МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ (МГС)
INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION (ISC)
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
ГОСТ
33978—
2016
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ И КОМБИКОРМА
Метод определения содержания тиреостатиков с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием
Издание официальное
Москва 2019
ГОСТ 33978—2016
Предисловие
Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 25 октября 2016 г. № 92-П)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004—97 | Код страны по МК (ИСО 3166)004—97 | Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
Армения | АМ | Минэкономики Республики Армения |
Беларусь | BY | Госстандарт Республики Беларусь |
Казахстан | KZ | Госстандарт Республики Казахстан |
Киргизия | KG | Кыргызстандарт |
Россия | RU | Росстандарт |
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 14 марта 2017 г. № 139-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33978—2016 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2018 г.
5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
6 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Ноябрь 2019 г.
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.
В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге «Межгосударственные стандарты»
© , оформление, 2017, 2019
В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии
ГОСТ 33978—2016
Содержание
1 Область применения....................................................................................................................................1
2 Нормативные ссылки....................................................................................................................................1
3 Сущность метода..........................................................................................................................................2
4 Требования безопасности и условия выполнения измерений..................................................................2
5 Средства измерений, аппаратура, материалы, посуда и реактивы.........................................................2
6 Подготовка к проведению измерений.........................................................................................................4
6.1 Подготовка лабораторной посуды и реактивов....................................................................................4
6.2 Приготовление растворов......................................................................................................................4
6.3 Приготовление градуировочных растворов..........................................................................................5
7 Отбор и подготовка проб..............................................................................................................................7
7.1 Отбор проб..............................................................................................................................................7
7.2 Подготовка проб......................................................................................................................................7
7.3 Очистка подготовленных проб методом твердофазной экстракции.................................................7
8 Порядок выполнения анализа.....................................................................................................................8
8.1 Условия ВЭЖХ-МС/МС измерений.......................................................................................................8
8.2 Построение градуировочных графиков и проведение измерений.....................................................9
9 Метрологические характеристики.............................................................................................................10
10 Обработка результатов измерений.........................................................................................................10
11 Оформление результатов измерений.....................................................................................................11
12 Контроль стабильности результатов измерений....................................................................................11
III
Поправка к ГОСТ 33978—2016 Продукты пищевые и комбикорма. Метод определения содержания тиреостатиков с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием
В каком месте | Напечатано | Должно быть |
Пункт 5.1, второе перечисление | - весы микроаналитические утвержденного типа, высокого (II) класса точности, поверенные в установленном порядке с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более ± 0,02 мг; | - весы специального класса точности с пределами допускаемой абсолютной погрешности взвешивания не более ± 0,1 мг; |
(ИУС № 4 2020 г.)
ГОСТ 33978—2016
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ И КОМБИКОРМА
Метод определения содержания тиреостатиков с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием
Food products and mixed feeds. Method for determination of thyreostats by high performance liquid chromatography—mass spectrometry
Дата введения — 2018—01—01
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на непереработанные пищевые продукты — мясо (в том числе мясо птицы), субпродукты (печень), комбикорма, а также на мочу животных и устанавливает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (далее — ВЭЖХ-МС/МС) для определения содержания тиреостатиков. Диапазон измерений содержания 6-пропил-2-тиоурацила, 6-метил-2-тиоурацила, 2-тиоурацила, 6-фенил-2-тиоурацила составляет от 2,0 до 30,0 мкг/кг, диапазон измерений содержания 2-меркаптобензимидазола составляет от 0,4 до 30,0 мкг/кг.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.1.005 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.007 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 12.2.085 Сосуды, работающие под давлением. Клапаны предохранительные. Требования безопасности*
ГОСТ OIML R 76-1 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 1770 (ИСО 1042—83, ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 2603 Реактивы. Ацетон. Технические условия
ГОСТ 3118 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 4198 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия
ГОСТ 4328 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ ИСО 5725-6 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике4*
ГОСТ ISO 6497 Корма. Отбор проб
* В Российской Федерации действует ГОСТ 12.2.085—2017 «Арматура трубопроводная. Клапаны предохранительные. Выбор и расчет пропускной способности».
** В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6—2002.
Издание официальное
1
ГОСТ 33978—2016
ГОСТ 6709 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 6995 Реактивы. Метанол-яд. Технические условия
ГОСТ 7269 Мясо. Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести
ГОСТ 9968 Метилен хлористый технический. Технические условия
ГОСТ 22300 Реактивы. Эфиры этиловый и бутиловый уксусной кислоты. Технические условия
ГОСТ 25336 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 29227 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
ГОСТ 31467 Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы отбора проб и подготовка их к испытаниям
Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов и классификаторов на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (www.easc.by) или по указателям национальных стандартов, издаваемым в государствах, указанных в предисловии, или на официальных сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации. Если на документ дана недатированная ссылка, то следует использовать документ, действующий на текущий момент, с учетом всех внесенных в него изменений. Если заменен ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, то следует использовать указанную версию этого документа. Если после принятия настоящего стандарта в ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение применяется без учета данного изменения. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Сущность метода
Метод основан на экстракции тиреостатиков из анализируемой пробы, дериватизации и очистки методом твердофазной экстракции, с последующим их количественным определением методом ВЭЖХ-МС/МС в режиме мониторинга множественных реакций (MRM). Количественное определение тиреостатиков проводят методом внутреннего стандарта.
4 Требования безопасности и условия выполнения измерений
4.1 Применяемые в работе реактивы относятся к веществам 1-го и 2-го класса опасности по ГОСТ 12.1.007, при работе с ними необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005.
4.2 Помещения, в которых проводят анализ и подготовку проб, должны быть оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией.
4.3 Приготовление градуировочных растворов проводят в вытяжном шкафу.
4.4 При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила по электробезопасности по ГОСТ 12.1.019 и правила безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением по ГОСТ 12.2.085.
4.5 К выполнению измерений методом ВЭЖХ-МС/МС допускаются лица, владеющие техникой ВЭЖХ-МС/МС и изучившие инструкции по эксплуатации применяемой аппаратуры.
4.6 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- температура окружающего воздуха........................................................................от 20 °C до 30 °C;
- атмосферное давление............................................................................................от 84 до 106 кПа;
- напряжение в питающей электросети.......................................................................от 200 до 240 В;
- частота переменного тока.............................................................................................от 49 до 51 Гц;
- относительная влажность воздуха............................................................................от 40 % до 80 %.
5 Средства измерений, аппаратура, материалы, посуда и реактивы
5.1 Для определения содержания тиреостатиков применяют следующие средства измерений, аппаратуру, посуду и материалы:
- весы неавтоматического действия высокого класса точности по ГОСТ OIML R 76-1 с пределами допускаемой погрешности не более ± 0,001 г;
- весы микроаналитические утвержденного типа, высокого (II) класса точности, поверенные в установленном порядке с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более ± 0,02 мг;
2
ГОСТ 33978—2016
- масс-спектрометр с квадрупольным анализатором с диапазоном измерений от 50 до 500 атомных единиц массы (а. е. м.), массовым разрешением не менее 1,0 а. е. м. на полувысоте пика, точностью измерения массы не менее 0,5 а. е. м., с режимом получения и анализа фрагментных ионов (режим МС/МС);
- систему высокоэффективную жидкостную хроматографическую, состоящую из бинарного насоса со смесителем, системы фильтрования и дегазации подвижных фаз, термостата хроматографической колонки, обеспечивающего температуру нагрева до (50 ± 1) °C;
- pH-метр или универсальный иономер диапазоном измерения от 4 до 9 ед. pH с погрешностью измерения ± 0,05 ед. pH;
- баню ультразвуковую с рабочей частотой не менее 20 Гц и объемом не менее 1 дм3;
- встряхиватель (шейкер) вибрационный для пробирок орбитального типа движения с амплитудой встряхивания 3 мм и диапазоном скоростей от 150 до 2000 об/мин;
- измельчитель-гомогенизатор лабораторный погружной;
- камеру лабораторную морозильную с цифровым контроллером температуры и рабочим диапазоном температур от минус 15 °C до минус 25 °C;
- колонку хроматографическую длиной 150 мм и диаметром 2,1 мм с обращенно-фазным сорбентом С18, и диаметром частиц сорбента не более 5,0 мкм;
- компьютер с установленным программным обеспечением для управления масс-спектрометром и обработки результатов измерений, аттестованным в установленном порядке;
- модуль термостатируемый нагревательный с системой отдувки растворителей инертным газом и максимальной температурой термостатирования не менее 50 °C;
- систему получения деионизированной воды высокой чистоты с удельным сопротивлением 18 МОм-см;
- устройство вакуумное для твердофазной экстракции;
- холодильник бытовой с морозильной камерой, цифровым контроллером температуры и рабочим диапазоном температур от 2 °C до 8 °C;
- центрифугу лабораторную рефрижераторную с центробежным ускорением не менее 3500 g и диапазоном температур от 4 °C до 20 °C;
-шкаф сушильный с максимальной температурой нагрева не менее 110 °C и погрешностью поддержания заданной температуры не более 5 °C;
- картриджи для твердофазной экстракции вместимостью не менее 12 см3, заполненные 0,5 г силикагеля с диаметром частиц от 15 до 100 мкм;
- пробы, не содержащие тиреостатиков, подготовленные и проанализированные ранее в соответствии с требованиями разделов 7 и 8, в зависимости от типа исследуемой матрицы («чистые» пробы)*;
- виалы (флаконы) стеклянные вместимостью 2 см3 с завинчивающимися крышками и тефлоновыми прокладками;
- виалы или пробирки полипропиленовые вместимостью 15 и 50 см3 с завинчивающимися крышками;
- колбы 2-10-1 с пришлифованными пробками по ГОСТ 1770;
-колбы 1-100(1000)-2 по ГОСТ 1770;
- колбы конические Кн-1-250(500, 1000)-29/32 ТС по ГОСТ 25336;
- пипетки 2-2-1-5(10, 25) по ГОСТ 29227;
- пипетки одноканальные переменной вместимости 20—200 мм3 с пределом допускаемого относительного отклонения среднеарифметического значения фактического объема дозы от номинального не более ±1,5 %;
-пипетки одноканальные переменной вместимости 100—1000 мм3 с пределом допускаемого относительного отклонения среднеарифметического значения фактического объема дозы от номинального не более ±1 %;
-цилиндры 1-50(100, 1000)-1 поГОСТ 1770.
5.2 При определении содержания тиреостатиков применяют следующие реактивы:
- 3-йодбензилбромид, ч. д. а.;
- ацетон по ГОСТ 2603;
- воду деионизированную для ВЭЖХ, полученную с использованием системы производства уль-трачистой воды из дистиллированной воды по ГОСТ 6709;
-дихлорметан по ГОСТ 9968, х. ч.;
- калия дигидрофосфат по ГОСТ 4198, ч. д. а.;
* Срок хранения «чистых» проб при температуре от минус 15 °C до минус 25 °C — не более трех месяцев.
3
ГОСТ 33978—2016
- кислоту соляную по ГОСТ 3118, х. ч.;
- метанол по ГОСТ 6995, х. ч.;
- натрия гидроксид по ГОСТ 4328, ч. д. а.;
- натрия гидрофосфат дигидрат, ч. д. а.;
- н-гексан, х. ч.;
- этилацетат по ГОСТ 22300, ч. д. а.;
- эфир диэтиловый, х. ч.
5.3 При определении содержания тиреостатиков в качестве образцов сравнения применяют соединения с массовой долей основного вещества не менее 98,0 %.
5.3.1 Для приготовления исходных растворов:
- 2-меркаптобензимидазол;
- 2-тиоурацил;
- 6-метил-2-тиоурацил;
- 6-пропил-2-тиоурацил;
- 6-фенил-2-тиоурацил.
5.3.2 Для приготовления исходного раствора внутреннего стандарта:
- 5,6-диметил-2-тиоурацил.
5.4 Допускается применение других средств измерений и посуды, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также аппаратуры, реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.
6 Подготовка к проведению измерений
6.1 Подготовка лабораторной посуды и реактивов
6.1.1 Мойку и сушку посуды проводят в отдельном помещении, оборудованном приточно-вытяжной вентиляцией. Для сушки лабораторной посуды и подготовки реактивов необходимо использовать отдельные сушильные шкафы.
6.1.2 Стеклянную посуду подвергают стандартной процедуре очистки лабораторной посуды с последующей последовательной промывкой органическими растворителями: этилацетатом (однократно), ацетоном (дважды).
6.1.3 Процедуру промывки органическими растворителями следует проводить в вытяжном шкафу. Рекомендуется на стадиях промывки использовать ультразвуковую баню. Окончательную сушку посуды проводят в сушильном шкафу, установленном в вытяжном шкафу, при температуре от 105 °C до 110 °C.
6.1.4 Каждую новую партию реактивов проверяют на отсутствие контаминации анализируемыми соединениями путем проведения холостого опыта в соответствии с процедурой анализа.
6.2 Приготовление растворов
6.2.1 Приготовление раствора метанол — деионизированная вода в объемном соотношении 2:1
В коническую колбу вместимостью 250 см3 вносят 100 см3 метанола и 50 см3 деионизированной воды, перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более трех месяцев.
6.2.2 Приготовление раствора метанол — деионизированная вода в объемном соотношении 4:1
В коническую колбу вместимостью 250 см3 вносят 200 см3 метанола и 50 см3 деионизированной воды, перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более трех месяцев.
6.2.3 Приготовление раствора натрия гидрофосфата молярной концентрации 0,2 моль/дм3
В мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 35,6 г натрия гидрофосфат дигидрата, доводят объем до метки деионизированной водой.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более одного месяца.
6.2.4 Приготовление раствора калия дигидрофосфата молярной концентрации 0,2 моль/дм3
В мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 27,2 г калия дигидрофосфата, доводят объем до метки деионизированной водой.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более одного месяца.
4
ГОСТ 33978—2016
6.2.5 Приготовление фосфатного буферного раствора с pH 8,0 ед. pH
В конической колбе вместимостью 1000 см3 смешивают 945 см3 раствора гидрофосфата натрия (см. 6.2.3) и 55 см3 раствора дигидрофосфата калия (см. 6.2.4). Измеряют pH, устанавливают его значение до (8,0 ± 0,1) ед. pH раствором гидроксида натрия (см. 6.2.9) или раствором соляной кислоты (см. 6.2.10).
Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более одного месяца.
6.2.6 Приготовление раствора 3-йодбензилбромида массовой концентрацией 5 мг/см3
В мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят 50,0 мг 3-йодбензилбромида, доводят объем раствора метанолом до верхней метки на колбе.
Срок хранения раствора при температуре от 2 °C до 8 °C — не более одних суток.
6.2.7 Приготовление раствора дихлорметан — гексан в объемном соотношении 1:3
В коническую колбу вместимостью 500 см3 вносят 100 см3 дихлорметана и 300 см3 гексана, перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более трех месяцев.
6.2.8 Приготовление раствора этилацетат — гексан в объемном соотношении 2:3
В коническую колбу вместимостью 500 см3 вносят 200 см3 этилацетата и 300 см3 гексана, перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более трех месяцев.
6.2.9 Приготовление раствора натрия гидроксида с концентрацией 1 моль/дм3
В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 90 см3 деионизированной воды и 4,0 г гидроксида натрия, перемешивают, после чего объем в колбе доводят до метки деионизированной водой.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более трех месяцев.
6.2.10 Приготовление раствора соляной кислоты с концентрацией 1 моль/дм3
В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 90 см3 деионизированной воды и с помощью пипеточного дозатора добавляют 8,6 см3 концентрированной соляной кислоты, после чего объем в колбе доводят до метки деионизированной водой и перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более трех месяцев.
6.3 Приготовление градуировочных растворов
6.3.1 Приготовление исходных стандартных растворов тиреостатиков массовыми концентрациями 1000 мкг/см3 (растворы Со)
Готовят индивидуальные исходные стандартные растворы каждого тиреостатика концентрациями Со, равными 1000 мкг/см3 каждый.
Для приготовления исходного стандартного раствора /-го тиреостатика в отдельную мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают рассчитанную массу соответствующего химического вещества, эквивалентную 10 мг чистого тиреостатика, взвешенную с точностью до 0,1 мг. Добавляют 8 см3 раствора метанол — деионизированная вода (см. 6.2.1) и помещают в ультразвуковую баню на 10 мин, затем доводят объем полученного раствора при температуре (20 ± 2) °C до 10 см3 этим же растворителем по метке на колбе.
Массу /-го химического вещества эквивалентную 10 мг /-го тиреостатика рассчитывают по формуле
100
mi=CV---0,001, (1)
Pi
где С — концентрация стандартного раствора, мкг/см3;
V — объем исходного стандартного раствора, см3;
Р; — массовая доля /-го тиреостатика в химическом веществе, %;
0,001 — коэффициент пересчета массы из мкг в мг.
Срок хранения растворов при температуре от минус 15 °C до минус 25 °C — не более одного года.
Перед применением растворы выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.
6.3.2 Приготовление рабочих стандартных растворов тиреостатиков массовыми концентрациями 2 мкг/см3 (раствор С^ и 0,04 мкг/см3 (раствор С2)
Рабочие стандартные растворы С^ С2 готовят в мерных колбах вместимостью 10 см3 согласно рисунку 1.
5
ГОСТ 33978—2016
Рисунок 1 — Приготовление рабочих растворов Ср С2
Раствор С1 хранят при температуре от минус 15 °C до минус 25 °C — не более одного года.
Перед применением раствор С1 выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.
Раствор С2 хранят при температуре от 2 °C до 8 °C в течение одних суток.
6.3.3 Приготовление исходного раствора внутреннего стандарта тиреостатиков массовой концентрацией 200 мкг/см3 (раствор Do)
В мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят рассчитанную по формуле (1) массу 5,6-диметил-2-тиоурацила эквивалентную 2 мг основного вещества, взвешенную с точностью до 0,1 мг. Добавляют 8 см3 раствора метанол — деионизированная вода (см. 6.2.1) и помещают в ультразвуковую баню на одну минуту, затем доводят объем полученного раствора при температуре (20 ± 2) °C этим же растворителем до 10 см3 по метке на колбе.
Раствор хранят при температуре от минус 15 °C до минус 25 °C. Срок годности — не более одного года.
Перед применением раствор Do выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.
6.3.4 Приготовление рабочего раствора внутреннего стандарта тиреостатиков массовой концентрацией 1 мкг/см3 (раствор D^
Для приготовления рабочего раствора О1 в мерную колбу вместимостью 10 см3 переносят 0,05 см3 раствора Do, доводят до метки раствором метанол — деионизированная вода (см. 6.2.1), закрывают пробкой и перемешивают.
Раствор хранят при температуре от минус 15 °C до минус 25 °C. Срок годности — не более шести месяцев.
Перед применением раствор О1 выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.
6.3.5 Приготовление матричных градуировочных растворов тиреостатиков (растворы G^ G2, G3 и G4)
Матричные градуировочные растворы G1 — G4 готовят в виалах или пропиленовых пробирках вместимостью 50 см3 из «чистых» проб массой 2,00 г, в которые вносят раствор внутреннего стандарта D1 и рабочие растворы определяемых тиреостатиков Ср С2 в соответствии с таблицей 1.
Таблица 1 — Приготовление матричных градуировочных растворов G1 — G4
Обозначение и массовая концентрация приготовляемого матричного градуировочного раствора | Вносимый объем рабочего раствора, см3 | ||
Ci | С2 | ||
G1 (60,0 нг/см3) | 0,03 | — | 0,04 |
G2 (16,0 нг/см3) | — | 0,40 | 0,04 |
G3 (4,0 нг/см3) | — | 0,10 | 0,04 |
G4 (0,8 нг/см3) | — | 0,02 | 0,04 |
Виалы (пробирки) встряхивают в шейкере в течение одной минуты и проводят дальнейшую обработку проб согласно разделу 7.
Срок хранения растворов G1 — G4 при температуре от 2 °C до 8 °C не более 24 ч.
6
ГОСТ 33978—2016
7 Отбор и подготовка проб
7.1 Отбор проб
7.1.1 Отбор проб мяса, печени — по ГОСТ 7269.
7.1.2 Отбор проб мяса птицы, печени — по ГОСТ 31467.
7.1.3 Объем отбираемых проб мочи должен быть не менее 40 см3.
7.1.4 Отбор проб комбикормов — по ГОСТ ISO 6497.
7.1.5 Пробы, отобранные по 7.1.1 и 7.1.2, при отсутствии возможности проведения анализа в день отбора замораживают и хранят при температуре минус 25 °C до проведения испытания, но не более 90 сут.
7.2 Подготовка проб
Мышечную ткань предварительно очищают от грубой соединительной ткани. Обработку анализируемой пробы проводят в соответствии с рисунком 2.
Рисунок 2 — Подготовка проб мяса, включая мясо птицы, печени, комбикормов, мочи
7.3 Очистка подготовленных проб методом твердофазной экстракции
Картриджи для твердофазной экстракции кондиционируют на вакуумном устройстве для ТФЭ, пропуская 10 см3 гексана. Затем через картридж пропускают пробу, полученную в соответствии с 7.2. Промывают картридж 5 см3 гексана. Определяемые вещества элюируют с сорбента 10 см3 раствора этилацетат — гексан (см. 6.2.8) в виалу или полимерную пробирку вместимостью 15 см3. Упаривают элюат досуха на системе упаривания растворителей при температуре не более 40 °C. Остаток пере-растворяют в 1 см3 раствора метанол — деионизированная вода (см. 6.2.2), помещают в ультразвуковую баню при комнатной температуре на одну минуту и центрифугируют при 3500 g в течение 15 мин при температуре 4 °C. Переносят экстракт в стеклянную виалу вместимостью 2 см3 и используют для ВЭЖХ-МС/МС анализа.
7
ГОСТ 33978—2016
8 Порядок выполнения анализа
8.1 Условия ВЭЖХ-МС/МС измерений
8.1.1 Хромато-масс-спектрометр включают в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и устанавливают параметры рабочих режимов масс-спектрометрического детектирования и хроматографического разделения.
8.1.2 Для колонки диаметром 2,1 мм, длиной 150 мм, с обращенно-фазным сорбентом С18 с размером частиц не более 5,0 мкм, соблюдают следующие условия хроматографирования:
- температура колонки — 40 °C;
- скорость потока подвижной фазы — 0,2 см3/мин;
- объем вводимой пробы — 20 мм3.
Разделение проводят в режиме градиентного элюирования (в качестве подвижной фазы А используют деионизированную воду, подвижной фазы Б — метанол) в соответствии с таблицей 2.
Таблица 2 — Условия градиентного элюирования
Время, мин | Подвижная фаза А, % | Подвижная фаза Б,% |
0,0 | 25 | 75 |
11,0 | 15 | 85 |
13,0 | 15 | 85 |
13,1 | 25 | 75 |
23,0 | 25 | 75 |
8.1.3 Параметры воздействия на ионы в режиме мониторинга множественных реакций (MRM) приведены в таблице 3.
Таблица 3 — Параметры воздействия на ионы в режиме MRM при ионизации электрораспылением с регистрацией отрицательных ионов
Тиреостатик | Ион-предшественник, m/z | Ион-продукт m/z | Потенциал декластеризации, В | Энергия соударений, эВ | Ускоряющее напряжение на выходе из ячейки столкновений, В |
2-Тиоурацил | 343 | 126,9 | -80 | -28 | -11 |
343 | 94,9 | -80 | -27 | -11 | |
6-Метил-2-тиоурацил | 357 | 126,9 | -80 | -30 | -11 |
357 | 108,9 | -80 | -27 | -11 | |
2-Меркаптобензимидазол | 365 | 147,9 | -80 | -30 | -11 |
365 | 103,9 | -80 | -53 | -11 | |
6-Пропил-2-тиоурацил | 385 | 126,9 | -80 | -30 | -11 |
385 | 350,9 | -80 | -25 | -11 | |
6-Фенил-2-тиоурацил | 419 | 170,9 | -80 | -30 | -11 |
419 | 126,9 | -80 | -35 | -11 | |
5,6-Диметил-2-тиоурацил* | 371 | 126,9 | -80 | -30 | -11 |
371 | 153,9 | -80 | -34 | -11 | |
* Внутренний стандарт. |
Примечание — Приведенные параметры хроматографического разделения и масс-спектрометрического детектирования могут отличаться в зависимости от используемого оборудования.
8
ГОСТ 33978—2016
8.1.4 Параметры источника ионизации и квадрупольного анализатора:
- напряжение на распыляющем капилляре (IS) минус 4500 В при регистрации отрицательных ионов;
- разрешение квадруполей Q1/Q3 — единичное;
- давление газа для фрагментации (CAD) — 41 кПа.
8.1.5 Контроль чувствительности методики осуществляют введением 20 мм3 матричных градуировочных растворов G3 и G4 (см. 6.3.5) в инжектор хроматографа. При анализе раствора G3 полученное соотношение сигнал/шум для каждого тиреостатика, за исключением 2-меркаптобензимидазола, должно быть не менее 3. При анализе раствора G4 полученное соотношение сигнал/шум для 2-меркаптобен-зимидазола должно быть не менее 3.
8.2 Построение градуировочных графиков и проведение измерений
8.2.1 ВЭЖХ-МС/МС анализ выполняют в виде серии измерений, включающей следующие образцы:
- образец подвижной фазы А — для уравновешивания ВЭЖХ-МС/МС системы;
- чистую пробу;
-градуировочные растворы (см. 6.3.5);
-экстракты анализируемых проб, приготовленных по 7.2.
8.2.2 Определяют и регистрируют на хроматограмме времена удерживания пиков двух ионов-продуктов каждого тиреостатика, соответствующее времени удерживания, найденному при измерении градуировочных растворов в условиях по 8.1.1,8.2.1. Проводят измерения градуировочных растворов, приготовленных по 6.3.5, в порядке возрастания их концентраций. Для построения градуировочного графика 2-меркаптобензимидазола используют данные анализа градуировочных растворов G^ G2, G3, G4; для построения градуировочных графиков других тиреостатиков используют данные анализа растворов G^ G2, G3.
8.2.3 Вычисление площади пика проводят для каждого иона-продукта анализируемых тиреостатиков и их внутреннего стандарта. Количественное определение каждого тиреостатика проводят по одному, наиболее интенсивному, иону-продукту.
Для подтверждения достоверности определения аналитов при анализе градуировочных растворов для каждого тиреостатика определяют значение отношения площади пика менее интенсивного иона-продукта к площади пика более интенсивного иона-продукта — относительную ионную интенсивность. Значение отклонений относительных ионных интенсивностей, полученные в экстрактах анализируемых проб, не должны превышать установленных по градуировочным растворам значений более, чем указано в таблице 4.
Таблица 4 —Допустимые отклонения относительных ионных интенсивностей
Относительная ионная интенсивность, % от основного пика | Максимально допустимые отклонения для ВЭЖХ-МС/МС детектирования,% |
Св. 50 | ±20 |
Св. 20 до 50 включ. | ±25 |
Св. 10 до 20 включ. | ±30 |
Менее 10 включ. | ±50 |
8.2.4 Построение градуировочных графиков проводят в каждой серии анализов с помощью программного обеспечения хромато-масс-спектрометра.
При построении градуировочной характеристики используют линейную регрессию вида у = а + Ьх (где у является отношением площади пика аналита к площади пика внутреннего стандарта, х— отношением концентраций аналита и внутреннего стандарта), при этом коэффициент корреляции должен быть не менее 0,98.
8.2.5 Построение линейного градуировочного графика и расчет содержания тиреостатиков в анализируемых пробах выполняется системой обработки данных в автоматическом режиме.
8.2.6 Градуировочную характеристику считают приемлемой, если рассчитанное с помощью компьютерной системы обработки данных значение коэффициента корреляции (коэффициент регрессии) каждого тиреостатика > 0,98, а значения отклонения содержания массовой доли определяемых соединений, рассчитанные по формуле (2), для каждой точки градуировочной характеристики не превышают 20 %:
9
ГОСТ 33978—2016
l^roan —^ оасч И 00
----< 20%, (2)
^расч.
где Сград — содержание определяемого соединения, найденное по градуировочной характеристике, мкг/кг,
Срасч — содержание определяемого соединения в градуировочном растворе, мкг/кг.
9 Метрологические характеристики
Установленный в настоящем стандарте метод обеспечивает выполнение измерений содержания тиреостатиков с расширенной неопределенностью результатов аналитических измерений при коэффициенте охвата к = 2 и доверительной вероятности Р = 0,95, указанной в таблице 5.
Таблица 5 — Показатели точности метода при проведении измерений содержания тиреостатиков
Тиреостатик | Диапазон измерений содержания, мкг/кг | Значение относительной расширенной неопределенности, Ц, при коэффициенте охвата к = 2, % | Показатель повторяемости (относительное стандартное отклонение повторяемости), ог % | Предел повторяемости, г, % (при Р = 0,95, к = 2) | Показатель воспроизводимости (относительное стандартное отклонение воспроизводимости), oR, % |
6-Пропил-2-тиоурацил | От 2,0 до 15,0 включ. | 63 | 22 | 61 | 32 |
Св. 15,0 до 30,0 включ. | 30 | 10 | 28 | 15 | |
6-Метил-2-тиоурацил | От 2,0 до 30,0 включ. | 32 | 12 | 33 | 16 |
2-Меркапто-бензими-дазол | От 0,4 до 8,0 включ. | 59 | 21 | 58 | 28 |
Св. 8,0 до 30,0 включ. | 37 | 13 | 36 | 16 | |
2-Тиоурацил | От 2,0 до 8,0 включ. | 69 | 30 | 83 | 35 |
Св. 8,0 до 30,0 включ. | 33 | 14 | 39 | 15 | |
6-Фенил-2-тиоурацил | От 2,0 до 8,0 включ. | 63 | 21 | 58 | 32 |
Св. 8,0 до 30,0 включ. | 43 | 15 | 42 | 22 |
10 Обработка результатов измерений
10.1 Расчет содержания /-го тиреостатика, мкг/кг, выполняется в автоматическом режиме с помощью программного обеспечения хромато-масс-спектрометра по формуле
где ct— концентрация /-го тиреостатика в анализируемой пробе, найденная по градуировочному графику, нг/см3;
Vj— объем разведения сухого остатка, см3;
т-'— масса навески анализируемой пробы, г.
10.2 За результат измерений принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:
10
ГОСТ 33978—2016
2|Xi-X2|-100 (Х-| + х2)
(4)
где Хр Х2 — результаты параллельных определений содержания тиреостатика, мкг/кг;
г— значение предела повторяемости, % (в соответствии с таблицей 5).
10.3 Если условие (4) не выполняется, получают еще два результата в полном соответствии с данной методикой измерений. За результат измерений принимают среднеарифметическое значение результатов четырех определений, если выполняется условие:
4|xmax ^minH^ (х1 + х2 + х3 + х4)
(5)
где Хтах, Xmjn — максимальное и минимальное значения из полученных четырех результатов параллельных определений содержания тиреостатика, мкг/кг;
СР0 95 — значение критического диапазона для уровня вероятности Р = 0,95 и n-результатов определений.
^0,95 ~ ^^г
для п = 4
^0,95 “ 3,60/.,
(6)
где вг— показатель повторяемости, % (в соответствии с таблицей 5).
10.4 Если условие (5) не выполняется, выясняют причины превышения критического диапазона, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями методики измерений.
11 Оформление результатов измерений
Содержание /-го тиреостатика, мкг/кг, представляют в виде Х/ ±0,01ЦХ/ при Р= 0,95,
(7)
где Xj — среднее арифметическое значение вычислений двух параллельных измерений содержания /-го тиреостатика в анализируемой пробе (см. 10.2), мкг/кг;
Ui — значение относительной расширенной неопределенности содержания /-го аналита для соответствующего диапазона измерений, % (в соответствии с таблицей 5);
0,01 ЦХ,— значение расширенной неопределенности в абсолютных единицах, мкг/кг.
Числовое значение результата измерений должно оканчиваться цифрой того же разряда, что и значение расширенной неопределенности, содержащее не более двух значащих цифр.
12 Контроль стабильности результатов измерений
Контроль стабильности результатов измерений в пределах лаборатории осуществляют по ГОСТ ИСО 5725-6 с использованием контрольных карт Шухарта.
11
ГОСТ 33978—2016
УДК 636.085:637.071:006.354
МКС 65.120
67.050
67.120
Ключевые слова: пищевые продукты, комбикорма, моча животных, тиреостатики, метод определения содержания тиреостатиков с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием
Редактор А.Е. Минкина
Технический редактор В.Н. Прусакова
Корректор М.С. Кабашова
Компьютерная верстка Е.О. Асташина
Сдано в набор 29.11.2019. Подписано в печать 08.12.2019. Формат 60><841/8. Гарнитура Ариал.
Усл. печ. л. 1,86. Уч.-изд. л. 1,68.
Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта
Создано в единичном исполнении во , 117418 Москва, Нахимовский пр-т, д. 31, к. 2.
МКС 65.120
67.050
67.120
Изменение № 1 ГОСТ 33978—2016 Продукты пищевые и комбикорма. Метод определения содержания тиреостатиков с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием
Принято Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол № 167-П от 17.11.2023)
Зарегистрировано Бюро по стандартам МГС № 17212
За принятие изменения проголосовали национальные органы по стандартизации следующих государств: AM, BY, KG, KZ, RU, UZ [коды альфа-2 по МК (ИСО 3166) 004]
Дату введения в действие настоящего изменения устанавливают указанные национальные органы по стандартизации*
Раздел 2. Исключить ссылку: «ГОСТ 6709 Вода дистиллированная. Технические условия»;
ГОСТ 12.2.085. Наименование изложить в новой редакции: «Арматура трубопроводная. Клапаны предохранительные. Выбор и расчет пропускной способности»;
исключить сноску *:
«------------------
* В Российской Федерации действует ГОСТ 12.2.085—2017 «Арматура трубопроводная. Клапаны предохранительные. Выбор и расчет пропускной способности»;
дополнить ссылкой: «ГОСТ 28311 Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний»;
примечание изложить в новой редакции:
«Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов и классификаторов на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (www.easc.by) или по указателям национальных стандартов, издаваемым в государствах, указанных в предисловии, или на официальных сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации. Если на документ дана недатированная ссылка, то следует использовать документ, действующий на текущий момент, с учетом всех внесенных в него изменений. Если заменен ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, то следует использовать указанную версию этого документа. Если после принятия настоящего стандарта в ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение применяется без учета данного изменения. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку».
Пункт 4.6 изложить в новой редакции:
«4.6 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- температура окружающего воздуха................................... от 15 °C до 30 °C;
- относительная влажность воздуха.................................... от 20 % до 80 %».
Раздел 4 дополнить пунктом 4.7:
«4.7 Утилизацию отходов проб и реактивов осуществляют в соответствии с требованиями нормативных документов, действующих на территории государства, принявшего настоящий стандарт».
Пункт 5.1. Третье перечисление изложить в новой редакции:
«- масс-спектрометр, оснащенный источником ионизации с электрораспылением, квадрупольными анализаторами, с диапазоном измерений от 25 до 1050 атомных единиц массы (а. е. м.) и относительным средним квадратическим отклонением выходного сигнала по площади пика не более 10 %, с режимом получения и анализа фрагментных ионов (режим МС/МС)»;
четвертое перечисление. Заменить значение: «до (50 ± 1) °C» на «не менее 40 °C»;
седьмое перечисление изложить в новой редакции:
«- встряхиватель (шейкер) для пробирок вибрационного, ротационного, линейного или орбитального типа»;
восьмое перечисление. Исключить слово: «погружной»;
Дата введения в действие на территории Российской Федерации — 2024—03—15.
1
(Продолжение Изменения № 1 к ГОСТ 339 78—2016)
десятое перечисление дополнить знаком сноски — *;
дополнить сноской *:
«-------------------
* Допускается применение хроматографических колонок, заполненных обращенно-фазным сорбентом С8 или С18 с диаметром частиц не более 5 мкм, длиной не менее 50 мм»;
двенадцатое перечисление изложить в новой редакции:
«- модуль термостатируемый нагревательный с системой отдувки растворителей инертным газом, позволяющий проводить концентрирование при температуре до 50 °C»;
семнадцатое перечисление изложить в новой редакции:
«- шкаф сушильный»;
восемнадцатое перечисление. После слова «картриджи» дополнить словами: «готовые или набивные»;
двадцать второе перечисление изложить в новой редакции:
«- колбы 2—10—2 по ГОСТ 1770»;
двадцать шестое перечисление изложить в новой редакции:
«- дозаторы механические одноканальные переменной вместимости 20—200, 100—1000 мм3 по ГОСТ 28311»;
двадцать седьмое перечисление исключить;
последнее перечисление. Заменить обозначение: «1-50(100, 1000)-1» на «1—50(100,1000)—2»;
дополнить перечислением:
«- систему получения инертного газа для концентрирования жидкостей».
Пункт 5.2. Третье перечисление. Исключить слова: «из дистиллированной воды по ГОСТ 6709».
Пункт 5.3 после слов «образцов сравнения» дополнить знаком сноски — *;
дополнить сноской *:
«------------------
* Допускается использовать в качестве образцов сравнения соединения с меньшей массовой долей основного вещества».
Пункт 6.3.5. Заголовок. Заменить обозначения: «G^ G2, G3 и G4» на «G1—G5»;
первый и последний абзацы. Заменить обозначения: «G1—G4» на «G1—G5»;
таблицу 1 изложить в новой редакции:
«Таблица 1 — Приготовление матричных градуировочных растворов G1—G5
Обозначение и массовая концентрация приготовляемо-го матричного градуировочного раствора | Вносимый объем рабочего раствора, см3 | ||
Ci | С2 | ||
G1 (60,0 нг/см3) | 0,03 | — | 0,04 |
G2 (32,0 нг/см3) | — | 0,80 | |
G3 (16,0 нг/см3) | — | 0,40 | |
G4 (4,0 нг/см3) | — | 0,10 | |
G5 (0,8 нг/см3) | — | 0,02 |
Пункт 8.2.2. Заменить обозначения: «G^ G2, G3, G4» на «G1—G5»; «G^ G2, G3» на «G1—G4».
Раздел 11 дополнить абзацем:
«В случае необходимости допускается представление результата измерений в мг/кг путем деления значения содержания /-го тиреостатика, полученного в соответствии с 10.1, и значения расширенной неопределенности 0,01 Ц • Xi в абсолютных единицах (мкг/кг) на 1000 (с сохранением количества значащих цифр)».
2
(Продолжение Изменения № 1 к ГОСТ 33978—2016)
Раздел 12 (кроме наименования) изложить в новой редакции:
«Контроль стабильности результатов измерений осуществляют в соответствии с документами, утвержденными в лаборатории. Рекомендуется использование контрольных карт Шухарта в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-6».
(ИУС № 3 2024 г.)
3