 1 см3 буфера гуанидингидрохлорид/протеиназв К (0.5 ммоль/дм1; 0.8 мг/см3) при температуре 56 ‘С в течение трех ч. После стадии обработки РНКазой 500 мкл очищенного экстракта смешивалось с 1 см3 силиконовой смолы Wizard*. и смола со связанной ДНК возвращалась путем отсасывания через колонку с фильтром Wizard*. После промывания изолропанолом ДНК элюировали с силиконовой смолы 10 ммоль/дм3 Трис-буфером pH 9.0 при температуре 70 *С. Концентрацию ДНК оценивали с помощью измерения оптической плотности при 260 нм и приводили к уровню 20 мкг/см3. Для последующего ПЦР-анвлиза 200 нг ДНК из каждого образца были проанализированы в двух независимых реакциях.

Образцы анализировались а двух повторностях.

Поскольку образцы, помеченные SA—SE. представляли собой смеси этих различных стандартов, результаты. полученные с помощью этих обрвзцов. не могут быть использованы для оценки истинности предложенного метода ПЦР в реальном времени. Однако эти результаты могут быть использованы для оценки точности этих методов, в силу чего описанные обстоятельства отражают наихудший вариант, ведущий к недооценке точности прикладного метода ПЦР в реальном времени (22).

Исключение лабораторий основано на использовании приборов ПЦР в реальном времени и статистическом расчете «выбросов». Метод был разработан для блочных термоциклеров. Поэтому две лаборатории, использовавшие системы LightCycler* (Rocne Diagnostics), были исключены еще до расчета «выбросов». Причина исключения определенных приборов для ПЦР состояла в наблюдении, что прикладной метод нуждается в тщательной адаптации и оптимизации в том случае, если он проводится на приборе для ПЦР в реальном времени, отличном от того, который изложен а методе. Оставшиеся лаборатории были, кроме того, проверены на выбросы по Груббсу (27]. Однако не было обнаружено ни одного выброса. Подробности совместного испытания лабораторий приведены в таблице С.1.

17

ГОСТ Р 53244—2008

Таблице С.1 — Данные валидации ЗЗв-лромотор-специфического обнаружения ГМО в 1999 г.

Наименование показатопя

Образцы

SA

SB

SC

SO

SE

Число лабораторий, имевших возвратные результаты

11

11

11

11

11

Число образцов на лабораторию

1

1

1

1

1

Число исключенных лабораторий

3

2

3

3

3

Число лабораторий, оставшихся после исключения

8

9

8

6

6

Число принятых образцов

8

9

8

6

в

Ожидаемое значение, Ч ГМО

1.4

1.8

3

0.7

1

Среднее значение. Ч ГМО

1.70

1.89

3.6S

0.86

1.56

Среднее линейное значение. Ч ГМО

1.71

1.90

3.68

0.85

1.49

Стандартное отклонение воспроизводимости ан. % ГМО

0.27

0.53

0.57

0.15

0.36

Относительное стандартное отклонение воспроизводимости. %

16

28

16

17

24

Предел воспроизводимости R [R • 2.8 s*)

0.77

1.48

1.60

0.42

1.06

Кроме того, четырьмя участниками межлабораторных испытаний были проанализированы четыре неизвестных коммерчески доступных образца пищевой продукции, содержавшей от 0.3% до 36% (по массе: средние значения) генетически модифицированной сои линии GTS 40-3-2. Метод, специфический для детектирования конструкции GTS 40-3-2. показал относительное стандартное отклонение воспроизводимости в диапазоне от 23 Ч до 36 % |23|.

С.1.2.3 Молекулярная специфичность

С.1.2.3.1 Общие положения

Метод был разработан для использования в качестве целевой части последовательности, описанной, например. в GenBank*. регистрационный номер АХ033493.

С.1.2.3.2 Теоретическая специфичность

Теоретическая специфичность праймеров и зондов была оценена путем поиска а базах данных GenBenk/EMBL/DDBJ с использованием нуклеотидных последовательностей в качестве запросных последовательностей с помощью программы BLASTN 2.2.3 (24 апреля 2002 г.]. Результат поиска подтвержден полной идентичностью только с ожидаемыми целевыми последовательностями.

С.1.2.3.3 Экспериментальное определение специфичности

Экспериментальная специфичность метода была оценена путем анализа COM IRMM-410 из высушенной соевой муки производства IRMM. содержащей от 0 Ч до 5 Ч сои линии GTS 40-3-2 и стандартного материала фирмы Leatnerhead Food Research Association international — необезжиренной соевой муки (Lot No. 2/99-01). содержащей О Ч. 0.3 Ч. 1.25 Ч и 2 Ч сои линии GTS 40-3-2. соответственно.

Исследованным коммерческим пищевым материалом были соевая мука, белковые иэоляты сои. композитные пищевые продукты, содержащие соевую муку и соевый белок.

С.1.2.4 Оптимизация

Оптимизация была проведена для системы детектирования последовательностей (СДЛ) ABI PRISM 7700* и набора TaqMan* химия.

Расчет праймеров и зондов был проведен с помощью программного обеспечения Primer Express* (Applied Biosystems).

С.1.2.5 Предел детектирования (LOO)

Поскольку метод является количественным. LOD прямо не оценивался. LOO должен быть лучше или равным пределу количественного определения, т. е. 50 геномных копий сои линии GTS 40-3-2 в 82000 геномных копиях обычной соевой муки.

С.1.2.6 Предел количественного определения (LOQ)

Предел количественного определения был определен путем измерения серии разбавлений целевой ДНК. как описано в (23). В соответствии с рекомендациями разработчика метода предел количественного определения составляет 50 геномных копий сои линии GTS 40-3-2 а 82000 геномных копиях обычной соевой муки. Значение 1C

18

ГОСТ Р 53244—2008

см. в [23]. в соответствии с этими ленными оцененный относительный LOQ состееляет 0.06 (» SO колий/82000 копий к 100 %).

Концентрации, исследованные в совместном испытании лабораторий, приведены в таблице С.1.

Примечание — Число копий в совместном испытании лабораторий не определялось.

С.1.3 Адаптация

Специфическая информация отсутствует.

С.1.4 Принцип

Фрагмент последовательности трансгена. использованного для конструирования сои линии GTS 40-3-2. размером 63 о. о., амплифицированный с помощью ПЦР двух праймеров, специфических для гена СТР из Petunia hybnda (RRS-F. см. таблицу С.2) и к 35£-лромотора (RRS-R. см. таблицу С.2). ПЦР-продукты измерялись в ходе каждого цикла ПЦР (в реальном времени) с помощью олигонуклеотидного зонде, специфического для соединения гена СТР и 35S-npOMOTOpa (см. таблицу С.2, RRS-TMP). Этот олигонуклеотидный зонд помечен двумя флуоресцентными красителями — РАМ в качестве репортерного красителя и TAMRA в качестве гасителя. Для этих целей применялся небор TaqMan* химия.

Фрагмент последовательности гена лектина сои размером 81 п. о. был амплифицирован с помощью ПЦР в отдельной реакции ПЦР в реальном времени с использованием двух праймеров, специфических к гену соевого лектина. и продукты ПЦР измерялись в течение каждого цикла ПЦР с применением зондов, специфических к гену соевого лектина производства TaqMan*1 (см. таблицу С.2. Лектин-ТМР).

Количественное определение проводили с использованием метода ддС, или t метода двойной калибровочной кривой (см. С.1.8).

C.1.S Реактивы

C.1.S.1 Общие положения

Для получения информации о качестве используемых реактивов см. ГОСТ Р 53214 (подраздел в.б).

С. 1.5.2 Воде.

С.1.5.3 Буфер для ПЦР (без MgCl2). 10'.

С. 1.5.4 Раствор MgCl,. c(MgCl,) » 25 ммоль/дм*.

С.1.5.5 Раствор дНТФ. с(дНТФ)» 2.5 ммоль/ дм* (каждый).

С.1.5.6 Олигонуклеотиды

Харвтеристики применяемых олигонуклеотидов приведены в таблице С.2.

Таблица С.2 — Олигонуклеотиды

Наименование

ДНК-последовательность олигонуклеотида

Окончательная

олигонуклеотида

концентрация при ПЦР

Целевая последовательность референсного гена

Лектин-F

5-ТСС ACC ССС АТС САС ATT Т-3'

900 нмоль/ДМ3

Лекгин-R

5-ggC АТА gAA ggT дАА дТТ дАА ддА-3-

900 нмоль/дм3

Лектин-ТМР

5-FAM-AAC Сдд ТАд СдТ ТдС САд СТТ Cg-TAMRA-3”*

100 нмоль/дм3

Целевая последовательность ГМО

RRS-F

5-дСС ATg ТТд ТТА ATT ТдТ дСС АТ-3'

900 нмоль/дм3

RRS-R

5-дАА дТТ CAT ТТС ATT Тдд АдА ддА С-3'

900 нмоль/дм3

RRS-TMP

5-FAM-CTT дАА АдА ТСТ дСТ АдА дТС АдС ТТд ТСА gCg-TAMRA-3*

100 нмоль/дм3

* FAM: 6-кврбоксифлуоресцеин. TAMRA: 6-карбокситетраметилродамин.

Длина пектинового ПЦР-лродуктв составляет 81 п. о.; длина ПЦР-продукта RRS составляет 83 п. о. С.1.5.7 Термоствбильнвя ДНК-лолимераза ДНК-полимераза AmpilTaq Cold*.

С.1.5.8 Урвцил-Ы-гликозилаза (необязательно).

С.1.6 Прибор

С.1.6.1 Общие положения

Следует использовать стандартный лабораторный прибор, если не определено иначе.

19

ГОСТ Р 53244—2008

С.1.6.2 Термоциклер

Отмеченный температурно-временной профиль изначально был оттестирован при помощи приборов СДП ABI PRISM* 7700 (Applied Biosysiems) и СДП GeneAmp* 5700 (Applied Bioaystems). Допускается использовать другие системы СДП ПЦР а реальном времени после адаптации реакционных условий.

С.1.6.3 Реакционные пробирки

Реакционные пробирки должны быть подходящими для ПЦР-амплификации в термоциклере, например. ABI PRISM* 96-Well Optical Reacton Plate или МюгоАптр* Optical Caps (восемь крышек/полоска. плоская) (Applied Biosyateme).

Допускается применение других средсте измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования и реактивов с техническими характеристиками не ниже вышеуказанных, если может быть показано. что их применение приводит к тем же результатам.

С.1.6.4 Процедура: порядок проведения ПЦР

Порядок проведения ПЦР для целевой последовательности референсного гена и целевой последовательности ГМО следует проводить а отдельных пробирках. Мультиплексная ПЦР (с использованием различных флуоресцентных меток для зондов) не была протестирована или валидирована.

Метод приведен для суммарного объема реакционной смеси ПЦР 50 мкл с реактивами, приведенными в таблице С.З.

Таблица С.З — Окончательный объем реакционной смеси амплификации/концентрация на одну реакционную пробирку

Целевая последовательность референсного гена

Суммарный объем

50 мкл

Кодирующая нить ДНК (максимальное количество 200 нг)

10 мкл

ДНК-полимераза

AmpliTaq Gold*

1.25 ед.

Деконтаминационная

система

дУТФ

Урацил-АГ-гликоэилаза AmpErase*

400 мкмольГдм3 0.5 ед.

Реакционный буфер

Буфер A TaqMan* (содержащий пассивный стандартный ROX)"

1-

MgCi,

S ммоль/дм*

Праймеры

Лектин-F и Лектин-R (см. таблицу С.2)

См. таблицу С.2

дНТФ

дАТФ.дЦТФ.дГТФ

200 мкмоль/дм* каждого

Зонд

Лектин-ТМР (см. таблицу С.2)

См. таблицу С.2

Целевая последовательность ГМО

Суммарный объем

50 мкл

Кодирующая нить ДНК (максимальное количество 200 нг)

10 мкл

ДНК-полимераза

AmpliTaq Gold*

1.25 ед.

Деконтаминационная

система

дУТФ

Урацил-АГ-гликоэилвзв AmpErase*

400 мкмоль/дм3 0.5 ед.

Реакционный буфер

Буфер A TaqMan* (содержащий пассивный стандартный ROX)"

1-

MflCl,

S ммоль/дм*

Праймеры

RRS-F и RRS-R (см. таблицу С.2)

См. таблицу С.2

дНТФ

дАТФ. дЦТФ. дГТФ

200 мкмоль/дм* каждого

Зонд

RRS-TMP (см. таблицу С.2)

См. таблицу С.2

а ROX — карбокси-Х-родамин

С.1.6.5 Контроли ПЦР

В качестве положительного контроля и стандартного материала для калибровки могут быть использованы сертифицированные стандартные материалы GTS 40-3-2 (материалы, содержащие от 0.1 % до 5 % генетически модифицированной сои), производимые IRMM. Geel. Бельгия (серии IRMM-410) |21].

Следует провести все соответствующие контроли. как зто предусмотрено в ГОСТ Р 53214.

20

ГОСТ Р 53244—2008

С.1.6.6 Температурно-временная программа

Температурно-временная программа, приведенная в таблице С.4. была оптимизирована для СДП ABI PRISM* 7700 (Appbed Btosystema). В исследовании по подтверждению достоверности метода СДП ABI PRISM® 7700 использовался совместно с AmpIlTaq Gold® ДНК-лолимеразой. Использование других термоциклеров может потребовать специальной адаптации. Температура и время, необходимые для активации ^инициации денатурации, зависят от особенностей используемой полимеразы.

Условия реакции приведены в таблице С.4.

Таблица С.4 — Процедуре, условия реакции

Этапы определение

Время, с

Температура. *С

Пред-ЛЦР: деконтаминация

120

50

Пред-ЛЦР: активация ДНК-полимврвзы и денатурация кодирующей нити ДНК

600

95

ПЦР (45 циклов)

Стадия 1

Денатурация

15

95

Стадия 2

Отжиги элонгация

60

60

С.1.7 Ограничения и интерпретация результатов

Поскольку ГМО иные, чем соя линии GTS 40-3-2. они могут содержать часть трансгена, использовавшегося для конструирования сои линии GTS 40-3-2. в частности. 35S-npOMOTOp. СТР-последовательносгь из Petunia hybnda и специфический участок соединения между атими двумя генетическими элементами, метод пригоден для количественного определения ДНК сои линии GTS 40-3-2 в отсутствие других ГМО. как определено выше.

Приведенный метод пригоден дпя измерения соотношения ДНК из сои пинии GTS 40-3-2 и ДНК обычной сои. Это соотношение отражает количество сои линии GTS 40-3-2 в соевом ингредиенте исследуемого пищевого продукта.

Если количество соевого ингредиента а исследуемом пищевом продукте превышает S %. маловероятно, что содержание 1 % сои линии GTS 40-3-2 может быть определено.

Примечание — Если обработка пищевого продукта в ходе его приготовления привела к деградации или уделению ДНК (например, при получении рафинированного соевого мвслв или рафинированных соевых лектинов), описанный метод не дает достоверных результатов.

С.1.8 Калибровка и расчет результатов

После определения порогового значения (например, от 0.01 до 0.1 нормализованной флуоресценции релор-тарного красителя (Rj| система детектирования последовательностей рассчитывает значения С, (число пороговых циклов) для каждой ПЦР (метод лдС,). Рассчитывают различия между значениями С, образцов (дС, о4е>) и стандартных образцов (дСц п). Относительное количество ДНК сои линии GTS 40-3-2 в образце w. %. относительно стандартного материала рассчитывают по формуле

w-2-4*****'лС,х,,сс,.    (С-1)

где сС1 — концентрация стандартного образца.

Альтернативным образом калибровочная кривая рассчитывалась (tog (с) относительно С,| системой детектирования последовательностей на основе стандартов, состоящих из смесей ГМО известных концентраций генетически модифицированной сои линии GTS 40-3-2 (например. 0.1 %; 0.5 %. 1 %; 2 % и 5 %) или стандартов, состоящих из подходящих разбавлений стандартных растворов, полученных из смесей ГМО с определенной концентрацией сои линии GTS 40-3-2 (например. 5 %). — метод двойной калибровочной кривой. Эту калибровочную кривую применяют для определения концентрации сои линии GTS 40-3-2 в неизвестном образце. Поскольку ДНК образца может быть деградироввна вследствие процесса приготовления пищевого продукта или из-за того, что образец может содержать ингредиенты иные, чем соевые бобы, рассчитанная концентрация сои линии GTS 40-3-2 должна быть нормализована в соответствии с количеством вмплифицируемой соевой ДНК. присутствующей в образце. Это количество определяют с помощью ПЦР в реальном времени, специфической для гена соевого лектина, с использованием в качестве стандартной ДНК смесей ДНК определенной концентрации (например. 100 4.50%. 25%. 10% и 1 % по массе) соевой ДНК из серии IRMM 410 или 41 OR. разбавленных подходящей ДНК-носителвм. Для нормализации измеренное количество ДНК сои линии GTS 40-3-2 делится на измеренное количество соевой ДНК.

Для этой альтернативной процедуры для расчета результатов важно, чтобы абсолютное количество кодирующей нити ДНК (нг) было одинаковым для каждой ПЦР. использованной для калибровки.

Другая альтернативная процедура приведена в С.2.

21

ГОСТ Р 53244—2008

С.2 Метод количественного определения содержания сои линии GTS 40-3-2 (специфический для конструкции) с использованием ПЦР в реальном времени (метод 2)

С.2.1 Введение

8 этом приложении приведен метод специфической амплификации и обнаружения таксок-слецифического гене сои (ген лектина. 1е1) и специфического участка генной конструкции — места соединения ДНК 355-промотора вируса мозаики цветной капусты и хлоропластного сигнала Pert/ma hybrids, предшествующего последовательности гене S-еноллирувилшикимвт-З-фосфат-синтазы Agrobacterium (epsps). присутствующего в генетически модифицированной сое линии GTS 40-3-2 (Roundup Ready*) для количественного определения относительного количества ДНК. происходящей из генетически модифицированной сои линии GTS 40-3-2.

Ограничения см. в С.2.8.

С.2.2 Статус подтверждения достоверности и характеристики рабочих параметров

С.2.2.1 Общие положения

Метод был оптимизирован для приборов для ПЦР в реальном времени с использованием сертифициован-ных стандартных материалов (ССМ IRMM-410R) [21). состоящих из высушенной муки соевых бобов, включающих смеси сои линии GTS 40-3-2 и обычной сои.

Воспроизводимость и точность приведенного методе была проверена в ходе совместных испытаний лабораторий с использованием неизвестных образцов, состоявших из упомянутых выше стандартных материалов. Кроме того, были протестированы обработанные стандартные материалы текстурированного растительного белка (ТРБ).

Число копий каждой из целевых последовательностей на геном подробно оценено не было.

С.2.2.2 Совместные испытания лабораторий

Шесть неизвестных образцов, содержавших от 0.1 % до S % (по массе) упомянутых выше сертифицированных стандартных материалов (ССМ IRMM-410R) и ТРБ. содержавшего 2 % (по массе) сои линии GTS 40-3-2, были проанализированы.

-    14 лабораториями, использовавшими СДП A8I PRISM* 7700.

• шестью лабораториями, использовавшими СДП ABI GeneAmp* 5700.

-    12 лабораториями, использовавшими систему LightCyclei* (Roche Diagnostics).

Число участников, как и число образцов, было в соответствии с ГОСТ Р 5725-6.

Система, специфическая для конструкции GTS 40-3-2, дала относительное стандартное отклонение воспроизводимости в диапазоне от 27 % до 44 % при использовании аппаратов СДП ABI PRISM* 7700 и СДП ABI GeneAmp* 5700. соответственно, ив диапазоне от 27 % до 64 % при использовании UghtCycter* (Roche Diagnostics).

Для экстракции ДНК использовалась процедура, описанная в ИСО 21571 (2). раздел А.З.

Для каждого образца параллельно анализировались два экстракта ДНК. Каждый испытательный образец был проанализирован в трех повторностях.

Точность метода, достоверность и предел количественного определения определялись в ходе совместного испытания лабораторий. Данные специфичности, линейности и пределов детектирования и количественного определения были установлены до совместного испытания лабораторий. Содержание ДНК в испытательных образцах охватывало эти величины.

Данные валидации достоверности и точности приведены в таблицах С.5 и С.6.

Таблица C.S — Данные валидации для СДП ABI PRISM* 7700 и СДП ABI GeneAmp* 5700 зв 2000 год

Наименование показателя

Образец 1 0.10% i 0.03%

Образец 2 0.60% i 0.06%

Образец Э 1.0 %i 0.1 %

Образец 4 2.0 % * 0.2 %

Образец S 5.0% t 0.2%

Образец в 2% ТРБ

Число участвовавших лабораторий

19

19

19

19

19

19

Число выбросов*

0

2

1

0

1

0

Число лабораторий, оставшихся после исключения выбросов

19

17

18

19

18

19

Среднее значение. %

0.11

0.49

1,00

2.27

5.11

1.71

Стандартное отклонение повторяемости в*

0,04

0.12

0.21

0.25

0.53

0.48

Относительное стандартное отклонение повторяемости. %

33

24

21

11

10

26

Предел повторяемости г (г* 2.8 а,)

0,10

0.33

0,59

0.71

1.48

1.34

22

ГОСТ Р 53244—2008

Окончание таблицы C.S

Наименование показа/пеля

Образец 1 0.10 4 t 0.03%

Образец 2 0.60 % t 0.06 К

Образец 3 1.0 4* 0.1 4

Образец 4 2.0 4 1 0.24

Образец S 5.0 4* 02 4

Образец 6 2 4 ТРБ

Стандартное отклонение воспроизводимости Sft*

0.05

0.3

0.28

0.71

1.38

0.SS

Относительное стандартное отклонение воспроизводимости. %

44

27

28

32

27

32

Предел воспроизводимости R (Я » 2.8 **)

0.13

0.37

0.77

2.00

3.87

1.54

* Выбросы были идентифицированы с помощью тестов Груббсв и Кохрана \27\.

Таблица С.6 — Данные валидации для системы UghtCycler* за 2000 год

Наименование показателя

Образец 1 0.10 4 * 0.03 4

Образец 2 0.50 4 1 0.06 4

Образец 3 1.0 4* 0.1 4

Образец 4 2.0 4* 0.24

Образец б 5.0 4* 02 4

Образец 6 2 4 ТРБ

Число участвовавших лабораторий

7

7

7

7

7

5

Число выбросов"

1

0

0

0

0

1

Число лабораторий, оставшихся после исключения выбросов

6

7

7

7

7

4

Среднее значение. %

0,13

0.55

0.95

2,01

5.43

1.82

Стандартное отклонение повторяемости а*

0.07

0.23

0.28

0.56

1.10

0.20

Относительное стандартное отклонение повторяемости. %

S5

42

30

28

20

11

Предел повторяемости г(/-*2.8 в,)

0.19

0.66

0.79

1.57

3.07

0.56

Стандартное отклонение воспроизводимости

0.08

0.31

0.34

0.64

1.94

0.50

Относительное стандартное отклонение воспроизводимости. 4

64

55

35

32

36

27

Предел воспроизводимости R (Я • 2.8 »я)

0.22

0.86

0.95

1.79

5.43

1.40

* Выбросы были идентифицированы с помощью тестов Груббсв и Кохрана [27].

Результаты, приведенные в таблице С.6. иллюстрируют вариабельность, наблюдавшуюся для системы LightCycier* (Roche Diagnostics).

С.2.2.3 Молекулярная специфичность

С.2.2.3.1 Общие положения

Метод был разработан для использования в качестве целевой части последовательности, описанной, например. в GenSank* регистрационный номер AYS96946.

С.2.2.3.2 Теоретическая специфичность

Теоретическая специфичность праймеров и зондов была оценена путем поиска в базах данных GenBank/EMBL/DDBJ с использованием нуклеотидных последовательностей в качестве запросных последовательностей с помощью программы BLASTN 2.2.3 (24 апреля 2002 г.). Результат поиска подтвержден полной идентичностью только с ожидаемыми целевыми последовательностями.

23

ГОСТ Р 53244—2008

С.2.2.3.3 Экспериментальное определение специфичности

Были идентифицированы ССМ IRMM-410R из высушенной соевой муки, содержавшей от 0 % до 5 Ч сои линии GTS 40-3-2. Были протестированы такие коммерческие пищевые материалы, как соевая мука и соевые белковые изолвты.

Проведенные перед совместным испытанием лабораторий тесты на специфичность показали отсутствие перекрестной реактивности детекторных систем к следующий нецелевым еидаи/образцаи рису (О/уга saliva). ржи (Sacale cereale). пшенице (Taticum aasiivum), ячменю (Hordeum vulgar»}, просу (Pamcum mibaceum). чечевице (Lens cuflnens). белой фасоли (Pbasaolus vulgaris), фасоли-мвшу (Phaseotus auraus). желтому люпину (Lupinus luteua). те-осинте мексиканскому (Zea mays asp. maxtcana). томату (Lycoperslcon esculentum), картофелю (Solarium tuberosum asp. tuberosum), сорго (Sorghum vulgare). кукурузе (Zee mays), репсу (Brassica napus). овсу (Avana sabva). полбе (Tnbcum spalta). льну (Опит usttatisstmum). гречихе (Fagopyrum esculentum), кунжуту (Sasamum sp ). человеку (Homo sapiens sapiens), лососю (Sa/mo salar). быку (Bos raurus) и Bacillus subMis. Более того, не обнаружено перекрестной реактивности с репсом линии MS8 * RF3 (SeedLmk) или со следующими ГМ-сортвми кукурузы ВП 76.8111. Т25. MON 810. СВН351. DBT418. GA21.

Аллельная стабильность и стабильность числа копий референсного соевого гена была оценена с использованием по крайней мере восьми сортов сои.

С.2.2.4 Оптимизация

Оптимизация концентраций реактивов была проведена для системы детектирования последовательностей (СДЛ) ABI PRISM 7700е и прибора LightCyclei* с использованием набора TaqMan* химия (5]. Никакой дополнительной оптимизации не производили для прибора GeneAmp* 5700. поскольку термоциклер в этом инструменте идентичен термоциклеру в ABI PRISM 7700*.

Расчет праймеров и зондов был проведен с помощью программного обеспечения Primer Express* (Applied Biosyateme).

C.2.2.5 Предел детектирования (LOO)

Предел детектирования в ходе совместного испытания лабораторий не оценивался. Предел детектирования для ЛЦР рассчитывался с помощью измерения серии разбавлений целевой ДНК. В соответствии с указаниями разработчика метода было показано, что LOD составлял пять копий целевой последовательности (определен с помощью плазмид).

С.2.2.6 Предел количественного определения (LOQ)

Предел количественного определения был определен путем измерения серии разбавлений целевой ДНК.

8 соответствии с рекомендациями разработчика методе предел количественного определения составляет по крайней мере 50 геномных копий сои линии GTS 40-3-2. Значение 1C см. в |23].

Концентрации, исследованные в совместном испытании лабораторий, приведены в таблицах С.5 и С.6.

Примечание — Число копий в совместном испытании лабораторий не определялось.

С.2.3 Адаптация

Специфическая информация отсутствует.

С.2.4 Принцип

Фрагмент последовательности, специфической для конструкции сои линии GTS 40-3-2. размером 74 л. о. был амплифицироеан с помощью ПЦР пары праймеров, специфических для сои пинии GTS 40-3-2. ЛЦР-лродукты измерялись в ходе каждого цикла ПЦР (в реальном времени) с помощью олигонуклеотидного зонда, специфического для конструкции сои линии GTS 40-3-2. меченного двумя флуоресцентными красителями — РАМ в качестве репор-терного красителя и TAMRA в качестве гасителя. Для этих целей применялся набор TaqMan* химия.

Фрагмент последовательности таксон-специфичвского гена лектина сои (1е1) размером 74 п. о. был вмппи-фицирован с помощью ЛЦР в отдельной реакции ЛЦР в реальном времени с использованием двух праймеров, специфических к гену соевого лектина /е1. и продукты ПЦР измерялись в течение каждого цикла ПЦР с применением зонда, специфического к гену №1. производства TaqMan*.

Для количественного определения экстрактов ДНК неизвестного исследовательского образца был использован метод калибровочной кривой.

Примечание — Перед количественным ПЦР-анализом растворы экстрагированной ДНК были проанализированы методом качественной ПЦР на приборе ПЦР в реальном времени. Качественный ПЦР-прогон («контрольный прогон») проводился для определения «порогового цикла» (значения Ct) каждого образца, для которого отсутствует экспериментальный опыт. Путем тестирования двух разных разбавлений экстрагированной нуклеиновой кислоты (например, рвзбвелений раствора ДНК 1:10 и 1:40) в ходе контрольного прогона можно обнаружить возможное присутствие ингибиторов вмллификации. Кроме того, можно определить подходящее разбавление экстракте нуклеиновых кислот, полученного из испытательного образца, которое попадает в калибровочный диапазон количественного анализа.

C.2.S Реактивы

С.2.5.1 Общие положения

Для получения информации о качестве используемых реактивов см. ГОСТ Р 53214 (подраздел 6.6).

24

ГОСТ Р 53244—2008

С.2.5.2 Воде.

С.2.5.3 Буфер для ПЦР (без МдС1г). 10'.

С.2.5.4 Раствор MgCl*. e(MgClj) * 25 ммоль/дм*

С.2.5.5 Раствор дНТФ, с(дНТФ) * 2.S ммоль/ дм->.

С.2.5.6 Олигонуклеотиды

Характеристики применяемых олигонуклеотидов приведены в таблице С.7.

Таблица С.7 — Олигонуклеотиды

Наименование

опигонукпеотидоа

ДНК-последовательиость олигонуклеотида

Окончательная концентрация при ПЦР

Целевая последовательность референсного гена

GM1-F

5-ССА gCT ТСд ССд СТТ ССТ ТС-Э'

600 нмоль/дм9

GM1-R

5-Gaa ддС ААд ССС АТС ТдС А Ад СС-3'

600 нмоль/дм9

GMI-зонд

5-FAM-CTT САС СТТ СТА ТдС ССС ТдА CAC-TAMRA-3"*

120 нмоль/дм9

Целевая последовательность ГМО

RR1-F

5-САТ ТТд дАд Адд АСА СдС ТдА-3-

600 нмоль/дм9

RR1-R

5-дАд CCA ТдТ ТдТ ТАА ТТТ дТд СС-3'

600 нмоль/дм9

RRi-зонд

5-FAM-CAA gCT дАС ТСТ ТТС-ТАМРА-З**

125 нмоль/дм9

* FAM: 6-карбоксифлуоресцеин; TAMRA: 6-карбокситетраметилродвмин.

Длина пектинового ПЦР-лродуктв и ЛЦР-продукта сои линии GTS 40-3-2 составляет 74 л. о.

C.2.S.7 Термоствбильная ДНК-лолимераза

НК-лолимераза AmptlTaq Gold*.

С.2.5.3 Урвцил-Ы-гликозилаза (необязательно).

С.2.6 Прибор

С.2.6.1 Общие положения

Следует использовать стандартный лабораторный прибор, если не определено иначе.

С.2.6.2 Термоциклер

Отмеченные температурно-временные профили исходно были оттестированы при помощи приборов СДП A8I PRISM* 7700 или СДП GeneAmp* 5700 (Applied Bioeysteme). или системой LightCycler* (Roche Diagnostics). Допускается использовать другие системы ПЦР в реальном времени, если они могут показать эквивалентные или лучшие результаты.

С.2.6.3 Реакционные пробирки

Реакционные пробирки должны быть подходящими для ПЦР-амллификации в термоциклере, например. ABI PRISM* 96-Well Optical Reaction Plate или MIcroAmp* Optical Cape (восемь крышек/полоскв. плоская) (Applied Biosystenrs) и капилляры LightCycler* (Roche Diagnostics).

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования и реактивов с техническими характеристиками не ниже вышеуказанных, если может быть показано, что их применение приводит к тем же результатам.

С.2.7 Процедура: порядок проведения ПЦР

С.2.7.1 Общие положения

Порядок проведения ПЦР для целевой последовательности референсного гена и целевой последовательности ГМО следует проводить в отдельных пробирках.

Мультиплексная ПЦР (с использованием различных флуоресцентных меток для зондов) не была протестирована или ввлидирована.

Перед «количественным прогоном» проводили прогон ПЦР в реальном времени по крайней мере с двумя разбавлениями ДНК. экстрагированной из испытательных образцов для обеих ПЦР-систем для контроля ампли фи-цируемости. Данные, полученные в ходе этого «контрольного прогона», использовали для контроля качества ДНК (ингибирования). Значения С,, полученные из двух линейных разбавлений, должны быть пропорциональны определенному различию С, (дС,). например, разбавление один к четырем приводит к значению дС,. равному приблизительно 2. Меньшее значение дС, указывает не нелинейную амплификацию, которая может быть вызвана ингибиторами ПЦР. Значение С, неизвестной ДНК. определенное в ходе контрольного прогона, дает также информацию о количестве целевой ДНК. Таким образом, выбирается подходящая концентрация ДНК неизвестного испытательного обрвзца. которая должна находиться в диапазоне стандартной кривой.

25

ГОСТ Р 53244—2008

Метод приведен для суммарного объеме реакционной смеси ПЦР S0 мкл с реективеми. приведенными в таблицах С .в и С.9.

Таблица С.8 — Реакционная смесь амплификации, окончательный объем и концентрации в расчете на одну реакционную пробирку для целевой таксок-спемифической последовательности

Суммарный объем

SO мкл

Добавленная кодирующая нить ДНК (от 1.7 до 108 нг соевой ДНК)

S мкл

ДНК-полимервза

ДНК-полимераэв AmpliTaq Gold*14

1.25 ед.

Деконтаминационнвя

система

ДУТФ

Урвцил-М-гликозилаза

400 мкмоль/ дм> 0.5 ед.

Реакционный буфер

Буфер A TaqMen* (содержащий пассивный стандартный ROX)6

1-

MgCi,

4.5 ммоль'дм3

Праймеры

GM1-F и GM1-R (см. таблицу С.7)

См. таблицу С.7

ДНТФ

дАТФ. дЦТФ.дГТФ

200 мкмопь/дм3 каждого

Зонд

GM1 (см. таблицу С.7)

См. таблицу С.7

Н20 (для молекулярной биологии)

Добавляется до 50 мкл

* В случае использования системы LightCycter* рекомендуется альтернативный буфер и Taq-полимераза, например. Platinum Taq или FastStart Taq в реакционном буфере производителя.

" ROX — кврбокси-Х-родамин.

Таблице С.9 — Реакционная смесь амплификации, окончательный объем и концентрации в расчете на одну реакционную пробирку дпя целевой последовательности ГМО

Суммарный объем

SO мкл

Добавленная кодирующая нить ДНК (от 1.7 до 108 нг соевой ДНК)

S мкл

ДНК-полимервза

ДНК-полимераза AmpltTeq Gold*4

1.25 ед.

Деконтаминационнвя

система

ДУТФ

Урвцил-М-гликозилаэа

400 мкмоль/ дм* 0.5 ед.

Реакционный буфер

Буфер A TaqMan* (содержащий пассивный стандартный ROXf

1-

MflCl.

4.5 ммоль/дм3

Праймеры

RR1-F и RR1-R (см. таблицу С.7)

См. таблицу С.7

ДНТФ

дАТФ. дЦТФ.дГТФ

200 мкмоль/дм3 каждого

Зонд

RR1 (см. таблицу С.7)

См. таблицу С.7

Н20 (для молекулярной биологии)

Добавляется до S0 мкл

*    В случае использования системы LightCycier* рекомендуется альтернативный буфер и Teq-лолимераза. например. Platinum Taq или FastStart Taq в реакционном буфере производителя.

*    ROX — кврбокси-Х-родамин

С.2.7.2 Контроли ПЦР

8 качестве положительного контроля могут быть использованы сертифицированные стандартные материалы генетически модифицированной сои GTS 40-3-2. производимые IRMM. Geel. Бельгия (серии IRMM-410) |2г).

Следует провести все соответствующие контроли. как это описано в ГОСТ Р 53214.

С.2.7.3 Температурно-временная программа

Температурно-временная программа, приведенная в таблице С.10. была оптимизирована для СДП ABI PRISM* 7700 (Applied Вюаув1етз)и системы UghlCycler* (Roche Diagnostics). 8 валидационном исследовании ABI PRISM* 7700 использовался совместно с ДНК-полимеразой AmpliTaq Gold*. Использование других термоциклеров может потребовать специальной адаптации. Время, необходимое для актиавции/иницивции денатурации, зависит от особенностей используемой полимеразы.

Условия ревкции приведены в таблице С.10.

26

ГОСТ Р 53244—2008

Т в б л и ц а С.10 — Процедура: условия реакции

Этапы определения

Время, с

Температура, ‘С

Пред-ПЦР: деконтаминация (необязательно)

120

50

Пред-ПЦР: активация ДНК-лолимвразы и денатурация кодирующей нити ДНК

600

95

ПЦР (45 циклов)

Стадия 1

Денатурация

15*/5в

95

Стадия 2

Отжиг и элонгация

60V2S6

60

в Оптимизировано для A8I PRISM* 7700 (Applied 8iosysteme).

* Оптимизировано для системы LlghtCyder*. Параметры флуоресценции в LightCycler* — ент усиления 4) и единичный сбор данных с программным обеспечением версии 3.

канал 1 (коэффици-

С.2.8 Ограничения и интерпретация результатов

Так как некоторые ГМО. в не только соя линии GTS 40-3-2. могут содержать часть генетической конструкции, использовавшейся для конструирования сои линии GTS 40-3-2. в частности, специфическое соединение между 35£-промотором и СТР-сигнальной последовательностью из Pefuma hybnda. метод пригоден только для количественного определения ДНК сои линии GTS 40-3-2 в отсутствии других ГМО. как определено выше.

Приведенный метод пригоден для измерения соотношения ДНК. специфической для сои линии GTS 40-3-2 и ДНК обычной сои. Это соотношение отражает количество сои линии GTS 40-3-2 в соевом ингредиенте исследуемого пищевого продукта.

Этот метод был валидирован для соевой муки и текстурированного растительного белка.

Примечание — Если соевая ДНК была утрачена или сильно деградирована в ходе обработки пищевого продукта при его приготовлении (например, при получении рафинированного соевого масле) или если соя является только очень минорным компонентом англизируемого образца, количество соевого стандарта и/или ГМ-специфи-ческих копий будет на уровне или ниже предела количественного определения, и описанные методы не будут применимыми.

С.2.9 Калибровка и расчет результатов

Отдельные калибровочные кривые для каждой системы праймер/зонд генерируются в ходе одного и того же аналитического амплификационного пробега. Калибровочные кривые включают четыре разбавления ДНК. экстра-гированной из 5 Ч-ного COM IRMM-410R. 8 каждой из четырех калибровочных точек проводилось дублирующее {СДП ABl PRISM* 7700) и СДП GeneAmp* 5700 или одиночное (система LightCycler*)определение. Тройные реакции с использованием соответствующих разбавлений ДНК. экстрагированной из неизвестного образца, измеряли с помощью инструментов ABI. в то время как единичные определения с использованием двух различных разбавлений экстракта ДНК образца проводились с помощью системы LightCycler*

Калибровочная кривая получается путем построения графика зависимости значений С( от логарифма числе копий целевой последовательности для калибровочных точек. Это может быть осуществлено, например, путем использования программного обеспечения (электронной таблицы), такого как Microsoft Excel, или напрямую с помощью опций, доступных а программном обеспечении системы детектирования последовательностей.

Число копий, измеренное для ДНК неизвестного образца, получается путем интерполяции из стандартных кривых. Для определения количества ДНК сои линии GTS 40-3-2 в неизвестном образце число копий целевой последовательности GTS 40-3-2 делится на число копий гена лектина и умножается на 100, после чего выражается в процентах.

Раздел С.З. не включен (см. предисловие).

С.4 Метод количественного определения содержания ДНК сои линии GTS 40-3-2 (специфический для конструкции) с использованием ПЦР в реальном времени

С.4.1 Введение

В этом приложении приведен метод обнаружения и количественного определения таксон-специфического гена сои (ген лектина. Ге1) и специфического участка ДНК конструкции — места соединения последовательности хлоропластного транзитного пептида Petunia hybnda и гена 5-енолпируеилшикимат-3-фосф8т-синтазы Agrobactanum (epsps). присутствующего в генетически модифицированной (ГМ) сое линии GTS 40-3-2 (соя Roundup Ready*. RRS). Метод основан не ПЦР в реальном времени с использованием плазмиды pMulSL2 в качестве стандартного материала для количественного определения относительного количества GTS 40-3-2 в сое с использованием конверсионного факторе (CQ, представляющего собой отношение числа копий GTS 40-3-2-специфических и таксон-специфических последовательностей ДНК в образце семян истинной сои линии GTS 40-3-2

Примечание — Cf используется для расчета содержания ГМО (мае. %}иэ числа копий ДНК ГМО целевой и твксон-специфической последовательностей. С/ может быть измерен как отношение числа копий для целе

27

ГОСТ Р 53244—2008

вой последовательности и таксон-специфической последовательности из соответствующего стандартного материала.

Ограничения см. в С.4 8.

С.4.2 Статус подтверждения достоверности и характеристики рабочих параметров

С.4.2.1 Общие положения

Этот метод был оптимизирован для приборов СДП ABl PRISM* 7700 ПЦР в реальном времени с использованием плазмиды pMulSL2 в качестве стандартного материала 126). Плазмида pMulSL2 включает, в частности. ПЦР-продукты. амплифицироввнные из систем ПЦР для специфической амплификации таксон-специфической последовательности из соевых бобов (J.01J и последовательности, специфической для конструкции сои линии GTS 40-3-2.

Примечание — Плазмида использовалась в качестве калибровочного вещества для определения содержания ГМО. рассчитанного из относительного числа копий ГМ-специфической и таксон-специфической последовательностей ДНК.

воспроизводимость и точность описанного метода была проверена в ходе совместных испытаний лабораторий с использованием стандартных материалов и неизвестных образцов высушенной муки семян сои. содержавших смеси сои линии GTS 40-3-2 и обычной сои (2d).

Число копий таксон-специфической последовательности (Let) в расчете на геном оценивалось для 10 представительных разновидностей сои.

Метод был опубликован в японском и корейском национальных стандартах (30). (31). (32). (33|.

С.4.2.2 Совместные испытания лабораторий

Шесть пар неизвестных образцов сои. содержввшихот 0 % до 10 % (по массе) высушенной соевой муки, полученной из сои линии GTS 40-3-2, были проанализированы пятнадцатью участниками.

Примечание — Для валидации были приготовлены неизвестные образцы смесей соевой мухи, которые содержали 0 %. 0.1 4.0.5%. 1.5 % и 10% (по массе) сухой соевой муки, полученной из сои линии GTS 40-3-2. Гомогенность образцов на каждом уровне была протестирована с использованием количественного метода в соответствии с протоколом АОАС (34).

валидация метода для GTS 40-3-2 была проведена путем совместного испытания лабораторий а соответствии с протоколом АОАС (29). |34). Совместное испытание лабораторий было организовано Национальным институтом исследования продуктов питания (NFRl, Tsukuba. Япония) совместно с Центром маркировки качества пищевых продуктов и услуг потребителям. Saltama. Япония, и Национальным институтом здравоохранения (National Institute of Health Sciences), Япония. 1S участников из Японии. Республики Корея и Соединенных Штатов Америки проводили зто совместное испытание с использованием СДП ABl PRISM* 7700 (Applied Blosystema) в две отдельные стадии. От всех участников требовалось следовать процедурам экстракции ДНК и количественной ПЦР. Первая стадия имела своей целью определение Cf для GTS 40-3-2. все участники получили набор праймеров, зондов. стандвртный материал и ДНК. экстрагированную из семян сои линии GTS 40-3-2. которые были приготовлены Oiegen DNA Easy Plant Maxlkil. Эта ДНК использовалась для измерения числа копий в каждой специфической для конструкции и таксон-специфической для сои последовательности ДНК. все измерения на этой стадии были повторены три раза. От участников было получено всего 135 данных. Корреляции калибровочных кривых, к которым были приложены данные от всех участников, были приемлемыми (г >0,990). в соответствии с протоколом АОАС [34|. лаборатории, чьи данные были признаны «выбросами», должны быть удалены как имеющие экстремальные значения (тест Кохрана, р < 0.025) и экстремальный средний уровень (тест Груббса. р < 0,025). Ни одного «выброса» не наблюдалось, как это показано в таблице C.f f.

Таблица C.ff — Сводные данные С(

Целевая последовательность

Последовательность, специфическая для конструкции GTS 40-3-2

Число участвовавших лабораторий

15

Число еыбоосов по тесту Кохоанв

0

Число выбросов по тесту Груббса

0

Число оставшихся лабораторий

15

Cf

0.951 0.02

" выражено как среднее значение t доверительный интервал (и * 0,05).

Значение С( может быть повторно определено исследоветелями с использованием подходящих стандартных материалов сои линии GTS 40-3-2.

28

ГОСТ Р 53244—2008

На второй стадии были проведены «слепые» анализы. Неизвестные образцы соевой муки были приготовлены как шесть пвр «слепых» дубликатов, которые содержали 04.0.1 4,0.5 4.1 4.54 и 10 4 (по массе) высушенной муки ГМ-сои линии GTS 40-3-2 в смеси с обычной соевой мукой. Образец, не содержавший сои пинии GTS 40-3-2 (О Ч). был использован как «пустой» образец, чтобы отсеять неработоспособные лаборатории перед статистическим анализом. Участники были проинструктированы экстрагировать ДНК из обрвзцов с использованием набора Otagen. Данные, представленные лабораториями, оставшимися в испытаниях после тестов на выбросы, были использованы для расчета среднего значения и доверительного интервала (« * 0.05). Средние значения были определены как С/для расчета количества ГМО (Ч) в ходе «слепого» анализа. Среднее значение С/для количественного определения последовательности, специфической для конструкции GTS 40-3-2. составляло 0.35.

13 лабораторий, участвовавших во второй стадии, проанализировали 156 образцов путем емплификации Le1 и последовательности, специфической для конструкции. Лаборатории, которые не смогли определить, что «пустые» образцы содержвг 0 4 сои пинии GTS 40-3-2. были расценены как неработоспособные, и все их данные были исключены еще до тестов на выбросы. Во всех экспериментах корреляции калибровочных кривых были приемлемыми <г> 0.990). Лаборатории, показавшие экстремальные отклонения и экстремальные средние значения данных в ларах «слепых» дубликатов с разными уровнями GTS 40-3-2. были исключены из испытания как выбросы по Кохрану [35] и по Груббсу [36]. соответственно, еще перед статистическим анализом достоверности и точности. 8 полученных данных не обнаружено выбросов ни по Кохрвну. ни по Груббсу. Рассчитанное среднее значение содержания ГМО. отклонение, относительное стандартное отклонение повторяемости (4) и относительное стандартное отклонение воспроизводимости (4) для каждого уровня ГМО а смеси приведены в таблице С. 12.

Примечание — Участники совместных испытаний не рассчитывали окончательные результаты с использованием значения С/, определенного в ходе первой стадии совместного испытания. Число копий для каждой целевой последовательности, полученное при определении величины С/ и проведении «слепых» анализов, было передано в NFRI. и содержание ГМО (4) а «слепых» испытательных образцах было преобразовано в окончательные результаты с использованием значения С(.

Таблица С. 12— Данные валидации для количественного определения последовательности, специфической для конструкции GTS 40-3-2

Наименование ooxaiamon*

Доля ГМ-сои линии GTS 40-3-2 а смеси. %

0.1

0.5

1

5

10

Число участвовавших лабораторий

13

13

13

13

13

Число неработоспособных лабораторий

1

1

1

1

1

Число выбросов по Кохрвну

0

0

0

0

0

Число выбросов по Груббсу

1

0

0

0

0

Число лабораторий, оставшихся после исключения

11

12

12

12

12

Среднее значение содержания ГМО. 4

0.1

0.6

1.2

5.8

11.7

Отклонение от истинного значения. 4

♦8.1

• 14.3

♦ 16.1

♦ 15.1

• 17.2

Стандартное отклонение повторяемости а,*

0.015

0.068

0.129

0.435

0.993

Предел повторяемости г* (/•■ 2.6 а,}

0.041

0.191

0.362

1.219

2.779

Относительное стандартное отклонение повторяемости. 4 *

13.4

12.0

11.2

7.6

6.S

Стандартное отклонение воспроизводимости в**

0.015

0.091

0.161

0.660

1,246

Предел воспроизводимости Я* (ft ■ 2.8 е«)

0.041

0.255

0.451

1.849

3.489

Относительное стандартное отклонение воспроизводимости. 4 ь

13.4

15.9

13.9

11.5

10.6

Ниже 20 копий4 (абсолютный предел детектирования этого метода)

4/22

0/24

0/24

0/24

0/24

4 выражается в 4 ГМО.

* Выражается как процент от среднего значения.

с Ниже 20 копий выражается как отношение числа оставшихся данных ниже 20 копий к суммарному числу оставшихся данных.

29

ГОСТ Р 53244—2008

С.4.2.3 Молекулярная специфичность

С.4.2.3.1 Общие положения

Этот метод был приведен е [2в]. Информация о генетической конструкции, встроенной в геном сои. доступна в [2d] и [25]. Последовательности ДНК для разработки этого метода могут быть получены, например, в DD8J. регистрационный номер базы данных Х04879. в отчете [37] и в патенте Соединенных Штатов Америки, номер 5633435.

Если ДНК-конструкция. встроенная в GTS 40-3-2. использована в других ГМ-собыгиях. может быть получен ложноположительный результат, поскольку вмплифицируемая последовательность происходит из этой конструкции.

С.4.2.3.2 Теоретическая специфичность

Теоретическая специфичность праймеров и зондов была оценена путем поиска а базах данных 008J |3 декабря 1999 г.) и документация по оценке безопасности была опубликована Министерством здоровья, труда и благополучия (Япония) и Министерством сельского хозяйства, лесного хозяйства и рыболовства (Япония) с использованием нуклеотидных последовательностей в качестве запросных последовательностей с помощью программы BLASTN 2.2.3. Результат поиска подтвержден полной идентичностью только с ожидаемой целевой последовательностью.

С.4.2.3.3 Экспериментальное определение специфичности

Амплификация с праймерами и зондами, приводящая к получению ожидаемых ПЦР-продуктов при исследовании с образцами высушенной соевой муки, содержащей от 0 % до 1014 (по массе) ГМ сои линии GTS 40-3-2. которые были приготовлены для этого метода NFRI [2d]. [29].

Проведенные перед совместным испытанием лабораторий тесты на специфичность показали отсутствие перекрестной реактивности детекторной системы со следующими нецелевыми видамигобразцвми — рисом (Огугв aativa), пшеницей (Тписит aesuvum] и ячменем [Hordaum vutgare). Не наблюдали перекрестной реактивности со следующими линиями ГМ-кукурузы — MON 810, Event176. 8111. GA21 и Т25.

С.4.2.4 Оптимизация

Оптимизация реактивов была проведена для СДП A8I PRISM 7700* с использованием набора ТадМап* химия (3d).

Расчет праймеров и зондов был проведен с помощью программного обеспечения Primer Express* (Applied Biosysiems).

C.4.2.5 Предел детектирования (LOO)

Абсолютный предел детектирования в соответствии с указаниями разработчика метода — 20 копий плазмид стандартного материала [2d].

Относительный LOO. валидированный в ходе совместного испытания лабораторий. — 0.1 % сои линии GTS 40-3-2.

С.4.2.6 Предел количественного определения (LOQ)

Абсолютный LOG в соответствии с указаниями разработчика метода — 20 копий плазмид стандартного материала.

Относительный LOO. валидированный в ходе совместного испытания лабораторий. — 0.1 % сои линии GTS 40-3-2.

С.4.3 Адаптация

Специфическая информация отсутствует.

С.4.4 Принцип

Фрагмент последовательности, специфической для конструкции сои линии GTS 40-3-2, размером 121 п. о. амплифицировали с помощью ПЦР пары праймеров, специфических для GTS 40-3-2. ПЦР-лродукты измерялись в ходе каждого цикла ПЦР (в реальном времени) с помощью олигонуклеотидного зонда, специфического для конструкции GTS 40-3-2. меченного двумя флуоресцентными красителями — РАМ в качестве репортерного красителя и TAMRA в качестве гасителя. Для этих целей применялся набор ТадМап* химия.

Фрагмент последовательности твксон-специфического гена лектина сои (£.е1) размером 118 п. о. был вмппи-фицироавн с помощью ПЦР в отдельной реакции ПЦР в реальном времени с использованием двух праймеров, специфических к гену £.е1. и продукты ПЦР измерялись в течение каждого цикла ПЦР с применением зонда, специфического к гену lei. производства TaqMan*.

Для количественного определения числа копий в экстрагированной ДНК из экстрактов ДНК неизвестного испытательного образца был использован метод калибровочной кривой. Отдельные калибровочные кривые с каждой системой првймвр/зонд генерировались в ходе одного и того же прогона аналитической амплификации. Калибровочные кривые составляли из пяти концентраций, включая 20. 125. 1500. 20000. 250000 копий ДНК плазмиды pMulSL2. В каждой из пяти калибровочных точек проводились трехкратные измерения. Тройные реакции с использованием соответствующих разбавлений ДНК. экстрагированной из неизвестного образца, проводились на ABI PRISM® 7700 SOS (Applied Biosystems) в том же самом аналитическом прогоне.

График зависимости значений С, («порогового цикла»), определенных для калибровочных точек в специфической для tel или целевой последовательности конструкции GTS 40-3-2. соответственно, от логарифма числа копий ДНК плазмиды pMulSL2 [2d], использовали для построения калибровочной кривой. Число копий, определенное

30

ГОСТ Р 53244—2008

для ДНК испытательного образца, получается путем интерполяции из стандартных кривых. Для определения количества (в процентах) GTS 40-3-2 в испытательном образце число копий конструкции GTS 40-3-2 делится на число копий гена Le1 и значений С,. специфическую для конструкции GTS 40-3-2, умноженную на 100. как описано а разделе С.4.9.

С.4.5 Реактивы

C.4.S.1 Общие положения

Для получения информации о качестве реактивов, которые могут использоваться, см. ГОСТ Р 53214 (подрез-дел 6.6).

С.4.5.2 Вода.

C.4.S.3 ТадМапФ Universal Master Mix. 2\

С.4,5.4 Стандартный материал (плазмида).

Стандартным материалом, использовавшимся для разработки и валидации метода, служила плазмида pMulSL2 (26). которая включена в набор плазмид для обнаружения ГМ сои (RRS. Fasmac Ne PS-2 и Nippon Gene N9 310-04961)

C.4.S.5 Олигонуклеотиды

Последовательности праймеров и зондов, специфических для конструкции и таксон-специфических генов сои линии GTS 40-3-2, приведены в таблице С. 13.

Таблица С. 13—Олигонуклеотиды

Наименование

олигонуклеотида

ДНК-лоследоеательиость олигонуклеотида

Окончательная концентрация при ПЦР

Целевая последовательность таксон-специфического гене

te1n02-S-

S'-gCC СТС ТАС ТСС ACC ССС А-3'

500 нмоль/ДМ*

Се1п02-Э'

S'-gCC CAT CTg САА gCC ТТТ ТТ-3'

500 НМОЛЫДМ*

Le1-Taq

5'-FAM-AgC ТТС gCC gCT ТСС ТТС AAC ТТС AC-TAMRA-3*

200 нмоль/дм*

Целевая последовательность ГМО

RRS 01-5'

S -CCT ТТА ggA ТТТ CAg CAT САд Тдд-31

500 нмоль/дм*

RRS 01-3'

5'-дАС ТТд ТСд ССд ддА АТд-3'

500 нмоль/дм*

RRS-Taq

S'-FAM- СдС ААС СдС ССд САА АТС C-TAMRA-3"

200 нмоль/дм*

* FAM; 6-кврбоксифлуоресцеин: TAMRA: 6-кербокситетраметилродамин.

Длина пектинового ПЦР-продукта составляет 118 п. о.: длина ПЦР-лродукта GTS 40-3-2 составляет 121 п. о.

С.4.6 Прибор

С.4.6.1 Общие положения

Следует использовать стандартный лабораторный прибор, если не определено иначе.

С.4.6.2 Термоциклер

Отмеченный температурно-временной профиль исходно был оттестирован в ходе совместного испытания лабораторий с прибором СДП ABI PRISM* 7700 (Applied Biosysteme). Допускается использовать другие системы ПЦР в реальном времени после адаптации условий реакции.

С.4.6.3 Реакционные плашка и микропробирки

Реакционные плашка и микропробирки должны быть подходящими для ПЦР-амплификации в термоциклере, например. ABI PRISM* 96-Well Optical Reaction Plate или Micro Amp® Optical Caps (восемь крышек/полоска. плоская) (Applied Biosysteme). соответственно.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, в также оборудования и реактивов с техническими характеристиками не ниже вышеуказанных, если может быть показано. что их применение приводит к тем же результатам.

С.4.7 Процедура: порядок проведения ПЦР

С.4.7.1 Общие положения

ПЦР для целевой последовательности таксон-специфического гена tel и для специфической целевой последовательности линии GTS 40-3-2 следует проводить в отдельных пробирках. Мультиплексная ПЦР (с использованием различных флуоресцентных меток для зондов) не была протестирована или ввлидироввнв.

Метод приведен для суммарного объема реакционной смеси ПЦР 25 мкл с реактивами, приведенными в таблицах С.14 для Le1 и С.15 для GTS 40-3-2.

31

ГОСТ Р 53244—2008

Таблице С М — Реакционная смесь амплификации в окончательном объеме на одну реакционную пробирку для целевой твксон-специфической последовательности Lei

Суммарный объем реакции

25 мкл

Кодирующая нить ДНК (50 нг геномной ДНК сои)

2.5 мкл

Реакционный буфер (включая ДНК-лолимврвзу и ДНТФ)

TeqMan£ Universal PCR Master Mix (ABI)

12.5 мкл

Праймеры

1е1п02-5'и Letn02-3'(CM. таблицу С. 13)

См. таблицу С.13

Зонд

Le1-Taq(см.таблицу С.13)

См. таблицу С.13

Таблица С.15 — Реакционная смесь амплификации для специфической последовательности GTS 40-3-2 в окончательном объеме е расчете не одну реакционную пробирку

Суммарный реакционный объем

25 мкл

Кодирующая нить ДНК (50 нг геномной ДНК сои)

2.5 мкл

Реакционный буфер (включая ДНК полимеразу и дНТФ)

Универсальная смесь для ПЦР Universal Master Mix (ABI) TaqMan*

12.5 мкл

Праймеры

RRS 01-5' и RRS 01-3a (см. таблицу C.13)

См.таблицу С.13

Зонд

RRS-Taq (см. таблицу C.13)

См. таблицу С.13

С.4.7.2 Контроли ПЦР

Каждая серия испытаний должна включать асе контроли. как это определено в ГОСТ Р 53214.

Если контроли не дадут ожидаемых результатов, результаты испытаний должны быть забракованы, и анализ должен быть повторен.

8 качестве положительного контроля/ствндвртного калибровочного материала доступны по крайней мере две альтернативы, а именно:

• высококачественная чистая геномная ДНК. экстрагированная из соевых бобов, может быть использована, если количество ДНК известно на основе расчета числа копий целевой последовательности, исходя из размера генома сои;

Ь) плазмида, содержащая целевую (ые)последовательность(и). может быть добавлена в различных концентрациях с известным числом копий. Твквя плазмида доступнв в наборе GM Soybean (RRS) Detection Plasmid Set (Fasmac No. PS-2 and Nippon Gene No. 310-04981 (28].

8 соответствии с требованиями обеспечения качества положительные контроли предпочтительно не должны быть теми же самыми, что и стандартные калибровочные материалы.

С.4.7.3 Температурно-временная программе

Температурно-временная программа, приведенная в таблице С.16. была оптимизирована для СДП ABI PRISM® 7700 (Applied Biosyetems). 8 валидационном исследовании он использовался совместно с универсальной смесью для ПЦР Universal Master Mix (A8I) ТадМап®. Использование других термоциклеров может потребовать специальной адаптации, время, необходимое для активации/инициации денатурации, зависит от особенностей используемой смеси Master Mix.

Таблица С.16 — Процедура, условия реакции

Этапы определения

Время. с

Температура. "С

Пред-ПЦР: деконтаминация

120

50

Лред-ПЦР: активация ДНК-лолимераэы и денатурация кодирующей нити ДНК

600

95

ПЦР (45 циклов)

Стадия 1

Денатурация

1530

95

Стадия 2

Отжиг и элонгация

60

59

32

ГОСТ Р 53244—2008

С.4.8 Ограничения и интерпретация результатов

Так как резные линии ГМ-сои. а не только соя линии GTS 40-3-2. могут содержать ту же самую специфическую для конструкции последовательность ДНК. метод пригоден только для количественного определения ДНК сои линии GTS 40-3-2 в отсутствие ГМО иных, чем соя линии GTS 40-3-2.

Приведенный метод пригоден только для количественного определения сои линии GTS 40-3-2 а отсутствие других ГМ-событий, содержащихся в этой конструкции. Это соотношение отражает количество сои линии GTS 40-3-2 в исследуемом образце сои. Этот метод был валидироаан только для сои.

Совместное испытание лабораторий является значимым источником данных для обеспечения оценки погрешности. Твкже необходимо идентифицировать любые источники погрешностей, которые не охватываются меж-лабораторными испытаниями, такими как отбор проб и др.. а соответствии с основными международными договоренностями [39]. [40].

С.4.9 Калибровка и расчет результатов

Исследователем должно быть определено пороговое значение для определения порогового цикла (С,). Пример процедуры после ПЦР-аналиэа можно найти а руководстве производителя к стандартным материалам ГМ-сои (GM Soybean (RRS) Detection Plasmid Set (Faemac No. PS-2 и Nippon Gene No. 310-04981]. См. также [28].

Конверсионный фактор (Cf) для количественного определения конструкции, специфической для сои линии GTS 40-3-2 и референсной плазмиды, использовавшихся в совместном испытании лабораторий, равен 0.95. Расчет количества RRS в образце сои w. %. проводят по формуле

Нем

100

«гх

Cf

(С. 2)

где Nqm — число копий ГМ-специфической целевой последовательности ДНК испытательного образца:

Nrx— число копий таксон-спеиифической целевой последовательности ДНК испытательного образца.

C.S Метод количественного определения содержания ДНК кукурузы линии MON 810 (специфический для конструкции) с использованием ПЦР в реальном времени

С.5.1 введение

В этом приложении приведен метод обнаружения и количественного определения таксон-специфического гена кукурузы (ген синтазы крахмала кукурузы, lib: zSSIIb) и специфического участка ДНК-конструкции — места соединения последовательности интрона гена белка теплового шока 70 (ВТШ70) кукурузы и синтетического гена c/ytAfp). происходящего из BacMus thuringiensis. присутствующего в генетически модифицированной (ГМ) кукурузе линии MON 810. на основе ПЦР в реальном времени с использованием плазмиды в качестве стандартного материала для количественного определения количества MON 810 с применением конверсионного фактора (С/), представляющего собой отношение числа копий, специфических для конструкции и таксон-специфических последовательностей ДНК в репрезентативном образце семян истинной кукурузы линии MON 810.

Примечание — Cf используется для расчета содержания ГМО (мае. %) из числа копий ДНК ГМО целевой и таксон-специфической последовательностей. Cf может быть измерен как отношение числа копий для целевой последовательности и таксон-специфической последовательности из соответствующего стандартного материале.

Ограничения см. в С.5.8.

С.5.2 Статус подтверждения достоверности и характеристики рабочих параметров

C.S.2.1 Общие положения

Этот метод был оптимизирован для приборов СДП ABl PRISM* 7700 ПЦР в реальном времени с использованием плазмиды рМЫ5 в качестве стандартного материала ]28]. Плазмида рМи!5 включает, в частности. ПЦР-продукты. амплифицированные из систем ПЦР для специфической амплификации таксон-специфической последовательности из кукурузы (2$Sllb). последовательности ЗБв-промоторв вируса мозаики цветной капусты (p35S), терминаторной последовательности нопвлин-синтвзы (tNOS) и последовательности, специфической для конструкций MON 810. EvenM 76. BM1.GA21 и Т25.

Примечание — Плазмида использовалась в качестве калибровочного материала для определения содержания ГМО. рассчитанного из относительного числа копий ГМ-специфической и таксон-специфической последовательностей ДНК.

Воспроизводимость и точность описанного метода была проверена в ходе совместных испытаний лабораторий с использованием стандартных материалов и неизвестных образцов высушенной муки семян кукурузы, содержавших смеси зерен линии MON 810 и обычной кукурузы |29].

Число копий таксон-специфической последовательности (2SS/J&) в расчете на геном оценивалось для двадцати представительных разновидностей кукурузы.

Метод был опубликован в японском и корейском национальных стандартах [30]. |3Г|. (32). [33].

33

ГОСТ Р 53244—2008

C.S.2.2 Совместные испытания лабораторий

Всего двенадцать неизвестных образцов кукурузы, содержавших от 0 % до 10 % (по мессе) высушенной кукурузной муки, полученной из кукурузы линии MON 810. были проанализированы пятнадцатью участниками.

Примечание — Для определения значений Cf и приготовления неизвестных образцов для совместного испытания лабораторий были использованы Семене образца линии MON 810. гетерозиготной по ГМ-вставке. Для валидации были приготовлены неизвестные образцы смесей кукурузной муки, которые содержали 0 V 0.1 %. 0.5 V 1 V 5 Ч и 10 % (по массе) сухой кукурузной муки, полученной из этой линии. Гомогенность образцов на каждом уровне была протестирована с использованием количественного метода в соответствии с протоколом АОАС (29]. [34].

валидация метода для кукурузы линии MON 810 была проведена путем совместного испытания лабораторий в соответствии с протоколом АОАС [34]. Совместное испытание лабораторий было организовано Национальным Институтом исследования продуктов питания (NFRl. Tsukuba. Япония) совместно с Центром маркировки качества пищевых продуктов и услуг потребителям. Саитвмв (Saitama), Япония и Национальным Институтом здравоохранения (National Institute of Health Sciences), Токио. Япония. 15 лабораторий, включая участников из Японии. Республики Корея и Соединенных Штатов Америки, проводили это совместное испытание с использованием СДЛ ABI PRISM* 7700 (Applied Btosystems) в две отдельные стадии. От всех участников требовалось следовать процедурам экстракции ДНК и количественной ПЦР.

Первая стадия имелв своей целью определение С/для MON 810. Все участники получили набор праймеров, зондов, стандартный материал и ДНК. экстрагированную из семян кукурузы линии MON 810. которые были приготовлены из Qiagen DNeasy Plant Maxi kit и чья пригодность былв протестироавнв NFRI перед исследованием. Эти образцы ДНК использовались для измерения числа копий конструкции специфической для MON 810 и таксон-спе-цифической zSSHb последовательности ДНК кукурузы, все измерения на этой стадии были повторены три раза. От участников было получено всего 90 комплектов данных. Корреляции калибровочных кривых, для которых были представлены данные от всех участников, были приемлемыми (г > 0.990). В соответствии с протоколом АОАС [34]. лаборатории, чьи денные были признаны «выбросами*, должны быть удалены как имеющие экстремальные значения (тест Кохрана, р < 0.025) и как имеющие экстремальный средний уровень (тест Груббса. р < 0,025). После обоих тестов однв лаборатория была выявлена как по Кохрану по соотношению конструкции специфической для MON 810 и таксон-специфической последовательности zSSHb. Ни одного выброса не наблюдалось по другим соотношениям. как это показано в таблице С. 17.

Таблице С. 17 — Сводные данные С/для MON 810

Целевая последовательность

Последовательность, специфическая для конструкции MON 810

Число участвовавших лабораторий

15

Число выбросов по тесту Кохрана

1

Число выбросов по тесту Груббса

0

Число оставшихся лабораторий

14

Cf

0.38 X 0.01

“ Выражено как среднее значение х доверительный интервал (и * 0.05).

Величина Cf может быть повторно определена исследователями с использованием подходящих стандартных материалов кукурузы линии MON 8Ю.

На второй стадии были проведены «слепые» анализы. Неизвестные образцы кукурузной муки были приготовлены как шесть пар «слепых* дубликатов, которые содержали 0 4.0.1 %. 0.5 %. 1 %. 5 % и 10% (по массе) высушенной муки ГМ-кукурузы линии MON 810 в смеси с обычной кукурузной мукой. Образец, содержавший 0 % кукурузы линии MON 810. был использован как «пустой» образец, чтобы отсеять неработоспособные лаборатории перед статистическим анализом. Участники были проинструктированы экстрагировать ДНК из образцов с использованием набора Qiagen. Данные, представленные лабораториями, оставшимися в испытаниях после тестов не выбросы. были использованы для расчета среднего значения и доверительного интервала (а ■ 0.05). Средние значения были определены как Cf для расчета количества ГМО(в Ч)в ходе «слепого* анализе. Среднее значение С/для количественного определения последовательности, специфической для конструкции MON 810. составляло 0.38.

14 лабораторий, участвовавших во второй стадии, проанализировали 168 образцов путем амплификации zSSHb и последовательности, специфической для конструкции MON 810. Лаборатории, которые не смогли определить. что «пустые» образцы не содержат кукурузы линии MON 810 (0 %). были расценены как неработоспособные, и

34

ГОСТ Р 53244—2008

все их денные были исключены еще до тестов на выбросы, во всех экспериментах корреляции калибровочных кривых были приемлемыми {г> 0.990). Лаборатории, показавшие экстремальные отклонения и экстремальные средние значения данных в парах «слепых* дубликатов с разными уровнями MON 810. были исключены из испытания, как выбросы по Кохрану и выбросы Груббсу (35). (36). соответственно, еще перед статистическим анализом достоверности и точности. В полученных данных обнаружено пять выбросов по Кохрану и один выброс по Груббсу. Рассчитанное среднее значение содержания ГМО. отклонение, относительное стандартное отклонение повторяемости (%) и относительное стандартное отклонение воспроизводимости (%) для каждого уровня ГМО в смеси приведены в таблице 0.18(29].

Примечание — Участники совместных испытаний не рассчитывали окончательные результаты с использованием значения С/, определенного в ходе первой стадии совместного испытания. Число копий для квждой целевой последовательности, полученное при определении значения Cf и проведении «слепых» анализов, было передано в NFRI и содержание ГМО (%) в «слепых» испытательных образцах было преобразовано в окончательные результаты с использованием значений Cf.

Таблица С. 18— Данные валидации для количественного определения последовательности, специфической для конструкции кукурузы MON 810

Наименование показателя

Доля ГМ-кухуруэы линии MON 810 в смеси. К

0.1

0.5

1

5

10

Число участвовавших лабораторий

14

14

14

14

14

Число неработоспособных лабораторий

0

0

0

0

0

Число выбросов по Кохрану

2

1

0

1

1

Число выбросов Груббсу

1

0

0

0

0

Число лабораторий, оставшихся после исключения

11

13

14

13

13

Среднее значение содержания ГМО. %

0.1

0.5

1.0

4.8

9.8

Отклонение от истинного значения. %

+25.0

+9.4

+4.6

-4.3

-1.8

Стандартное отклонение повторяемости з,“

0.040

0.082

0.124

0.647

1.026

Предел повторяемости г* (/•» 2.6 а,)

0.113

0.231

0.347

1.813

2.679

Относительное стандартное отклонение повторяемости. % ь

13.4

12.0

11.2

7.6

8.5

Стандартное отклонение воспроизводимости $ЛЯ

0.040

0.107

0.158

0.647

1.140

Предел воспроизводимости Я * (ft * 2.8 * s„)

0.113

0.301

0.443

1.813

3.191

Относительное стандартное отклонение воспроизводимости. % 6

32.3

19.6

15.1

13,5

11.6

Ниже 20 копийс (абсолютный предел детектирования этого метода)

19122

0/26

0/28

0/26

0/26

*    Выражается в % ГМО.

*    Выражается как процент от среднего значения.

4 Ниже двадцати копий выражается как отношение числа оставшихся данных ниже 20 копий к суммарному числу оставшихся данных.

C.S.2.3 Молекулярная специфичность

C.S.2.3.1 Общие положения

Этот метод был приведен в [26]. Информация о генетической конструкции, встроенной в геном кукурузы, доступна в (26) и (41). Праймеры и зонды ТадМап® для разработки этого метода были сконструированы с помощью информации. изложенной в ссылке [41].

Если ДНК-кокструкция. встроенная в MON 810. была использована в других ГМ-событиях. может быть получен ложнололожительный результат, поскольку амплифицируемая последовательность происходит из этой конструкции.

35

ГОСТ Р 53244—2008

С.5.2.3.2 Теоретическая специфичность

Теоретическая специфичность праймеров и зондов была оценена путем поиска в базах денных ODBJ (3 декабря 1999 г.), и документация по оценке безопасности была опубликована Министерством здоровья, труда и благополучия (Япония) и Министерством сельского хозяйства, лесного хозяйства и рыболовства (Япония) с использованием нуклеотидных последовательностей в качестве запросных последовательностей с помощью программы BLASTN 2.2.3. Результат поиска подтвержден полной идентичностью только с ожидаемой целевой последовательностью.

С.5.2.3.3 Экспериментальное определение специфичности

Амплификация с праймерами и зондами, приводящая к получению ожидаемых ПЦР-продуктов при исследовании с образцами высушенной кукурузной муки, содержащей от 0 % до 10 % (по массе) ГМ-кукурузы линии MON 810. которые были приготовлены для зтого метода NFRI (28). (29).

Испытанными образцами были зерна кукурузы, кукурузная крупа, кукурузная мука грубого и тонкого помолов

Проведенные перед совместным испытанием лабораторий тесты на специфичность показали отсутствие перекрестной реактивности детекторной системы со следующими нецелевыми видвми/обрвзцвми — рисом [Огуга saDva). пшеницей (Tnticum aasbvum) и ячменем {Hordeum vulgarв). Не наблюдали перекрестной реактивности с ГМ-соей линии GTS 40-3-2 и со следующими линиями ГМ-кукурузы — Event176. Bill. GA21 и Т25.

С.5.2.4 Оптимизация

Оптимизация реактивов была проведена для СДП ABl PRISM 7700* с использованием набора ТадМап* химия (38).

Расчет праймеров и зондов был проведен с помощью программного обеспечения Primer Express* (Applied Biosysteme).

C.S.2.5 Предел детектирования (LOO)

Абсолютный предел детектирования в соответствии с указаниями разработчика метода — 20 копий плазмид стандартного материала (28).

Относительный LOD. валидированный в ходе совместного испытания лабораторий. — 0.5 % кукурузы линии MON 810.

С.5.2.6 Предел количественного определения (LOQ)

Абсолютный LOO в соответствии с указаниями разработчика метода — 20 копий плазмид стандартного материала (28).

Относительный LOQ. валидированный в ходе совместного испытания лабораторий. — 0.5 % кукурузы линии MON 810.

С.5.3 Адаптация

Специфическая информация отсутствует.

С.5.4 Принцип

Фрагмент последовательности, специфической для конструкции кукурузы линии MON 810. размером 113п. о. амплифицироввпи с помощью ПЦР пары праймеров, специфических для MON 810. ПЦР-продукты измерялись в ходе каждого цикла ПЦР (в реальном времени) с помощью олигонуклеотидного зонда, специфического для конструкции MON 810. меченного двумя флуоресцентными красителями — РАМ в качестве репортерного красителя и TAMRA в качестве гасителя. Для зтих целей применялся набор ТвдМвп* химия.

Фрагмент последовательности таксон-специфической последовательности zSSUb размером 151 п. о. был вмплифицирован с помощью ПЦР в отдельной реакции ПЦР в реальном времени с использованием двух праймеров. специфических к 2$Sllb. и продукты ПЦР измерялись в течение каждого цикла ПЦР с применением зонда, специфического к zSSUb. производства TaqMan*.

Для количественного определения числа копий в экстрагированной ДНК из экстрактов ДНК неизвестного испытательного образца был использован метод калибровочной кривой. Отдельные калибровочные кривые с каждой системой праймер/зонд генерировались в ходе одного и того же прогона аналитической амплификации. Калибровочные кривые составляли из пяти концентраций, включая 20.125.1500,20000. 250000 копий ДНК плазмиды рМи15 (28). 8 каждой из пяти калибровочных точек проводились трехкратные измерения. Тройные реакции с использованием соответствующих разбавлений ДНК. экстрагированной из неизвестного образца, проводились на ABl PRISM® 7700 SOS (Applied Biosysteme) в том же самом аналитическом прогоне.

График зависимости значений С, («порогового цикла»), определенных для калибровочных точек в специфической для zSSUb или целевой последовательности конструкции MON 810. соответственно, от логарифма числа копий ДНК плазмиды pMulS [28] испольэоввли для построения калибровочной кривой. Число копий, определенное для ДНК испытательного образца, получается путем интерполяции из стандартных кривых. Для определения количества MON 810 в испытательном образце число копий конструкции MON 610 делится на число копий конструкции zSSUb и значение Cf. специфическое для конструкции MON810, умноженное на 100. как описано в разделе С.5.9.

С.5.5 Реактивы

С.5.5.1 Общие положения

Для получения информации о качестве используемых реактивов см. ГОСТ Р 53214 ( подраздел 6.6).

36

ГОСТ Р 53244—2008

C.S.5.2 Воде.

С.5.5.3 TaqMan€> Universal Master Mix. 2'.

С.5.5.4 Стандартный материал (плазмида).

Стандартным материалом, использовавшимся для разработки и валидации метода служила плазмида рМи15 (23). которая вклечека в набор плазмид для обнаружения ГМ кукурузы (Fasmac № РМ-2 и Nippon Gene Nb 319-04981). Могут быть использованы и другие стандартные материалы, если они могут продемонстрировать такие же или лучшие результаты.

C.S.5.5 Олигонуклеотиды

Последовательности праймеров и зондов, специфических для конструкции линии MON 810 и твксон-специ-фических генов кукурузы, приведены в таблице С. 19.

Таблица С.19—Олигонуклеотиды

Наименование опигонуяпеот t/4a

ДИК-последовательность олигонуклеотида

Окончательная концентрация при ПЦР

Целевая последовательность таксон-специфического гена

SSIlb 1-5'

5-СТС ССА АТС СТТ TgA CAT CTg С-3'

500 нмоль/дм1

SSIlb 1-3'

5-TCg ATT ТСТ СТС TTg gTg АСА gg-3'

500 нмопь/дм3

SSIlb -Taq

5-FAM-AgC AAA gTC AgA gCg CTg CAA TgC A-TAMRA-3*

200 нмоль/дм3

Целевая последовательность ГМО

MON810 2-5'

5- gAT gCC TTC ТСС СТА gTg TTg A-3'

500 нмоль(дм3

MON810 2-3'

5‘- ggA TgC ACT CgT TgA TgT TTg-3'

500 нмоль/дмэ

MON810-Taq

5-FAM- AgA TAC CAA gCg gCC ATg gAC AAC AA-TAMRA-3-

200 нмоль/дмэ

* FAM: 6-карбоксифлуоресцеин: TAMRA: 6-карбокситетраметилродамин.

Длине ПЦР-лродукта SSIlb составляет 151 л. о.: длина ПЦР-продукта MON 810 составляет 113 л. о.

С.5.6 Прибор

C.S.6.1 Общие положения

Следует использовать стандартный лабораторный прибор, если не определено иначе.

C.S.6.2 Термоциклер

Отмеченный температурно-временной профиль исходно был оттестирован в ходе совместного испытания лабораторий с прибором СДП ABI PRISM* 7700 (Applied Biosystems). Допускается использовать другие системы ПЦР в реальном времени после адаптации условий реакции.

С.5.6.3 Реакционные плашка и микропробирки

Реакционные плашка и микропробирки должны быть подходящими для ПЦР-амплификации а термоциклере, например. ABI PRISM* 96-Well Optical Reaction Plate или Micro Amp* Optical Caps (восемь крышек/полоска. плоская) (Applied Blosystems), соответственно. Допускается использование других реакционных плашек, михрофлаконов или микролробирок, если они могут продемонстрировать такие же или лучшие результаты.

Допускается применение друеих средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования и реактивов с техническими характеристиками не ниже вышеуказанных, если может быть показано. что их применение приводит к тем же результатам.

C.S.7 Процедура: порядок проведения ПЦР

C.S.7.1 Общие положения

ПЦР для целевой последовательности таксон-специфического гена zSSllb и для специфической целевой последовательности линии MON 810 следует проводить в отдельных пробирках. Мультиплексная ПЦР (с использованием различных флуоресцентных меток для зондов) не была протестирована или валидирована.

Метод приведен для суммарного объема реакционной смеси ПЦР 25 мкл с реактивами, приведенными е таблицах С.20 для zSSllb и С.21 для MON 810.

37

ГОСТ Р 53244—2008

Таблице С.20 — Реакционная смесь амплификации в окончательном объеме на одну реакционную пробирку для целевой твксон-специфической последовательности 2SSllb

Суммарный объем реакции

25 мкл

Кодирующая нить ДНК (S0 нг геномной ДНК кукурузы)

2.5 мкл

Реакционный буфер (включая ДНК полимеразу и дНТФ)

ТадМвпФ Universal PCR Master Mix (ABI)

12,5 мкл

Праймеры

zSStttb5'и zSSJ/6-3-(см. таблицу C.19)

См. таблицу C.19

Зонд

zSS/16-Taq (см. таблицу C.19)

См.таблицу C. 19

Таблица С.21 — Реакционная смесь амплификации для специфической последовательности MON 810 в окончательном объеме в расчете на одну реакционную пробирку

Суммарный реакционный объем

25 мкл

Кодирующая нить ДНК (50 нг геномной ДНК кукурузы)

2.5 мкл

Реакционный буфер (включая ДНК полимеразу и дНТФ)

Универсальная смесь для ПЦР Universal Master Mix (ABI) TaqMan*

12.5 мкл

Праймеры

MON 810 2-5'and MON 810 2-3'(см. таблицу C.19)

См. таблицу C.19

Зонд

MON 810-Taq (см. таблицу C. 19)

См. таблицу C.19

С.5.7.2 Контроли ПЦР

Каждая серия испытаний должна включать все контроли. как это определено в ГОСТ Р 53214.

Если контроли не дадут ожидаемых результатов, результаты испытаний должны быть забракованы и анализ должен быть повторен.

8 качестве положительного контроля/стандартного калибровочного материала доступны по крайней мере две альтернативы, а именно:

a)    высококачественная чистая геномная ДНК. экстрагированная из зерен кукурузы, может быть использована, если количество ДНК известно на основе расчета числа копий целевой последовательности, исходя из размера генома кукурузы линии MON 810.

b)    плазмида, содержащая целевую последовательность (и) может быть добавлена в различных концентрациях с известным числом копий. Такая плазмида доступна в наборе ОМ Мв&е Detection Plasmid Set (Fasmac No. PS-2 и Nippon Gene No. 310-04981}(28).

8 соответствии с требованиями обеспечения качества положительные контроли предпочтительно не должны быть теми же самыми, что и стандартные калибровочные материалы.

C.S.7.3 Температурно-временная программа

Температурно-временная программа, приведенная в таблице С.22. была оптимизирована для СДП ABI PRISM® 7700 (Applied Btosystems). 8 валидационном исследовании он использовался совместно с универсальной смесью для ПЦР TaqMan® Universal Master Mix. Использование других термоциклеров может потребовать специальной адаптации. Время, необходимое для активации/инициации денатурации, зависит от особенностей используемой смеси Master Mix.

Таблица С.22 — Условия реакции

Этапы определения

Время. с

Температура. "С

Пред-ПЦР: деконтаминация

120

50

Пред-ПЦР: активация ДНК-полимераэы и денатурация кодирующей нити ДНК

600

95

ПЦР (40 циклов)

Стадия 1

Денатурация

30

95

Стадия 2

Отжиг и элонгация

60

59

38

ГОСТ Р 53244—2008

С.5.8 Ограничений и интерпретация результатов

Так как разные линии ГМ-кукурузы.а не только кукуруза линии MON 610. могут содержать ту же самую специфическую для конструкции последовательность ДНК. метод пригоден только для количественного определений ДНК кукурузы линии MON 810 е отсутствие ГМО. иных, чем кукуруза линии MON 810.

Приведенный метод пригоден только для определения соотношения последовательности, специфической для конструкции линии MON 810. и таксон-специфической zSS/to-послвдовагельности кукурузы. Это соотношение отражает количество MON 810 в исследуемом образце кукурузы. Этот метод был валидироевн только для зерен кукурузы.

Совместное испытание лабораторий является значимым источником данных для обеспечения оценки погрешности. Также необходимо идентифицировать любые источники погрешностей, которые не охватываются межлабораторными испытаниями, такие как отбор проб и др.. в соответствии с (39). (40).

С.5.9 Калибровка и расчет результатов

Исследователем должно быть определено пороговое значение для определения порогового цикла (С,). Пример процедуры после ПЦР-внализа можно найти в руководстве производителя к стандартным материалам ГМ-ку-курузы (СМ Maize Detection Plasmid Set (Fasmac No. PS-2 и Nippon Gene No. 319-04981). См. также ссылку (26).

Конверсионный фактор (С/) для количественного определения конструкции, специфической для линии MON 810. и референсной плазмиды, использовавшихся в совместном испытании лабораторий, равен 0.36. Расчет количества ГМ-кукурузы в матриксе образца w. V проводят по формуле

« ^2^.    (С.З)

ы,х а '

где — число копий ГМ-специфической целевой последовательности ДНК испытательного образца:

— число копий таксон-специфической целевой последовательности ДНК испытательного образца.

Разделы С.6. С.7. не включены (см. предисловие).

С.8 Метод количественного определения содержания ДНК кукурузы линии СА21 (специфический для конструкции) с использованием ПЦР в реальном времени

С.8.1 Введение

В этом приложении приведен метод обнаружения и количественного определения таксон-специфического гена кукурузы (ген синтазы крахмала кукурузы. Mb: zSSHb) и специфического участка ДНК-кокструкции — места соединения между оптимизированной последовательностью транзитного пептида и геном 5-енолпируеилшики-мвт-3-фосфат-синтазы (m-epsps) кукурузы, присутствующего в ГМчсукурузе линии GA21. на основе ПЦР в реальном времени с использованием плазмиды в качестве стандартного материала для определения относительного количества GA21 с применением конверсионного фактора (С(). представляющего собой отношение числа копий, специфических для конструкции и таксон-специфических последовательностей ДНК в репрезентативном образце семян истинной кукурузы линии GA21.

Примечание — С/ используется для расчета содержания ГМО (мае. %) из числа копий ДНК ГМО целевой и таксон-специфической последовательностей. С/ может быть измерен как отношение числа копий для целевой последовательности и таксон-специфической последовательности из соответствующего стандартного материале.

Ограничения см. в С.8.8.

С.8.2 Статус подтверждения достоверности и характеристики рабочих параметров

С.8.2.1 Общие положения

Этот метод был оптимизирован для приборов СДП ABI PRISM* 7700 ПЦР в реальном времени с использованием плазмиды рМи!5 в качестве стандартного материала (28). Плазмида pMulS включает, в частности, ПЦР-про-дукты. амллифицированные из систем ПЦР для специфической амплификации таксон-специфической последовательности из кукурузы (zSSPb). последовательности 3SS-промотора вируса мозаики цветной капусты (p35S). терминаторной последовательности нолалик-синтазы (INOS). и последовательности, специфической для конструкций MON 810. Eventl76. Bill. GA21 и Т25.

Примечание — Плазмида использовалась в качестве калибровочного материала для определения содержания ГМО. рассчитанного из относительного числа копий ГМ-специфической и таксон-специфической последовательностей ДНК.

Воспроизводимость и точность описанного метода была проверена в ходе совместных испытаний лабораторий с использованием стандартных материалов и неизвестных образцов высушенной муки семян кукурузы, содержавших смеси зерен линии GA21 и обычной кукурузы (29).

Число копий таксон-специфической последовательности (zSSMb) в расчете на геном оценивалось для 20 представительных разновидностей кукурузы.

Метод был опубликован в японском и корейском национальных стандартах (30). (31). (32). (33).

ГОСТ Р 53244—2008

С.8.2.2 Совместные испытания лабораторий

Всего 12 неизвестных образцов кукурузы, содержавших от 0 4 до 10 Ч (по массе} высушенной кукурузной муки, полученной из кукурузы линии GA21. были проанализированы 13 участниками.

Примечание — Для определения значений Cf и приготовления неизвестных образцов для совместного испытания лабораторий были использованы семена образца линии GA21. гетерозиготной по ГМ-встввке. Для валидации были приготовлены неизвестные образцы смесей кукурузной муки, которые содержали 04.0,1 4.0.5 4.1 Ч. S Ч и 10 Ч (ло массе) сухой кукурузной муки, полученной из атой линии. Гомогенность образцов на каждом уровне была протестирована с использованием количественного метода в соответствии с протоколом АОАС (29). (34).

валидация метода для кукурузы линии GA21 была проведена путем совместного испытания лабораторий в соответствии с протоколом АОАС (34). Совместное испытание лабораторий было организовано Национальным Институтом исследования продуктов питания (NFRl. Tsukuba. Япония) совместно с Центром маркировки качества пищевых продуктов и услуг потребителям. Саитвма (Sattama). Япония и Национальным Институтом здравоохранения (National Institute of Health Sciences), Токио. Япония. 15 лабораторий, включая участников из Японии. Республики Корея и Соединенных Штатов Америки, проводили ото совместное испытание с использованием СДП ABI PRISM* 7700 (Applied Biosystems} в две отдельные стадии. От всех участников требовалось следовать процедурам экстракции ДНК и количественной ПЦР.

Первая стадия имела своей целью определение Cf для GA21 Все участники получили набор праймеров, зондов. стандартный материал и ДНК. экстрагированную из семян кукурузы линии GA21. которые были приготовлены из Oiagen DNeasy Plant Maxi kit. и чья пригодность была протестирована NFRI перед исследованием Эти образцы ДНК использовались для измерения числа копий конструкции специфической для GA21 и твксон-слецифической zSSlIb последовательности ДНК кукурузы. Все измерения на этой стадии были повторены три раза. От участников было получено всего 90 комплектов данных. Корреляции калибровочных кривых, для которых были представлены данные от всех участников, были приемлемыми (г > 0.990). 8 соответствии с протоколом АОАС (34) лаборатории, чьи данные были признаны «выбросами», должны быть удалены как имеющие экстремальные значения (тест Кохрана. р < 0.025) и как имеющие экстремальный средний уровень (тест Груббса. р < 0.025). Ни одного выброса не наблюдалось ни в одном из тестов, как это показано в таблице С.23.

Таблица С.23 — Сводные данные Cf для GA21

Целевая последовательность

Последовательность, специфическая для конструкции GA21

Число участвовавших лабораторий

15

Число выбросов по тесту Кохрана

0

Число выбросов по тесту Груббса

0

Число оставшихся лабораторий

15

СГ

1.40Ю.05

" выражено как среднее значение х доверительный интервал (и * 0,05).

Значение Cf может быть повторно определено исследователями с использованием подходящих стандартных материалов кукурузы линии GA21.

На второй стадии были проведены «слепые» анализы. Неизвестные образцы кукурузной муки были приготовлены как шесть пар «слепых» дубликатов, которые содержали 0 Ч. 0.1 Ч. 0.5 % . 1 Ч. 5 4 и 10 Ч (по массе) высушенной муки ГМ-кукурузы линии GA21 в смеси с обычной кукурузной мукой. Образец, не содержавший кукурузы линии GA21 (0 Ч). был использован как «пустой» образец, чтобы отсеять неработоспособные лаборатории перед статистическим анализом. Участники были проинструктированы экстрагировать ДНК из образцов с использованием набора Qiagen. Данные. представленные лабораториями, оставшимися в испытаниях после тестов на выбросы, были использованы для расчета среднего значения и доверительного интервала (а * 0.05). Средние значения были определены как С/ для расчета количества ГМО (Ч) в ходе «слепого» анализа. Среднее значение Cf для количественного определения последовательности, специфической для конструкции GA21. составляло 1.40.

14 лабораторий, участвовавших во второй стадии, проанализировали 166 образцов путем амплификации zSSlIb и последовательности, специфической для конструкции GA21. Лаборатории, которые не смогли определить пустые образцы с содержанием кукурузы линии GA21 О Ч. были расценены как неработоспособные, и асе их данные были исключены еще до тестов на выбросы. Во всех экспериментах корреляции калибровочных кривых были приемлемыми (/•> 0.990). Лаборатории, показавшие экстремальные отклонения и экстремальные средние значения данных а парах «слепых» дубликатов с разными уровнями GA21. были исключены из испытания как выбросы по Кохрану и по Груббсу (25). [26]. соответственно, еще перед статистическим анализом достоверности и точности. В

40

ГОСТ Р 53244—2008

полученных денных было обнаружено деа выбросе по Кохрану. Рассчитанное среднее значение содержаний ГМО. отклонение, относительное стандартное отклонение повторяемости (%) и относительное стандартное отклонение воспроизводимости (%) для каждого уровня ГМО в смеси приведены в таблице С.24 (29).

Примечание — Участники совместных испытаний не рассчитывали окончательные результаты с использованием значения Cf. определенного в ходе первого совместного испытания. Число копий для каждой целевой последовательности, полученное при определении значения С( и проведении «слепых* анализов, было передано в NFRI и содержание ГМО в % в «слепых* испытательных образцах было преобразовано в окончательные результаты с использованием значений С(.

Таблица С.24 — Данные валидации для количественного определения последовательности, специфической для конструкции кукурузы GA21

Наименование показателя

Доля ГМ-кукурузы линии GA21 в смеси.%

0.1

0.5

1

5

10

Число участвовавших лабораторий

14

14

14

14

14

Число неработоспособных лабораторий

1

1

1

1

1

Число выбросов по Кохрану

1

0

0

1

0

Число выбросов по Груббсу

0

0

0

0

0

Число лабораторий, оставшихся после исключения

12

13

13

12

13

Среднее значение содержания ГМО. %

0.1

0.5

1.2

5.6

11.5

Отклонение от истинного значения . %

—5,4

♦7.7

♦20.2

*16.6

*15.0

Стандартное отклонение повторяемости а,"

0.019

0.068

0.148

0.476

0.907

Предел повторяемости г* (г » 2.6 а,)

0.054

0.189

0.414

1.332

2.539

Относительное стандартное отклонение повторяемости. % ь

20.5

12.6

12.3

8.2

7.9

Стандартное отклонение воспроизводимости ал*

0.019

0.117

0.224

0.927

1.565

Предел воспроизводимости Я • (Я ■ 2.8 * вн)

0.055

0.329

0.627

2.597

4.382

Относительное стандартное отклонение воспроизводимости. %ь

20.6

21.6

16.6

15.9

13.6

Ниже 20 копий* (абсолютный предел детектирования зтого метода)

4/24

0/26

0/26

0/24

0/26

*    Выражается в % ГМО.

*    Выражается как процент от среднего значения

' Ниже 20 копий выражается как отношение числа оставшихся данных ниже 20 копий к суммарному числу оставшихся данных.

С.8.2.3 Молекулярная специфичность

С.8.2.3.1 Общие положения

Этот метод был приведен в [28]. Информация о генетической конструкции, встроенной в геном кукурузы, доступна в ссылках 128] и (41). Праймеры и зонды TeqMarvS) для разработки зтого метода были сконструированы с помощью информации, описанной в (47).

Если ДНК-конструкция. встроенная в ОА21. была использована в других ГМ-событиях. может быть получен ложнололожительный результат, поскольку амплифицируемая последовательность происходит из атой конструкции.

С.8.2.3.2 Теоретическая специфичность

Теоретическая специфичность праймеров и зондов была оценена путем поиска в базах данных DD8J (3 декабря 1999 г.), и документаций по оценке безопасности была опубликована Министерством здоровья, труда и благополучия (Япония) и Министерством сельского хозяйства, лесного хозяйства и рыболовства (Япония) с использованием нуклеотидных последовательностей в качестве запросных последовательностей с помощью программы BLASTN 2.2.3. Результат поиска подтвержден полной идентичностью только с ожидаемой целевой последовательностью.

41

ГОСТ Р 53244—2008

С.8.2.3.3 Экспериментальное определение специфичности

Амплификация с праймерами и зондами, приводящая к получению ожидаемых ЛЦР-продуктов при исследовании с образцами высушенной кукурузной муки, содержавшей от 0 % до 10 % (по массе) ГМ-кукуруэы линии GA21. которые были приготовлены для этого метода NFRI (28]. [29].

Испытанными образцами были зерна кукурузы, кукурузная крупа, кукурузная мука грубого и тонкого помола.

Проведенные перед совместным испытанием лабораторий тесты на специфичность показали отсутствие перекрестной реактивности детекторной системы со следующими нецелевыми видами/образцами — рисом (Огуга saliva), пшеницей (Triticum aestivum) и ячменем (Hordeum vulgare). Не наблюдали перекрестной реактивности с ГМ-соей линии GTS 40-3-2 и со следующими линиями ГМ-кукурузы — MON 810, Eventl 76. 8t11 и Т25.

С.8.2.4 Оптимизация

Оптимизация реактивов была проведена для СДП ABl PRISM 7700е с использованием набора TaqMan* химия [38].

Расчет праймеров и зондов был проведен с помощью программного обеспечения Primer Express* (Applied Biosystems).

C.8.2.S Предел детектирования (LOO)

Абсолютный предел детектирования в соответствии с указаниями разработчика метода — 20 копий плазмид стандартного материала [28].

Относительный LOO. валидироаанный а ходе совместного испытания лабораторий. — 0.1 % кукурузы линии

GA21.

С.8.2.6 Предел количественного определения (LOO)

Абсолютный LOO в соответствии с указаниями разработчика метода — 20 копий плазмид стандартного материала [28|.

Относительный LOQ. валидироввнный в ходе совместного испытания лабораторий. — 0.1 % кукурузы линии

GA21.

С.8.3 Адаптация

Специфическая информация отсутствует.

С.8.4 Принцип

Фрагмент последовательности, специфической для конструкции кукурузы линии GA21. размером 133 л. о. амплифицировали с помощью ПЦР лары праймеров, специфических для GA21. ПЦР-продукты измерялись в ходе каждого цикла ПЦР (а реальном времени) с помощью олигонуклеотидного зонда, специфического для конструкции GA21. меченного двумя флуоресцентными красителями — РАМ в качестве релортерного красителя и TAMRA е качестве гасителя. Для этих целей применялся набор TaqMan* химия.

Фрагмент последовательности таксон-слецифической последовательности zSSllb размером 151 п. о. был вмплифицироввн с помощью ПЦР в отдельной реакции ПЦР в реальном времени с использованием двух праймеров. специфических к 2$Sllb, и продукты ПЦР измерялись в течение каждого цикла ПЦР с применением зонда, специфического к zSSllb. производства TaqMan*.

Для количественного определения числа копий в экстрагированной ДНК из экстрактов ДНК неизвестного испытательного образца был использован метод калибровочной кривой. Отдельные калибровочные кривые с каждой системой праймер/зонд генерировались в ходе одного и того же прогона аналитической амплификации. Калибровочные кривые составляли из пяти концентраций, включая 20.12S, 1500.20000,250000 копий ДНК плазмиды pMulS. В каждой из пяти калибровочных точек проводились трехкратные измерения. Тройные реакции с использованием соответствующих разбавлений ДНК. экстрагированной из неизвестного образца, проводились на ABl PRISM® 7700 SOS в том же самом аналитическом прогоне.

График зависимости значений С,, определенных для калибровочных точек в специфической для 2$$НЬ или целевой последовательности конструкции GA21. соответственно, от логарифма числа копий ДНК плазмиды рМи!5 [28]. использовали для построения калибровочной кривой. Число копий, определенное для ДНК испытательного образца, получается путем интерполяции из стандартных кривых. Для определения количества GA21 в испытательном образце число копий конструкции GA21 делится на число копий гена zSSllb и значение С/, специфическое для конструкции GA21. умноженное на 100 для получения результата в процентах, как описано в разделе С.8.9.

С.8.5 Реактивы

С.8.5.1 Общие положения

Для получения информации о качестве реактивов, которые могут использоваться, см. ГОСТ Р 53214 (подраздел б. б).

C.8.S.2 вода.

С.8.5.3 TaqMan® Universal Master Mix. 2-.

C.8.S.4 Стандартный материал (плазмида).

Стандартным материалом, использовавшимся для разработки и валидации метода, служила плазмида рМи!5 [28]. которая включена в набор плазмид для обнаружения ГМ кукурузы (Fasmac № РМ-2 и Nippon Gene № 319-04981) [28]. Могут быть использованы и другие стандартные материалы, если они могут продемонстрировать такие же или лучшие результаты.

42

ГОСТ Р 53244—2008

C.8.S.5 Олигонуклеотиды

Последовательности праймеров и зондов для специфических для конструкции линии GA21 и таксон-специ-фических генов кукурузы приведены в таблице С.25.

Таблица С.25 — Олигонуклеотиды

Наименование

олигонуклеотида

ДНК-послеаоеательяость олигонуклеотида

Окончательная концентрация при ПЦР

Целевая последовательность таксон-специфического гена

SSlib 1-5'

б'-СТС ССА АТС СТТ TgA CAT СТд С-3'

500 нмОЛь/ДМэ

SSlib 1-3'

5‘-ТСд ATT ТСТ СТС ТТд дТд АСА дд-3'

500 нмоль/дм11

SSlib-Taq

5-FAM-AgC AAA дТС АдА дСд СТд САА ТдС A-TAMRA-3"

200 нмоль'дм*

Целевая последовательность ГМО

GA21 3-5'

5'-дАА дСС ТСд дСА АСд ТСА-3'

500 нмоль/дм3

GA21 3-3*

5-АТС Сдд ТТд дАА АдС дАС ТТ-3'

500 ныоль/дмэ

GA21-2-Taq

5'-FAM-AAg дАТ ССд дТд CAT ддС Cg-TAMRA-3"

200 нмоль/дм'*

* FAM: б-кврбоксифлуоресцеин; TAMRA: 6-карбокситетрвметилродамин.

Длине ПЦР-продуктв SSlib составляет 1S1 п. о.: длина ПЦР-продуктв GA21 составляет 133 л. о.

С.8.6 Прибор

С.8.6.1 Общие положения

Должен использоваться стандартный лабораторный прибор, если не определено иначе.

С.8.6.2 Термоциклер

Отмеченный температурно-временной профиль исходно был оттестирован в ходе совместного испытания лабораторий с прибором СДЛ ABI PRISM* 7700 (Applied Biosystems). Допускается использовать другие системы ПЦР в реальном времени после адаптации условий реакции.

С.8.6.3 Реакционные плашке и микропробирки

Реакционные плашка и микропробирки должны быть подходящими для ПЦР-амплификации в термоциклере, например. ABI PRISM* 86-Well Optical Reaction Plate или MicroAmp® Optical Caps (восемь крышек/полоска. плоская) (Applied 8iosysteiine}, соответственно. Допускается использовать и другие реакционные плашки, микрофлвконы или микропробирки, если они могут продемонстрировать такие же или лучшие результаты.

Допускается применение других средсте измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования и реектиеое с техническими характеристиками не ниже вышеуказанных, если может быть показано. что их применение приводит к тем же результатам.

С.8.7 Процедуре: порядок проведения ПЦР

С.8.7.1 Общие положения

ПЦР для целевой последовательности таксон-специфического гена zSSUb и для специфической целевой последовательности линии GA21 следует проводить в отдельных пробирках. Мультиплексная ПЦР (с использованием различных флуоресцентных меток для зондов) не была протестирована или валидироввнв.

Метод описан для суммарного объеме реакционной смеси ПЦР 25 мкл с реактивами, приведенными в таблицах С.26 для 2SSIIb и С.27 для GA21.

Таблица С. 26— Реакционная смесь амплификации в окончательном объеме на одну реакционную пробирку для целевой таксон-специфической последовательности zSSUb

Суммарный объем реакции

25 мкл

Кодирующая нить ДНК (50 нг геномной ДНК кукурузы)

2.5 мкл

Реакционный буфер (включая ДНК полимеразу и дНТФ)

TaqMan® Universal PCR Master Mix (ABI)

12,5 мкл

Праймеры

2SSW01-5'h zSSUb 1-3' (см. таблицу C.25)

См. таблицу C.25

Зонд

zSS//b-Taq (см. таблицу C.25)

См. таблицу C.25

43

ГОСТ Р 53244—2008

Таблице С.27 — Реакционная смесь амплификации для специфической последовательности GA21 в окончательном объеме в расчете на одну реакционную пробирку

Суммарный реакционный объем

25 мкл

Кодирующая нить ДНК (50 нг геномной ДНК кукурузы)

2.5 мкл

Реакционный буфер (включая ДНК-полимеразу и дНТФ)

Универсальная смесь для ПЦР Universal Master Mix (ABI) TaqMan*

12.5 мкл

Праймеры

GA21 2-5'and GA21 2-3'(см. таблицу C.25)

См. таблицу С.25

Зонд

GA21-2-Taq (см. таблицу C.25)

См. таблицу С.25

С.8.7.2 Контроли ПЦР

Каждая серия испытаний должна включать все контроли. как это определено в ГОСТ Р S3214.

Если контроли не дадут ожидаемых результатов, результаты испытаний должны быть забракованы и анализ должен быть повторен.

8 качестве положительного конгроля/ствндартного калибровочного материала доступны по крайней мере две альтернативы, а именно:

в) высококачественная чистая геномная ДНК. экстрагированная из зерен кукурузы, может быть использована. если количество ДНК известно на основе расчета числе копий целевой последовательности, исходя из размера генома кукурузы линии GA21:

Ь) плазмида, содержащая целевую(ые) последовательностей). может быть добавлена в различных концентрациях с известным числом копий. Такая плазмида доступна в наборе GM Maize Detection Piaemid Set (Fasmac No. PS-2 и Nippon Gene No. 310-04981) (28).

в соответствии с требованиями обеспечения качестве положительные контроли предпочтительно не должны быть теми же самыми, что и стандартные калибровочные материалы.

С.8.7.3 Температурно-временная программа

Температурно-временная программа, приведенная в таблице С.28. была оптимизирована для СДП ABI PRISM0 7700 (Applied Bioeyetems). 8 валидационном исследовании он использовался совместно с универсальной смесью для ПЦР TaqMan* Universal Master Mix. Использование других термоцикперое может потребовать специальной адаптации. Время, необходимое для активации/иницивции денатурации, зависят от особенностей используемой смеси Master Mix.

Таблица С.28 — Условия реакции

Этапы определения

Время. с

Температура. *С

Пред-ПЦР: деконгаминация

120

50

Пред-ПЦР: активация ДНК-полимеразы и денатурация кодирующей нити ДНК

600

95

ПЦР (40 циклов)

Стадия 1

Денатурация

30

95

Стадия 2

Отжиг и элонгация

60

95

С.8.8 Ограничения и интерпретация результатов

Так как разные линии ГМ-кукурузы. а не только кукуруза линии GA21. могут содержать ту же самую специфическую для конструкции последовательность ДНК. метод пригоден только для количественного определения ДНК кукурузы линии GA21 а отсутствие ГМО. иных, чем кукуруза линии GA21.

Приведенный метод пригоден только для определения соотношения последовательности, специфической для конструкции линии GA21. и таксон-специфической zSSJJP-последоаательности кукурузы. Это соотношение отражает количество GA21 в исследуемом образце кукурузы. Этот метод был валидироаан только для зерен кукурузы.

Совместное испытание лабораторий является значимым источником данных для обеспечения оценки погрешности. Также необходимо идентифицировать любые источники погрешностей, которые не охватывают меж-лабораторные испытания, такие как отбор проб и др.. в соответствии с основными международными договоренностями [39]. [40].

44

ГОСТ Р 53244—2008

С.8.9 Калибровка и расчет результатов

Исследователем должно быть определено пороговое значение для определения порогового цикла {С,). Пример процедуры после ПЦР-анализа можно нейти в руководстве производителя к стандартным материалам ГМ-кукурузы (GM Mai2e Detection Plasmid Set (Fasmac No. PS-2 и Nippon Gene No. 319-04981). См. также [28].

Конверсионный фактор (СО для количественного определения конструкции, специфической для линии GA21. и референсной плазмиды, использовавшихся в совместном испытании лабораторий, равен 1,40.

Расчет количества ГМ-кукурузы, %. в матриксе образца, проводят по формуле

Now

100

Cf

(С.4)

где Wjy, — число копий ГМ-слецифической целевой последовательности ДНК испытательного образца;

NJX — число копий твксон-специфической целевой последовательности ДНК испытательного образца.

С.9 Метод количественного определения содержания ДНК кукурузы линии Т25 (специфический для конструкции) с использованием ПЦР в реальном времени

С.9.1 Введение

В атом приложении приведен метод обнаружения и количественного определения твксон-специфического гена кукурузы (ген синтазы крахмале кукурузы, lib: 2SSII0) и специфического участка ДНК-конструкции — места соединения между последовательностью промотора вируса мозаики цветной капусты и синтетическим геном фосфи-нотрицикацетилтрансфервзы (paf). происходящего из Streptomycea virtdochromogenea и присутствующего в ГМ-кукурузе линии T2S. на основе ПЦР в реальном времени с использованием плазмиды в качестве стандартного материала для определения относительного количества Т25 с применением конверсионного фактора (СО. представляющего собой отношение числа копий специфических для конструкции и таксон-специфических последовательностей ДНК в репрезентативном образце семян истинной кукурузы линии Т25.

Примечание — ССиспольэуется для расчета содержания ГМО (мае. %}иэ числе копий ДНК ГМО целевой и твксон-специфической последовательностей. Cf может быть измерен как отношение числа копий для целевой последовательности и твксон-специфической последовательности из соответствующего стандартного материала.

Ограничения см. в С.9.8.

С.9.2 Статус подтверждения достоверности и характеристики рабочих параметров

С.9.2.1 Общие положения

Этот метод был оптимизирован для прибора СДП ABI PRISM* 7700 ПЦР в реальном времени с использованием плазмиды pMulS в качестве стандартного материала (28). Плазмида рМи15 включает, в частности. ПЦР-продук-ты. вмплифицированные из систем ПЦР для специфической амплификации таксон-специфической последовательности из кукурузы (zSS/tt). последовательности 3SS-npOMOTopa вируса мозаики цветной капусты (p35S). терминаторной последовательности нопвлин-синтазы (tNOS). и последовательности, специфической для конструкций MON 810. Event176. ВИ1. GA21 и T2S.

Примечание — Плазмида использовалась а качестве калибровочного материала для определения содержания ГМО. рассчитанного из относительного числа копий ГМ-специфической и таксон-специфической последовательностей ДНК.

Воспроизводимость и точность описанного метода была проверена в ходе совместных испытаний лабораторий с использованием стандартных материалов и неизвестных образцов высушенной муки семян кукурузы, содержавших смеси зерен линии Т25 и обычной кукурузы [29|.

Число копий таксон-специфической последовательности (zSSlIb) в расчете не геном оценивалось для 20 представительных разновидностей кукурузы.

Метод был опубликован в японском и корейском национальных стандартах (30). |ЗТ). (32). (33).

С.9.2.2 Совместные испытания лабораторий

Всего 12 неизвестных образцов кукурузы, содержавших от О % до 10 % (по массе) высушенной кукурузной муки, полученной из кукурузы линии T2S. были проанализированы 15 участниками.

Примечание — Для определения величин Cf и приготовления неизвестных образцов для совместного испытания лабораторий были использованы семена образце линии Т25. гетерозиготной по ГМ-вставке. Для валидации были приготовлены неизвестные образцы смесей кукурузной муки, которые содержали 0 %. 0.1 %. 0.5 %. 1 %. 5 % и 10 % (по массе) сухой кукурузной муки, полученной из этой линии. Гомогенность образцов на каждом уровне была протестирована с использованием количественного метода в соответствии с протоколом АОАС (29). (34|.

Валидация метода для кукурузы линии Т25 была проведена путем совместного испытания лабораторий в соответствии с протоколом АОАС (34). Совместное испытание лабораторий было организовано Национальным

45

ГОСТ Р 53244—2008

Институтом исследований продуктов питания (NFRl. ТвикиЬа. Япония) совместно с Центром маркировки качества пищевых продуктов и услуг потребителям. Саитама (Sattama). Япония и Национальным Институтом здравоохранения (National Institute of Health Sciences), Токио. Япония. 15 лабораторий, включая участников из Японии. Республики Корея и Соединенных Штатов Америки, проводили ото совместное испытание с использованием СДП ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems)epee отдельные стадии. От всех участников требовалось следовать процедурам экстракции ДНК и количественной ПЦР.

Первая стадия имела своей целью определение С7 для Т25. Все участники получили набор праймеров, зондов. стандартный материал и ДНК. экстрагированную из семян кукурузы пинии Т25. которые были приготовлены из Qiagen ONeasy Plant Maxi kit и чья пригодность была протестирована NFRI перед исследованием. Эти образцы ДНК использовались для измерения числа копий конструкции, специфической для T2S и таксон-специфической 2$$НЬ последовательности ДНК кукурузы, все измерения на этой стадии были повторены три раза. От участников было получено всего 90 комплектов данных. Корреляции калибровочных кривых, для которых были представлены данные от всех участников, были приемлемыми (г > 0.990). 8 соответствии с протоколом АОАС (34) лаборатории, чьи данные были признаны выбросами, должны быть удалены как имеющие экстремальные значения (тест Кохрана, р < 0.025) и как имеющие экстремальный средний уровень (тест Груббса. р < 0.025). Ни одного выброса не наблюдалось ни в одном из тестов, как это показано в таблице С.29.

Таблице С.29 — Сводные данные Cf для T2S

Целевая последовательность

Последовательность, специфическая для конструкции Т25

Число участвовавших лабораторий

15

Число выбросов по тесту Кохрана

0

Число выбросов по тесту Груббса

0

Число оставшихся лабораторий

15

СГ

0.34 1 0.01

* Выражено как среднее значение ± доверительный интервал (а « 0.05).

Значение Cf может быть повторно определено исследователями с использованием подходящих стандартных материалов кукурузы линии Т25.

На второй стадии были проведены нелепые» анализы. Неизвестные образцы кукурузной муки были приготовлены как шесть пар нелепых» дубликатов, которые содержали 014.0.1 %. 0.5 Ч. 1 Ч. 5 % и 10 % (по массе) высушенной муки ГМ-кукурузы линии Т25 в смеси с обычной кукурузной мукой (29). Образец, не содержавший кукурузы линии Т25 (0 Ч). был использован как нпустой* образец, чтобы отсеять неработоспособные лаборатории перед статистическим анализом. Участники были проинструктированы экстрагировать ДНК из образцов с использованием набора Qiagen. Данные, представленные лабораториями, оставшимися в испытаниях после тестов на выбросы, были использованы для расчета среднего значения ГМО и доверительного интервала (а * 0.05). Средние значения были определены как Cf для расчета количества ГМО (Ч) входе «слепого* анализа. Средняя величина С7 для количественного определения последовательности, специфической для конструкции Т25. составляла 0.34.

14 лабораторий, участвовавших ао второй стадии, проанализировали 166 образцов путем амплификации zSSHb и последовательности, специфической для конструкции Т25. Лаборатории, которые не смогли определить пустые образцы с содержанием кукурузы линии Т25 0 Ч. были расценены как неработоспособные, и все их данные были исключены еще до тестов на выбросы, во всех экспериментах корреляции калибровочных кривых были приемлемыми (г* 0.990). Лаборатории, показавшие экстремальные отклонения и экстремальные средние значения данных в парах «слепых» дубликатов с разными уровнями Т25, были исключены из испытания как выбросы по Кохрану и выбросы по Груббсу |35]. (36). соответственно, еще перед статистическим анализом достоверности и точности. в полученных данных было обнаружено два выброса по Кохрану. Рассчитанные средние значения содержания ГМО. отклонение, относительное стандартное отклонение повторяемости (Ч) и относительное стандартное отклонение воспроизводимости (Ч) для каждого уровня ГМО в смеси приведены в таблице С.30.

Примечание — Участники совместных испытаний не рассчитывали окончательные результаты с использованием значения Cf. определенного в ходе первого совместного испытания. Число копий для каждой целевой последовательности, полученное при определении значений Cf и проведении «слепых» анализов, было передано в NFRI и содержание ГМО (Ч)е «слепых» испытательных образцах было преобразовано в окончательные результаты с использованием значений Cf.

46

ГОСТ Р 53244—2008

Таблица С.30 — Данные валидации для количественного определения последовательности, специфической для конструкции кукурузы T2S

Наименование показателя

Доля ГМ-кукуруэы линии T2S • смеси. %

0.1

0.5

1

S

10

Число участвовавших лабораторий

14

14

14

14

14

Число неработоспособных лабораторий

0

0

0

0

0

Число выбросов по Кохрану

2

0

1

1

0

Число выбросов по Груббсу

1

0

0

0

0

Число лабораторий, оставшихся после исключения

11

14

13

14

14

Среднее значение содержания ГМО, %

0.1

0.6

1,2

5.6

10.8

Отклонение от истинного значения

*36,6

♦ 15.3

♦20.0

♦ 11.6

♦8.1

Стандартное отклонение повторяемости а,"

0.033

0.162

0.082

0.690

1.439

Предел повторяемости г* (г» 2.6 в,)

0.092

0.455

0.228

1.932

4.030

Относительное стандартное отклонение повторяемости. 6

23.7

28.2

6.6

12.4

13.3

Стандартное отклонение воспроизводимости зя*

0.037

0.162

0.138

0.827

1.591

Предел воспроизводимости Я * (Я ■ 2.8 * гн)

0.103

0.455

0.386

2.317

4.456

Относительное стандартное отклонение воспроизводимости. %.в

26.5

28,2

11.5

14.8

14.7

Ниже 20 копийс (абсолютный предел детектирования этого метода)

22/22

1/28

0/26

0/28

0/28

*    Выражается а % ГМО.

*    Выражается квк процент от среднего значения.

с Ниже 20 копий выражается как отношение числа оставшихся данных ниже двадцать копий к суммарному числу оставшихся данных.

С.9.2.3 Молекулярная специфичность

С.9.2.3.1 Общие положения

Этот метод был приведен в (28). Информация о генетической конструкции, встроенной в геном кукурузы, доступна в ссылках (28) и (41). Праймеры и зонды ТадМапф для разработки этого метода были сконструированы с помощью информации, описанной в (41).

Если ДНК-конструкция. встроенная в Т25. была использована в других ГМ-событиях, может быть получен ложноположительный результат, поскольку амплифицируемвя последовательность происходит из этой конструкции.

С.9.2.3.2 Теоретическая специфичность

Теоретическая специфичность праймеров и зондов была оценена путем поиска в базах данных DD8J (3 декабря 1999 г.), и документация по оценке безопасности была опубликована Министерством здоровья, труда и благополучия (Япония) и Министерством сельского хозяйства, лесного хозяйства и рыболовства (Япония) с использованием нуклеотидных последовательностей в качестве запросных последовательностей с помощью программы BLASTN 2.2.3. Результат поиска подтвержден полной идентичностью только с ожидаемой целевой последовательностью.

С.9.2.3.3 Экспериментальное определение специфичности

Амплификация с праймерами и зондами, приводящая к получению ожидаемых ПЦР-лродуктов при исследовании с образцами высушенной кукурузной муки, содержащей от 0 % до 10 % (по массе) ГМ-кукурузы линии T2S. которые были приготовлены для этого методе NFRI (28). (29).

Испытанными образцами были зерна кукурузы, кукурузная крупа, кукурузная мука грубого и тонкого помола.

47

ГОСТ Р 53244—2008

Проведенные перед совместным испытанием лабораторий тесты на специфичность показали отсутствие перекрестной реактивности детекторной системы со следующими нецелевыми еидами/образцами — рисом (Огуга saliva), пшеницей (Triticum aestivum) и ячменем (Hordeum vulgere). Не наблюдапи перекрестной реактивности с ГМ-соей пинии GTS 40-3-2 и со следующими линиями ГМ-кукурузы — MON 810, Event176, 8111 и GA21.

С.9.2.4 Оптимизация

Оптимизация реактивов была проведена для СДП ABI PRISM 7700е с использованием набора TaqMan* химия (38|.

Расчет праймеров и зондов был произведен с помощью программного обеспечения Рпшег Express* (Applied Biosystems).

C.9.2.S Предел детектирования (LOO)

Абсолютный предел детектирования в соответствии с указаниями разработчика метода — 20 копий плазмид стандартного материала (28).

Относительный LOD. валидированный в ходе совместного испытания лабораторий. — 0.5 % кукурузы линии T2S.

С.9.2.6 Предел количественного определения (LOO)

Абсолютный LOQ в соответствии с указаниями разработчика метода — 20 копий плазмид стандартного материала [28].

Относительный LOQ. валидированный в ходе совместного испытания лабораторий. — 0.S % кукурузы линии

T2S.

С.9.3 Адаптация

Специфическая информация отсутствует.

С.9.4 Принцип

Фрагмент последовательности, специфической для конструкции кукурузы линии Т25. размером 149 п. о. вм-плифицировали с помощью ПЦР пары праймеров, специфических для Т25. ПЦР-продукты измерялись а ходе каждого цикла ПЦР (в реальном времени) с помощью олигонуклеотидного зонда, специфического для конструкции T2S. меченного двумя флуоресцентными красителями — РАМ в качестве репортерного красителя и TAMRA в качестве гасителя. Для этих целей применялся TaqMan* химия.

Фрагмент последовательности твксон-слецифической последовательности zSSllb размером 151 п. о. был амплифицирован с помощью ПЦР а отдельной реакции ПЦР в реальном времени с использованием двух праймеров. специфических к zSSllb. и продукты ПЦР измерялись в течение каждого цикла ПЦР с применением зонда, специфического к zSSllb. производства TaqMan*.

Для количественного определения числа копий в экстрагированной ДНК из экстрактов ДНК неизвестного испытательного образца был использован метод калибровочной кривой. Отдельные калибровочные кривые с каждой системой праймер/зонд генерировались в ходе одного и того же прогона аналитической амплификации. Калибровочные кривые составляли из пяти концентраций, включая 20.12S, 1500.20000.250000 копий ДНК плазмиды pMul5. В каждой из пяти калибровочных точек проводились трехкратные измерения. Тройные реакции с использованием соответствующих разбавлений ДНК. экстрагированной из неизвестного образца, проводились на A8I PRISM® 7700 SOS в том же самом аналитическом прогоне.

График зависимости значений С,, определенных для калибровочных точек в специфической для 2$Sllb или целевой последовательности конструкции Т25. соответственно, от логарифма числа копий ДНК плазмиды рМЫ5 использовали для построения калибровочной кривой. См. также ссылку (28). Число копий, определенное для ДНК испытательного образца, получается путем интерполяции из стандартных кривых. Для определения количества Т25 а испытательном образце число копий конструкции Т25 делится на число копий гена zSSllb и значение С(. специфическое для конструкции Т25. умноженное на 100 для получения результата а процентах, как описано в разделе С.9.9.

С.9.5 Реактивы

С.9.5.1 Общие положения

Для получения информации о качестве реактивов, которые могут использоваться, см. ГОСТ Р 53214 (подраздел 6.6).

C.9.S.2 Вода.

С.9.5.3 TaqMan® Universal Master Mix. 2'.

C.9.S.4 Стандартный материал (плазмида).

Стандартным материалом, использовавшимся для разработки и валидации метода, служила плазмида pMulS. которая включена в набор плазмид для обнаружения ГМ кукурузы (Fasmac N9 РМ-2 и Nippon Gene Nf 319-04981) (28). Могут быть использованы и другие стандартные материалы, если они могут продемонстрировать такие же или лучшие результаты.

C.9.5.S Олигонуклеотиды

Последовательности праймеров и зондов для специфических для конструкции линии Т25 и твксон-специфи-ческих генов кукурузы приведены в таблице C.3f.

48

ГОСТ Р 53244—2008

Таблице С.ЗТ — Олигонуклеотиды

Наименование

опигонукпаоюида

ДНК-последоаательмостъ олигонуклеотида

Окончательная концентрация при ПЦР

Целевая последовательность таксон-слецифического гена

SSllb 1-5-

5--СТС ССА АТС СТТ TgA CAT СТд С-3-

500 нмоль/дм4

SSllb 1-3'

5--ТСд ATT ТСТ СТС ТТд дТд АСА дд-3'

500 нмоль/дм4

SS//P-Taq

5-FAM-AgC AAA дТС АдА дСд СТд САА ТдС A-TAMRA-3*

200 нмоль/дм4

Целевая последовательность ГМО

Т25 1-5'

5-дСС АдТ ТАд дСС АдТ ТАС ССА-З1

500 нмоль/дмэ

T2S 1-3'

5-ТдА дСд AAA ССС TAT ААд ААС ССТ-31

500 нмоль/дм-1

T25-2-Taq

5-FAM-TgC Адд CAT дСС СдС TgA ААТ C-TAMRA-3*

200 нмоль/дм4

* FAM: 6-кврбоксифлуоресцеин; TAMRA: 6-карбокситетраметилродвмин.

Длине ПЦР-лродукга SSllb составляет 151 л. о.: длина ПЦР-продукта Т25 составляет 149 п. о.

С.9.6 Прибор

С.9.6.1 Общие положения

Должен использоваться стандартный лабораторный прибор, если не определено иначе.

С.9.6.2 Термоциклер

Отмеченный температурно-временной профиль исходно был оттестирован в ходе совместного испытания лабораторий с прибором СДП ABI PRISM* 7700 (Applied Blosystems). Допускается использовать другие системы ПЦР в реальном времени после адаптации условий реакции.

С.9.6.3 Реакционные плашка и микропробирки

Реакционные плашка и микропробиркм должны быть подходящими для ПЦР-амплификации в термоциклере, например. ABI PRISM* 96-Well Optical Reaction Plate или MicroAmp* Optical Caps (восемь крышек/полоска. плоская) (Applied Biosystems) соответственно. Допускается использовать и другие реакционные плашки, микрофлвкоиы или микропробирки, если они могут продемонстрировать твкие же или лучшие результаты.

С.9.7 Процедура: порядок проведения ПЦР

С.9.7.1 Общие положения

ПЦР для целевой последовательности таксон-слецифического гена zSSilb и для специфической целевой последовательности линии Т25 должна проводиться в отдельных пробирках. Мультиплексная ПЦР (с использованием различных флуоресцентных меток для зондов) не была протестирована или валидироввнв.

Метод приведен для суммарного объема реакционной смеси ПЦР 25 мкл с реактивами, список которых приведен в таблицах С.32 для zSSilb и С.33 для T2S.

Таблица С.32 — Реакционная смесь вмплификвции в окончательном объеме на одну реакционную пробир

ку для целевой твксон-специфичвской последовательности zSSilb

Суммарный объем реакции

25 мкл

Кодирующая нить ДНК (50 нг геномной ДНК кукурузы)

2.5 мкл

Реакционный буфер (включая ДНК полимеразу и дНТФ)

ТадМапФ Universal PCR Master Mix (ABI)

12,5 мкл

Праймеры

zSSim-S'u 2SSHb 1-3- (см. твблицу C.37)

См. твблицу С.31

Зонд

zSS//0-Taq (см. таблицу C.31)

См. твблицу С.31

49

ГОСТ Р 53244—2008

Таблице С.ЗЗ — Реакционная смесь амплификации для специфической последовательности Т25 а окончательном объеме в расчете на одну реакционную пробирку

Суммарный реакционный объем

25 мкл

Кодирующая нить ДНК (50 нг геномной ДНК кукурузы)

2.5 мкл

Реакционный буфер (включая ДНК-полимервзу и дНТФ)

Универсальная смесь для ПЦР Universal Master Mix (ABt) TaqMan*

12.5 мкл

Праймеры

T25 1-S'and T25 1-3’ (см. таблицу C.37)

См. таблицу С.31

Зонд

T2S-2-Taq (см. таблицу С.31)

См. таблицу С.31

С.9.7.2 Контроли ПЦР

Каждая серия испытаний должна включать все контроли. как это определено в ГОСТ Р 53274.

Если контроли не дадут ожидаемых результатов, результаты испытаний должны быть забракованы, и анализ должен быть повторен.

в качестве положительного контроля/ствндартного калибровочного материала доступны по крайней мере две альтернативы, а именно;

а) высококачественная чистая геномная ДНК. экстрагированная из зерен кукурузы, может быть использована. если количество ДНК известно на основе расчета числа копий целевой последовательности, исходя из размера генома кукурузы линии T2S;

0) плазмида, содержащая целевую(ые) последовательностей), может быть добавлена в различных концентрациях с известным числом копий. Такая плазмида доступна в наборе GM Maize Detection Plasmid Set (Fasmac No. PS-2 и Nippon Gene No. 310-04981). См. также (28).

в соответствии с требованиями обеспечений качества положительные контроли предпочтительно не должны быть теми же самыми, что и стандартные калибровочные материалы.

С.9.7.3 Температурно-временная программа

Температурно-временная программа, приведенная в таблице С.34. была оптимизирована для СДЛ ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems). В валидационном исследовании он использовался совместно с универсальной смесью для ПЦР TaqMan* Universal Master Mix. Использование других термоциклеров может потребовать специальной адаптации. Время, необходимое для активации/иницивции денатурации, зависит от особенностей используемой смеси Master Mix.

Таблица С.34 — Условия реакции

Этапы определения

Вреыя. с

Температура. ’С

Пред-ПЦР: деконгвминация

120

50

Лред-ПЦР; активация ДНК-лолимеразы и денатурация кодирующей нити ДНК

600

95

ПЦР (40 циклов)

Стадия 1

Денатурация

30

95

Стадия 2

Отжиг и элонгация

60

59

С.9.8 Ограничения и интерпретация результатов

Если ГМ-кукуруза. иная, чем кукуруза линии T2S. содержит ту же самую специфическую для конструкции последовательность ДНК. метод пригоден только для количественного определения ДНК кукурузы линии Т25 в отсутствие ГМО. иных, чем кукуруза линии Т25.

Описанный метод пригоден только для определения соотношения последовательности, специфической для конструкции линии T2S. и таксон-спвцифической zSSMP-последовательности кукурузы. Это соотношение отражает количество T2S в исследуемом образце кукурузы. Этот метод был валидирован только для зерен кукурузы.

Совместное испытание лабораторий является значимым источником данных для обеспечения оценки погрешности. Также необходимо идентифицировать любые источники погрешностей, которые не охватываются меж-лабораторными испытаниями, такие как отбор проб и др.. в соответствии с основными международными договоренностями (39). (40).

50

ГОСТ Р 53244—2008

С.9.9 Калибровка и расчет результатов

Исследователем должно быть определено пороговое значение для определения порогового цикла (С,). Пример процедуры после ПЦР-анализа можно нейти в руководстве производителя к стандартным материалам ГМ-кукуруэы {GM Maize Detection Plasmid Set (Fasmac No. PM-2 и Nippon Gene No. 319-04981). См. также (28).

Конверсионный фактор (Cf) для количественного определения конструкции, специфической для линии Т25, и референсной плазмиды, использовавшихся в совместном испытании лабораторий, равен 0.34. Расчет количества ГМ-кукуруэы, %. в матриксе образце, проводят по формуле

tr ■ Nau 100    (C.S)

Ntx Cf •

Где NM — число копий ГМ-специфической целевой последовательности ДНК испытательного образца:

Nrx — число копий таксон-специфической целевой последовательности ДНК испытательного образца.

S1

ГОСТ Р 53244—2008

Приложение О {рекомендуем ое)

Метод, специфический для трансформационного события

Раздел 0.1. не включен (см. предисловие).

0.2 Метод относительного количественного определения содержания ДНК кукурузы линии MON 810 (специфический для трансформационного события) с использованием ПЦР в реальном времени

0.2.1 Введение

в атом приложении приведен метод специфической амплификации и количественного определения специфического участка, состоящего из таксон-специфического гена {гене белка группы высокой мобильности [Лтд] [42]) кукурузы (Zea mays) и единственной копии ДНК из района граничного соединения геномной последовательности и элемента встроенной последовательности, происходящего из вируса мозаики цветной капусты (35б-лромотора CaMV). получившегося в результате рекомбинации т vitro, который присутствует в генетически модифицированной устойчивой к нвсекомым кукурузе MON 810 («YleklGuard». Мол зато), с целью оценки относительного количества ДНК кукурузы MON 810.

Ограничения см. а 0.2.8.

0.2.2 Статуе подтверждения достоверности и характеристики рабочих параметров

D.2.2.1 Общие положения

Метод был оптимизирован для сертифицированного стандартного материала (ССМ IRMM-413) (43). состоящего из высушенной кукурузной муки, содержавшей смеси генетически модифицированной кукурузы MON 810 и обычной кукурузы.

воспроизводимость и точность описанного метода была проверена в ходе совместных испытаний лабораторий с использованием серии ССМ IRMM-413. упомянутых выше.

Число копий целевых генов в расчете на геном определено не было.

Метод был исходно разработан для СДП ABl PRISM® 7700.

0.2.2.2 Совместные испытания лабораторий

Метод был валидирован в ходе совместного испытания лабораторий Федеральным институтом оценки рисков (Federal Institute for Risk Assessment. BfR) в содружестве с Американской ассоциацией химиков зерна (American Association of Cereal Chemists, AACC), Совместным исследовательским центром (Joint Research Centre. JRC) Еврокомиссии (ЕС). Институтом стандартных материалов и измерений (Institute for Reference Material and Measurement. IRMM). Институтом здоровья и защиты потребителей (Institute for Health and Consumer Protection. IHCP) и фирмой GeneScan. Berlin. Совместное испытание было организовано таким образом, чтобы оно удовлетворяло критериям, изложенным в согласованном протоколе IUPAC [15). Исследование было предпринято 15 лабораториями, использующими ABl PRISM* 7700. A8I PRISM* 7900 (Applied Biosystems) или iCycler iQ систему детектирования ПЦР в реальном времени (Bio-Rad Laboratones). 14 лабораторий сообщили результаты.

8 соответствии с инструкциями производителя для экстракции ДНК была использована ДНК-экстракционная система GENESpm (GeneScan).

Для каждого неизвестного образце была предпринята одна экстракция ДНК. Каждый испытательный образец был проанализирован с помощью ПЦР в трех повторностях.

Каждый участник получил 12 неизвестных образцов. Образцы состояли из шести сертифицированных стандартных материалов (ССМ IRMM-413). содержавших от <0.02% до 5.0% ГМ-кукурузы MON 810 (по массе) а смеси с обычной кукурузой.

Межлабораторные испытания были спланированы как двойные «слепые» испытания. Каждая лаборатория получила каждую из концентраций ССМ ГМ-кукурузы MON 810 а двух неизвестных образцах.

Подробности совместного испытания лабораторий приведены а таблице D.f.

Таблица D.f — Данные валидации количественного определения специфического для трансформационного события MON 810 за 2003/2004 годы

Наименование пояааатепя

Образец 1 < 0.02 %

Образец 2 0.10 * 0.03%

Образец 3 0.50 % 1 0.04 %

Образец 4 1.00 1 0.05 %

Образец 5 2.0 1 0.1 %

Образец б 5%

Число лабораторий, приславших результаты

11

14

14

14

14

14

Число исключенных лабораторий*

1

1

0

2

0

0

52

ГОСТ Р 53244—2008

Окончание таблицы 0.1

Наименование показателя

Образец 1 < 0.02 %

Образец 2 0.10 t 0.03 4

Образец Э 0.60 4 i 0.04 4

Образец 4 1.00 i 0.05 4

Образец 5 2.01 0.1 4

Образец в S 4

Число лабораторий, оставшихся после исключения

10

13

14

12

14

14

Среднее значение. 4

0.028

0.1023

0.4613

0.8327

1.7814

4.S154

Стандартное отклонение повторяемости вв

0.00736

0.03641

0.9606

0.13744

0.28385

1.29374

Относительное стандартное отклонение повторяемости. 4

26.27

35.60

20.82

16.51

1S.93

28.65

Предел повторяемости г(г* 2.8 а,)

0.0206

0.1019

0.269

0.3848

0.7948

3.6225

Стандартное отклонение воспроизводимости вм

0.02326

0.04646

0.20068

0.26534

0.56609

1.65451

Относительное стандартное отклонение воспроизводимости. 4

83.03

45.43

43.5

31.86

31.7а

36.64

Предел воспроизводимости R (Я ■ 2.8 »*)

0.0651

0.1301

0.5619

0.743

1.5851

4.6326

* Выбросы идентифицировали с помощью тестов Кохрана и Груббса.

D.2.2.3 Молекулярная специфичность

D.2.2.3.1 Общие положения

Наборы праймеров были разработаны для амплификации последовательности ДНК. специфической для искусственного соединения (района граничного соединения) между интегрированной генетической конструкцией и хозяйским геномом, которая в природе не встречается.

D.2.2.3.2 Теоретическая специфичность

Никакой гомологии последовательностей с последовательностями не модифицированной генетически кукурузы и других сельскохозяйственных растений не было обнаружено путем поиска в базах данных (база данных GenBank®: BlaslN® 2.2.1. поиск от 1 октября 2003 г.). Результат поиска с помощью программы 8LASTN насейте Национального института здравоохранения США [14 сентября 2004 г.) дел 100 4-ное совпадение с последовательностью с номером доступа AF434709. описывающей специфический для MON 810 участок интеграции в кукурузном геноме.

D.2.2.3.3 Экспериментальное определение специфичности

Идентифицировали COM IRMM-413 высушенной кукурузной муки, содержавшей от < 0.02 % до 5.0 % генетически модифицированной кукурузы линии MON 810.

Тесты на специфичность, проведенные перед исследованием, показали отсутствие перекрестной реактивности систем детектирования к следующим нецелевым видам/обраэцам: ДНК сои.

Не обнаружено перекрестной реактивности со следующими трансформационными событиями ГМ-кукурузы: Evenl176. Bin. Т25. GA21 и сои GTS 40-3-2.

D.2.2.4 Оптимизация

Оптимизация концентраций реактивов была произведена для СДП ABI PRISM* 7700 и СДП GenAmp S700 с использованием набора TaqMan* химия.

Расчет праймеров и зондов был произведен с помощью программного обеспечения Primer Express® software (Applied Biosystems).

D.2.2.S Предел детектирования (LOO)

Абсолютный предел детектирования не был определен в ходе межлаборвторных испытаний. В соответствии с указаниями разработчика метода абсолютный LOO, как это определено в ГОСТ Р 53214. составляет S копий целевой последовательности.

Относительный LOD не был определен в ходе межлабораторных испытаний. В соответствии с указаниями разработчика метода относительный LOD. как это определено в ГОСТ Р 53214. составляет по крайней мере 0.1 4.

S3

ГОСТ Р 53244—2008

0.2.2.6 Предел количественного определения (LOQ)

Абсолютный LOD не был определен е ходе межлабораторных испытаний. 8 соответствии с указаниями разработчика метода было показано, что абсолютный предел количественного определения составляет Ю копий целевой последовательности.

Относительный LOD не был определен в ходе межлаборвторных испытаний. 6 соответствии с указаниями разработчика метода было показано, что относительный предел количественного определения составляет по крайней мере 0.1 % (равен точке наименьшей концентрации на использовавшейся калибровочной кривой).

0.2.3 Адаптаций

Специфическая информация отсутствует.

0.2.4 Принцип

Фрагмент размером 92 п. о. последовательности, специфической для кукурузы линии MON 810, был ампли-фицироавн с помощью ПЦР. Накопленные ПЦР-продукты измеряли а ходе каждого цикла ПЦР (в реальном времени) с помощью специфического для целевой последовательности олигонуклеотидного зонда, меченного двумя флуоресцентными красителями — FAM в качестве репортерного красителя и TAMRA в качестве гасителя [33].

Для относительной количественной оценки содержания ДНК кукурузы линии MON 610 с помощью специфической для кукурузы реферексной системы вмплифицировали фрагмент размером 79 п. о. кукурузного гена hmg, используя ген-слецифическую комбинацию праймеров и зондов.

0.2.S Реактивы

0.2.S.1 Общие положения

Для получения информации о качестве реактивов, которые могут использоваться, см. ГОСТ Р S3214. подраздел 6.6).

0.2.S.2 Вода.

0.2.5.3 ПЦР-буфвр (без MgClj), 2-.

D.2.5.4 Раствор МдС12. c(MgCl2) • 25 ммоль/дм3.

0.2.5.S Раствор дКТФ. с(дНТФ) « 2.5 ммоль/ дм> (каждый).

D.2.5.6 Олигонуклеотиды

Характеристики применяемых олигонуклеотидов приведены в таблице О.2.

Таблице D.2 — Олигонуклеотиды

Наименование

показателя

ДНК-лоследоаательиость олигонуклеотида

Окончательная концентрация при ПЦР

Целевая последовательность референсного гена

ZM1-F

5-TTg дАС ТАд ААА ТОТ СдТ дСТ дА-3'

300 нмоль/ДМ*

ZM1-R

S-дСТ АСА ТАд ддА дСС ТТд ТСС Т-3'

300 нмоль/дм*

Зонд ZM1

S-FAM-CAA ТСС АСА САА АСд САС дСд TA-TAMRA-3'

160 нмоль/дм*

Целевая последовательность ГМО

Mall-F1

5-ТСд ААд дАС дАА ддА СТС ТАА СдТ-3'

300 нмоль/дм*

Mall-R1

5-дСС ACC ТТС СТТ ТТС САС TAT СТТ-3'

300 нмоль/дм’

Зонд Mall-S2

S'-FAM-AAC АТС СТТ ТдС CAT ТдС CCA gC-TAMRA Р-3-

180 нмопь/дм*

* FAM: 6-карбоксифлуоресцеин; TAMRA: 6-карбокситетраметилродвмин. Длина ампликона кукурузы ВМ1 составляет 70 п. о.

Длина ген-специфического ПЦР-лродуктв А/пд-гека составляет 79 п.о.: длина MON 610-специфического ПЦР-продукта составляет 92 л. о.

0.2.S.7 Термоствбильная ДНК-лолимеразв ДНК-лолимераза AmphTaq Gold*.

0.2.5.8 Урацил-Н-гликозилаза (необязательно)

0.2.5.9 Реакционная смесь амплификации

Подробности реакционной смеси амплификации приведены в таблице О.З.

0.2.6 Прибор

0.2.6.1 Общие положения

Должен использоваться стандартный лабораторный прибор, если не определено иначе.

54

ГОСТ Р 53244—2008

D.2.6.2 Термоциклер

Отмеченный температурно-временной профиль изначально был оттестирован с приборами СДП ABI PRISM* 7700 и СДП GeneAmp* 5700 (Applied Biosystems). Допускается использовать другие системы детектирования ПЦР в реальном времени после адаптации реакционных условий.

D.2.6.3 Реакционные пробирки

Реакционные пробирки должны быть подходящими для ПЦР-вмплификвции в термоциклере реального времени. например. ABI PRISM* 96-Well Optical Reaction Plate или МюгоАлтр* Optical Caps (восемь крышек/полоска. плоская) (Applied 8losystems).

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования и реактивов с техническими характеристиками не ниже вышеуказанных, если может быть показано. что их применение приводит к тем же результатам.

D.2.7 Процедура: порядок проведения ПЦР

D.2.7.1 Общие положения

Порядок проведения ПЦР для такок-специфичвсхой целевой последовательности и для целевой последовательности ГМО проводят в отдельных пробирках. Мультиплексная ПЦР (с использованием различных флуоресцентных меток для зондов) не была протестирована или ввлидированв.

Метод приведен для суммарного объема реакционной смеси ПЦР 25 мкл с реактивами, список которых приведен в таблице О.З.

Таблица 0.3 — Реакционная смесь амплификации в окончательном объеме на одну реакционную пробирку

Суммарный объем реакции

25 мкл

Добавленная кодирующая нить ДНК (2.3 нг к 150 нг ДНК кукурузы)

5 мкл

ДНК-полимераза

AmphTaq Gold*

1.25 ед.

Деконтаминвционнвя система

дУТФ

Урацил-/У-гликозилвза AmpErase*

400 мкмоль/дм* 0.5 ед.

Реакционный буфер

буфер A TaqMan* (содержащий пассивный стандартный ROX)*

1-

MgCl,

6.5 ммоль/дмз

Праймеры

См. таблицу D.2

См. таблицу D.2

ДНТФ

дАТФ.дЦТФ.дГТФ

200 мкмоль/дм* каждого

Зонды

См. таблицу D.2

См. таблицу D.2

* ROX — кврбокси-Х-родамин.

D.2.7.2 Контроли ПЦР

В качестве положительного контроля и стандартного калибровочного материала может быть использован сертифицированный стандартный материал MON вЮ (материал, содержащий от < 0.02 % до 5 % генетически модифицированной кукурузы), изготовленной IRMM. Geel. 8elgium (серии IRMM-413).

Следует использовать все соответствующие контроли. как это определено в ГОСТ Р 53214.

0.2.7.3 Температурно-временная программа

Температурно-временная программа, приведенная в таблице D.4. была оптимизирована для СДП ABI PRISM* 7700 (Applied Bioayetems). В валидационном исследовании она была использована в сочетании с ДНК-по-лимеразой AmphTaq Gold* Использование других термоциклеров может потребовать специфической адаптации. Время для акгивации/первоначальной денатурации зависит от используемой полимеразы.

Условия реакции приведены в таблице D.4.

Таблица 0.4 — Процедура: условия реакции

Этапы определения

Время, с

Температура. *С

Пред-ЛЦР: двконтаминация

120

50

Пред-ПЦР: активация ДНК-лолимврвэы и денатурация кодирующей нити ДНК

600

95

55

ГОСТ Р 53244—2008

Окончание таблицы 0.4

Этель/ определения

время, с

Температуре. *С

ПЦР (4S циклов)

Стадия 1

Денатурация

1S

95

Стадия 2

Отжиг И ЭЛ0НГ8ЦИЯ

60

60

0.2.8 Ограничения и интерпретация результатов

Приведенный метод пригоден для измерения соотношения уровня MON 810-специфической ДНК к содержанию ДНК кукурузы. Эго соотношение отражает относительное количество MON 810 в кукурузном ингредиенте исследуемого пищевого продукта.

Примечание — Если кукурузная ДНК уделена или сильно деградирована в ходе приготовления пищевого продукта (например, рафинированного растительного масла) или если кукуруза является лишь очень минорным компонентом в анализируемом образце, количество кукурузных референсных и/или ГМ-специфических копий будет не уровне или ниже пределе количественного определения, и описанные методы не будут применимы.

0.2.9 Калибровке и расчет результатов

После определения порогового значения во время логарифмической фазы амплификации (например, от 0,01 до 0.1 нормализованной флуоресценции репортерного красителя (Кл)| программное обеспечение прибора рассчитывает значения С, для каждой реакции. Строят график зависимости значений С,, которые измерены для калибровочных точек, приготовленных из ССМ. предназначенных для количественных анализов (COM IRMM-413) в ПЦР-системах. специфических для кукурузного таксона и MON 810. соответственно, от натурального логарифме числа копий ДНК. Числа копий, измеренные для ДНК неизвестных образцов, получают интерполяцией из стандартных кривых.

Калибровочную кривую получают путем построения графика зависимости значений С, от логврифма числа копий целевой последовательности для калибровочных точек. Это может быть сделано, например, с помощью программного обеспечения (электронной таблицы), такой как Microsoft Excel, или напрямую с использованием опций, доступных в программном обеспечении системы детектирования последовательностей.

Для определения количества ДНК MON 810 в испытательном образце число копий MON 810 делится на число эквивалентов кукурузного генома и умножается не 100. чтобы получить значение в процентах. Для получения величины 1C см. (17).

6 дополнение к прогону количественного анализа следует проводить факультативный, так называемый контрольный прогон. Контрольный прогон должен быть также включен в межлабораторные испытания и он должен еще улучшить процедуру анализа. Контрольный прогон наиболее важен при анализе матриксов, для которых малоизвестны выход и качество ДНК. Тестируя в контрольном прогоне дев различных разбавления экстрагированной нуклеиновой кислоты (например, разбавлений раствора ДНК 1:10 и 1:40), может быть обнаружено возможное присутствие ингибитора(ов) амплификации, а также может быть определено подходящее разбавление экстракта нуклеиновой кислоты, полученной из испытательного образца, попадающее в калибровочный диапазон количественного анализа.

56

ГОСТ Р 53244—2008

Приложение Е (справочное)

Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов национальным стандартам Российской Федерации, использованным в настоящем стандарте в качестве нормативных

ссылок

Таблица Е.1

Обозначение ссылочного Национального стандарта Российской Федерации

Обозначение и наименование ссылочною международного стандарта и условное обозначение степени его соответствия ссылочному национальному стандарту

ГОСТ Р 5725-1—2002

ИСО 5725.1:1994 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Честь 1. Основные положения и определения» (MOD)

ГОСТ Р 5725-6—2002

ИСО 5725.1:1994 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Использование значений точности на практике» (MOD)

ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025—2006

ИСО 17025:2005 «Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий» (ЮТ)

ГОСТ Р 50779.11—2000

ИСО 3534.2—93 «Статистические методы. Статистическое управление качеством. Термины и определения» (МОО)

ГОСТ Р 52173—2003

ГОСТ Р 52174—2003

ГОСТ Р 53214—2008

ИСО 24276:2006 «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Общие требования и определения» (MOD)

Примечание — в настоящей таблице использованы следующие условные обозначения степени соответствия стандартов:

•    ЮТ — идентичные стандарты.

•    MOD — модифицированные стандарты.

S7

ГОСТ Р 53244—2008

библиография

[Г] ИСО 21569:2005' Продукты пищевые. Методы анализа, предназначенные дпя обнаружения генетически мо-дифииированных ореанизиов и полученных из них продуктов. Методы, основанные не качественной определении нуклеиновых кислот

(ISO 21569:2005) Foodstuffs— Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Qualitative nucleic acid based methods

[2] ИСО 21571:2005' Продукты пищевые. Методы анапиза. предназначенные дпя обнаружения генетически ио-дифицировенных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот

(ISO 21571:2005) Foodstuffs— Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Nucleic acid extraction

[3]    DIVIACCO, S.. NORIO. P . ZENTILIN. L.. MENZO. CLEMENT». M.. BIAMONTl. Q.. RIVA. S.. FALASCHI, A. and GiACCA. M. A novel procedure for quantitative polymerase chain reaction by coampllflcabon of competitive templates. Gene. 1992.122 <2). 313-320

[4]    PANNETIER. C.. DELASSUS. S.. DARCHE. S.. SAUCIER. C. and KOURlLSKY. P. Quantitative titration of nucleic acids by enzymatic amplification reactions run to saturation. Nucleic Acids Res.. 1993, 21 (3). 577-S83

[5]    ORLANDO. C.. PINZANI. P.and PAZZAGLI. M. Developments in quantitative PCR. dm. Chem.Lab. Med..1996. 36 {S). 255-269

[6]    YANG. 8.. YOLKEN. R. and VISCIDI. R. Quantitative polymerase chain reaction by monitoring епгутаИс activity of DNA polymerase. Anal. Biochem.. 1993. 206 (1): 110-116

[7]    THOMPSON. M. and WOOD. R. Harmonized Guidelines for interne! Quality Control in Analytical Chemistry Laboratories. J. PureApp. Chern.. 1995. 67 (4). 649-666

[8]    Alinorm 03/23 Criteria for Evaluating Acceptable Methods of Analysis for Codex Purposes. Codex Alimentarius Twenty-sixth Session, Rome. Italy. 30 June — 5 July 2003  ISBN 0-948926-12-0

[9]    Eurachem Guide: «The fitness for Purpose of Analytical methods — A laboratory Guide to Method Validation and Related Topics». Eurachem Working Group. Dec. 1998

[10]    Eurachem/ClTAG Guide: Quantifying Uncertamty In Analytical Measurement. Elbsson. S.L.R.. Rossleln. M.. Williams. A.. 2000. 2nd Ed.

ISO Guide 32 Calibration in analytical chemistry and use of certified reference materials

[f 1) IRMM Certified Reference Material Reports and Certificates

(12)    HERNANDEZ. M.. DUPLAN. M.-N.. BERTHIER. G.. VAlTILINGOM. M.. HAUSER. W.. FREYER. R.. PLA. M. and 8ERTHEAU. Y. Development and companson of four real-time polymerase chain reaction systems for specific detection and quantification of Zee mays L. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2004. 52: 4632-4637

(13)    HORWITZ. W. Protocol for the design, conduct and interpretation of method performance studies. Pure and Appi. Chem. 1995. 67:331-343

(14)    DELLAPORTA. S.L.. WOOD. J.. HICKS. J.B. A plant DNA mmipreparation: version II. Plant Mol. Biol. Rep. Vol. 1. 1983.4:19-2156

(15)    ARUMUGUNATHAN. K.. EARLE. E.D. Nuclear DNA content of some important plant species. Plant Mol. Biol. Rep. 1991.9:208-218

[16} Community Reference Laboratory (2004a). GMO specific real-time PCR system. Protocol for eventspecific quantitation of Bt11 in maize. Protocol published by the European Commission, Joint Research Centre. Institute for Health and Consumer Protection. 1-protocol.pdf. 6 pp.

(17)    Community Reference Laboratory (2004 b). Validation of the GMO specific detection method developed by NVI/lNRA for Bit 1 Ш sweet mane. Report published by the European Commission. Joint Research Centre. Institute for Health and Consumer Protection.  20report.pdf. 9 pp.

[18)    JAENICKE-DESPRES. V . 8UCKLER. E.S.. SMITH. 6.D.. GILBERT. M.T.P.. COOPER. A.. DOEBLEY. J. and РААВО. S. Early Allelic Selection in Maize as Revealed by Ancient DNA. Science. 2003. 302: 1206-1208

(19)    PAUWELS. J.. KRAMER. G.N.. SCHIMMEL. H.. ANKLAM. E.. LIPP. M. BROOMANN. P. The Cert/Acehon of Reference Matenals of Soya bean Powder with different Mass Fractions of RoundupReady® Soya bean. EC certification report EUR 18683 EN. 1999. ISBN 92-828-5925-8

[20)    PAULI. U.. LINIGER. M.. SCHROTT. M . SCHOUWEY. B.. HUBNER. Ph.. BROOMANN. P. and EUGSTER. A Quantitative Detection of Genetically Modified Soybean and Maize: Method Evaluation in a Swiss Ring Tnal. Mitt. Lebens. undHyg. 2001.92:145-158 *

* Соответствующий национальный стандарт отсутствует. До его утверждения рекомендуется испопьзовать перевод на русский язык данного международного стандарта. Перевод данного международного стандарта находится в Федеральном информационном фонде технических регламентов и стандартов.

56

ГОСТ Р 53244—2008

(2fJ HU8NER. Ph.. WAIBLINGER. H-U.. PIETSCH. K. end BROOMANN. P. Validation of PCR Methods for Quantitation of Genetically Modified Plants in Food. J. AOAC Int. 2001.84:1835-1864

(22]    VOOKIN. L.O., RHODES. P.R.. GOLDBERG. R.B. Ca Lectin gene insertion has the structural features of a transposable element. Cefl.1983. 34: 1023-1031

(23]    PADGETTE. S.R.. KOLACZ. K.H.. DELANNY. X.. RE. D.B.. LAVELLEE. B.J.. TINIUS. C.N.. RHODES. W.K.. OTERO. Y.I.. BARY. G.F.. ElCHHOLTZ. O.A.. PESCHKE. V.M.. NIOA. D.L.. TAYLOR. N.B.. KISHORE. G.M. Development, identification end characterization of a glyphosate-tolerant soybean tine. Crop Set. 199S, 35: 1451-1461

(24]    SLMB-Methode 528/2.1.3/2000 (CD-Rom. Eidgenossische Matenalzentrale. PO Box. CH 3000. Bern)

(25]    GRU8BS. F.E. Procedures for detecting outtying observations in samples. Tecfinometncs. 1969.11:1-21

(26]    KURIBARA. H.. SHINOO. Y.. MATSUOKA. T.. TAKUBO. K.. FUTO. S.. AOKI. M.. HIRAO. T.. AKIYAMA. H.. GOOA. Y.. TOYOOA. M. and HINO. A. Novel Reference Molecules for Quantitation of Genetically Modified Maize and Soybean. J.AOAC tnt. 2002. 8S. 1077-1089

(27]    SHINDO. Y.. KURIBARA. H.. MATSUOKA. T.. FUTO. S.. SAWADA. C.. SHONO. J.. AKIYAMA. H.. GODA. Y.. TOYODA. M. and HINO. A. Validation of Real-Time PCR Analyses for Line-specific Quantitation of Genetically Modified Mace and Soybean Using New Reference Molecules. JAQAC Int. 2002. 85. 1119-1126

(23] Instruction Manual for Tasting and Analysing Genetically Modified Food —Quantitative PCR. Japanese Agricultural Standard Testing and Analysis Handbook Senes (Centre for Food Quality. Labelling and Consumers Services. Saitama. Japan). 2002

(29]    Tasting for Foods Produced by Recombinant DNA Techniques. Ministry of Health. Labor end Welfare (Ministry of Health. Labour and Welfare. Japan). 2002

(30]    Guideline of Defection Methods of Genetically Modified Foods. Korean Food and Drug Administration. Korea |3f) Testing Manual for Genebcalty Modified Agricultural Products by National Agncultural Quality Services. Korea

(32)    European Food Res. Technot Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL. 17th Ed.. 2000. AOAC INTERNATIONAL. Gaithersburg. MD. Appendix D. pp 2—11

(33]    COCHRAN. W.G. The distnbution of the largest of a set of estimated vanances as a fraction of their total. Annals of Eugenics. 1949. 11:47-52

(34)    GRU8BS. F.E. Sample criteria for testing outlying observations. Ann. Math. Statist. Assn. 1950, 21: 27-58

(35]    KOPPEL. E.. STADLER. M.. LUTHY. J.. HUBNER. P. Sensitive method for the Detection of the Genetically Engineered Soy Bean «Roundup Ready®. Mitt. Gebiete. Hyg. 1997. 88:164-175

(33) Anonymous. Relative quantitation of Gene Expression. User Bulletin ABI Pram 7700 Sequence Detection System. 1997.2:1-36

(37] Eurechem Guide: eQuantifying Uncertainty in Anatybcal Measurement». Ellisson. L.R.. Rosstem. M.. Williams. A.. 2000

(33) Eurachem/CITAG Guide: Traceability in Chemical Meesurement. Elksson. L.R.. King. 8.. Rosslein. M.. Salit. M.. Williams. A.. 2003

(39]    MATSUOKA. T.. KURI8ARA. H.. TAKUBO. K.. AKIYAMA. H.. MIURA. H.. GODA. Y.. KUSAKABE. Y.. ISSHIKI. K.. TOYODA. M.. & HINO. A. Detection of Recombinant DNA Segments introduced to Genetically modified Maize (Zea mays). J. Agric. Food Chem. 2002. 50. 2100-2109

(40]    KRECH. A.B.. WURZ. A. STEMMER. C.. FElX. G.. CRASSER. K.D. Structure of genes encoding chromosomal HMGlprotems from maize. Gene. 1999. 234: 45-50

(4f) Institute for Reference Matenals and Measurements (IRMM): Certified Reference Materials ERM-XYOOOxy. CERTIFICATION REPORT. The certification of dry-mixed maize powder with different mass fractions of MON 810 maize Certified Reference Materials ERM BF4l3a. BF4l3b. BF413c. 8F4l3d. BF413S. BF413L , 2004

ГОСТ Р 53244—2008

УДК 579.672:637.065:006.354    ОКС 65.120    Н09    ОКСТУ 9109

67.040    9209

9709

Ключевые слова: пищевые продукты, корма для животных, семена, растительные образцы, отобранные из окружающей среды, количественное определение содержания ДНК из ГМО. полимеразная цепная реакция в реальном времени, таксон-специфическая последовательность ДНК. целевая последовательность ДНК

60

Редактор П.в. Коретнокоеэ Технический редактор Н.С. Гришанова Корректор E.Q. Дупьнева Компьютерная верстка б.И Гришеихо

Сдано в набор <6.06.2009. Подписано в лечат» 19.10.2009. Формат 60x847*. Бумага офсетная. Гарнитура Ариап. Печать офсетная. Усп. печ. л. 7.44. Уч.-изд. л. 6.60. Тираж 403 э«з. Зак. 727.

ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ». 12399S Москва. Гранатный пер.. 4. ru in(o@goslm fo.ru Набрано во ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ* на ПЭВМ

Отпечатано е филиале ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ* — тип. «Московский печатник*. 10S062 Москва. Лялин пер.. 6