allgosts.ru67. ПРОИЗВОДСТВО ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ67.160. Напитки

ГОСТ Р 53185-2008 Напитки безалкогольные и слабоалкогольные тонизирующие. Методы испытания

Обозначение:
ГОСТ Р 53185-2008
Наименование:
Напитки безалкогольные и слабоалкогольные тонизирующие. Методы испытания
Статус:
Действует
Дата введения:
01/01/2010
Дата отмены:
-
Заменен на:
-
Код ОКС:
67.160.20

Текст ГОСТ Р 53185-2008 Напитки безалкогольные и слабоалкогольные тонизирующие. Методы испытания



ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

НАЦИОНАЛЬНЫМ

СТАНДАРТ

РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

ГОСТР

53185-

2008

НАПИТКИ БЕЗАЛКОГОЛЬНЫЕ И СЛАБОАЛКОГОЛЬНЫЕ ТОНИЗИРУЮЩИЕ

Методы испытания

Издание официальное

К

О

к

5

8

<4

I

«ч

м

id

Москва

Стандартинформ

2010

ГОСТ Р 53185—2008

Предисловие

Цели и принципы стандартизации а Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0—2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения »

Сведения о стандарте

1    РАЗРАБОТАН группой специалистов Некоммерческой организации «Национальный фонд защиты потребителей» при участии НИИ питания РАМН. ООО «Ред Булл». ООО «ПепсиКоХолдинге», ООО «Хэппилэнд», ООО «Браво-Премиум»

2    ВНЕСЕН Техническим комитетом ло стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность»

3    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 18 декабря 2008 г. № 635-ст

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется е ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Сгандартинформ.2010

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

ГОСТ Р 53185—2008

Содержание

1    Область применения...................................................1

2    Нормативные ссылки..................................................1

3    Отбор проб.........................................................2

4    Методы определения компонентов..........................................2

4.1    Метод определения таурина...........................................2

4.2    Метод определения глюкуронолактона....................................7

4.3    Метод определения инозита..........................................11

4.4    Метод определения Ькарнитина........................................14

4.5    Метод определения схиэандрина.......................................18

4.6    Метод определения элеутероэидое......................................22

4.7    Метод определения гинсеноэидов.......................................27

4.8    Метод определения кофеина..........................................31

4.9    Метод определения витамина В3 (ниацина).................................34

4.10 Метод определения витамина 8S (лантотеновой кислоты).......................38

4.11    Метод определения витамина Вв (лиридоксина гидрохлорида)....................41

Библиография........................................................45

in

ГОСТ Р 53185—2008

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

НАПИТКИ БЕЗАЛКОГОЛЬНЫЕ И СЛАБОАЛКОГОЛЬНЫЕ ТОНИЗИРУЮЩИЕ

Методы испытания

Alcohol-free and low-alcoholic tonic beverages. Test methods

Дата введения — 2010—01—01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает методы контроля содержания тонизирующих компонентов и биологически активных веществ, которые обеспечивают функциональное действие напитков безалкогольных тонизирующих и налитков слабоалкогольных тонизирующих.

Настоящийстандартнераслространяется начай. кофе, безалкогольные напитки на основе чайных и кофейных экстрактов.

Настоящий стандарт устанавливает в напитках безалкогольных тонизирующих и налитках слабоалкогольных тонизирующих следующие методы контроля:

•    метод определения кофеина;

•    метод определения таурина:

•    метод определения глюкуронолактона:

•    метод определения инозита;

•    метод определения L-карнитина;

•    метод определения схизандрина;

•    метод определения элеутерозидов:

- метод определения гинсенозидов:

•    метод определения витаминов: В3 (ниацин), В5 (пантотеновая кислота), Вв {пиридоксик гидрохлорид).

2    Нормативные ссылки

8 настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р ИСО 5725*1—2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ Р ИСО 5725-2—2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

ГОСТ Р ИСО 5725-6—2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть6. Использование значений точности на практике

ГОСТ Р 53228—2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

Издание официальное

1

ГОСТ Р 53185—2008

ГОСТ 1770—74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118—77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 4172—76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый деузамещенный 12-водный. Технические условия

ГОСТ 4198—75 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия ГОСТ 4199—76 Реактивы. Натрий тетраборнокислый 10-водный. Технические условия ГОСТ 4206—75 Реактивы. Калий железосинеродистый. Технические условия ГОСТ 4328—77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия ГОСТ 5789—78 Реактивы. Толуол. Технические условия ГОСТ 6552—80 Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия ГОСТ 6687.0—86 Продукция безалкогольной промышленности. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 6709—72 Водадистиллированная.Техничесхиеусловия ГОСТ 6995—77 Реактивы. Метанол-яд. Технические условия

ГОСТ 9147—80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия ГОСТ 10652—73 Реактивы. Сольдинатриввая этилендиамин-N. N. N'. N'-тетрауксусной кислоты 2-еодная (трилон Б). Технические условия

ГОСТ 12069—90 Меры длины штриховые брусковые. Технические условия ГОСТ 18270—72 Кислота уксусная особой чистоты. Технические условия ГОСТ 18704—78 Кислота борная. Технические условия ГОСТ 19710—83 Этиленгликоль. Технические условия

ГОСТ 19814—74 Кислота уксусная синтетическая и регенерированная. Технические условия ГОСТ 20903—75 Кюветы прямоугольные кварцевые для спектрофотометров. Основные размеры. Технические требования

ГОСТ 25336—82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29227—91 {ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии а сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется а части, не затрагивающей эту ссылку.

3    Отбор проб

3.1    Отбор проб безалкогольных и слабоалкогольных тонизирующих напитков — по ГОСТ 6687.0.

4    Методы определения компонентов

4.1    Метод определения таурина

4.1.1    Сущность метода

Определение таурина основывается на предколоночной двриватизациисортофталевым альдегидом в присутствии меркаптопропионовой кислоты «ОРА» и последующем хроматографическом разделении с помощью обращенно фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ). Детектирование ОРАдериватов проводят на спектрофотометрическом детекторе при к - 338 нм или флуорометрическом детекторе при Хех = 340 нм и лет = 450 нм.

2

ГОСТ Р 53185—2008

Т“+

^сно

HjN-CH*

80*Н

h

+ HS-tCHjfe-OH

S-fCH&OH

+

2HjO

«аН

4.1.2 Условия проведения анализа

При подготовке и проведении измерений должны быть соблюдены следующие условия:

температура окружающего воздуха относительная влажность воздуха напряжение в электросети.....

от 10 вС до 35 *С: от 40% до 95%: 220;|®*В.

220

В.

Помещение, где проводят работы с реактивами, должно быть обеспечено приточно-вытяжной вентиляцией.

4.1.3 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы и материалы Хроматограф жидкостной, оснащенный насосом высокого давления со скоростью подачи растворителя отО.1 до5.0см3/мин.

Хроматографическая аналитическая колонка: длина колонки — 250 мм. диаметр — 4.8 мм. заполненная октадецклсиликагелем. размером частиц 5 мкм.

Флуориметрический детектор: спектральный диапазон 200—600 нм. спектр излучения 320—800 нм.

Слектрофотометрический детектор на основе диодной матрицы: диапазон длин волн от 190 до 950 нм.

Таурин с массовой долей основного вещества не менее 99,0 %.

Бумажные фильтры «синяя лента».

Микрошприц МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Ультразвуковая установка с частотой ультразвука 43—45 кГц.

Аппарат для встряхивания проб.

Весы лабораторные по ГОСТ Р 53228 с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более 10.0001 г.

Колбы мерные 2-10-2.2-50-2.2-100-2.2-250-2.1-1000*2 поГОСТ 1770.

Стаканы химические вместимостью 50 и 1000 см3 по ГОСТ 25338.

Пипетки 4-1-2-2 или 5-1-2-2.4-2-2-10 или 5-2-2-10.4-2-2-25 или 5-2-2-25 по ГОСТ 29227.

Виалы (емкости для жидкостных проб) — плоскодонные микропробирки с завинчивающимися крышками объемом 1.5 см3.

Ацетонитрил для ВЭЖХ.

pH-метр с диапазоном измерений от 2 до 18ед. pH. погрешность измерений ±0,01 ед. pH.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или дистиллированная, фильтрованная через капроновый фильтр с диаметром пор 0.45 мкм.

Бумага фильтровальная с размером лор 0,5 мкм по ГОСТ 12089.

Мембранный фильтр с диаметром пор 0.45 мкм.

Капроновый фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

О-фталевый альдегиде массовой долей основного вещества не менее 98.0 %. 3-меркаптопролионоеая кислота с массовой долей основного вещества не менее 99,0 %.

Натрия ацетат трехводный х. ч.

Ледяная уксусная кислота х. ч. поГОСТ 19814.

Соляная кислота концентрированная х. ч. по ГОСТ 3118.

Тетраборат натрия (декагидрат) поГОСТ 4199.

Метанол ч. д. а. по ГОСТ 6995.

з

ГОСТ Р 53185—2008

Натрий гидроокись (гидроксид натрия) ч. д. а. по ГОСТ 4328.

Допускается применение других средств измерений и вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов по классу чистоты не ниже вышеуказанных.

4.1.4 Приготовление растворов

4.1.4.1    Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрацией 0.1 моль/дм3

Осторожно помещают 8.5 см3 концентрированной соляной кислоты с плотностью 1.1 г/см3 в мерный стакан вместимостью 1000 смэ. до половины заполненный дистиллированной водой. Перемешивают и доводят объем до 1000 см3.

4.1.4.2    Приготовление раствора уксусной кислоты массовой долей 1 %—2 %

1—2 г ледяной уксусной кислоты помещают в мерную колбу на 100 см3, наполовину заполненную дистиллированной водой, доводят объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

4.1.4.3    Приготовление подвижной фазы

Для приготовления подвижной фазы А молярной концентрацией 0,02 моль/дм3 в стакан вместимостью 1000 см3 помещают (1.360 ± 0,025) г тригидроацетата натрия, добавляют 500 см3 дистиллированной воды, доводят pH до 6.6 (контролируют pH-метром) с помощью раствора уксусной кислоты массовой долей 1 %—2 %. Полученный раствор фильтруют через капроновый фильтр с диаметром пор 0.45 мкм. В качестве подвижной фазы В используют ацетонитрил. Раствор хранят в темном прохладном месте не более трех недель.

4.1.4.4    Приготовление раствора ОРА массовой концентрацией 5 мг/см3

150 мго-фталееого альдегида растворяют в 3 см3 метанола в мерной колбе вместимостью 25 см3, добавляют 120 мм3 3-меркалтопропионоеой кислоты и доводят объем до 25 см3 водным раствором боратного буфера молярной концентрацией 0.4 моль/дм3 (0.4 Н)с pH = 10.4 (приготовление раствора см. ниже). Раствор хранят в темном прохладном месте не более трех недель.

4.1.4.5    Приготовление раствора гидроксида натрия молярной концентрацией 1 моль/дм3 (1 Н)

Навеску гидроксида натрия массой (4.0 ± 0.1) г растворяют дистиллированной водой, не содержащей углекислого газа, в мерной колбе объемом 1 дм3, раствор доводят водой до метки. Раствор можно приготовить из стандарт-титра.

4.1.4.6    Приготовление боратного буфера молярной концентрацией 0,4 моль/дм3 (0,4 Н)

76 г натрия тетрабората (декагидрат) помещают в стакан вместимостью 1000 см3, добавляют 1000 см3 дистиллированной воды и прибавляют раствор гидрооксида натрия молярной концентрацией 1 моль/дм3 (1Н) до (10.4 ♦ 0,05) ед. pH. Полученный раствор фильтруют через капроновый фильтр с диаметром лор 0,45 мкм. Раствор хранят в темном прохладном месте не более трех недель.

4.1.4.7    Приготовление стандартных градуировочных растворов таурина

Стандартные градуировочные растворы таурина готовят для расчета градуировочной зависимости по четырем точкам, от меньшей массовой концентрации к большей, из основного стандартного раствора № 1.

Стандартные градуировочные растворы таурина хранят не более трех месяцев.

Для приготовления градуировочногораствора №1 (основного)наввску таурина массой 50 мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, до половины заполненную раствором соляной кислоты молярной концентрацией 0.1 моль/дм3 (0.1 Н). перемешивают до полного растворения вещества, доводят до метки и тщательно перемешивают.

Для приготовления градуировочных растворов №№ 2—4 отбирают пипетками соответствующие аликвоты градуировочного раствора № 1 в соответствии с таблицей 1. помещают их в мерные колбы и доводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивая.

Таблице 1 — Приготовление стандартных градуировочных растворов таурина

№ п/я

N» стандартного раствора

Вместимость мерной колбы.

сы’

Способ

приготовления

Массовая

концентрация, ыг/ды'1

1

1

(основной}

100

Навеску таурине массой S0 мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, до половины заполненную раствором соляной кислоты молярной концентрацией 0.1 моль/дм1 (0.1 Н). перемешивают до полного растворения вещества, доводят до метки и тщательно перемешивают

600

ГОСТ Р 53185—2008

Окончание таблицы 1

N* п/п

№ стандартного раствора

вместимость мерной молбм. см3

Способ

приготовления

Массовая

концентрация, мг.’дм3

2

2

2S

Отбирают 10 см3 раствора № 1. переносят в мерную колбу, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают

200

3

3

2S

Отбирают 5 см3 раствора No 1. переносят в мерную колбу, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают

100

4

4

25

Отбирают 0.5 см3 раствора Ns 1. переносят в мерную колбу, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают

10

Примечание — Раствор № 4 используют в качестве одного из контрольных растворов в повседневных анализах, поскольку его массовая концентрация наиболее близка к среднему содержанию таурина в анализируемых пробах.

4.1.5    Подготовка образца к анализу

Энергетический напиток наливают в химический стакан вместимостью 50 см3 и удаляют газ в токе азота. Аликвоту напитка 10 см3 помещают в мерную колбу вместимостью 250 см3, доводят раствором соляной кислоты молярной концентрацией 0.1 моль/дм3 (0.1 Н) до метки и тщательно перемешивают. Фильтруют через бумажный фильтр «синяя лента», затем через мембранный фильтр с размером лор 0.45 мкм.

4.1.6    Проведение измерений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

4.1.6.1    Условия хроматографического анализа

Условия хроматографического анализа:

колонка ло4.1.3.2;

подвижная фаза в процентах по объему: 85 % тригидроацетага натрия молярной концентрацией 0.02 моль/дм3 с pH 6.6 (фаза А) и 15 % ацетонитрила (фаза 6):

скорость подвижной фазы 1,0смэ/мин:

детектирование: УФ ). = 338 нм (рефрактометрическое >. = 390 нм) и по флуоресценции, при Хех - 340 нм и лет - 450 нм.

При использовании инжектора предколоночную дериватизацию проводят в виалах. с помощью шприца помещают 50 мм3 боратного буфера. 10 мм3 ОРА, 10 мм3 подготовленного образца, перемешивают. набирая в шприц и обратно5—10 раз. и вводят пробу 10 мм3. Вводить пробу необходимо сразу же. так как ОРА комплексы не стойкие и разрушаются в течение 2—5 мин.

4.1.6.2    Построение градуировочной зависимости

Проводят хроматографический анализ всех градуировочных растворов таурина.

Регистрируют площади пиков и строят градуировочный график — зависимость площади пика от массовой концентрации таурина в градуировочном растворе.

Процедуры построения градуировочной зависимости выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования и руководством пользователя программным обеспечением.

Градуировочную зависимость выражают линейным уравнением

y-kx.    (1)

Правильность построения градуировочной зависимости контролируется величиной достоверности аппроксимации (/?2)

*0,9997.

Из уравнения (1) следует, что площадь пиков градуировочных растворов таурина S (mV с или V • с) и их массовая концентрация с(мг/дм3) находятся в соответствующей функциональной зависимости

где к — градуировочный коэффициент. [мг/дм3/ту • с]-'.

5

ГОСТ Р 53185—2008

кш^.с.)    <3>

ic?

где S, — площадь пика соответствующего вещества л ри анализе ьго стандартного раствора. mAU с или AUc;

С; — массовая концентрация соответствующего вещества при анализе ко стандартного раствора. мг/дм3.

Градуировочную зависимость строят при смене хроматографа, колонок, условий хроматографического анализа или при выявлении несоответствия метрологическим требованиям результатов оперативного контроля или внутреннего аудита.

4.1.6.3 Анализ проб

Проводят хроматографический анализ подготовленных проб ло4.1.5. Каждую пробу продукта анализируют два раза в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ РИСО 5725-1 (под-раздел 3.14) и ГОСТ Р ИСО 5725-2. Регистрируют площадь пика таурина, в случае, если площадь пика выходит за границы диапазона градуировки хроматографа, готовят новую менее или более разбавленную пробу и анализ повторяют.

4.1.7    Обработка результатов определения

Массовую концентрацию таурина в пробе продукта рассчитывают по градуировочным зависимостям с учетом степени разведения, вычисления проводят до третьего десятичного знака.

Обработку хроматограмм и расчет количественных характеристик проводят с помощью программно-аппаратного комплекса сбора и обработки данных, с использованием градуировочной зависимости

c<X)=£i-ii    <4>

или по формуле с использованием стандартного градуировочного раствора таурина

е(Х) = с"'5'    (5)

где S, — площадь пика анализируемого вещества. mV • с или V • с;

V2 — вместимость мерной колбы, взятой для разбавления, см3; к— градуировочный коэффициент. [мг/дм3/тУ •с]-1;

V, — объем пробы, отобранный для измерения, см3; с (X) — массовая концентрация таурина в анализируемой пробе, мг/дм3; сС1 — массовая концентрация таурина в стандартном растворе, мг/дм3;

Sc, — площадь пика анализируемого вещества в стандартном растворе. mV с или V • с.

Результаты обработки двумя способами (программно-аппаратным и расчетным) должны сходиться.

4.1.8    Оформление результатов измерений

За окончательный результат измерений принимают среднеарифметическое двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости

2.IX.-X,! юо,,    ,Й1

(х, + хг)

гдеХ,.Х2 — результаты параллельных определений. мг/дмэ;

гоп, — значение предела повторяемости (в процектахот среднеарифметического значения), приведенное втаблицахметрологичвскиххарактеристикдлякаждой методики при вероятности Р = 0.95.

Предел воспроизводимости R — значение, котороес доверительной вероятностью 95 % не превышается абсолютной величиной разности между результатами двух измерений, полученными в условиях воспроизводимости

IX.-^UO.OIR^.X^.    (71

где Я01и — значение предела воспроизводимости (в процентах от среднеарифметического значения), приведенное в таблицах метрологических характеристик для каждой методики при вероятности Р= 0.95;

Х^ — среднеарифметическое двух результатов измерений, выполненных в условиях воспроизводимости. мг/дм3.

При соблюдении условий, регламентированных методиками (методами) измерений настоящего стандарта, при вероятности Р-Соотносительная погрешность измерений ±6% не должна превышать

6

ГОСТ Р 53185—2008

значений, приведенных в таблицах метрологических характеристик для каждой методики (метода) измерений.

Результат анализа представляют в виде

(X1Д) мг/дм3 при вероятности Р - 0.95,

гдеХ — среднеарифметическое значение результатов определений, признанных приемлемыми. мг/дм3.

± д — абсолютная погрешность измерений. мг/дмэ. рассчитанная по формуле

Д= 0.01 8 X.    (в)

где 8— границы относительной погрешности методики (метода) измерений. % (значения приведены в таблицах метрологических характеристик для каждой методики при вероятности Р - 0,95).

4.1.9    Контроль повторяемости (сходимости) результатов измерений проводят путем сравнения абсолютного расхождения между результатами двух параллельных определений, выполненных в уело* виях повторяемости с пределом повторяемости, приведенным в таблице 2.

Сходимость результатов признают удовлетворительной при условии

|Х,-Х2|* 0.01-гоп.-Хф.    (в)

При превышении норматива контроля повторяемости (сходимости) измерения повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725*6 (пункт 5.3.4).

4.1.10    Показатели точности и прецизионности измерений массовой концентрации таурина Показатели точности и прецизионности измерений массовой концентрации таурина при Р- 0,95

приведены в таблице 2.

Таблица 2

Метропотическая характеристика (Р • 0.95}

Значение

Диапазон измерений, мг/дм3

От 1 до 500 включ.

Св. 500 до 5000

Предел повторяемости гаш, %

17

11

Предел воспроизводимости ft,,*. %

25

13

Границы относительной погрешности ± &.%

9

4.2 Метод определения гтокуронолактона

4.2.1    Сущность метода

Метод основан на идентификации и количественном определении D-глюкуроно-у-лактона с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением рефрактометрического и ультрафиолетового детектирования.

4.2.2    Условия проведения анализа

При подготовке и проведении измерений должны быть соблюдены следующие условия:

температура окружающего воздуха.............от 10 вС до 35 *С;

относительная влажность воздуха.............от 40 % до 95 %;

напряжение в электросети.................. 220;]“*В.

Помещение, где проводят работы с реактивами, должно быть обеспечено приточно-вытяжной вентиляцией. Все операции с реактивами следует проводить в вытяжном шкафу.

4.2.3 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы и материалы

Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0,1 до 5см3/мин.

Хроматографическая аналитическая колонка: длина колонки — 250 мм. диаметр — 4.6 мм. заполненная октадецилсиликагелем размером частиц 5 мкм.

Хроматографическая аналитическая колонка: длина колонки — 300 мм. диаметр — 7.8 мм. с катионитом в форме Са++ на основе сульфированного стиролдивинилбенэола в ионной кальциевой форме (8%).

Рефрактометрический детектор: предел детектирования по глюкозе < 1 • 10~s г.

7

ГОСТ Р 53185—2008

Термостат колонок: температурный диапазон от 10 *С до 80 *С.

Слектрофотометричесхий детектор: диапазон длин волн от 190 до 950 нм.

Микрошприц МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Ультразвуковая установкасчастотой ультразвука 43—45 кГц.

Аппарат для встряхивания проб.

Весы лабораторные по ГОСТ Р 53228 с пределами абсолютной погрешности однократного взвешивания ± 0.0001 г.

Колбы мерные наливные 2-50-2,2-100-2.2-250-2.1-1000-2 поГОСТ 1770.

Пипетки4-1-2-2 или5-1-2-2.4-2-2-10или 5-2-2-10.4-2-2-25или5-2-2-25 по ГОСТ29227.

Ацетонитрил для ВЭЖХ.

Шкаф сушильный, обеспечивающий нагрев до 150 *С.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или дистиллированная, фильтрованная через капроновый фильтр с диаметром пор 0.45 мкм.

Бумага фильтровальная с размером пор 0.5 мкм по ГОСТ 12069.

Бумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ.

Капроновый фильтре диаметром пор 0.45 мкм.

0-глюкуроно-7-лактон кристаллический с содержанием основного вещества не менее 99.9 %.

Допускается применение других средств измерений и вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов по классу чистоты не ниже вышеуказанных.

4.2.4 Подготовка к анализу

4.2.4.1 Приготовление стандартных градуировочных растворов D-глюкуроно-у-лактона

Стандартные градуировочные растворы О-гл юкуроно-у-лактона готовят для расчета градуировочной зависимости по четырем точкам, от меньшей массовой концентрации к большей, изосновного стандартного раствора № 1.

Стандартные градуировочные растворы D-глюкуроно-у-лактона хранят не более трех месяцев.

Для приготовления градуировочного раствора № 1 (основного) навеску О-глюкуроно-у-лактона массой 75 мг помещают в мерную колбу вместимостью 25 см3, до половины заполненную дистиллированной водой, перемешивают до полного растворения вещества, доводят до метки и тщательно перемешивают.

Для приготовления градуировочных растворов NeNo 2—4 отбирают пипетками соответствующие аликвоты градуировочного раствора Ne 1 в соответствии с таблицей 3. помещают их в мерные колбы и доводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивая.

Таблице 3 — Приготовление стандартных градуировочных растворов 0-глюкуроно-?-лвктона

Nf п/п

стандартного

раствора

вместимость мерной колбы. см3

Способ приготовления

Массовая

концентрация.

1

1

(основной)

25

Навеску О-глюкуроно-г-лактона массой 75 мг помещают в мерную колбу вместимостью 25 см3, до половины заполненную дисгиллированой водой, перемешивают до полного растворения вещества, доводят до метки и тщательно перемешивают

3000

2

2

25

Отбирают 5 см3 раствора Не 1. переносят в мерную колбу, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают

600

3

Э

25

Отбирают 2 см1 раствора Не 1. переносят в мерную колбу, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают

240

4

4

25

Отбирают 0.5 см* растворе № 1. переносят в мерную колбу, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают

60

Примечание — Раствор Ш 3 используют в качестве одного из контрольных растворов в текущих анализах. поскольку его массовая концентрация наиболее близка к среднему содержанию О-глюкуроно-г-лактонв в анализируемых пробах.

8

ГОСТ Р 53185—2008

4.2.4.2 Подготовка образца

Энергетический напиток наливают в химический стакан вместимостью 50 см3 и удаляют газ в токе азота. Аликвоту напиткав 10 см3 помещаюта мерную колбу вместимостьюбО см3, доводят объем раствора дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают ифильтруютчереэ складчатый бумажный фильтр с размером пор 0.5 мкм или через капроновый фильтр.

4.2.5 Проведение измерений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

4.2.5.1    Приготовление подвижной фазы

550см3 ацетонитрила помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см3, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтруют через фильтровальную бумагу с диаметром пор 0.5 мкм или через капроновый фильтр с диаметром пор 0.45 мкм в установке для фильтрования растворов.

4.2.5.2    Условия хроматографического анализа Условия ВЭЖХ при анализе энергетических напитков: колонка Л0 4.2.3.2;

подвижная фаза ацетонитрил-вода (55:45) в процентах по объему: скорость потока 1.0 см3/мин;

детектор слектрофотометрический. длина волны >.= 210 нм; аликвота, вводимая в инжектор. 10—15мкл: ориентировочное время D-глюкуроно-у-лактона (3.9 ± 0.3) мин.

4.2.5.3    Построение градуировочной зависимости

Проводят хроматографический анализ всех градуировочных растворов D-глюкуроно-у-лактона. Регистрируют площади пиков и строят градуировочный график — зависимость площади пика от массовой концентрации D-глюкуроно-у-лактона в градуировочном растворе.

Процедуры построения градуировочной зависимости выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования и руководством пользователя программным обеспечением. Градуировочную зависимость выражают линейным уравнением

у-кх.    {Ю)

Правильность построения градуировочной зависимости контролируется величиной достоверности аппроксимации (/?2)

R3 а 0.9997.

Из уравнения (10) следует, что площадь пиков градуировочных растворов D-глюкуроно-у-лактона S (mV - с или V • с) и их массовая концентрация с (мг/дм3) находятся в соответствующей функциональной зависимости

к

где к — градуировочный коэффициент. [мг/дм3/тУ - с)-'.

(12)

гс*

гдеЭ, — площадь пика соответствующего вещества при анализе/-гостандартногораствора. mAU - с или AU с;

с, — массовая концентрация соответствующего вещества при анализе ьго стандартного раствора. мг/дм3.

Градуировочную зависимость строят при смене хроматографа, колонок, условий хроматографического анализа или при выявлении несоответствия метрологическим требованиям результатов оперативного контроля или внутреннего аудита.

4.2.5.4 Анализ проб

Проводят хроматографический анализ подготовленных проб по 4.2.4.2. Каждую пробу продукта анализируют два раза в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-1 (подраздел 3.14) и ГОСТ Р ИСО 5725-2. Регистрируют площадь пика D-глюкуроно-у-лактона. В случае, если площадь пика выходит за границы диапазона градуировки хроматографа, готовят новую менее или более разбавленную пробу и анализ повторяют.

4.2.6 Обработка результатов определения

Массовую концентрацию D-глюкуроно-у-лактона в пробе продукта рассчитывают по градуировочным зависимостям с учетом степени разведения. Вычисления проводят до третьего десятичного знака.

9

ГОСТ Р 53185—2008

Обработку хроматограмм и расчет количественных характеристик проводят с помощью программно-аппаратного комплекса сбора и обработки данных, с использованием градуировочной зависимости

с<Х) = ^-    (13)

k-V,

или по формулам с использованием стандартного градуировочного раствора D-глюкуроно-улактоиа

с(Х)~ с" S- 'v*,    (14)

где с(Х) — массовая концентрация О-глюкуроно-х.-лактона в анализируемой пробе, мг/дм3;

S„ — площадь пика анализируемого вещества. mV с или V ■ с;

V3 — вместимость мерной колбы, взятой для разбавления, см3: к — градуировочный коэффициент. [мг/дм3/тУ • с)-1;

V, — объем пробы, отобранный для измерения, см3:

сС1 — массовая концентрация D-глюкуроно-улактона в стандартном растворе, мг/дм3;

Sct — площадь пика анализируемого вещества в стандартном растворе. mV с или V с. Результаты обработки двумя способами (программно-аппаратным и расчетным) должны сходиться.

4.2.7    Оформление результатов измерений

За окончательный результат измерений принимают среднеарифметическое двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости

2 |Х, - Хг|-100    f1Sv

(*,-*,) оп‘'

где X,. Х2 — результаты параллельных определений, мг/дм3:

готм — значениепредвла повторяемости (впроцентахот среднеарифметического значения), при-веденноевтаблицахметрологическиххарактеристикдлякаждой методики лри вероятности Р= 0,95.

Предел воспроизводимости R •— значение, котороес доверительной вероятностью 95 % не превышается абсолютной величиной разности между результатами двух измерений, полученными в условиях воспроизводимости

|X1-Xa|S0.01-«m.Xqil    (16)

где Я01и — значение предела воспроизводимости (в процентах от среднеарифметического значения), приведенное в таблицах метрологических характеристик для каждой методики при вероятности Р- 0,95;

Xt{, — среднеарифметическое двух результатов измерений, выполненных в условиях воспроизводимости. мг/дм3.

При соблюдении условий, регламентированных методиками (методами) измерений настоящего стандарта, при вероятности Р-безотносительная погрешность измерений ± 8% не должка превышать значений, приведенных в таблицах метрологических характеристик для каждой методики (метода) измерений.

Результат анализа представляют в виде

(Х±д) мг/дм3 при вероятности Р - 0.95,

гдеХ — среднеарифметическое значение результатов определений, признанных приемлемыми. мг/дм3;

± д — абсолютная погрешность измерений, мг/дм3. рассчитанная по формуле

д = 0,01 • 5 -X,    (17>

где 8— границы относительной погрешности методики (метода) измерений, % (значения приведены в таблицах метрологических характеристик для каждой методики при вероятности Р-0.95).

4.2.8    Контроль повторяемости (сходимости) результатов измерений проводят путем сравнения абсолютного расхождения между результатами двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости с пределом повторяемости, приведенным в таблице 4.

Сходимость результатов признают удовлетворительной при условии

|X1-X2|S0.01.re№-X<p.    (18,

10

ГОСТ Р 53185—2008

При превышении норматива контроля повторяемости (сходимости) измерения повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6 (пункт 5.3.4).

4.2.9 Показатели точности и прецизионности измерений массовой концентрации D-глюку роно-у-лактона

Показатели точности и прецизионности измерений массовой концентрации D-глюкуроно-у-лакто-на при Р - 0.95 приведены е таблице 4.

Таблица 4

Метропотическая характеристика (Р * 0.95}

Значение

Диапазон концентраций, мг/дм*

От 10 до 1000 включ.

Св. 1000 до 5000

Предел повторяемости гт, %

30

11

Предел воспроизводимости Я«,„. %

35

15

Границы относительной погрешности » &.

25

11

4.3 Метод определения инозита

4.3.1    Сущность метода

Метод основан на идентификации и количественном определении инозита с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии.

4.3.2    Условия проведения анализа

При подготовке и проведении измерения должны быть соблюдены следующие условия:

температура окружающего воздуха.............от 10 вСдо35 *С;

относительная влажность воздуха.............от 40% до 95%:

напряжение в электросети.................. 220‘J®£B.

Помещение, гдепроеодят работысреактивами. должно быть обеспечено приточно-вытяжной вентиляцией.

все операции с реактивами следует проводить в вытяжном шкафу.

4.3.3    Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы и материалы

Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0.1 до

5смэ/мин.

Хроматографическая аналитическая колонка: длина колонки 250 мм. диаметр 4.6 мм, на основе ковалентной сшивки аминосилана к поверхности силикагеля, размер частиц 5 мкм.

Рефрактометрический детектор: предел детектирования по глюкозе< 1 • 10~9г.

Микрошприц МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Весы лабораторные по ГОСТ Р 53228 с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0,0001 г.

Колбы мерные наливные 2-50-2,2-100-2.2-250-2.1-1000*2 поГОСТ 1770.

Пипетки 4-1-2-2 или 5-1-2-2.4-2-2-10 или 5-2-2-10,4-2-2-25 или 5-2-2-25 по ГОСТ 29227.

Ацетонитрил для ВЭЖХ.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или дистиллированная, фильтрованная через капроновый фильтр с диаметром пор 0.45 мкм.

Бумага фильтровальная с размером пор 0.5 мкм поГОСТ 12069.

Бумажные фильтры обеээоленные марки ФОМ.

Капроновый фильтр с диаметром пор 0.45 мкм.

Установка для фильтрования растворов.

Шкаф сушильный, обеспечивающий нагрев до 150 ®С.

Инозит кристаллический с массовой долей основного вещества не менее 99.0 % или по действующей нормативно-технической документации.

Допускается применение других средств измерений и вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов по классу чистоты не ниже вышеуказанных.

4.3.4    Приготовление растворов

4.3.4.1 Приготовление стандартных градуировочных растворов инозита

11

ГОСТ Р 53185—2008

Стандартные градуировочные растворы инозита готовят для расчета градуировочной зависимости по четырем точкам, от меньшей массовой концентрации к большей, из основного стандартного раствора Nv 1.

Стандартные градуировочные растворы инозита хранят не более трех месяцев.

Для приготовления градуировочного раствора № 1 (основного) навеску инозита массой 100 мг помещают в мерную колбу вместимостью 50 см3, до половины заполненную дистиллированной водой, перемешивают до полного растворения вещества, доводят до метки и тщательно перемешивают.

Для приготовления градуировочных растворов №N9 2—4 отбирают пипетками соответствующие аликвоты градуировочного раствора № 1 в соответствии с таблицей 5. помещают их в мерные колбы и доводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивая.

Таблице 5 — Приготовление стандартных градуировочных растворов инозита

Ш nln

N1 стандартного раствора

Вместимость мерной колбы. см3

Способ приготовления

Массовая

концентрация.

ui/дм*

1

1

(основной)

50

Навеску инозите массой 100 мг помещают в мерную колбу вместимостью 50 см1, до половины заполненную дистиллироввной водой, перемешивают до полного растворения вещества, доводят до метки и тщательно перемешивают

2000

2

2

2S

Отбирают Ю см3 раствора № 1. переносят а мерную колбу, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают

800

3

3

2S

Отбирают 5 см1 раствора N9 1. переносят а мерную колбу, доводят дистиллированной водой до матки и тщательно перемешивают

400

4

4

2S

Отбирают 1 см1 раствора Ns 1. переносят в мерную колбу, доводят дистиллированной водой до матки и тщательно перемешивают

60

Примечание — Раствор № 2 используют в качестве одного из контрольных растворов в текущих анализах. поскольку его массовая концентрация наиболее близкв к среднему содержанию инозита в анализируемых пробах.

4.3.4.2 Подготовка образца

Энергетический напиток наливают в химический стакан вместимостью 50 см3 и удаляют газ в токе азота. Аликвоту напитка в 10 смэ помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят объем раствора дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают и фильтруют через складчатый бумажный фильтр с размером пор 0.5 мкм или через капроновый фильтр.

4.3.5 Проведение измерений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

4.3.5.1    Приготовление подвижной фазы

770 см3 ацетонитрила помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см3, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтруют через фильтровальную бумагу с диаметром пор 0.5 мкм или через капроновый фильтр с диаметром пор 0.45 мкм в установке для фильтрования растворов.

4.3.5.2    Условия хроматографического анализа

Условия ВЭЖХ:

колонка по 4.3.3.2;

подвижная фаза ацетонитрил-вода (77:23) в процентах по объему.

скорость подвижной фазы 1,0 cmVmhh.

аликвота, вводимая в инжектор 10—15 мкл.

Ориентировочное время удерживания инозита (10.0 ± 0.2) мин.

4.3.5.3    Построение градуировочной зависимости

Проводят хроматографический анализ всех градуировочных растворов инозита.

Регистрируют площади ликов и строят градуировочный график — зависимость площади пика от массовой концентрации инозита в градуировочном растворе.

12

ГОСТ Р 53185—2008

Процедуры построения градуировочной зависимости выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования и руководством пользователя программным обеспечением.

Градуировочную зависимость выражают линейным уравнением

у = кх.    {19)

Правильность построения градуировочной зависимости контролируется величиной достоверности аппроксимации (/?2)

*2*0.9997.

Из уравнения (19) следует, что площадь пиков градуировочных растворов инозита S (mV • с или V с) и их массовая концентрация с(мг/дм3) находятся в соответствующей функциональной зависимости

с = 1,    (20)

к

где к — градуировочный коэффициент. [мг/дм3/тУ • с]'1.

Ч = 1    (21)

£в*

гдев,. — площадь пика соответствующего вещества при анализе /-гостандартногораствора.тАи с или AU с;

с, — массовая концентрация соответствующего вещества при анализе /-го стандартного раствора. мг/дм3.

Градуировочную зависимость строят при смене хроматографа, колонок, условий хроматографического анализа или при выявлении несоответствия метрологическим требованиям результатов оперативного контроля или внутреннего аудита.

4.3.5.4 Анализ проб

Проводят хроматографический анализ подготовленных проб по 4.2.4.2. Каждую пробу продукта анализируют два раза в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-1 (подраздеп 3.14) и ГОСТ Р ИСО 5725-2. Регистрируют площадь пика инозита. 8 случае, если площадь пика выходит за границы диапазона градуировки хроматографа, готовят новую менее ил и более разбавленную пробу и анализ повторяют.

4.3.6 Обработка результатов определения

Массовую концентрацию инозита в пробе продукта рассчитывают по градуировочным зависимостям с учетом степени разведения. Вычисления проводят до третьего десятичного знака.

Обработку хроматограмм и расчет количественных характеристик проводят с помощью программно-аппаратного комплекса сбора и обработки данных с использованием градуировочной зависимости

c(X)«£iJi    (22)

* К

или по формулам с использованием стандартного градуировочного раствора инозита

с(Х)«

c„ S, v2

(23)

гдес(Х) — массовая концентрация инозита в анализируемой пробе, мг/дм3;

S, — площадь пика анализируемого вещества. mV • с или V с:

V2 — вместимость мерной колбы, взятой для разбавления, см3; к — градуировочный коэффициент. [мг/дм3/тУ •с]*’;

V, — объем пробы, отобранный для измерения, см3;

с4, — массовая концентрация инозита в стандартном растворе, мг/дм3;

Scr — площадь пика анализируемого вещества в стандартном растворе. mV с или V с. Результаты обработки двумя споообами (программко-аппаратным и расчетным) допжны сходиться.

4.3.7 Оформление результатов измерений

За окончательный результат измерений принимают среднеарифметическое двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости

2|Х,-Х:|100^

—гг:—г-:—»'огы> {X, * X,)

(24)

гдеХгХ2 — результаты параллельных определений, мг/дм3;

13

ГОСТ Р 53185—2008

г01и — значение предела повторяемости (в процентах от среднеарифметического значения), приведенное етаблицахметрологическиххарактеристик для кажаой методики при вероятности Р= 0.95.

Предел воспроизводимости R — значение, котороес доверительной вероятностью 95 % не превышается абсолютной величиной разности между результатами двух измерений, полученными в условиях воспроизводимости

|Х, - Х2| £ 0.01 ■ Roni ■ Х.    ,25}

гдеХС|> — среднеарифметическое двух результатов измерений, выполненных в условиях воспроизводимости. мг/дм3;

Р0,и — значение предела воспроизводимости (в процентах от среднеарифметического значения), приведенное етаблицах метрологическиххарактеристикдля каждой методики при вероятности 0.95.

При соблюдении условий, регламентированных методиками (методами) измерений настоящего стандарта, при вероятности Р-0.95 относительная погрешность измерений ± 8% не должна превышать значений, приведенных в таблицах метрологических характеристик для каждой методики (метода) измерений.

Результат анализа представляют в виде

(X ± Д) мг/дм3 при вероятности Р - 0.95,

гдеХ — среднеарифметическое значение результатов определений, признанных приемлемыми, мг/дм3; ± д— абсолютная погрешность измерений, мг/дм3. рассчитанная по формуле

д s 0,01 • б -Х",    ,26)

где б—границы относительной погрешности методики (метода) измерений. % (значения приведены в таблицах метрологических характеристикдля каждой методики при вероятности Р-0.95).

4.3.8    Контроль повторяемости (сходимости) результатов измерений проводят путем сравнения абсолютного расхождения между результатами двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости с пределом повторяемости, приведенным в таблице 6.

Сходимость результатов признают удовлетворительной при условии

1Х,-Хг|£0.01-Гв1Мф.    ,27}

При превышении норматива контроля повторяемости (сходимости) измерения повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6 (5.3.4).

4.3.9    Показатели точности и прецизионности измерений массовой концентрации инозита Показатели точности и прецизионности измерений массовой концентрации инозита при Р- 0.95

приведены в таблице 6.

Таблице 6

Метрологическая характеристика (Р * 0.95)

Значения

Диапазон измерений, мг/дм3

От 20 до 300 еключ.

Св. 300 до 1000

Предел повторяемости г0,.. %

31

24

Предел воспроизводимости Ra,., %

36

28

Границы относительной погрешности t Д Ч

26

20

4.4 Метод определения L-карнитина

4.4.1    Сущность метода

Метод основан на идентификации и количественном определении свободного L-карнитина с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением рефрактометрического детектирования.

4.4.2    Условия проведения анализа

При подготовке и проведении измерения должны быть соблюдены следующие условия: температура окружающего воздуха.............от 10 *С до 35 °С;

14

ГОСТ Р 53185—2008

относительная влажность воздуха.............от 40% до 95%;

напряжение в электросети.................. 220 "l™ в.

Помещение, где проводят работы с реактивами, должно быть обеспечено приточно-вытяжной вентиляцией.

Все операции с реактивами следует проводить в вытяжном шкафу.

4.4.3    Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы и материалы

Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0.1 до

5смэ/мин.

Хроматографическая аналитическая колонка: длина колонки 250 мм. диаметр 4.6 мм. на основе ковалентной сшивки аминосилана к поверхности силикагеля, размер частиц 5 мкм.

Рефрактометрический детектор: предел детектирования по глюкозе < 1 10*5 г.

Микрошприц МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Весы лабораторные по ГОСТ Р 53228 с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0.0001 г.

Колбы мерные наливные 2-50-2,2-100-2.2-250-2,1-1000-2 по Г ОСТ 1770.

Пипетки 4-1-2-2 или 5-1-2-2.4-2-2-10 или 5-2-2-10.4-2-2-25 или 5-2-2-25 по ГОСТ 29227.

Ацетонитрил для ВЭЖХ.

8ода дистиллированная по ГОСТ 6709 или дистиллированная, фильтрованная через капроновый фильтр с диаметром пор 0.45 мкм.

Бумага фильтровальная с размером лор 0.5 мкм по ГОСТ 12069.

Бумажные фильтры обеэзоленные марки ФОМ.

Капроновый фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Установка для фильтрования растворов.

Шкаф сушильный, обеспечивающий нагрев до 150 *С.

L-карнитин гидрохлорид кристаллический с массовой долей основного вещества не менее 98.0 % или по действующей нормативно-технической документации.

Допускается применение других средств измерений и вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов по классу чистоты не ниже вышеуказанных.

4.4.4    Приготовление реактивов

4.4.4.1 Приготовление стандартных градуировочных растворов L-карнитина

Стандартные градуировочные растворы L-карнитина готовят для расчета градуировочной зависимости по четырем точкам, от меньшей массовой концентрации к большей, из основного стандартного раствора N? 1.

Стандартные градуировочные растворы L-карнитика хранят не более трех месяцев.

Для приготовления градуировочного раствора N91 (основного) навеску L-карнитина массой 100 мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, до половины заполненную дистиллированной водой, перемешивают до полного растворения вещества, доводят до метки и тщательно перемешивают.

Для приготовления градуировочных растворов №№ 2—4 отбирают пипетками соответствующие аликвоты градуировочного раствора № 1 в соответствии с таблицей 7. помещают их в мерные колбы и доводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивая.

Таблица 7 — Приготовление стандартных градуировочных рвстеоров L-кврнигинв

Nf п/п

№ стандартного раствора

вместимость мерной колбы.см5

Способ приготовления

Массовая

концентрация.

мг/дм3

1

1

(основной)

100

Навеску L-карнитина массой 100 мг помещают а мерную колбу вместимостью 100 см1, до половины заполненную дистиллированной водой, перемешивают до полного растворений вещества, доводят до метки и тщательно перемешивают

1000

2

2

25

Отбирают 10 см3 растворе № 1. переносят в мерную колбу, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают

400

15

ГОСТ Р 53185—2008

Окончание таблицы 7

№ п/л

Nt стандартного раствора

Вместимость мерной колбы, ем’

Способ приготовления

Массовая

концентрация.

мс/дм1

3

3

25

Отбирают 2 см3 раствора N9 1. переносят в мерную колбу, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают

60

4

4

25

Отбирают 1 см5 раствора № 1. переносят в мерную колбу, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают

40

Примечание — Раствор N* 4 используют е качестве одного из контрольных растворов в повседневных анализах, поскольку его массовая концентраций наиболее близка к среднему содержанию L-карнитинв в анализируемых пробах.

4.4А.2 Подготовка образца

Энергетический налиток наливают в химический стакан вместимостью 50 см3 и удаляют газ в токе азота. Ал иквоту нал итка в 5 см3 помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят объем раствора дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают и фильтруют через складчатый бумажный фильтр с размером пор 0.5 мкм или через капроновый фильтр.

4.4.5 Проведение измерений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

4.4.5.1    Приготовление подвижной фазы

750 см3 ацетонитрила помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см3, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтруют через фильтровальную бумагу с диаметром пор 0.5 мкм или через капроновый фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в установке для фильтрования растворов.

4.4.5.2    Условия хроматографического анализа

Условия ВЭЖХ:

колонка no 4.4.3.2;

подвижная фаза ацетонитрил-вода (75:25) в процентах ло объему;

скорость подвижной фазы 1,0 см3/мин;

объем раствора, вводимого в инжектор 10—15 мкл.

Ориентировочное время удерживания L-карнитина (8.6 ± 0.2) мин.

4.4.5.3    Построение градуировочной зависимости

Проводят хроматографический анализ всех градуировочных растворов L-карнитина.

Регистрируют площади пиков и строят градуировочный график — зависимость площади лика от массовой концентрации L-карнитина в градуировочном растворе.

Процедуры построения градуировочной зависимости выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования и руководством пользователя программным обеспечением.

Градуировочную зависимость выражают линейным уравнением

у-кх.    (28)

Правильность построения градуировочной зависимости контролируется величиной достоверности аппроксимации (R2)

Я2 а 0,9997.

Изуравнения (28) следует, что площадь ликов градуировочных растворов L-карнитина S (mV • с или V • с) и их массовая концентрация с(мг/дм3) находятся в соответствующей функциональной зависимости

к

где к — градуировочный коэффициент. [мг/дм3/тУ - с].

с.>

*--7Т2—'

(30)

где S, — площадь пика соответствующего вещества при анализе ьго стандартного раствора. mAU с или AUc;

16

ГОСТ Р 53185—2008

с, — массовая концентрация соответствующего вещества при анализе ко стандартного раствора. мг/дм3.

Градуировочную зависимость строят при смене хроматографа, колонок, условий хроматографического анализа или при выявлении несоответствия метрологическим требованиям результатов оперативного контроля или внутреннего аудита.

4.4.5.4 Анализ проб

Проводят хроматографический анализ подготовленных проб по 4.4Л2. Каждую пробу продукта анализируют два раза в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-1 (подраздел 3.14) и ГОСТ Р ИСО 5725*2. Регистрируют площадь пика L-карнитина. В случав, если площадь пика выходит за границы диапазона градуировки хроматографа, готовят новую менее или более разбавленную пробу и анализ повторяют.

4.4.6    Обработка результатов определения

Массовую концентрацию L-карнитина в пробе продукта рассчитывают по градуировочным зависимостям с учетом степени разведения. Вычисления проводят до третьего десятичного знака.

Обработку хроматограмм и расчет количественных характеристик проводят с помощью программно-аппаратного комплекса сбора и обработки данных, с использованием градуировочной зависимости

с(Х)=ЬЛ    (31)

к М

или по формуле с использованием стандартного градуировочного раствора L-карнитина

с(Х) = е,,Д‘'\    (32)

где с(Х) — массовая концентрация L-карнитина в анализируемой пробе, мг/дм3;

S, — площадь пика анализируемого вещества. mV ■ с или V • с:

V2 — вместимость мерной колбы, взятой для разбавления, см3; к — градуировочный коэффициент. [мг/дм3/тУ • с]

V, — объем пробы, отобранный для измерения, см3;

сет — массовая концентрация L-карнитина в стандартном растворе, мг/дм3:

Sct — площадь пика анализируемого вещества в стандартном растворе. mV - сипи V с. Результаты обработки двумя методами (программно-аппаратным и расчетным) должны совладать.

4.4.7    Оформление результатов измерений

За окончательный результат измерений принимают среднеарифметическое двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости

2 |Х,-Х2М00    ,331

.    ^    а ГфТМ*

(Х,*Х2>

где X,. Х2 — результаты параллельных определений, мг/дм3;

гвгн — значение предела повторяемости (в процентах от среднеарифметического значения), приведенное в таблицах метрологических характеристик для каждой методики при вероятности Р* 0.95.

Предел воспроизводимости R —* значение, которое сдоверительнойвероятностью95% не превышается абсолютной величиной разности между результатами двух измерений, полученными вусловиях воспроизводимости:

|X,-X3|fi0.01 RotH Хф.    (34)

где Хср — среднеарифметическое двух результатов измерений, выполненных в условиях воспроизводимости. мг/дм3;

R0IH — значение предела воспроизводимости (в процентах от среднеарифметического значения), лриведенноевтаблицах метрологических характвристикдля каждой методикипри вероятнос-тиР*0,95.

При соблюдении условий, регламентированных методиками (методами) измерений настоящего стандарта, при вероятности Р - 0.95 относительная погрешность измерений ± &% не должна превышать значений, приведенных в таблицах метрологических характвристикдля каждой методики (метода) измерений.

17

ГОСТ Р 53185—2008

Результат анализа представляют е виде

(X ± Д) мг/дм3 при вероятности Р - 0.95,

гдеХ — среднеарифметическое значение реэультатоеопределений.признанныхприемлвмыми.мг/дм3; 1Д — абсолютная погрешность измерений, мг/дм3. рассчитанная по формуле

д = 0.01ЙХ,    (35>

где 8— границы относительной погрешности методики (метода) измерений, % (значения приведены в таблицах метрологических характеристик для каждой методики при вероятности Р-0,95).

4.4.8    Контроль повторяемости (сходимости) результатов измерений проводят путем сравнения абсолютного расхождения между результатами двух параллельных определений, выполненных в уело* виях повторяемости, с пределом повторяемости, приведенным в таблице 8.

Сходимость результатов признают удовлетворительной при условии

P^i ~ ^г1 ^ 0.01 • г01н • Хф.    ,36}

При превышении норматива контроля повторяемости (сходимости) измерения повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6 (пункт 5.3.4).

4.4.9    Показатели точности и прецизионности измерений массовой концентрации L-карнитина

Показатели точности и прецизионности измерений массовой концентрации L-карнитина при Р - 0.95 приведены в таблице 8.

Таблица 8

Метрологическая характеристика |Р я 0.95)

Значения

Диапазон измерений, мг/дм5

От 10 ДО 500 включ.

Са. 500 до 2000

Предел повторяемости (в,„, %

36

24

Предел воспроизводимости Я0,„. %

41

2d

Границы относительной погрешности t А %

30

20

4.5 Метод определения схизандрина

4.5.1 Сущность метода

Определение схизандрина и у-схизандрина в напитках проводится методом ВЭЖХ с фотометрическим детектированием при длине волны). - 254 нм.

Схюаидрж    у-Схимндон

18

ГОСТ Р 53185—2008

4.5.2 Условия проведения анализа

При подготовке и проведении измерений должны быть соблюдены следующие условия:

температура окружающего воздуха.............от 10 вС до 35 *С;

относительная влажность воздуха.............от 40% до 95%:

напряжение в электросети.................. 220*J®'B.

Помещение, где проводят работысреактивами. должно быть обеспечено приточно-вытяжной вентиляцией.

4.5.3    Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы и материалы

Хроматограф жидкостной, оснащенный насосом высокого давления со скоростью подачи растворителя отО.1 до5,0смэ/мик.

Хроматографическая аналитическая колонка: длина колонки 250 мм. диаметр4,6 мм. заполненная октадецилсиликагелем размером частиц 5 мкм.

Спектрофотометрический детектор на основе диодной матрицы, диапазон длин волн от 190 до 950 нм.

Микрошприц МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Ультразвуковая установка с частотой ульразвука 43—45 кГц.

Аппарат для встряхивания проб.

Весы лабораторные по ГОСТ Р 53228 с пределами абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0.001 г.

pH-метр с диапазоном измерений от минус 2 до 18 ед. pH с абсолютной погрешностью измерений ±0,01вд. pH.

Колбы мерные 2-50-2.2-100-2.2-250-2.1 -1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки4-1-2-2 или 5-1-2-2.4.2.2-10или 5-2-2-10.4-2-2-25 или 5-2-2-25по ГОСТ29227.

Стаканы химические вместимостью 50 и 1000 см3 по ГОСТ 25336.

Ацетонитрил для ВЭЖХ ч.

Бумажные фильтры «синяя лента».

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или дистиллированная, фильтрованная через капроновый фильтр с диаметром пор 0.45 мкм.

Патрон Диапак С18.

Мембранный фильтр с диаметром лор 0,45 мкм.

Капроновый фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Схизандрин с массовой долей основного вещества не менее 98.0 %.

Гамма-схиэандрин с массовой долей основного вещества не менее 98.0 %.

Метанол ч. д. а. по ГОСТ 6995.

Трифторуксуснаякислотах. ч.ГОСТ 18270.

4.5.4    Приготовление реактивов

4.5.4.1 Приготовление стандартных градуировочных растворов схизандрина и у-схиэандрина

Стандартные градуировочные растворы схизандрина и '/-схизандрина готовят для расчета градуировочной зависимости по четырем точкам, от меньшей массовой концентрации кбольшей. из основного стандартного раствора № 1.

Стандартные градуировочные растворы схизандрина и у-схизандрина хранят не более трех месяцев.

Для приготовления градуировочного раствора № 1 (основного) навески схизандрина и у-схизан-дрина массой 10 мг помещают в мерные колбы вместимостью 50 см3, до половины заполненные метанолом. перемешивают до полного растворения вещества, доводят до метки и тщательно перемешивают.

Для приготовления градуировочных растворов №№ 2—4 отбирают пипетками соответствующие аликвоты градуировочного раствора N91 в соответствии с таблицей 9. помещают их в мерные колбы и доводят метанолом до метки, тщательно перемешивая.

19

ГОСТ Р 53185—2008

Таблице 9 — Приготовление стандартных градуировочных растворов схизандринв и у-схизандрина

№ п/л

N* стандартного раствора

Вместимость мерной колбы.см1

Споооб приготовления

Массовая

концентрация.

мт/дм*

1

(основной)

50

Навеску схизандрина и у-схизандрина массой 10 мг помещают в мерные колбы вместимостью 50 см*, до половины заполненные метанолом, перемешивают до полного растворения вещества, доводят до метки и тщательно перемешивают

200

2

2

25

Отбирают 10 см* раствора to 1. переносят в мерную колбу, доводят метанолом до метки и тщательно перемешивают

во

3

3

25

Отбирают 5 см1 раствора to 1. переносят в мерную колбу, доводят метанолом до метки и тщательно перемешивают

40

4

4

25

Отбирают 1 см1 раствора to 1. переносят в мерную колбу, доводят метанолом до метки и тщательно перемешивают

в

Примечание — Раствор № 3 используют в качестве одного из контрольных растворов в повседневных анвлизвх, поскольку его массовая концентрация наиболее близка к среднему содержанию схизандрина и у-схизандрина в анализируемых пробах.

4.5.4.2    Подготовка образца

Энергетический напиток наливают в химический стакан вместимостью 50 см3 и удаляют газ в токе азота. Аликвоту напитка 10 см3 наносят на патрон Диапак С18. предварительно активированный 10 смметиловогоспиртаи 20см3 дистиллированной воды. Патрон промывают 30 см3 дистиллированной воды. Схиэандрины смывают 5 см3 метилового спирта. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр «синяя лента», затем через мембранный фильтре размером пор 0,45 мкм.

4.5.4.3    Приготовление трифторуксусной кислоты массовой долей 1 %—2%

1—2 г трифторуксусной кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, наполовину заполненную дистиллированной водой, доводят объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

4.5.5 Проведение измерений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

4.5.5.1    Приготовление подвижной фазы

Для приготовления раствора трифторуксусной кислоты с pH 2.5 (подвижная фаза А) 500 см3 дистиллированной воды помещают в стакан вместимостью 500 см3 и доводят pH до 2.5 с помощью трифторуксусной кислоты массовой долей 1 %—2 %. Полученный растворфильтруют через капроновый фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. В качестве подвижной фазы В используют ацетонитрил.

4.5.5.2    Условия хроматографического анализа Условия хроматографического анализа: колонка по 4.5.3.2;

подвижная фаза: ацетонитрил — трифторуксусная кислота pH 2.5 (73:27) в процентах по объему; скорость подачи элюента: 1.0 см3/мин; детектирование: УФ>. = 254 нм: объем пробы 10 мм3;

ориентировочные времена удерживания схизандрина 3.7 и у-схизандрина 8.8 мин.

4.5.5.3    Построение градуировочной зависимости

Проводят хроматографический анализ всех градуировочных растворов схизандрина и у-схи-эакдрииа.

Регистрируют площади пиков и строят градуировочный график — зависимость площади лика от массовой концентрации схизандрина и у-схизандрина в градуировочном растворе.

Процедуры построения градуировочной зависимости выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования и руководством пользователя программным обеспечением.

Градуировочкую зависимость выражают линейным уравнением

У-кХ.    (37)

20

ГОСТ Р 53185—2008

Правильность построения градуировочной зависимости контролируется величиной достоверности аппроксимации (/?;)

R2 й 0,9997.

Из уравнения (37) следует, что площадь пиков градуировочных растворов схиэандрина и у-схизан-дрика S (mV с или V • с) и их массовая концентрация с (мг/дм3) находятся в соответствующей функциональной зависимости

к

где к — градуировочный коэффициент. [мг/дм3/тУ • с]-1.

к -    (39)

- в*

гдеБ, — площадьликасоответствующеговеществалрианализеьгостандаргногораствора.тАи -с или AU с;

с, — массовая концентрация соответствующего вещества при анализе /-го стандартного раствора. мг/дм3.

Градуировочную зависимость строят при смене хроматографа, колонок, условий хроматографического анализа или при выявлении несоответствия метрологическим требованиям результатов оперативного контроля или внутреннего аудита.

4.5.S.4 Анализ проб

Проводят хроматографический анализ подготовленных проб по 4.5.4.2. Каждую пробу продукта анализируют два раза в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-1 (подраздел 3.14) и ГОСТ Р ИСО 5725-2. Регистрируют площадь пиков схизандрина и у-схизандрина. В случае, если площадь пиков выходит за границы диапазона градуировки хроматографа, готовят новую менее или более разбавленную пробу и анализ повторяют.

4.5.6 Обработка результатов определения

Массовую концентрацию схизандрина и у-схизандрина в пробе продукта рассчитывают по градуировочным зависимостям с учетом степени разведения. Вычисления проводят до третьего десятичного знака.

Обработку хроматограмм и расчет количественных характеристик проводят с помощью программно-аппаратного комплекса сбора и обработки данных с использованием градуировочной зависимости

c(X)=£i-ii    <40>

kVx

или по формуле с использованием стандартного градуировочного раствора схизандрина и у-схи-зандрина

c(X)=c~'S-    «П

гдес(Х) — массовая концентрация схизандрина и у-схизандрина в анализируемой пробе, мг/дм3;

S, — площадь пика анализируемого вещества. mV • с или V с:

V2 — объем метилового спирта, которым смыли с патрона образец, см3: к — градуировочный коэффициент. [мг/дм3/ггА/ с)-1:

V, — объем наносимого на патрон образца напитка, см3;

сет — массовая концентрация схизандрина и у-схизандрина в стандартном растворе, мг/дм3:

Scr — площадь пика анализируемого вещества в стандартном растворе. mV • с или V с. Результаты обработки двумя методами (программно-аппаратным и расчетным) должны совпадать.

4.5.7 Оформление результатов измерений

За окончательный результат измерений принимают среднеарифметическое двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости

2-|Х,-ХгМ00

(х,-х,>

гдеХ,.Х2 — результаты параллельных определений, мг/дм3;

готи — значение предела повторяемости (в процентах от среднеарифметического значения), приведенное в таблицах метрологических характеристик для каждой методики при вероятности Р*0,95.

21

ГОСТ Р 53185—2008

Предел воспроизводимости R — значение, котороес доверительной вероятностью 95 % неправы-шается абсолютной величиной разности между результатами двух измерений, полученными в условиях воспроизводимости

|Х,-Ха|*0.01-Явп,-Хв.    (43)

где Х — среднеарифметическое двух результатов измерений, выполненных в условиях воспроизводимости. мг/дмэ;

RC,H — значение предела воспроизводимости (в процентах от среднеарифметического значения), приведенноевтаблицахмвтрологических характвристикдля каждой методикипри вероятности Р * 0.95.

При соблюдении условий, регламентированных методиками (методами) измерений настоящего стандарта, при вероятности Р-0.95 относительная погрешность измерений ± 8% не должна превышать значений, приведенных в таблицах метрологических характеристик для каждой методики (метода) измерений.

Результат анализа представляют в виде

(X ± Д) мг/дм3 при вероятности Р - 0,95,

гдвХ — среднеарифметическое значение результатов определений, признанных приемлемыми, мг/дм3; ± Д — абсолютная погрешность измерений, мг/дм3, рассчитанная по формуле

Д = 0,01-6Х,    (44)

где 8— границы относительной погрешности методики (метода) измерений, % (значения приведены в таблицах метрологических характеристик для каждой методики при вероятности Р-0.95).

4.5.8    Контроль повторяемости (сходимости) результатов измерений проводят путем сравнения абсолютного расхождения между результатами двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости с пределом повторяемости, приведенным е таблице.

Сходимость результатов признают удовлетворительной при условии

Pf,-X,U0.01.roitt.Xq).    ,45)

При превышении норматива контроля повторяемости (сходимости) измерения повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6 (пункт 5.3.4).

4.5.9    Показатели точности и прецизионности измерений массовой концентрации схиэандрина и у-схиэандрина

Показатели точности и прецизионности измерений массовой концентрации схизандрина и у-схи-зандрина при Р - 0.9S приведены в таблице 10.

Таблице Ю

Метрологическая характеристика (Р * 0.95)

Значения

Диапазон измерений, мг/дм’

От 10 до 200 включ.

С в. 200 до 1000

Предел повторяемости г0<». 14

3S

26

Предел воспроизводимости R0... %

43

37

Границы относительной погрешности х б. Ч

30

26

4.6 Метод определения элеутерозидов

4.6.1 Сущность метода

Определение элеутерозидов В и Е в налитках проводится методом ВЭЖХ с фотометрическим детектированием при X = 215 нм.

22

ГОСТ Р 53185—2008

4.6.2 Условия проведения анализа

При подготовке и проведении измерения должны быть соблюдены следующие условия:

температура окружающего воздуха.............от 10 °С до 35 *С;

относительная влажность воздуха.............от 40% до 95%;

напряжение в электросети.................. 220*]®^ В.

Помещение, где проводят работы с реактивами, должно быть обеспечено приточно-вытяжной вентиляцией.

4.6.3    Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы и материалы

Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0.1 до

5см3/мин.

Хроматографическая аналитическая колонка: длина колонки 250 мм. диаметр 4.6 мм. заполненная октадецилсиликагелем с размером частиц 5 мкм.

Спектрофотометрический детектор на основе диодной матрицы, диапазон длин волн от 190 до 950 км.

Микрошприц МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Ультразвуковая установка с частотой ультразвука 43—45 кГц.

Аппарат для встряхивания проб.

Весы лабораторные по ГОСТ Р 53228 с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0.0001 г.

Колбы мерные наливные 2-50-2.2-100-2,2-250-2.1-1000-2 по Г ОСТ 1770.

Пипетки4-1-2-2 или 5-1-2-2.4-2-2-10 или 5-2-2-10,4-2-2-25 или 5-2-2-25 по ГОСТ 29227.

Ацетонитрил для ВЭЖХ.

Бумажные фильтры «синяя лента*.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или дистиллированная, фильтрованная через капроновый фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Мембранный фильтр с диаметром пор 0.45 мкм.

Патрон Диапак С18.

Капроновый фильтр с диаметром пор 0.45 мкм.

Элеутероэид В массовой допей основного вещества не менее 96,0 %.

Элеутерозид Е массовой долей основного вещества не менее 97.0 %.

Метанол ч. д. а. по ГОСТ 4199.

Оргофосфорная (фосфорная) кислота массовой долей 85 % по ГОСТ 6552.

4.6.4    Приготовление реактивов

4.6.4.1 Приготовление стандартных градуировочных растворов элеутерозидов Е и В

Стандартные градуировочные растворы элеутерозидов Е и В готовят для расчета градуировочной зависимости по четырем точкам, от меньшей массовой концентрации кбольшей. изосноеного стандартного раствора № 1.

Стандартные градуировочные растворы элеутерозидов Е и В хранят не более трех месяцев.

Для приготовления градуировочного раствора № 1 (основного) навески элеутерозидов Е и В массой 10 мг помещают в мерные колбы вместимостью 50 см3, до половины заполненные метанолом, перемешивают до полного растворения вещества, доводят до метки и тщательно перемешивают.

Для приготовления градуировочных растворов №№ 2—4 отбирают пипетками соответствующие аликвоты градуировочного раствора № 1 в соответствии с таблицей 11. помещают их в мерные колбы и доводят метанолом до метки, тщательно перемешивая.

23

ГОСТ Р 53185—2008

Таблице 11 — Приготовление стандартных градуировочных растворов

N» л/п

№ стандартного раствора

вместимость мерной колбы.см*

Способ приготовления

Массовая

концентрация.

мг/дм3

1

1

(основной)

SO

Навеску элеутероэидов Е и 8 массой 10 мг помещают в мерные колбы вместимостью 50 см*, до половины заполненные метанолом, перемешивают до полного растворения вещества, доводят до метки и тщательно перемешивают

200

2

2

25

Отбирают Ю см3 раствора № 1. переносят в мерную колбу, доводят метанолом до метки и тщательно перемешивают

80

3

3

25

Отбирают 5 см3 раствора № 1. переносят в мерную колбу, доводят метанолом до метки и тщательно перемешивают

40

4

4

25

Отбирают 1 см3 раствора № 1. переносят в мерную колбу, доводят метанолом до метки и тщательно перемешивают

8

Примечание — Раствор № 3 используют в качестве одного из контрольных растворов в повседневных анализах, поскольку его массовая концентрация наиболее близка к среднему содержанию элеутероэидов Е и В в анализируемых пробах.

4.6 4.2 Подготовка образца

Энергетический налиток наливают в химический стакан вместимостью 50 см3 и удаляют газ в токе азота. Аликвоту напитка 20 см3 наносят на патрон Диалак С18. предварительно активированный 10 смметиловогоспирта и 20смэ дистиллированной воды. Патрон промывают 30 см3 дистиллированной воды. Элеутерозиды смывают 5 см3 метилового спирта. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр «синяя лента», затем через мембранный фильтре размером пор 0,45 мкм.

4.6.4.3 Приготовление раствора 1 %—2 % фосфорной кислоты

1—2 гфосфорной кислоты помещают в мерную колбу на 100 см3. наполовину заполненную дистиллированной водой, доводят объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

4.6.5 Проведение измерений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

4.6.5.1    Приготовление подвижной фазы

Для приготовления раствора фосфорной кислоты с pH 2.5 500 см3 дистиллированной воды помещают е стакан и доводят pH до 2.5 с помощью 1 %—2 % ортофосфорной кислоты. Полученный раствор фильтруют через капроновый фильтр с диаметром пор 0.45 мкм {подвижная фаза А), в качестве подвижной фазы В используют ацетонитрил.

4.6.5.2    Условия хроматографического анализа

Условия хроматографического анализа.

колонка по 4.6.3.2;

подвижная фаза:

Длительность, мин

А

Раствор HjP04 pH * 2.6. % по объему

в

Ацетонитрил. % по объему

0

90

10

2

90

10

20

70

30

скорость подачи элюента 0,8 смэ/мин; детектирование УФ X * 215 нм: объем пробы 10 мм3:

ориентировочные времена удерживания элеутерозида В 3.7 мин и элеутерозида Е 8.8 мин.

4.6.5.3 Построение градуировочной зависимости

Проводят хроматографический анализ всех градуировочных растворов элеутероэидов.

24

ГОСТ Р 53185—2008

Регистрируют площади пиков и строят градуировочный график — зависимость площади пика от массовой концентрации элеутероэидов Е и В в градуировочном растворе.

Процедуры построения градуировочной зависимости выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования и руководством пользователя программным обеспечением.

Градуировочную зависимость выражают линейным уравнением

у-кХ.    (46)

Правильность построения градуировочной зависимости контролируется величиной достоверное* ти аппроксимации (Яг)

R2 а 0.9997.

Из уравнения (46) следует, что площадь пиков градуировочных растворов элеутерозидов Е и В S (mV • с или V • с) и их массовая концентрация с (мг/дм3) находятся в соответствующей функциональной зависимости

с=—.

где к — градуировочный коэффициент. (мг/дм3/тУ ■ с).

(48)

где S, — площадь пика соответствующего вещества при анализе /-го стандартного раствора. mAU с или AU - с;

с, — массовая концентрация соответствующего вещества при анализе /-го стандартного раствора. мг/дм3.

Градуировочную зависимость строят при смене хроматографа, колонок, условий хроматографического анализа или при выявлении несоответствия метрологическим требованиям результатов оперативного контроля или внутреннего аудита.

4.6.5.4 Анализ проб

Проводят хроматографический анализ подготовленных проб по 4.5.4.2. Каждую пробу продукта анализируют два раза в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-1 (подраздел 3.14) и ГОСТ Р ИСО 5725-2. Регистрируют площадь пиков элеутероэидов. В случае, если площадь пиков выходит за границы диапазона градуировки хроматографа, готовят новую менее или более разбавленную пробу и анализ повторяют.

4.6.6    Обработка результатов определения

Массовую концентрацию элеутерозидов Е и В в пробе продукта рассчитывают по градуировочным зависимостям с учетом степени разведения. Вычисления проводят до третьего десятичного знака.

Обработку хроматограмм и расчет количественных характеристик проводят с помощью программно-аппаратного комплекса сбора и обработки данных, с использованием градуировочной зависимости

(48) к М

или по формуле с использованием стандартных градуировочных растворов элеутерозидов

C(X) = c^'St^.    (И)

гдес(Х) — массовая концентрация элеутероэидов Ей В в анализируемой пробе, мг/дм3;

Sx — площадь пика анализируемого вещества. mV • с или V с;

V2 — объем метилового спирта, которым смыли с патрона образец, см3; к — градуировочный коэффициент. (мг/дм3/тУ с)-1;

V, — объем наносимого на патрон образца напитка, см3;

cet — массовая концентрация элеутероэидов Е и В в стандартном растворе, мг/дм3:

Sct — площадь пика анализируемого вещества в стандартном растворе. mV • с или V ■ с.

Результаты обработки двумя методами (программно-аппаратным и расчетным) должны совладать.

4.6.7    Оформление результатов измерений

За окончательный результат измерений принимают среднеарифметическое двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости

2S

ГОСТ Р 53185—2008

2-|X,-Xi| 100

<Х,*Ха)

(51)

где Х,.Х2 — результаты параллельных определений. мг/дмэ;

гоп, — значение предела повторяемости(елроцентахот среднеарифметического значения), при-веденноеетаблицахметрологическиххарактеристикдлякажоой методики при вероятное* тиР = 0.95.

Предел воспроизводимости R — значение, которое с доверительной вероятностью 95 % не превышается абсолютной величиной разности между результатами двух измерений, полученными в условиях воспроизводимости

|г|й0.01-#?отн,    ,52)

гдеХ<с> — среднеарифметическое двух результатов измерений, выполненных в условиях воспроизводимости. мг/дм3;

RotM — значение предела воспроизводимости (в процентах от среднеарифметического значения), приведенное в таблицах метрологических характеристик для каждой методики при вероятности 0,95.

При соблюдении условий, регламентированных методиками (методами) измерений настоящего стандарта, при вероятности Р-Соотносительная погрешность измерений ± 8% не должна превышать значений, приведенных в таблицах метрологических характеристик для каждой методики (метода) измерений.

Результат анализа представляют в виде

(X ± Д) мг/дм3 при вероятности Р - 0.95,

гдеХ — среднеарифметическое значение реэультатоеопредепений.признанныхприемлемыми. мг/дм3; ± д — абсолютная погрешность измерений, мг/дм3. рассчитанная по формуле

д = 0,01 • 8 X,    ,53)

где 8— границы относительной погрешности методики (метода) измерений, % (значения приведены в таблицах метрологических характеристик для каждой методики при вероятности Р-0.95).

4.6.8    Контроль повторяемости (сходимости) результатов измерений проводят путем сравнения абсолютного расхождения между результатами двух параллельных определений, выполненных вусло-виях повторяемости с пределом повторяемости, приведенным в таблице 12.

Сходимость результатов признают удовлетворительной при условии

1а|*0.01.гвш<(,    ,54,

При превышении норматива контроля повторяемости (сходимости) измерения повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6 (пункт 5.3.4).

4.6.9    Показатели точности и прецизионности измерений массовой концентрации элеутерозидов Е и В

Показатели точности и прецизионности измерений массовой концентрации элеутерозидов Е и В при Р - 0,95 приведены в таблице 12.

Таблице 12

Метрологическая характеристика <Р * 0.05)

Значение

Диапазон измерений, мг/дм3

От 3 ДО 200 включ.

Св. 200 до 1000

Предел поаторяемости г0„. 14

51

40

Предел воспроизводимости R0,„. 14

59

45

Границы относительной погрешности t 6. %

42

32

26

ГОСТ Р 53185—2008

4.7 Метод определения гиксеноэидов

4.7.1 Сущность метода

Определение панаксоэидое (гинсенозидов) в напитках проводится методом ВЭЖХ с фотометрическим детектированием при    203 нм. Для исследования используют следующие ланаксозиды:

Название

R

R.

Rb,

D-Glc-M1-> 2)-0-Glc

D-Glc-(41-» 6)-D-Glc

Rb;

D-Glc-p-(1 2)-0-Glc

1-А/в(пирвноэаЦ1-+ 6)-0-Glc

Rc

D-Glc-HI-* 2)-0-Glc

L-Ara(<byp8H03aX1-» 6>-0-Glc

Rd

D-Glc-H1~> 2)-0-Glc

D-Glc

Rg.

D-Glc

D-Glc

Re

L-Rha (1-> 6)-D-Gfc

D-Glc

4.7.2 Условия проведения анализа

При подготовке и проведении измерения должны быть соблюдены следующие условия:

температура окружающего воздуха.............от 10 вС до 35 X;

относительная влажность воздуха.............от 40% до 95%:

напряжение в электросети.................. 220'|®£В.

Помещение, где проводят работы с реактивами, должно быть обеспечено приточно-вытяжной вентиляцией.

4.7.3 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы и материалы:

Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0.1 до 5см3/мин.

Хроматографическая аналитическая колонка: длина колонки 250 мм. диаметр4.6 мм. заполненная октадецилсиликагелем размером частиц 5 мкм.

Спектрофотометрический детектор на основе диодной матрицы, диапазон длин волн от 190 до 950 км.

Микрошприц МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Ультразвуковая установка с частотой ульразвука 43—45 кГц.

Аппарат для встряхивания проб.

Весы лабораторные по ГОСТ Р 53228 с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0,0001 г.

Колбы мерные наливные 2-50-2.2-100-2.2-250-2.1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки4-1-2-2 или 5-1-2-2.4-2-2-10 или 5-2-2-10.4-2-2-25 или 5-2-2-25 по ГОСТ 29227.

Ацетонитрил для ВЭЖХ.

Патрон Диапак С18.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или дистиллированная, фильтрованная через капроновый фильтр с диаметром пор 0.45 мкм.

Бумага фильтровальная с размером пор 0.5 мкм по ГОСТ 12069.

Бумажные фильтры «синяялента».

Капроновый фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

27

ГОСТ Р 53185—2008

Панаксозид Rb1 массовой допей основного вещества не менее 95.0 %.

Панаксозид Rb2 массовой долей основного вещества не менее 95,0 %.

Панаксозид Rc массовой долей основного вещества не менее 95.0 %.

Панаксозид Rd массовой долей основного вещества не менее 95.0 %.

Панаксозид Re массовой долей основного вещества не менее 95,0 %.

Панаксозид Rg1 массовой долей основного вещества не менее 95,0 %.

4.7.4 Приготовление реактивов

4.7.4.1 Приготовление стандартных градуировочных растворов гинсеноэидое

Стандартные градуировочные растворы гинсенозидов готовят для расчета градуировочной зависимости по четырем точкам, от меньшей массовой концентрации к большей, из основного стандартного раствора № 1.

Стандартные градуировочные растворы гинсенозидов хранят не более трех месяцев.

Для приготовления градуировочного раствора № 1 (основного) навески гинсенозидов массой 10 мг помещают в мерные колбы вместимостью 50 см3. до половины заполненные метанолом, перемешивают до полного растворения вещества, доводят до метки и тщательно перемешивают.

Для приготовления градуировочных растворов №№ 2—4 отбирают пипетками соответствующие аликвоты градуировочного раствора Ne 1 в соответствии с таблицей 13. помещают их в мерные колбы и доводят метанолом до метки, тщательно перемешивая.

Таблице 13— Приготовление стандартных градуировочных растворов

№ л/п

№ стандартного раствора

Вместимость мерной колбы. см3

Способ приготовления

Массовая

концентрация.

ыг/ды*

1

1

(основной)

50

Навеску гинсенозидов массой 10 мг помещают в мерные колбы вместимостью 50 см3, до половины заполненные метанолом, перемешивают до полного растворения вещества, доводят до метки и тщательно перемешивают

200

2

2

25

Отбирают Ю см3 растворе № 1. переносят а мерную копбу. доводят мвтанопом до метки и тщательно перемешивают

во

3

3

25

Отбирают 5 cmj раствора № 1. переносят е мерную копбу. доводят метанолом до метки и тщательно перемешивают

40

4

4

25

Отбирают 1 см3 раствора № 1. переносят а мерную колбу, доводят метанолом до метки и тщательно перемешивают

8

Применение — Раствор № 3 используют в качестве одного из контрольных растворов в повседневных анализах, поскольку его массовая концентрация наиболее близка к среднему содержанию гинсенозидов в анализируемых пробах.

4.7.4.2 Подготовка образца

Энергетический напиток наливают в химический стакан вместимостью 50 см3 и удаляют газ в токе азота. Аликвоту напитка 20 см3 наносят на патрон Диапак С18. предварительно активированный 10 смметиловогоспирта и 20 см3 дистиллированной воды. Патрон промывают 30 см3 дистиллирован ной воды. Панаксозиды смывают 5 см3 метилового спирта. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр «синяя лента», затем через мембранный фильтре размером лор 0,45 мкм.

4.7.5 Проведение измерений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

4.7.5.1 Условия хроматографического анализа

Условия хроматографического анализа.

колонка по 4.7.3.2;

подвижная фаза:

Длительность, мин

Дистиллированная вода. Ч по объеыу

Ацетонитрил. Ч по объему

0

90

10

20

75

25

60

40

60

28

ГОСТ Р 53185—2008

скорость подачи элюента: 1.0см3/мин;

детектирование: УФ 215 км;

объем пробы 10 мм3:

ориентировочные времена удерживаний панаксозидое: Rg1 — 24.3: Re — 24.7; Rb1 — 34.5; Rc — 35,5; Rb2 — 36,5; Rd — 38.0 мин.

47.5.2 Построение градуировочной зависимости

Проводят хроматографический анализ всех градуировочных растворов гинсенозидов.

Регистрируют площади пиков и строят градуировочный график — зависимость площади пика от массовой концентрации гинсенозидов в градуировочном растворе.

Процедуры построения градуировочной зависимости выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования и руководством пользователя программным обеспечением.

Градуировочную зависимость выражают линейным уравнением

У = кХ.    (55)

Правильность построения градуировочной зависимости контролируется величиной достоверное* ти аппроксимации (R2)

R3 а 0,9997.

Из уравнения (55) следует, что площадь пиков градуировочных растворов гинсенозидов S (mV • с или V - с) и их массовая концентрация с (мг/дм3) находятся в соответствующей функциональной зависимости

с = £,    (56)

к

где к — градуировочный коэффициент. [мг/дм3/тУ • с]*1.

(57)

S. — площадь лика соответствующего вещества при анализе /-го стандартного раствора. mAU • с или AU с;

с, — массовая концентрация соответствующего вещества при анализе /-го стандартного раствора. мг/дм3.

Градуировочную зависимость строят при смене хроматографа, колонок, условий хроматографического анализа или при выявлении несоответствия метрологическим требованиям результатов оперативного контроля или внутреннего аудита.

47.5.3 Анализ проб

Проводят хроматографический анализ подготовленных проб по 47.4.2. Каждую пробу продукта анализируют два раза в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-1 (подраздел 3.14) и ГОСТ Р ИСО 5725-2. Регистрируют площадь пиков гинсенозидов. в случае, если площадь пиков выходит за границы диапазона градуировки хроматографа, готовят новую менее или более разбавленную пробу и анализ повторяют.

4.7.6 Обработка результатов определения

Массовую концентрацию гинсенозидов в пробе продукта рассчитывают по градуировочным зависимостям с учетом степени разведения, вычисления проводят до третьего десятичного знака.

Обработку хроматограмм и расчет количественных характеристик проводят с помощью программно-аппаратного комплекса сбора и обработки данных, с использованием градуировочной зависимости

с(Х)»£гА    (58)

*-Ц

или по формуле с использованием стандартных градуировочных растворов гинсенозидов

C(X)gC,,'S| Ч    (59)

гдес(Х) — массовая концентрация гинсеноэида в анализируемой пробе, мг/дм3:

S, — площадь пика анализируемого вещества, mV • с или V с;

V2 — объем метилового спирта, которым смыли с патрона образец, см3: к — градуировочный коэффициент, (мг/дм3/гтЛ/ с)-1:

V, — объем наносимого на патрон образца напитка, см3;

ссг — массовая концентрация гинсеноэида в стандартном растворе, мг/дм3:

29

ГОСТ Р 53185—2008

Set — площадь пика анализируемого вещества в стандартном растворе. mV ■ с или V • с. Результаты обработки двумя методами (программно-аппаратным и расчетным) должны совпадать.

4.7.7 Оформление результатов измерений

За окончательный результат измерений принимают среднеарифметическое двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости

2-|Х,-Ха| 100 (Х.-Х,)

йг.

от*

(60)

где X,, Хг — результаты параллельных определений, мг/дм3;

гоп< — эначениепредела повторяемости (в лроцентахот среднеарифметического значения), при-веденноевтаблицахметрологическиххарактеристикдлякаждой методики при вероятности Р= 0.95.

Предел воспроизводимости R — значение, котороес доверительной вероятностью 95 % не превышается абсолютной величиной разности между результатами двух измерений, полученными в условиях воспроизводимости

|X,-XJS0.01    X*.    (61)

гдеХср — среднеарифметическое двух результатов измерений, выполненных в условиях воспроизводимости. мг/дм3;

RaiH — значение предела воспроизводимости (в процентах от среднеарифметического значения), приведенное в таблицах метрологических характеристик для каждой методики при вероятности Р= 0.95.

При соблюдении условий, регламентированных методиками (методами) измерений настоящего стандарта, при вероятности Р-0.95 относительная погрешность измерений ± 8% не должна превышать значений, приведенныхвтаблицах метрологических характеристикдля каждой методики(метода)изме-рений.

Результат анализа представляют в виде

(Х±д) мг/дм3 при вероятности Р = 0,95.

гдеХ — среднеарифметическоезначениерезультатоеопределений. признанных приемлемыми, мг/дм3; ± д — абсолютная погрешность измерений, мг/дм3. рассчитанная по формуле

д = 0,01-6Х,    (62)

где 6— границы относительной погрешности методики (метода) измерений, % (значения приведены в таблицах метрологических характеристикдля каждой методики при вероятности Р-0.95).

4.7.8    Контроль повторяемости (сходимости) результатов измерений проводят путем сравнения абсолютного расхождения между результатами двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости с пределом повторяемости, приведенным в таблице 14.

Сходимость результатов признают удовлетворительной при условии

|Х, - Х2\ & 0,01 -    - Х.    (63)

При превышении норматива контроля повторяемости (сходимости) измерения повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6 (пункт 5.3.4).

4.7.9    Показатели точности и прецизионности измерений массовой концентрации гинсеноэидов

Показатели точности и прецизионности измерений массовой концентрации гинсенозидов при Р - 0.95 приведены в таблице 14.

Таблице 14

Метрологическая характеристика (Р » 0.96)

Значения

Диапазон концентраций, мг/дм3

От 3 до 200 включ.

Се. 200 до 1000

Предел повторяемости г0П1. %

S2

40

Предел воспроизводимости Rot„ %

61

47

Границы относительной погрешности t 6, %

43

34

30

ГОСТ Р 53185—2008

4.8 Метод определения кофеина

4.8.1    Сущность метода

Метод основан на идентификации и количественном определении кофеина (пуринового алкалоида) с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением ультрафиолетового детектирования.

4.8.2    Условия проведения анализа

При подготовке и проведении измерения должны быть соблюдены следующие условия:

температура окружающего воздуха.............от 10 вС до 35 4С;

относительная влажность воздуха.............от 40% до 95%;

напряжение в электросети.................. 220;|££ В.

Помещение, где проводят работы с реактивами, должно быть обеспечено приточно-вытяжной вентиляцией.

Все операции с реактивами следует проводить в вытяжном шкафу.

4.8.3    Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы и материалы

Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0.1 до

5смэ/мин.

Хроматографическая аналитическая колонка: длина колонки 250 мм. диаметр 4.6 мм. заполненная октадецилсиликагелем с размером частиц 5 мкм.

Спектрофотометрический детектор на основе диодной матрицы, диапазон длин волн от 190 до 950 км.

Микрошприц МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Весы лабораторные по ГОСТ Р 53228 с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0.0001 г.

Колбы мерные наливные 2-50-2,2-100-2.2-250-2,1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки4-1-2-2 или 5-1-2-2.4-2-2-10 или 5-2-2-10,4-2-2-25 или 5-2-2-25 по ГОСТ 29227.

Ацетонитрил для ВЭЖХ.

Ледяная уксусная кислота х. ч. поГОСТ 19814.

Шкаф сушильный, обеспечивающий нагрев до 150 ®С.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или дистиллированная, фильтрованная через капроновый фильтр с диаметром пор 0.45 мкм.

Бумага фильтровальная с размером пор 0.5 мкм поГОСТ 12069.

Бумажные фильтры обезволенные марки ФОМ.

Капроновый фильтр с диаметром лор 0.45 мкм.

Установка для фильтрования растворов.

Кофеин (1,3,7-триметилксантин) кристаллический массовой долей основного вещества не менее 99.0 % или по действующей нормативно-технической документации.

4.8.4    Приготовление растворов

4.8.4.1 Приготовление стандартных градуировочных растворов кофеина

Стандартные градуировочные растворы кофеина готовят для расчета градуировочной зависимости по четырем точкам, от меньшей массовой концентрации к большей, из основного стандартного раствора № 1.

Стандартные градуировочные растворы кофеина хранят не более трех месяцев.

Для приготовления градуировочного раствора № 1 (основного) навеску кофеина массой 40 мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3. до половины заполненную дистиллированной водой, перемешивают до полного растворения вещества, доводят до метки и тщательно перемешивают.

Для приготовления градуировочных растворов №№ 2—4 отбирают пипетками соответствующие аликвоты градуровочного раствора № 1 е соответствии с таблицей 15. помещают их в мерные колбы и доводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивая.

31

ГОСТ Р 53185—2008

Таблице 15 — Приготовление стандартных градуировочных растворов кофеина

№ п/п

№ стандартного раствора

Вместимость мерной колбы. CMJ

Способ приготовления

Массовая комцен грация. мг/дм3

1

1

(основной)

100

навеску кофеина массой 100 мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, до половины заполненную дистиллированной водой, перемешивают до полного растворения вещества, доводят до метки и тщательно перемешивают

400

2

2

25

Отбирают 10 см3 раствора № 1. переносят в мерную колбу, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают

160

Э

3

25

Отбирают 5 см3 растворе № 1. переносят в мерную кол-бу.доеодят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают

80

4

4

25

Отбирают 1 см3 растворе № 1. переносят е мерную кол-бу.доеодят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают

16

Примечание — Раствор № 2 используют в качестве одного из контрольных растворов в повседневных анализах, поскольку его массовая концентрация наиболее близка к среднему содержанию кофеина в анализируемых пробах.

4.8.4.2 Подготовка образца

Энергетический налиток наливают в химический стакан вместимостью 50 см3 и удаляют газ в токе азота. Аликвоту напитка в 5 см3 помещают в мерную колбу вместимостью 250 см3. доводят дистиллированной водой до метки.тщательно перемешивают иотфильтроеывают через бумажныйфкльтрсраэме-ром пор 0.5 мкм или через капроновый фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

4.8.5 Проведение измерений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

4.8.5.1    Приготовление подвижной фазы

150 см3 ацетонитрила помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см3, добавляют 10 см3 уксусной кислоты, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтруют черезфильтровальную бумагу с диаметром пор0,5 мкм или через капроновый фильтре диаметром пор 0,45 мкм.

4.8.5.2    Условия хроматографического анализа

Условия ВЭЖХ для анализа кофеина:

подвижная фаза ацетонитрил: дистиллированная вода: уксусная кислота (15:84:1) в процентах по объему:

колонка по 4.8.3.2:

скорость потока 1.0 см3/мин;

детектирование: УФ при длине волны к-272 нм;

вводимый объем пробы 10.0 мм3;

ориентировочное время удерживания кофеина (9.8 ± 0.2) мин.

4.8.5.3    Построение градуировочной зависимости

Проводят хроматографический анализ всех градуировочных растворов кофеина.

Регистрируют площади пиков и строят градуировочный график — зависимость площади лика от массовой концентрации кофеина в градуировочном растворе.

Процедуры построения градуировочной зависимости выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования и руководством пользователя программным обеспечением.

Градуироеочную зависимость выражают линейным уравнением

у-кх.    (64)

Правильность построения градуировочной зависимости контролируется величиной достоверности аппроксимации (R3)

Кгй 0.9997.

Из уравнения (84) следует, что площадь пиков градуировочных растворов кофеина S (mV с или V • с) и их массовая концентрация с(мг/дм3) находятся в соответствующей функциональной зависимости

32

ГОСТ Р 53185—2008

где к — градуировочный коэффициент. [мг/дм3/тУ • с]

к = -&с>\    (66)

-

S — ллощадьпикасоответствующвговвщвства при анализе /-го стандартного раствора. mAU с или AU с;

с,— массовая концентрация соответствующего вещества при анализе /-го стандартного раствора. мг/дм3.

Градуировочную зависимость строят при смене хроматографа, колонок, условий хроматографического анализа или при выявлении несоответствия метрологическим требованиям результатов оперативного контроля или внутреннего аудита.

4.8.5.4 Анализ проб

Проводят хроматографический анализ подготовленных проб по 4.8.4.2. Каждую пробу продукта анализируют два раза в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-1 (подраздел 3.14) и ГОСТ Р ИСО 5725-2. Регистрируют площадь пика кофеина. В случае, если площадь пика выходит за границы диапазона градуировки хроматографа, готовят новую, менее или более разбавленную пробу, и анализ повторяют.

4.8.6 Обработка результатов определения

Массовую концентрацию кофеина в пробе продукта рассчитывают по градуировочным зависимостям с учетом степени разведения. Вычисления проводят до третьего десятичного знака.

Обработку хроматограмм и расчет количественных характеристик проводят с помощью программно-аппаратного комплекса сбора и обработки данных, с использованием градуировочной зависимости

с(Х)=ЬЛ    (67)

к м

или по формуле с использованием стандартного градуировочного раствора кофеина

с(Х) =

Cc,S. V3

Ч ■

(68)

где с(Х) — массовая концентрация кофеина в анализируемой пробе, мг/дм3:

S, — площадь пика анализируемого вещества. mV • с или V - с;

V2 — вместимость мерной колбы, взятой для разбавления, см3; к — градуировочный коэффициент. (мг/дм3/тУ - с);

V, — объем пробы, отобранный для измерения, см3;

сет — массовая концентрация кофеина в стандартном растворе, мг/дм3:

Scr — площадь пика анализируемого вещества в стандартном растворе. mV • с или V - с. Результаты обработки двумя способами (программно-аппаратным и расчетным) должны сходиться.

4.8.7 Оформление результатов измерений

За окончательный результат измерений принимают среднеарифметическое двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости

2-|Х,-хгноо    т

t V ^ V «    <*"'

где X,. Х2 — результаты параллельных определений, мг/дм3;

га1н — значение предела повторяемости (в процентах от среднеарифметического значения), приведенное в таблицах метрологических характеристик для каждой методики при вероятности Р* 0.95.

Предел воспроизводимости/? — значение, которое сдоверительнойеероятностью95% не превышается абсолютной величиной разности между результатами двух измерений, полученными вусловиях воспроизводимости

|Х,-Хг|й 0.01- /?й,и Х^,    (70)

где Хер — среднеарифметическое двух результатов измерений, выполненных в условиях воспроизводимости. мг/дм3;

33

ГОСТ Р 53185—2008

RotM — значение предела воспроизводимости (в процентах от среднеарифметического значения), приведенное в таблицах метрологических характеристик для каждой методики при вероятности Р= 0.95.

При соблюдении условий, регламентированных методиками (методами) измерений настоящего стандарта, при вероятности Р-0.95относительная погрешность измерений ± 5% не должна превышать значений, приведенных в таблицах метрологических характеристик для каждой методики (метода) измерений.

Результат анализа представляют в виде

(X ± Д) мг/дм3 при вероятности Р - 0.95,

гдеХ — среднеарифметическоезначениерезультатоеопредепений. признанных приемлемыми, мг/дм3; ± д — абсолютная погрешность измерений, мг/дм5. рассчитанная по формуле

д = 0.01 • 5 X.    (П)

где б—границы относительной погрешности методики (метода) измерений. % (значения приведены в таблицах метрологических характеристик для каждой методики при вероятности Р-0.95).

4.8.8    Контроль повторяемости (сходимости) результатов измерений проводят путем сравнения абсолютного расхождения между результатами двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости, с пределом повторяемости, приведенным в таблице 16.

Сходимость результатов признают удовлетворительной при условии

1Х,-Хг|£0.01 г..Хф.    (72)

При превышении норматива контроля повторяемости (сходимости) измерения повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6 (пункт 5.3.4).

4.8.9    Показатели точности и прецизионности измерений массовой концентрации кофеина Показатели точности и прецизионности измерений массовой концентрации кофеина при Р- 0.95

приведены в таблице 16.

Таблице 16

Метрологическая характеристика <Р * 0.9S)

Значение

Диапазон измерений, мг/дм*

От 1 до 200 аключ.

Св. 200 до 6000

Предел повторяемости г. %

27

16

Предел воспроизводимости Я. %

33

20

Границы относительной погрешности г 6, %

24

14

4.9 Метод определения витамина В} (ниацина)

4.9.1    Сущность метода

Метод основан на идентификации и количественном определении витамина В3 (ниацина) с помощью метода ион-парной ВЭЖХ в изократическом режиме со спектрофотометрическим детектированием.

4.9.2    Условия проведения анализа

При подготовке и проведении измерения должны быть соблюдены следующие условия:

температура окружающего воздуха.............от 10 *Сдо35 вС;

относительная влажность воздуха.............от 40% до 95%:

напряжение в электросети.................. 220']"^ 8.

Помещение, где проводят работы среактивами. должнобытьобеспечено приточно-вытяжной вентиляцией.

Все операции с реактивами следует проводить в вытяжном шкафу.

4.9.3 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы и материалы Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0.1 до 5см5/мин.

34

ГОСТ Р 53185—2008

Хроматографическая аналитическая колонка: длина колонки 150 мм. диаметр4,6 мм. заполненная октадецилсиликагелем с размером частиц 5 мкм.

Спектрофотометрический детектор на основе диодной матрицы, диапазон длин волн от 190 до 950 нм.

Микрошприц МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Баня водяная с терморегулятором с погрешностью ± 1 вС в интервале температур от 25 °С до 100 *С.

Соляная кислота, концентированная, х. ч. по ГОСТ 3118.

Гептилсульфонат натрия массовой долей основного вещества не менее 95.0 %.

Весы лабораторные по ГОСТ Р 53228 с пределами допускаемой абсолютной погрешности одно* кратного взвешивания ±0.0001 г.

Колбы мерные наливные 2-50-2.2-100-2.2-250-2,1-500-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 4-1-2-2 или 5-1-2-2.4-2-2-10 или 5-2-2-10.4-2-2-25 или 5-2-2-25 по ГОСТ 29227.

Ниацинч. д. а. ло(1].

Ледяная уксусная кислотах, ч. поГОСТ 19814.

Триэтиламин.

вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или дистиллированная, фильтрованная через капроновый фильтр с диаметром пор 0.45 мкм.

Метанол ч. д. а. по ГОСТ 6995.

Бумажные фильтры обезволенные марки ФОМ.

Капроновый фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Соляная кислота, концентрированная х. ч. по ГОСТ 3118.

Допускается применение других средств измерений и вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов по классу чистоты не ниже вышеуказанных.

4.9.4 Приготовление реактивов

4.9.4.1    Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрацией 0.5 моль/дм3

К 400 см3 дистиллированной воды добавляют 20 см3 концентрированной соляной кислоты (плотностью 1.19 г/см3), объем раствора доводят до метки в мерной колбе вместимостью 500 см3.

4.9.4.2    Приготовление стандартных градуировочных растворов ниацина

Стандартные градуировочные растворы ниацина готовят для расчета градуировочной зависимости по четырем точкам, от меньшей массовой концентрации к большей, из основного стандартного раствора № 1.

Стандартные градуировочные растворы ниацина хранят не более трех месяцев.

Для приготовления градуировочного раствора № 1 (основного)навеску ниацина массой 20 мг количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в растворе соляной кислоты молярной концентрацией 0.5 моль/дм3 и доводят объем этим же раствором до метки. Содержимое колбы тщательно перемешивают. Приготовленный раствор можно хранить в холодильнике в течение 2—3 мес.

Для приготовления градуировочных растворов №№ 2—4 отбирают пипетками соответствующие аликвоты градуировочного раствора № 1 в соответствии с таблицей 17. помещают их в мерные колбы и доводят раствором соляной кислоты молярной концентрацией 0.5 моль/дм3 до метки, тщательно перемешивая.

Таблица 17 — Приготовление стандартных градуировочных растворов ниацина

N* л/п

N* стандартного раствора

Вместимость мерной колбы.сы*

Способ приготовления

Масоовая

концентрация.

мг/дм3

1

1

(основной)

100

Навеску ниацина массой 100 мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, до половины заполненную дистиллироааной водой, перемешивают до полного растворения вещества, доводят до метки и тщательно перемешивают

200

2

2

25

Отбирают 10 смJ раствора N9 1. переносят в мерную колбу, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают

80

35

ГОСТ Р 53185—2008

Окончание таблицы 17

№ nftr

№ стандартного раствора

Вместимость мерной колбы,см3

Способ приготовления

Массовая

концентрация,

ыгГды*

3

3

2S

Отбирают 5 см1 раствора № 1, переносят в мерную колбу, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают

40

А

4

2S

Отбирают 1 см1 раствора № 1. переносят в мерную колбу, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают

6

Примечание — Раствор № 2 используют в качестве одного из контрольных растворов в повседневных анализах, поскольку его массовая концентрация наиболее близка к сред нему содержанию ниацина в анализируемых пробах.

4.9.4.3 Подготовка образца

Энергетический напиток наливают в химический стакан вместимостью 50 см3 и удаляют газ в токе азота. Аликвоту напитка в 50 см помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают и отфильтровывают через бумажный фильтр сразив-ром пор 0.5 мкм или через капроновый фильтр с диаметром лор 0,45 мкм.

4.9.5 Проведение измерений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

4.9.5.1    Приготовление подвижной фазы

В мерную колбу вместимостью 1000 см3 добавляют 150—200 см3 дистиллированной воды. 2 г геп-тилсульфоната натрия. 150 см3 метанола. 10 см3 ледяной уксусной кислоты. 0.4 см3 триэтиламина и доводят объем до метки дистиллированной водой, раствор тщательно перемешивают.

4.9.5.2    Условия хроматографического анализа

Условия ВЭЖХ для анализа ниацина:

подвижная фаза метанол: ледяная уксусная кислота: вода (15:1:84), об. %, содержащая 0.01 моль гелтилсульфоната натрия;

колонка по 4.9.3.2;

скорость потока 1.0 см3/мин;

детектирование: УФ при длине волны к-262 нм;

вводимый объем образца 10.0 мм3;

ориентировочное время удерживания ниацина (8,0 ±0,5) мин.

4.9.5.3    Построение градуировочной зависимости

Проводят хроматографический анализ всех градуировочных растворов ниацина.

Регистрируют площади ликов и строят градуировочный график — зависимость площади пика от массовой концентрации ниацина в градуировочном растворе.

Процедуры построения градуировочной зависимости выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования и руководством пользователя программным обеспечением.

Г радуй ровочную зависимость выражают линейным уравнением

у-кХ.    (73)

Правильность построения градуировочной зависимости контролируется величиной достоверное* ти аппроксимации (R2)

R2i 0.9997.

Из уравнения (73) следует, что площадь пиков градуировочных растворов ниацина S (mV - с или V • с) и их массовая концентрация с(мг/дм3) находятся в соответствующей функциональной зависимости

к

где к — градуировочный коэффициент. [мг/дм3/тУ с]*1

с.>

"—77Г-’

(75)

36

S, — площадьпика соответствующего вещества при анализе г~го стандартного раствора. mAll с или AUc;

ГОСТ Р 53185—2008

С)—массовая концентрация соответствующего вещества при анализе /-го стандартного раствора, мг/дм3.

Градуировочную зависимость строят при смене хроматографа, колонок, условий хроматографического анализа или при выявлении несоответствия метрологическим требованиям результатов оперативного контроля или внутреннего аудита.

4.9.5.4 Анализ проб

Проводят хроматографический анализ подготовленных проб по 4.9.4.3. Каждую пробу продукта анализируют два раза в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-1 (подраздел 3.14) и ГОСТ Р ИСО 5725-2. Регистрируют площадь пика ниацина. В случае, если площадь пика выходит за границы диапазона градуировки хроматографа, готовят новую, менее или более разбавленную пробу, и анализ повторяют.

4.9.6    Обработка результатов определения

Массовую концентрацию ниацина в пробе продукта рассчитывают по градуировочным зависимостям с учетом степени разведения. Вычисления проводят до третьего десятичного знака.

Обработку хроматограмм и расчет количественных характеристик проводят с помощью программно-аппаратного комплекса сбора и обработки данных, с использованием градуировочной зависимости

с(Х)=ЬЛ    (76)

к М

или по формуле с использованием стандартного градуировочного раствора ниацина

с (X) = Сс' S’    (77)

SCI-y,

где с(Х) — массовая концентрация ниацина в анализируемой пробе, мг/дм3;

S, — площадь пика анализируемого вещества. mV ■ с или V • с:

V2 — вместимость мерной колбы, взятой для разбавления, см3; к — градуировочный коэффициент. [мг/дм3/тУ • с);

V, — объем пробы, отобранный для измерения см3: сС1 — массовая концентрация ниацина в стандартном растворе, мг/дм3;

S<t — площадь пика анализируемого вещества в стандартном растворе. mV • с или V с. Результаты обработки двумя способами (программно-аппаратным и расчетным) должны сходиться.

4.9.7    Оформление результатов измерений

За окончательный результат измерений принимают среднеарифметическое двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости

2 -юо „    (78)

.    ^    а ГфТМ*

(Х,*х2}

гдеХ,.Х2 — результаты параллельных определений, мг/дм3;

готи — значение предела повторяемости (в процентах от среднеарифметического значения), при-веденноевтаблицахметрологическиххарактеристикдлякаждой методики при вероятности Р= 0.95.

Предел воспроизводимости R —• значение, которое сдоверительнойвероятностью95% не превышается абсолютной величиной разности между результатами двух измерений, полученными вусловиях воспроизводимости

|Х,-Х2|й0.01 Rani Хф.    (79)

где Xte — среднеарифметическое двух результатов измерений, выполненных в условиях воспроизводимости. мг/дм3;

Ra,u — значение предела воспроизводимости (в процентах от среднеарифметического значения), приведенное в таблицах метрологических характеристикдля каждой методики при вероятности Р = 0,95.

При соблюдении условий, регламентированных методиками (методами) измерений настоящего стандарта, при вероятности Р - 0.95 относительная погрешность измерений ± &% не должна превышать значений, приведенныхвтаблицах метрологических характеристик для каждой методики (метода)иэме-рений.

37

ГОСТ Р 53185—2008

Результат анализа представляют е виде

(X ± Д) мг/дмэ при вероятности Р - 0.95,

гдеХ — среднеарифмбтичвскоезначемиерезультатоеопредепений.признанныхлриемлемыми.мг/дм3; 1Д — абсолютная погрешность измерений, мг/дм3, рассчитанная по формуле

д= 0,01.8.x.    (80>

где8—границы относительной погрешности методики (метода) измерений, % (значения приведены в таблицах метрологических характеристик для каждой методики при вероятности Р-0.95).

4.9.8    Контроль повторяемости (сходимости) результатов измерений проводят путем сравнения абсолютного расхождения между результатами двух параллельных определений, выполненных в уело* виях повторяемости, с пределом повторяемости, приведенным в таблице 18.

Сходимость результатов признают удовлетворительной при условии

^-XjSO.OI.r^.X^    (81)

При превышении норматива контроля повторяемости (сходимости) измерения повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6 (пункт 5.3.4).

4.9.9    Показатели точности и прецизионности измерений массовой концентрации ниацина Показатели точности и прецизионности измерений массовой концентрации ниацина при Р - 0,95

приведены в таблице 18.

Таблица 18

Метрологическая характеристика (Р * 0.9S)

Значение

Диапазон измерений, мг/дм3

От 2 до 200 включ.

Са. 200 до 2000

Предел повторяемости г0,«. %

35

26

Предел воспроизводимости %

44

35

Границы относительной погрешности г й, %

31

2S

4.10 Метод определения витамина В$(пантотеновой кислоты)

4.10.1    Сущность метода

Метод основан на колориметрическом определении по реакции пантотеноеой кислоты с 2.5-димв-токситетрагидрофураном и 4-диметиламинобензальдегидом.

4.10.2    Условия проведения анализа

При подготовке и проведении измерения должны быть соблюдены следующие условия:

температура окружающего воздуха.............от 10 *С до 35 вС;

относительная влажность воздуха.............от 40 % до 95 %:

напряжение в электросети.................. 220*™* В.

Помещение, где проводят работы с реактивами, должно быть обеспечено приточно-вытяжной вентиляцией.

Все операции с реактивами следует проводить в вытяжном шкафу.

4.10.3 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы и материалы 4-Димстиламинобензальдсгид массовой долей основного вещества не менее 99.0 %. Пантотеновая кислота массовой долей основного вещества не менее 98.0 %.

Спектрофотометр, позволяющий проводить измерения при длинах волн от>.= 200 нмдо>.= 900нм. сдолускаемой абсолютной погрешностью измерения коэффициента пропускания не более 1 %. Катионит в Н-форме.

Баняводянаястерморегуляторомслогрешностью1 *С в интервале температурот 25 'С до 100 *С. Соляная кислота концентрированная х. ч. по ГОСТ 3118.

Ледяная уксусная кислота х. ч. по ГОСТ 19814.

2.5-Диметокситетрагидрофуран массовой долей основного вещества не менее 95,0 %.

Весы лабораторные по ГОСТ Р 53228 с пределами абсолютной допускаемой погрешности однократкого взвешивания не более ± 0,0001 г.

38

ГОСТ Р 53185—2008

Колбы мерные наливные 2*25*2.2*50*2.2-100*2.2-250*2,1*500*2 по ГОСТ 1770.

Пипетки4-1-2-2 или 5.1*2-2.4.2*2*10или5*2*2*10.4-2*2-25 или 5*2*2*25 по ГОСТ29227.

Натрия гидроокись ч. д. а. по ГОСТ 4328.

Соль динатриевая этилендиамин-Н.М.Ы’М’-тетрауксусной кислоты. 2-еодная (трилон Б. ЭДТА) по ГОСТ 10652.

Пролиленгликоль по ГОСТ 19710.

Бода дистиллированная по ГОСТ 6709 или дистиллированная, фильтрованная через капроновый фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Спирт изобутиловый ч. д. а. по ГОСТ 6061.

Бумажные фильтры обезволенные марки ФОМ.

Капроновый фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Стакан фарфоровый 150 по ГОСТ 9147.

Колба коническая КН-1-100-14/23поГОСТ 25336.

Шейкер лабораторный ЛАБ-ПУ-04.

Центрифуга лабораторная с величиной фактора разделения (д-факгор) 800—1500.

Термометр стеклянный ртутный с диапазоном измерения от 0 вСдо 100 *С.

Стаканы химические вместимостью 50 и 1000 см3 по ГОСТ 25336.

Допускается применение других средств измерений и вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов по классу чистоты не ниже вышеуказанных.

4.10.4 Приготовление растворов

4.10.4.1    Приготовление раствора гидроокиси натрия массовой концентрацией 0.01 г/см3

1.0 г гидроокиси натрия растворяют в 20—40 см3 дистиллированной воды в фарфоровом стакане, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят объем дистиллированной водой до метки и перемешивают.

4.10.4.2    Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрацией 0,01 моль/дм3

Осторожно помещают 8.5 см3 концентрированной соляной кислоты с плотностью 1.1 г/см3 в мерный стакан вместимостью 1000 см3. до половины заполненный дистиллированной водой. Перемешивают и доводят объем до 1000 см3.

4.10.4.3    Приготовление реагента I

0.5см32,5*диметокситетрагидрофурана помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 40 см3 ледяной уксусной кислоты. 40 см3 изобут илового спирта, доводят объем до метки ледяной уксусной кислотой и перемешивают. Раствор готовят непосредственно перед проведением испытания.

4.10.4.4    Приготовление реагента К

Точную навеску 4-диметиламинобензальдегида 5 г в мерной колбе вместимостью 250 см3 растворяют в 20 см3 раствора соляной кислоты молярной концентрации 0.01 моль/дм3. доводят объем до метки ледяной уксусной кислотой и перемешивают.

4.10.4.5    Приготовление стандартного раствора пантотеновой кислоты с массовой концентрацией

1,0 мг/см3

Навеску пантотеновой кислоты массой 100 мг количественно переносят е мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем дистиллированной водой до метки. Содержимое колбы тщательно перемешивают. Приготовленный раствор можно хранить в холодильнике в течение двух — трех месяцев.

4.10.5    Приготовление рабочего стандартного раствора пантотеновой кислоты

Для приготовления рабочего стандартного раствора в мерную колбу вместимостью 100 см3 помешают аликвоту 1.0 см3 раствора пантотеновой кислоты массовой концентрацией 1.0 мг/см3 и доводят объем до метки дистиллированной водой. Массовая концентрация рабочего стандартного раствора пантотеновой кислоты составляет 0.01 мг/см3.

4.10.6    Подготовка к анализу

Энергетический напиток наливают в химический стакан вместимостью 50 см3 и удаляют газ в токе азота. 25 см3 полученного раствора используют для проведения калориметрической реакции.

4.10.7    Проведение анализа

8 конические колбы вместимостью 100 см3 помешают по 25 см3 стандартного рабочего раствора и ислытуемогообразца. добавляют по 2.0г катионита в каждую и интенсивно перемешивают на шейкере в течение 10 мин. Затем полученные смеси центрифугируют в течение 5 мин при 1500д. Полученный супернатант используют в ходе дальнейшего исследования.

Аликвоты стандартного рабочего раствора (Sf) пантотеновой кислоты и ислытуемогообразца (Sa) помещают в мерные колбы вместимостью 25 см3.

39

ГОСТ Р 53185—2008

Состав исследуемых проб и порядок добавления к ним реагентов приведены в табпице 19. Таблице 1д

Реагент

St

Sa

Контроль

Обьем стандартного рабочего раствора пантоте-новой кислоты.см’

5.0

Объем испытуемого образца, см3

5.0

Объем дистиллированной воды, см3

5.0

Объем раствора гидроокиси натрия массовой концентрацией 0.01 г/см3, см*

5.0

S.0

5.0

Колбы закрывают пробками и помещают в баню с пропиленгликолем при температуре 85 *С на 15 мин. добавляют в каждую колбу 5.0см3 раствора реагента I и быстро перемешивают, не вынимая кол» бы из бани. Через 10 мин после добавления реагента колбы вынимают, тщательно вытирают и помещают в водяную баню при температуре 20 вС. Доводят объем до метки в каждой колбе раствором реагента II. Через 15 мин колбы вынимают и измеряют оптическую плотность полученных растворов на спектрофотометре при длине волны к- 560 нм. используя в качестве контроля смесь дистиллированной воды и раствора гидроокиси натрия молярной концентрации 0.01 г/см3 в соотношении 1:1.

4.10.8 Обработка результатов

Массовую концентрацию пактотеновой кислоты в напитке X. мг/дм3. рассчитывают по формуле

X=^£i-£2L1000    (82)

К

где ASa — оптическая плотность испытуемого раствора;

Ад, — оптическая плотность стандартного рабочего раствора пактотеновой кислоты;

CSI — массовая концентрация стандартного рабочего раствора, мг/см3;

1000 — коэффициент пересчета см3 на дм3.

Вычисления проводят до второго десятичного знака.

4.10.9 Оформление результатов измерений

За окончательный результат измерений принимают среднеарифметическое двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости

2|Х,-ХД| юо <X,*Xj)

(83>

где X,. Х2 — результаты параллельных определений, мг/дм3:

готы — значение предела ловторяемости(впроцентахот среднеарифметического значения), при-веденноевтаблицахметрологическиххарактеристикдлякаждой методики при вероятности 0.95.

Предел воспроизводимости R — значение, котороес доверительной вероятностью 95 % не превышается абсолютной величиной разности между результатами двух измерений, полученными в условиях воспроизводимости

IX.-X^O.OIP^-X*.    ,84}

гдеХ<с> — среднеарифметическое двух результатов измерений, выполненных в условиях воспроизводимости. мг/дм3;

R0TM — значение предела воспроизводимости (в процентах от среднеарифметического значения), приведенное в таблицах метрологических характеристик для каждой методики при вероятности Р*0.95.

При соблюдении условий, регламентированных методиками (методами) измерений настоящего стандарта, при вероятности Р-0.9S относительная погрешность измерений 16% не должна превышать значений, приведенныхвтаблицах метрологических характеристик для каждой методики (метода) измерений.

40

ГОСТ Р 53185—2008

Результат анализа представляют в виде

(X ± д) мг/дм3 при вероятности Р = 0.95.

гдвХ — среднеарифметическое значение результатовопрвделений. признанных приемлемыми, мг/дм3; ± д — абсолютная погрешность измерений, мг/дм3, рассчитанная по формуле

Д= 0.01 ЙХ.    (85)

гдеб—границы относительной погрешности методики (метода) измерений. % (значения приведены в таблицах метрологических характеристик для каждой методики при вероятности Р-0,95).

4.10.10    Контроль повторяемости (сходимости) результатов измерений проводят путем сравнения абсолютного расхождения между результатами двух параллельных определений, выполненных вусло-виях повторяемости, с пределом повторяемости, приведенным втаблице.

Сходимость результатов признают удовлетворительной при условии

|Х,-Х3|й 0.01 • rwtl - Х.    (вб)

При превышении норматива контроля повторяемости (сходимости) измерения повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6 (пункт 5.3.4).

4.10.11    Показатели точности и прецизионности массовой концентрации измерений пантотеновой кислоты

Показатели точности и прецизионности измерений пантотеновой кислоты в диапазоне измерений от 5 до 50 мг/дм3 при Р - 0,95 приведены в таблице 20.

Таблица 20

Метрологическая характеристика (Р * 0,95)

Значение

Диапазон измерений, мг/дм5

От 5 до 50

Предел повторяемости гт. %

43

Предел воспроизводимости %

56

Границы относительной погрешности ± &.%

40

4.11 Метод определения витамина Вв (пиридоксина гидрохлорида)

4.11.1    Сущность метода

Метод основан на колориметрическим определении по реакции пиридоксина гидрохлорида с N-диэтилпарафенипендиамином.

4.11.2    Условия проведения анализа

При подготовке и проведении измерения должны быть соблюдены следующие условия:

температура окружающего воздуха.............от 10 *С до 35 *С;

относительная влажность воздуха.............от 40% до 95%:

напряжение в электросети.................. 220']^ В.

Помещение, где проводят работы с реактивами, должно быть обеспечено приточно-вытяжной вентиляцией.

все операции с реактивами следует проводить в вытяжном шкафу.

4.11.3 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы и материалы Пробирки стеклянные центрифужные вместимостью до 35 см3 с плотными пробками. pH-метр с диапазоном измерений pH от 2 до 18: погрешность измерений ± 0.01 ед. pH. Спектрофотометр, обеспечивающий измерения при длинах волн от 200 до 900 нм с допускаемой абсолютной погрешностью измерения коэффициента пропускания не более 1 %.

Стакан фарфоровый вместимостью 500 см3 по ГОСТ 9147.

Баня водяная стерморегулятором с погрешностью 1 °С винтервале температур от 25 °С до 100 *С. Эксикатор исполнения 2 по ГОСТ 25336.

N.N-диэтилларафикилендиаминсернокислыйссодержанием основного вещества не менее 90%. Калий железосинеродистый ч. д. а. по ГОСТ 4206.

41

ГОСТ Р 53185—2008

Весы лабораторные по ГОСТ Р 53228 с пределами допускаемой абсолютной погрешности одно* краткого взвешивания не более ± 0.0001 г.

Колбы мерные наливные 2-25*2.2*50*2.2*100-2.2*250*2.1 -500-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 4*1 *2*2 или 5*1*2*2.4*2-2*10 или 5*2*2-10.4-2*2-25 или 5*2*2*25 по ГОСТ 29227.

Натрия гидроокись ч. д. а. по ГОСТ 4328.

Соль динатриевая этилендиамин-Ы.М.М'М'-тетрауксусной кислоты 2*еодная (трилок Б. ЭДТА) ло ГОСТ 10652.

Калий фосфорнокислый однозамещенный ч. д. а. ло ГОСТ 4198.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или дистиллированная, фильтрованная через капроновый фильтр с диаметром пор 0.45 мкм.

Кислота борная поГОСТ 18704.

Бумажные фильтры обезволенные марки ФОМ.

Капроновый фильтр с диаметром пор 0.45 мкм.

Соляная кислота, концентрированная, квалификации х. ч. по ГОСТ3118.

Натрий фосфорнокислый двуэамещекный 2-водный ч. д. а. по ГОСТ 4172.

Пиридоксин гидрохлорид с содержанием основного вещества не менее 95 %.

Толуол ч. д. а. по ГОСТ 5789.

Стаканы химические вместимостью 50 и 1000 смэ по ГОСТ 25336.

Шейкер лабораторный ЛАБ-ПУ-04.

Центрифуга лабораторная с величиной фактора разделения (д*фактор)800—1500.

Кварцевая кювета вместимостью 3.0 см* и длиной оптического пути 1.0 см по ГОСТ 20903.

Допускается применение других средств измерений и вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необхо* димую точность измерения, а также реактивов ло классу чистоты не ниже вышеуказанных.

4.11.4 Приготовление растворов

4.11.4.1    Приготовление фосфатного буфера I

11.88 г натрия фосфорнокислого двухзамещенного дигидрата растворяют в 500 см3 дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1000 см3, доводят водой объем до метки и перемешивают.

4.11.4.2    Приготовление фосфатного буфера II

9.08 г калия фосфорнокислого однозамещенного растворяют в 500 см3 дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1000 см3, доводят водой объем до метки и перемешивают..

4.11.4.3    Приготовление раствора желеэосинеродистого калия массовой концентрации 0.05 г/см3

1.25 г железосинеродистого калия растворяют в 10—15 см3 дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 25 см3, доводят объем этим же растворителем до метки и перемешивают. Раствор хранят в темном месте не более трех часов.

4.11.4.4    Приготовление стандартного раствора пиридоксина гидрохлорида с массовой концентрацией 1.0 мг/см3

Навеску пиридоксина гидрохлорида массой 100 мг. высушенного в эксикаторе над фосфорным ангидридом в течение 10 сут. растворяют в 20—30 см3 дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 100 см3, доводят объем водой и перемешивают. Раствор хранят в холодильнике в течение двух месяцев.

4.11.4.5    Приготовление раствора N.N-диэтилпарафенилвндиамина массовой концентрацией 0,01 г/см3

Навеску N.N-диэтилпарафенилендиамина массой 100.0 мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, доводят объем до метки дистиллированной водой и перемешивают. Для предотвращения разрушения N.N-диэтилпарафени* лендиамина под действием света раствор готовят непосредственно перед использованием..

4.11.4.6    Приготовление фосфатного буфера pH 7.0

500 см3 фосфатного буфера I переносят в стакан вместимостью 1000 см3, добавляют приблизительно 250 см3 фосфатного буфера II и доводят pH до значения 7.0 ед. pH.

4.11.4.7    Приготовление раствора борной кислоты массовой концентрацией 0.05 г/см3

5.0 г кристаллической борной кислоты растворяют дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 100 см3, доводят объем до метки водой и перемешивают.

4.11.5 Приготовление рабочего стандартного раствора пиридоксина гидрохлорида

1 см3 полученного стандартного раствора пиридоксина гидрохлорида массовой концентрацией

1.0 мг/см3 пипеткой переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят объем до метки дистил* лироеанной водой. Массовая концентрация рабочего стандартного раствора пиридоксина гидрохлорида составляет 0.01 мг/см3.

42

ГОСТ Р 53185—2008

4.11.6    Подготовка к анализу

Энергетический напиток наливают в химический стакан вместимостью 50 см3 и удаляют газ в токе азота. Для проведения колориметрической реакции используют 2 см3 подготовленной пробы налитка.

4.11.7    Проведение анализа

Колориметрическую реакцию стандартного рабочего раствора (S0 и испытуемого образца (Sa) проводят в центрифужных пробиркахс пробками. Состав исследуемых проби порядок добавления к ним реагентов приведены в таблице 21.

Таблица 21

PeaieHt

St

Sa

Контрол»

Дистиллированная вода, см3

2.0

Экстракт испытуемого образца, см9

2.0

Стандартный рабочий раствор пиридоксина гидрохлорида, см9

2.0

Фосфатный буфер pH 7.0. см9

10.0

ю.о

10.0

Раствор диэгилпарафени ленд намина массовой концентрации 0.01 г/см3. см9

1.0

1.0

1.0

Толуол, см9

10.0

10.0

10.0

Раствор железосинеродистого калия массовой концентрации 0.05 г/см3, см*

1.0

1.0

1.0

При добавлении раствора N.N-диэтилпарафенилендиамина содержимое каждой пробирки быстро перемешивают на шейкере в течение 30 с. после чего пробирки центрифугируют в течение 2 мин при 1500 g для более четкого разделения органической и водной фаз.

Для проведения колориметической реакции в каждую пробирку быстро добавляют 1.0 см3 раствора железосинеродистого калия с массовой концентрацией 0.05 г/см3, интенсивно перемешивают в течение 30 с и центрифугируют в течение 2 мин при 1500 g до четкого разделения органического и водного слоев.

Пипеткой первносят2.5см3толуол ьного слоя, окрашенногоесиний цвет, екеарцееую кювету вместимостью 3.0 см3 и длиной оптического пути 1.0 см. Оптическую плотность измеряют при длине волны X = 605 нм. используя в качестве контроля толуольный слой контрольной пробы.

Для устранения мешающего влияния примесей, поглощающих при данной длине волны. 5.0 см3 образца (Sa) и стандартного рабочего раствора (50смешиваютс 5.0 см3 раствора борной кислоты с массовой концентрацией 0.05 г/см3, встряхивают в течение 1 мин на шейкере, центрифугируют при 1500 g и измеряют оптическую плотность, какописано выше. При расчете полученные таким образом оптические плотности (ASM> и    вычитают из полученных выше соответственно. После каждого измерения кювету

немедленно промывают толуолом.

4.11.8 Обработка результатов

Массовую концентрацию пиридоксина гидрохлорида в напитке X, мг/дм3. рассчитывают по формуле

y.<Af    (87)

Мы -

гдеД — оптическая плотность анализируемой пробы:

ASab — оптическая плотность испытуемого раствора после реакции с борной кислотой;

ASl— оптическая плотность стандартного рабочего раствора пиридоксина гидрохлорида;

Д5№ — оптическая плотность стандартного рабочего раствора после реакции с борной кислотой;

С5, — массовая концентрация стандартного рабочего раствора, мг/см3;

1000 — коэффициент пересчета см3 на дм3.

Вычисления проводят до второго десятичного знака.

43

ГОСТ Р 53185—2008

4.11.9 Оформление результатов измерений

За окончательный результат измерений принимают среднеарифметическое двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости

2-|Х, -Ха| юо (Х1 + х2>

(88)

где X,, Х2 — результаты параллельных определений. мг/дмэ;

готм — значение предела поеторяемости{в процентахот среднеарифметического значения), приведенное в таблицах метрологических характеристик для каждой методики при вероятности 0.95.

Предеп воспроизводимости R — значение, котороес доверительной вероятностью 95 % не превышается абсолютной величиной разности между результатами двух измерений, полученными в условиях воспроизводимости

1г|й0.01-/?,-Хсо.    ,89)

гдеХср — среднеарифметическое двух результатов измерений, выполненных в условиях воспроизводимости. мг/дм3;

Ront — значение предела воспроизводимости (в процентах от среднеарифметического значения), приведенное в таблицах метрологических характеристик для каждой методики при вероятности Р-0.95.

При соблюдении условий, регламентированных методиками (методами) измерений настоящего стандарта, при вероятности Р-Соотносительная погрешность измерений ± 8% не должна превышать значений, приведенных в таблицах метрологических характеристик для каждой методики (метода) измерений.

Результат анализа представляют в виде

(X ± д) мг/дм3 при вероятности Р - 0,95,

гдеХ — среднеарифметическоезначениерезультатоеопредепений, признанных приемлемыми, мг/дм3; ± д — абсолютная погрешность измерений, мг/дм3. рассчитанная по формуле

д = 0,01б-Х,    ,90)

где 8— границы относительной погрешности методики (метода) измерений. % (значения приведены в таблицах метрологических характеристик для каждой методики при вероятности Р-0.95).

4.11.10    Контроль повторяемости (сходимости) результатов измерений проводят путем сравнения абсолютного расхождения между результатами двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости, с пределом повторяемости, приведенным в таблице.

Сходимость результатов признают удовлетворительной при условии

1Х,-Хг|* 0,01-г^.Х^.    ,91,

При превышении норматива контроля повторяемости (сходимости) измерения повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6 (пункт 5.3.4).

4.11.11    Показатели точности и прецизионности измерений пиридоксина гидрохлорида. мг/дм3

Показатели точности и прецизионности измерений пиридоксина гидрохлорида в диапазоне измерений от 5 от 50 мг/дм3 при Р-0.95 приведены в таблице 22.

Таблице 22

Метрологическая характеристика (Р » 0,95)

Значение

Диапазон измерений, мг/дм*

От 5 до SO включ.

Предел повторяемости Го». 14

26

Предел воспроизводимости /?„,„. %

3S

Границы относительной погрешности х & 14

2S

44

ГОСТ Р 53185—2008

Библиография

(1| Госфармакопея. XI издание, вып, 2

45

ГОСТ Р 53185—2008

УДК 663.86:006.354    ОКС67.160.20    Н79    ОКСТУ9185

Ключевые слова: напитки безалкагольные и слабоалкогольные тонизирующие, тонизирующие ингре* диенты. методы определения, кофеин, гингоэиды, схиэандрик. элеутероэиды. таурин, глюкуронолактон. карнитин. инозитол. витамины, обработка результатов

Редактор Л.0. Коратникова Технический редактор Н.С Гришаноаа Корректор в.£. Нестерова Компьютерная еерстка И. А. Нопейкинои

Сдано а набор 21.07.2010. Подписано а печать 09.09.2010. Формат 60 ■ 84 Бумага офсетная. Гарнитура Ариап. Печать офсетная. Усл печ л. 5.56. Уч.-иэд. л. 5.10. Тираж 361 ока. Зак. 710.

ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ». 123935 Москва. Гранатный лер.. 4.     inlo@9oslin!o ги

Набрано ао ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» на ПЭВМ.

Отпечатано е филиале ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» — тип. • Московский печатник». 105062 Москва. Лялин пер.. 6.