ГОСТ 31781-2012 Рыба и продукция из нее. Видовая идентификация рыбы методом изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле

ГОСТ 31781-2012

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

РЫБА И ПРОДУКЦИЯ ИЗ НЕЕ

Видовая идентификация рыбы методом изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле

Fish and products from it. Species identification of fish by IEF method

МКС 67.120.30

Дата введения 2013-07-01

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Открытым акционерным обществом "Научно-исследовательский и проектно-конструкторский институт по развитию и эксплуатации флота" (ОАО "Гипрорыбфлот")

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 1 октября 2012 г. N 51)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1626-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31781-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

6 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Декабрь 2019 г.

7 Настоящий стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 52840-2007*

________________

* Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1626-ст ГОСТ Р 52840-2007 отменен с 15 февраля 2015 г.

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.

В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на рыбу-сырец*, мороженые рыбу, филе рыбы и рыбный фарш, используемые для приготовления пищевой продукции, и устанавливает метод изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в полиакриламидном геле для их видовой идентификации.

_______________

* Охлажденная (без применения льда и воды).

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.1.004 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 83 Реактивы. Натрий углекислый. Технические условия

ГОСТ 244 Натрия тиосульфат кристаллический. Технические условия

ГОСТ 1277 Реактивы. Серебро азотнокислое. Технические условия

ГОСТ 1625 Формалин технический. Технические условия

ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 4165 Медь (II) сернокислая 5-водная. Технические условия

ГОСТ 5962 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 6259 Реактивы. Глицерин. Технические условия

ГОСТ 6709 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 7631 Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Методы определения органолептических и физических показателей

ГОСТ 9147 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 12026 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 12738 Колбы стеклянные с градуированной горловиной. Технические условия

ГОСТ 19814 Кислота уксусная синтетическая и регенерированная. Технические условия

ГОСТ 24104 Весы лабораторные. Общие технические требования*

________________

* В Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

ГОСТ 25336 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26678 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия

ГОСТ 29227 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов и классификаторов на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (www.ease.by) или по указателям национальных стандартов, издаваемым в государствах, указанных в предисловии, или на официальных сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации. Если на документ дана недатированная ссылка, то следует использовать документ, действующий на текущий момент, с учетом всех внесенных в него изменений. Если заменен ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, то следует использовать указанную версию этого документа. Если после принятия настоящего стандарта в ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение применяется без учета данного изменения. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 изоэлектрическая точка белка: Значение водородного показателя (рН), при котором заряд молекулы белка равен нулю.

3.2 маркерные белки: Основные белки, характерные (видоспецифичные) для каждого вида анализируемого объекта.

3.3 стандартные белки: Белки с известной изоэлектрической точкой.

3.4 референс-образец: Образец рыбы, идентифицированный по морфологическим признакам.

3.5 саркоплазматические белки: Белки, входящие в состав саркоплазмы клеток мышечной ткани.

Примечание - На рыбу, отобранную для получения образца, должна быть оформленная декларация о соответствии или сертификат соответствия с указанием ее научного названия (на латинском языке). Образец хранят в герметично упакованном виде при температуре не выше минус 18°С.

4 Сущность метода

Метод основан на видовой специфичности саркоплазматических белков и заключается в разделении молекул белков по их изоэлектрическим точкам в полиакриламидном геле. Идентификация проводится путем сравнения картин распределения белковых полос анализируемого образца с референс-образцом для данного вида.

5 Оборудование и материалы

5.1 Оборудование

5.1.1 Универсальная модульная автоматизированная система для разделения белков с использованием готовых гелевых сред в программируемом режиме и автоматической обработкой гелей (фиксация, окрашивание, отмывка), с контролем условий разделения (температуры, параметров тока) со следующими программными параметрами: напряжение от 10 до 2000 В, сила тока от 0,1 до 50,0 мА, мощность от 0,1 до 7,0 Вт, температура от 0°С до 70°С или иное электрофоретическое оборудование для разделения белков методом ИЭФ.

5.1.2 Центрифуга рефрижераторная с частотой вращения не менее 13000 мин.

5.1.3 Пробирки центрифужные вместимостью 50 и 10 см.

5.1.4 Гели полиакриламидные (5% Т, 3% С), содержащие фармалит.

5.1.5 Аппликатор с капиллярными отверстиями объемом 1 мкл для внесения образцов в гель.

5.1.6 Микродозатор с переменным объемом дозирования от 0,5 до 10,0 мм (шаг - 0,1 мм, точность ±(1,5-5,0)%, воспроизводимость от 1,0% до 5,0%).

5.1.7 Наконечники для микродозаторов (микропипеток) с переменным объемом дозирования жидкостей.

5.1.8 Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические вместимостью от 50 до 1000 см по ГОСТ 25336.

5.1.9 Колбы стеклянные с градуированной горловиной вместимостью 100 см по ГОСТ 12738.

5.1.10 Штамп лунок для образца с лунками вместимостью не менее 1,5 мкл.

5.1.11 Цилиндры стеклянные мерные лабораторные вместимостью 50 и 100 см по ГОСТ 1770.

5.1.121 Пипетки стеклянные градуированные вместимостью 5 см по ГОСТ 29227.

5.1.13 Ступка фарфоровая по ГОСТ 9147.

5.1.14 Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределом абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0,01 г.

5.1.15 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда по ГОСТ 26678.

5.1.16 Пленка парафиновая.

5.1.17 Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

5.2 Материалы

5.2.1 Кислота уксусная ледяная по ГОСТ 19814, х.ч.

5.2.2 Медь сернокислая 5-водная по ГОСТ 4165, ч.д.а.

5.2.3 Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962, х.ч.

5.2.4 Краситель кумасси бриллиантовый голубой .

5.2.5 Глицерин по ГОСТ 6259, ч.д.а.

5.2.6 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

5.2.7 Альдегид глутаровый с содержанием основного компонента не менее 25%.

5.2.8 Серебро азотнокислое по ГОСТ 1277.

5.2.9 Натрий углекислый по ГОСТ 83.

5.2.10 Формальдегид по ГОСТ 1625.

5.2.11 .

5.2.12 Кислота трихлоруксусная .

5.2.13 Кислота уксусная синтетическая и регенерированная по ГОСТ 19814.

5.2.14 Набор стандартных калибровочных белков с известными изоэлектрическими точками в диапазоне рН 3-9; 4-6,5; 5-8.

5.2.15 Натрия тиосульфат кристаллический по ГОСТ 244.

6 Отбор проб

Отбор проб проводят по ГОСТ 7631.

7 Подготовка к проведению анализа. Приготовление растворов

7.1 Растворы для обработки гелей при окрашивании кумасси голубым

7.1.1 Фиксирующий раствор: в колбу вместимостью 500 см помещают 100 г трихлоруксусной кислоты и доводят объем дистиллированной водой до метки. Раствор используют 3-4 раза.

7.1.2 Промывной раствор (обесцвечивающий): в колбу вместимостью 1000 см вносят 300 см 96%-ного этилового спирта, добавляют 600 см дистиллированной воды и 100 см ледяной уксусной кислоты. Раствор используют 3-4 раза.

7.1.3 Окрашивающие растворы состоят из основного и рабочего.

7.1.3.1 Основной раствор: в стеклянную плоскодонную колбу вместимостью 300 см помещают (0,400±0,001) г кумасси бриллиантового голубого, добавляют 80 см дистиллированной воды и перемешивают в течение 10 мин. Затем добавляют 120 см 96%-ного этилового спирта и перемешивают в течение 5 мин.

7.1.3.2 Рабочий раствор: смешивают 10 см раствора по 7.1.3.1 с 90 см раствора по 7.1.2, добавляют (0,170±0,001) г сернокислой 5-водной меди. Сульфат меди добавляют, чтобы уменьшить окрашивание фона. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.

7.1.4 Консервирующий раствор: в колбу вместимостью 1000 см вносят 40 см глицерина, добавляют 920 см дистиллированной воды и 40 см уксусной ледяной кислоты.

7.1.5 Промывной раствор готовят в количестве не менее 400 см, фиксирующий, окрашивающий и консервирующий растворы - не менее 80 см.

7.2 Растворы для обработки гелей при окрашивании серебром

7.2.1 Фиксирующий раствор: в колбу вместимостью 500 см помещают (100,00±0,01) г трихлоруксусной кислоты и доводят объем дистиллированной водой до метки. Раствор используют 3-4 раза.

7.2.2 Промывной раствор: в колбу вместимостью 1000 см вносят 100 см 96%-ного этилового спирта, добавляют 850 см дистиллированной воды и 50 см ледяной уксусной кислоты.

7.2.3 Раствор, усиливающий окраску (сенсибилизатор): в колбе вместимостью 100 см смешивают 30 см 25%-ного глутарового альдегида и 60 см дистиллированной воды.

7.2.4 Окрашивающий раствор: в колбу вместимостью 100 см вносят (0,150±0,001) г азотнокислого серебра и доводят объем дистиллированной водой до метки.

7.2.5 Раствор, развивающий окраску (проявитель): в колбу вместимостью 1000 см вносят 200 см 12,5%-ного раствора углекислого натрия, 800 см дистиллированной воды и 400 мкл 37%-ного формальдегида.

7.2.6 Раствор, останавливающий окраску: в колбу вместимостью 100 см вносят (1,60±0,01) г тиосульфата натрия и (3,70±0,01) г и доводят объем дистиллированной водой до метки.

7.2.7 Консервирующий раствор: в колбу вместимостью 100 см вносят 10 см глицерина и доводят объем дистиллированной водой до метки.

7.2.8 Промывной раствор готовят в количестве не менее 400 см. Фиксирующий, окрашивающий, проявляющий растворы и растворы, усиливающий окраску и останавливающий окраску, готовят в количестве не менее 80 см. Количество дистиллированной воды - не менее 400 см.

8 Проведение анализа

8.1 Приготовление проб для анализа

8.1.1 Мышечную ткань исследуемого образца и референс-образца освобождают от крови, темных мышц. Навеску массой (5,0±0,1) г светлой мышечной ткани рыбы-сырца, филе или сырого фарша измельчают в течение 30 с в ступке с 5 см дистиллированной воды.

8.1.2 Смесь, полученную по 8.1.1, переносят в центрифужные пробирки вместимостью 50 см и центрифугируют при температуре 4°С в рефрижераторной центрифуге при частоте вращения 4000 мин в течение 15 мин.

8.1.3 Надосадочную жидкость, полученную по 8.1.2, переносят в центрифужные пробирки вместимостью 10 см и центрифугируют при температуре 4°С в рефрижераторной центрифуге при частоте вращения 12000 мин в течение 15 мин.

8.1.4 Надосадочную жидкость, полученную по 8.1.3, фильтруют через бумажный фильтр в колбу. Полученный прозрачный раствор используют для проведения ИЭФ.

8.2 Приготовление раствора стандартных образцов

Готовят раствор стандартных калибровочных белков в дистиллированной воде в зависимости от диапазона рН, выбранного для анализа: в 30-40 мкл дистиллированной воды для окрашивания кумасси и в 2 см* дистиллированной воды для окрашивания серебром.

___________________

* Текст документа соответствует оригиналу. - .

8.3 Проведение изоэлектрофокусирования на приборе

8.3.1 Включают систему.

8.3.2 Помещают полиакриламидный гель в систему в соответствии с инструкцией, прилагаемой к ней.

8.3.3 Формируют лунки в парафиновой пленке с помощью штампа: штамп с лунками, обращенными вверх, кладут на стол; накрывают парафиновой пленкой защитным покрытием вверх (по направлению линий отверстий); в парафиновой пленке, двигаясь вдоль линии лунок, делают углубления при помощи стеклянной палочки, а затем снимают защитный слой.

8.3.4 Растворы, полученные по 8.1.4 из анализируемого образца и референс-образца, а также раствор стандартного набора калибровочных белков с известной изоэлектрической точкой, выбранный в зависимости от заложенного в программе диапазона рН, вносят микродозатором в лунку в количестве 1,5 мкл.

8.3.5 Аппликатор опускают на поверхность растворов исследуемого образца, референс-образца и стандартного набора калибровочных белков, помещенных в лунки, сформированные в парафиновой пленке с помощью штампа по 8.3.3, нарушая поверхность капель для заполнения капилляров.

8.3.6 Аппликатор, наполненный образцами по 8.3.5, помещают в систему со стороны катода и проводят ИЭФ в автоматическом режиме на полиакриламидных гелях по программам в соответствии с таблицами 1 и (или) 2.

Выбор программы зависит от цели анализа: для выбора оптимального диапазона рН при измерении иэоэлектрических точек используют широкий диапазон рН 3,0-9,0, для характеристики и анализа белков с небольшими различиями в изоэлектрической точке используют более узкие диапазоны: рН 5,0-9,0 и рН 4,0-6,5.

Программы проведения изоэлектрофокусирования в широком и узких диапазонах рН состоят из трех этапов:

- префокусирование (происходит формирование градиента рН);

- этап нанесения исследуемых образцов (белки вносятся в гель);

- этап разделения (белки мигрируют к своим изоэлектрическим точкам).

Таблица 1 - Программа проведения анализа ИЭФ в полиакриламидном геле в широком диапазоне рН 3,0-9,0

Таблица 2 - Программа проведения анализа ИЭФ в полиакриламидном геле в узких диапазонах рН: 5,0-8,0 или 4,0-6,5

Этап фокусирования продолжается от 8 до 10 мин. Общее время ИЭФ составляет около 30 мин.

После окончания ИЭФ полиакриламидный гель помещают в камеру для окрашивания.

8.4 Проведение окрашивания

Полиакриламидные гели окрашивают в автоматическом режиме с применением красителя кумасси бриллиантового голубого в соответствии с таблицей 3 для образцов с высоким (от 20 до 50 нг/мкл) содержанием белка или с применением азотнокислого серебра в соответствии с таблицей 4 для образцов с низким содержанием белка (от 1 до 5 нг/мкл).

Таблица 3 - Программа окрашивания полиакриламидных гелей с помощью раствора кумасси бриллиантового голубого

Таблица 4 - Программа окрашивания полиакриламидных гелей с помощью раствора азотнокислого серебра

Растворы используют только один раз (за исключением фиксирующего раствора), не применяя циркуляцию. Приготовленные растворы, за исключением проявителя, стабильны 2-3 сут при температуре от 20°С до 25°С.

Окрашивание и обесцвечивание занимают от 30 до 35 мин. После консервирования полиакриламидные гели вынимают из системы и высушивают при температуре от 20°С до 25°С в течение 4 ч.

9 Обработка результатов анализа

9.1 Полученную картину распределения белковых полос анализируемой пробы сравнивают с картиной распределения белковых полос референс-образца.

9.2 Строят графическую зависимость значений изоэлектрических точек стандартных белков от расстояния каждой белковой полосы до катода (см. приложение А.2).

9.3 Измеряют расстояние от катода до локализации белковых полос исследуемого образца и референс-образца и с помощью калибровочного графика, построенного по 9.2, находят соответствующие значения изоэлектрических точек белков.

Графическое построение и определение изоэлектрических точек может осуществляться с помощью компьютерной программы после переноса изображения распределения белковых полос с полиакриламидного геля на монитор компьютера с использованием систем видеодокументирования.

9.4 Совпадение картин распределения белковых полос и совпадение значений изоэлектрических точек маркерных белков анализируемого и референс-образцов свидетельствует об их идентичности и подтверждает правильность наименования анализируемого образца. Пример результата анализа и его компьютерной обработки для разных видов исследуемых объектов приведен в приложении А.

9.5 Для подтверждения результатов идентификации проводят параллельное разделение белковых полос как из одной пробы, так и из разных проб, полученных из двух-трех образцов анализируемого объекта.

9.6 Результаты анализа оформляют в виде протокола. Образцы протоколов приведены в приложении Б.

10 Требования безопасности

10.1 При выполнении всех работ необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007.

10.2 Помещение, в котором проводятся работы, должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005.

10.3 При работе с электроустановками электробезопасность должна соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.019. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и быть оснащено средствами пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

Приложение А
(справочное)

Результаты проведения анализа и компьютерной обработки полученных данных

А.1 Пример фотографии распределения белковых полос на экране монитора компьютера приведен на рисунке А.1.

Примечание - На фотографии представлены следующие линии:

1 и 2 - анализируемый образец филе форели N 1;

3 и 4 - анализируемый образец филе форели N 2;

5 - референс-образец форели;

6 - стандартный набор белков.

Рисунок А.1

А.2 График, полученный в результате разделения стандартных образцов, обработанный с помощью компьютерной программы, приведен на рисунке А.2.

Рисунок А.2

A.3 Пример компьютерной обработки данных, полученных в результате анализа, приведен в таблице А.1.

Таблица А.1

А.4 Обобщение результатов анализа для определения вида анализируемого объекта по рисункам А.1, А.2 и таблице А.1.

А.4.1 В результате изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле выделенных белков светлой мышечной ткани двух исследованных образцов от разных производителей, имеющих одно торговое наименование, и референс-образца получены отличающиеся друг от друга картины распределения белковых полос.

А.4.2 У анализируемого образца N 1 локализация маркерных белков не совпадает с основными белковыми полосами референс-образца. Таким образом, можно сделать вывод, что образец N 1 не соответствует своему наименованию.

А.4.3 У анализируемого образца N 2 картина распределения маркерных белков и изоэлектрических точек полностью совпадают с локализацией основных белков референс-образца и их значениями . Наименование этого образца соответствует наименованию на этикетке.

Приложение Б
(рекомендуемое)

Форма протокола испытаний

Наименование организации (испытательной лаборатории)

ПРОТОКОЛ ИСПЫТАНИЙ

Электронный текст документа

и сверен по:

, 2019