allgosts.ru11. ЗДРАВООХРАНЕНИЕ11.120. Фармацевтика

ГОСТ Р 57130-2016 Лекарственные средства для медицинского применения. Исследование генотоксичности и интерпретация полученных данных

Обозначение:
ГОСТ Р 57130-2016
Наименование:
Лекарственные средства для медицинского применения. Исследование генотоксичности и интерпретация полученных данных
Статус:
Действует
Дата введения:
05/01/2017
Дата отмены:
-
Заменен на:
-
Код ОКС:
11.120.01, 11.020

Текст ГОСТ Р 57130-2016 Лекарственные средства для медицинского применения. Исследование генотоксичности и интерпретация полученных данных



ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО

ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

Исследование генотоксичности и интерпретация полученных данных

(ЮН S2:2011, Guidance on genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals intended for human use, IDT)

НАЦИОНАЛЬНЫЙ

СТАНДАРТ

РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

ГОСТР

57130-

2016

Издание официальное

Москва

Стенда ртмнформ 2016

ГОСТ Р 57130—2016

Предисловие

1    ПОДГОТОВЛЕН Государственным бюджетным образовательным учреждением высшего про» фессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Первый МГМУ имени И.М. Сеченова) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 4

2    ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 458 «Разработка, производство и кон* троль качества лекарственных средств»

3    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 10 октября 2016 г. № 1345-ст

4    Настоящий стандарт идентичен международному документу ЮН S2:2011 «Руководство по изучению генотоксичности и интерпретации полученных данных для лекарственных препаратов для медицинского применения» («Guidance on genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals intended for human use». ЮТ) Международной конференции no гармонизации технических требований для регистрации лекарственных средств для медицинского применения (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use; ICH).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования международного документа в связи с особенностями построения межгосударственной системы стандартизации

5    8ВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Правила применения настоящего стандарта установлены в статье 26 Федерального закона от 29 июня 2015 г. No 162-ФЗ «О стандартизации в Российской Федерации». Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе «Национальные стандарты», аофициальныйтекст изменений и поправок — е ежемесячном информационномуказателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте национального органа Российской Федерации по стандартизации в сети Интернет ()

© Стандартинформ.2016

Настоящий стандарт не может быть воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

и

ГОСТ Р 57130—2016

Содержание

1    Область применения...................................................1

1.1    Общие принципы..................................................1

2 Набор стандартных тестов для оценки генотоксичности............................1

2.1    Общие подходы...................................................1

2.2    Описание двух вариантов стандартного набора тестов..........................3

2.3    Изменения стандартного набора тестов....................................4

2.4    Определение мутагенов зародышевых клеток................................5

3 Рекомендации в отношении тестов in vitro.....................................5

3.1    Повторение тестов и интерпретация их результатов............................5

3.2    Рекомендованный протокол выявления бактериальных мутаций....................5

3.3    Рекомендованные протоколы для проведения испытаний на клетках млекопитающих......6

4    Рекомендации по проведению испытаний in vivo.................................8

4.1    Тесты, проводимые с целью определения хромосомных повреждений in vivo............б

4.2    Другие испытания генотоксичности in vivo...................................9

4.3    Выбор доз в рамках анализа in vivo......................................10

4.4    Демонстрация концентраций в целевых тканях при отрицательных результатах анализов

in vivo.........................................................11

4.5    Пробоотбор/время проведения анализов in vivo..............................12

4.6    Количество анализируемых животных....................................12

4.7    Использование самцов/самок грызунов в исследованиях генотоксичности in vivo.........12

4.8    Путь введения...................................................12

4.9    Использование положительного контроля в исследованиях in vivo..................12

5 Рекомендации по оценке результатов испытаний и стратегий контрольных испытаний........13

5.1    Оценка биологической актуальности.....................................13

5.2    Оценка результатов, полученных в испытаниях in vitro..........................13

5.3    Оценка результатов, полученных в испытаниях in vivo..........................14

5.4    Стратегии последующей разработки при получении положительных результатов........15

5.5    Последующий анализ генотоксичности применительно к результатам опухолевого роста

в биологическом анализе канцерогенности................................16

6    Термины..........................................................16

Библиография........................................................19

in

ГОСТ Р 57130—2016

Введение

Данный стандарт направлен на оптимизацию набора стандартных испытаний генотоксичности. обеспечивающих прогноз потенциального риска для человека, и описание общепринятых подходов к интерпретации результатов с конечной целью совершенствования оценки риска канцерогенных эффектов. связанных с изменением генетического материала. Стандарт содержит описание согласованных на международном уровне стандартных испытаний и подходов к интерпретации положительных результатов in vitro и in vivo. полученных при проведении стандартного набора тестов на генотоксичность. включая оценку нерелевантных результатов.

В стандарте учтены актуальные рекомендации последнего руководства Организации экономического сотрудничества и развития (ОЕСО) и отчеты Международных семинаров по испытаниям генотоксичности (IWGT). Отличия от рекомендаций OECD или IWGT. при их наличии, указанные в тексте стандарта. Стандарт применяется совместно с другими ГОСТ ло лекарственным средствам для медицинского применения и (или) руководствами ICH.

Настоящий стандарт идентичен Руководству ICH S2 ло изучению генотоксичности и интерпретации полученных данных для лекарственных препаратов для медицинского применения (ICH S2 Guidance on genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals intended for human use) Международной конференции no гармонизации технических требований для регистрации лекарственных средств для медицинского применения (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use: ICH).

IV

ГОСТ Р 57130—2016

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ Исследование гекотоксичности и интерпретация полученных данных

Medicines for medical application. Cenotoxiclty testing and data interpretation

Дата введения — 2017—05—01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется только на лекарственные средства для медицинского при* менения химического происхождения, то есть малых молекул, и не распространяется на биологические препараты. Рекомендации относительно времени проведения исследований в рамках клинической разработки представлены в ГОСТ Р 56701—2015.

1.1    Общие принципы

К испытаниям генотоксичности относятся тесты, проводимые in vitro и in vivo в целях выявления компонентов, индуцирующих генетическое повреждение вследствие различных механизмов. Данные испытания лозволяютопределить риске отношении повреждения ДНКификсации. Фиксация повреждения ДНК в форме генных мутаций, более обширные хромосомные повреждения или рекомбинация, в целом необходимая для наследуемых эффектов и в рамках многоэтапного процесса развития злокачественного новообразования — сложного процесса, в рамках которого генетические изменения, возможно, играют роль лишь частично.

Числовые хромосомные изменения также были обусловлены туморогенезом и могут указывать на возможную акеуплоидию в зародышевых клетках.

Вещества, дающие положительный результат в испытаниях по определению подобных нарушений могут иметь канцерогенный и/ипи мутагенный потенциал для человека. Поскольку связь между концентрацией определенных препаратов и канцерогенезом установлена для человека, в то время как подобную связь трудно доказать для наследственных болезней, испытания генотоксичности применялись. главным образом, для установления канцерогенности. Несмотря на это, поскольку мутации зародышевой линии имеют четкую связь с заболеванием у человека, подозрение на то. что лекарственное вещество может провоцировать наследственные эффекты, считается не менее серьезным, чем подозрение на канцерогенные эффекты вещества. Кроме того, результаты исследований генотоксичности имеют большое значение для интерпретации исследований канцерогенности.

2    Набор стандартных тестов для оценки генотоксичности

2.1    Общие подходы

Регистрация лекарственных средств требует полноценной оценки генотоксического потенциала. Обширный анализ показал, что многие вещества, показавшие свойства мутагенности при проведении теста Эймса на обратную мутацию бактерий, являются канцерогенами для грызунов. Кроме того, испытания на тканях млекопитающих in vrtro повышаютчувствительность к детекции канцерогенову грызунов и расширяют спектр выявляемых генетических нарушений, при этом снижая специфичность определения. т. в. повышают частоту положительных результатов, что не коррелирует с данными о канцероген-

Иэдднив официальное

1

ГОСТ Р 57130—2016

ности у грызунов. Кроме того, использование батарей тестов целесообразно, поскольку ни один тест отдельно не способен выявить все генотоксические механизмы развития туморогенеза.

Общие характеристики стандартной батареи тестов:

i.    Оценка мутагенности в виде теста обратной мутации бактерий. Данный тест позволяет выявить соответствующие генетические изменения и большинство канцерогенов человека и грызунов с генотоксическим потенциалом.

ii.    Генотоксичностыаюкеследует оцениватье клетках млекопитающих in ийгои/или in последующим образом.

Несколько систем анализа клеток млекопитающих in vitro широко используются и могут считаться в достаточной степени еалидированными. Анализ хромосомных аберраций в метафазе in vitro, микроя-дерные пробы in vitro (примечание 1) и анализ генных мутаций клеток лимфомы мышей L5178Y 77с (тими-динкиназы) (MLA). Данные три анализа в настоящее время считают в одинаковой степени актуальными, а следовательно, и взаимозаменяемыми при анализе повреждения хромосом при использовании в сочетании с другими испытаниями генотоксичности в рамках стандартной батареи тестов лекарственных средств, в случае если используются протоколы испытаний, представленных в настоящем стандарте.

Примечание 1

Микроядерная проба in vitro широко изучапась в рамках международных совместных исследований (Kirsch-Voldersetal.. 2003). is validated byECVAM (Corvl etal.. 2008). и описана в руководстве OEC 487 (2010).

Испытания in vivo включены в батарею тестов, поскольку некоторые вещества показывают мутагенность in vivo, но не in vitro (примечание 2). а также потому, что желательно включить анализы, учитывающие такие факторы, как всасывание, распределение, метаболизм и выведение. Поданной причине также проведен выбор анализа микрочастиц в эритроцитах (в крови и костном мозге) или хромосомных аберраций в клетках костного мозга в метафаэе (примечание 3). Лимфоциты, культивируемыеотживот* ных. получавших лечение, также могут использоваться для цитогенетического анализа, несмотря на ограниченный опыт проведения подобного анализа.

Примечание 2

Имеется небольшое, но значительное количество генотоксических канцерогенов, которые возможно надежно выявить в анализах хромосомных поломок, но которые показали отрицательиые/слабоположитель-ные/сомнительныв результаты в анализах in vitro е стандартной батарее. Канцерогены, такие как прокарбазин. гидрохинон, уретан и бензин, попадают е эту категорию. Некоторые другие примеры, полученные по результатам исследования, проведенного компаниями, описаны Tweats etal.. 2007. It.

ПримечаниеЗ

В принципе, микроядра в гемопоатических клетках можно исследовать на костном мозге любого биологического вида и в крови тех животных, которые не отфильтровывают циркулируюшие микроядерные эритроциты в селезенке. У лабораторных мышей микроядра измеряют в полихроматических эритроцитах крови, а при терапии мышей продолжительностью 4 недели и более могут использоваться зрелые (нормохроматические) эритроциты. Несмотря на то. что в организме крыс микроядерные эритроциты быстро покидают кровоток, было установлено, что в ретикулоцитах крови крыс обнаруживается микроядерная индукция, обусловленная иелым рядом кластогенов (Wakataetal.. 1998: Hamada etal.. 2001). Кровь крыс может использоватьсядлямикро-яде рного анализа, учитывая методы, используемые для обеспечение анализе вновь сформированныхретикуло-иитов (Hayashl etal.. 2007; MacGregor era).. 2006). при достаточно большом размере выборки для обеспечения статистической чувствительности при более низком уровне микроядер в крови крыс, по сравнению с костным мозгом (Kisshng etal.. 2007). Независимо от выбранного метода, анализа в костном мозге или в крови, автоматизированного или ручного анализа, каждая лаборатория должна устанавливать соответствующий размер выборки для обеспечения уровня ошибки ниже уровня вариативности между животными.

В настоящее время имеется определенны!) опыт микроядерной индукции в организме собак и макак-резус (Harper el at.. 2007; Hotchkiss etal., 2008). Одним из примеров полезности данного альтернативного вида может быть оценка метаболита человека, е недостаточной степени представленного у грызунов, но сформированного у собак и макак.

Испытания in vitro* in иуодля оценки хромосомных аберраций кпетокв метафазе выявляют широкий спектр нарушений хромосомной целостности. Поломка хроматид или хромосом может привести к формированию микроядер в случае образования ацентрического фрагмента, поэтому анализы, позволяющие определить хромосомные аберрации или микроядра. подходят для выявления кластогенов. Микроядра могут образоваться вследствие задержки одной или нескольких цельных хромосом в анафазе, поэтому микроядерные пробы потенциально позволяют определить некоторые индукторы анеуплои-дии. MLA позволяет выявить мутации гена Тк. обусловленные генными мутациями и хромосомными

2

ГОСТ Р 57130—2016

повреждениями. Имеются сведения о том. что при помощи MLA также возможно выявить утрату хромосом.

Существуют некоторые дополнительные анализы in vivo, которые можно использовать в рамках батареи тестов или в качестве дополнительных тестов для получения необходимого объема доказательств при оценке результатов анализов in vitro* in v/vo(cm. ниже). Отрицательных результатов соответствующих анализов in vivo (обычно двух) с достаточным обоснованием конечных точек и демонстрацией концентраций (см. раздел 4.4) обычно оказывается достаточно для подтверждения отсутствия существенного риска генотоксичности.

2.2 Описание двух вариантов стандартного набора тестов

Следующие два варианта стандартной батареи тестов считаются в равной степени приемлемыми (примечание4):

вариант 1

i. Испытание генных мутаций в бактериях.

н. Цитогенетический тест хромосомных повреждений (анализ хромосомных аберраций в метафазе in vitro или микроядерная проба in vitro) либо анализ генных мутаций Тк в лимфоме мышей in vitro.

iii. Тест генотоксичности in vivo, обычно тест на хромосомные поломки на гемопоэтических клетках мышей в виде либо микроядерной пробы, либо анализа на хромосомные аберрации в метафазе.

вариант 2

i.    Испытание генных мутаций в бактериях.

ii.    Оценка генотоксичности in vivo двух разных тканей, обычно микроядерная проба с использованием гемопоэтических клеток грызунов и второй анализ in vivo. Как правило, используется анализ поломки нитей ДНК в печени, если не указано иного (см. ниже, раздел 2 и примечание 12).

Примечание 4

Несмотря на возможность использования обоих вариантов батареи тестов, конкретные данные об индивидуальном испытуемом веществе моаут свидетельствовать о предпочтительности одного из вариантов. Например, если системные концентрации в моделях животных равны либо менее ожидаемой клинической концентрации. могут использоваться анализы т vitro, вариант 1 (см. также разделы 2.3.4 и 4 4.1). С другой стороны. вариант 2. включая испытания а печени, рекомендован в случаях, когда предполагается, что в печени генерируются короткоживущие реактивные метаболиты.

Исторически опыт выбора варианта 1 шире, отчасти потому, что он основан на версии S2A и В. Однако аргументами в пользу взаимозаменяемости вариантов 1 и 2 включают: при получении положительного результата анализа на клетках млекопитающих in vitro, четкие отрицательные результаты двух проведенных анализов in vivo в соответствующих тканях при подтвержденной достаточной концентрации считаются достаточными для подтверждения отсутствия генотоксического потенциала in vivo (см. пункт 5.4.1.1). Таким образом, стратегия проведения анализа, при которой проводятся два анализа in vivo, аналогична стратегии контроля положительного результата in vitro (примечание 4).

При проведении испытаний в разных вариантах может использоваться дизайн исследований in vivo острой или хронической токсичности. При многократном введении предпринимались попытки включить конечные точки генотоксичности в исследования токсичности, с учетом научной обоснованности. При оценке in vivo нескольких конечных точек предпочтительнее включать их в одно исследование. Зачастую имеется достаточно информации о вероятной пригодности доз в рамках исследования длительной токсичности до начала исследования, позволяющих определить целесообразность проведения острого теста или комплексного испытания.

8 случае получения отрицательных результатов использование одного из вариантов стандартной батареи тестов, проводимых и оцениваемых в соответствии с текущими рекомендациями, обеспечит достаточные доказательства отсутствия генотоксической активности и в этом случае дополнительных тестов не требуется. В случае получения положительных результатов стандартной батареи тестов в зависимости от их терапевтической пользы, вещество подлежит более тщательному исследованию (см. раздел 5).

Несколько анализов in vivo могут быть использованы во второй части оценки in vivo в рамках варианта 2 (см. раздел 4.2), некоторые из которых могут быть интегрированы в исследования токсичности многократных доз. Предпочтительной тканью является печень, благодаря характеристикам достигаемых концентраций и метаболизма, но выбор ткани для анализов in vivo и видов анализов должен быть основан на понимании потенциального механизма метаболизма in vivo или тканей, подверженных воздействию.

Информацию о числовых изменениях можно получить в результате анализов на клетках млекопитающих in vitro и микроядерных проб in vitro или in vivo. Элементы стандартных протоколов, способные

з

ГОСТ Р 57130—2016

указывать на подобный потенциал, включают повышение митотического индекса, индукцию полиплои* дии и микроядерную оценку. Также имеются экспериментальные доказательства того, что в результате MLA могут быть выявлены веретенные яды. Предпочтительным цитогенетическим тестом in vivo в соответствии свариантом 2 является микроядерныйанализ. а не тест на хромосомныеаберрации. поскольку он имеет больше возможностей для выявления утраты хромосом (потенциал анеуплоидии).

Предполагаемый стандартный набор тестов не подразумевает, что другие тесты генотоксичности являются несостоятельными или нецелесообразными. Для дальнейшего исследования результатов анализа генотоксичности. полученных в результате применения стандартной батареи тестов, могут потребоваться дополнительные анализы (см. разделы4.2 и 5). Также при условии достаточной валидации могут использоваться другие виды животных, включая не относящихся к грызунам.

При условиях, при которых один или несколько тестов в стандартной батарее не могут быть использованы по техническим причинам, альтернативные валидированные тесты могут обеспечить адекватную замену при условии достаточного научного обоснования.

2.3 Изменения стандартного набора тестов

В следующих разделах представлены ситуации, в которых может потребоваться модификация стандартного набора тестов.

2.3.1    Поисковые клинические исследования

В некоторых поисковых клинических исследованиях может использоваться меньше анализов генотоксичности либо различных критериев обоснования максимальной дозы in vivo.

2.3.2    Испытуемые препараты с бактериотоксическим действием

В случае, если вещество имеет бактернотоксические свойства (например, некоторые антибиотики). тем не менее, следует провести тест Эймса на обратную мутацию бактерий, кроме того, должно проводиться испытание цитотоксических веществ в клетках млекопитающих, поскольку мутагенность может возникать при более низких и менее токсичных концентрациях. В подобных случаях также следует провести один из анализов в клетках млекопитающих in vitro, т. е. следует проводить анализы по 1-му варианту.

2.3.3    Вещества, по своей структуре имеющие генотоксический потенциал

Вещества с подозрительной структурой (примечание 5) обычно выявляются в рамках стандартного набора тестов, поскольку большинство структурно подозрительных веществ определяют в контексте бактериальной мутагенности. Известно несколько химических классов веществ, которые лучше поддаются определению в рамках анализа повреждения хромосом в клетках млекопитающих, по сравнению с анализами бактериальной мутации. Таким образом, отрицательные результаты проведения стандартного набора тестов для вещества сподоэрительной структурой обычно учитывают достаточное доказательство отсутствия генотоксичности. Однако для веществ с подозрительной структурой может быть целесообразна модификация стандартных протоколов (примечание 5). Выбор дополнительных тестов или модификации протокола зависит от химического состава, химической активности и данных о метаболизме вещества слодозрительной структурой.

Примечвниеб

Установлено, что некоторые структурно настораживающие химические соединения имеют причинную связь с канцерогенным и/или мутагенным потенциалом химических препаратов. Примеры веществ с опасной структурой включают алкилирующие злектрофильные центры, нестабильные эпоксиды, ароматические амины. азо-структуры. N-нитрозогруплы и ароматические нитрогруппы (Ashby and Paton. 1994). Для некоторых классов веществсо специфическими рисками установлено, что специфическая модификация протокопа/допол-нительные испытания необходимы для оптимального выявления генотоксичности (например. молекулы, содержащие азогруппу, гликозиды. такие компоненты как нитроимидазолы, которым для активации необходима нитроредукиия. такие вещества как фенацетин, требующие для метаболической активации другого вида грызунов S9).

2.3.4    Ограничения по применению тестов In vivo

Существует множество веществ, в отношение которых тесты in vivo (обычно в костном мозге, крови или печени) не дают полезной дополнительной информации. К ним относятся вещества, в отношении которых данные о токсикокинетике и фармакокинетике указывают на отсутствие их системной абсорбции. а следовательно, они не попадают в целевые ткани. Примерами таких веществ являются рентгеноконтрастные вещества, антациды на основе алюминия, некоторые ингаляционные препараты, а также лекарственные средства кожного или иного топикального применения. В случаях, когда модификация пути введения необеспечивает достижения достаточной концентрации в целевых тканях, и если нет воз-

4

ГОСТ Р 57130—2016

можности провести подходящий анализ генотоксичности в наиболее подверженной воздействию ткани, может быть целесообразным е оценке опираться только на исследования in отГ/о. В некоторых случаях целесообразно проведение оценки генотоксических эффектов в участке контакта, при том что подобные исследования до сих пор не получили широкого распространения (примечание 6).

Примечание 6

Имеется определенный опыт анализов in vivo микроядарной индукции а коже и толстой кишке (Hayastnet а!.. 2007). и анализы поломки ДНК в этих тканях также моеут быть целесообразным заменителем.

2.4 Определение мутагенов зародышевых клеток

Результаты сравнительных исследований показали, что в количественном отношении большинство мутагенов зародышевых клеток могут быть обнаружены по генотоксичности в испытаниях соматических клеток, так что отрицательные результаты испытаний генотоксичности соматических клеток in vivo в целом указывают на отсутствие эффектов со стороны зародышевых клеток.

3 Рекомендации в отношении тестов in vitro

3.1    Повторение тестов и интерпретация их результатов

Воспроизводимость результатов тестов — важнейший аспект исследований, проводимых с использованием инновационных методов или неожиданных результатов, однако плановый анализ препаратов с использованием стандартных широко применяемых испытаний генотоксичности зачастую не требует повторного проведения. Данные тесты в достаточной степени характеризованы и имеют достаточный внутренний контроль, такчтоповторениетестов с определенно положительным или отрицательным результатом анализа, как правило, не требуется. 8 идеале должна быть возможность указать, что в результате проведения теста были достигнуты определенно отрицательные или определенно положительные результаты. Однако результаты испытаний иногда не удовлетворяют установленным критериям положительного или отрицательного результата и, таким образом, их считают «сомнительными». Применение статистических методов анализа может улучшить интерпретацию данных, при этом достаточная биологическая интерпретация имеет критически важное значение. При повторном проведении теста, в результате которого был достигнут сомнительный результат, может быть достигнут (i) определенно положительный результат, тогда общий результат будет положительным, (ii) отрицательный результат, в этом случае результат будет признан невоспроизводимым, а следовательно, и общий результат испытания будет отрицательным, или (Ш) еще один сомнительный результат, при котором общий результат остается сомнительным.

3.2    Рекомендованный протокол выявления бактериальных мутаций

Рекомендации по протоколу представлены в руководстве OECD (1997) и отчете IWGT (Gatehouse et al.. 1994).

3.2.1    Выбор высоких доз

Максимальные дозы

Максимальная рекомендованная доза составляет 5000 мкг/тарелка (для испытуемых веществ в жидкой форме), без ограничений, обусловленных свойствами растворимости или цитотоксичности.

Предел растворимости

Для бактериальных культур проводят оценку преципитирующих доз при условии, что преципитат не влияет на обработку, токсичность не является лимитирующей, а максимальная концентрация не превышает 5000 мкг/тарелка (или 5 мкп/тарелка — для испытуемых веществ в жидкой форме). В отсутствие наблюдаемой цитотоксичности самую низкую преципитирующую дозу следует использовать в качестве максимальной. Если отмечается цитотоксичность или мутагенность, независимо от растворимости, максимальная доза должна быть установлена с учетом цитотоксичности, как описано ниже.

Предел цитотоксичности

8 тесте Эймса установленные дозы должны показывать признаки значительной токсичности, при этом не превышая максимальной дозы 5000 мкг/тарелка. Токсичность может быть установлена по снижению числа ревертантов и/или очистка, и/или уменьшение бактериального газона.

3.2.2    Дизайн исследования /протокол тестов

Рекомендованный набор бактериальных штаммов (OECD) включает штаммы, позволяющие определить замещение основания и мутации со сдвигом рамки считывания следующим образом:

• Salmonella typhimurium ТА98;

s

ГОСТ Р 57130—2016

•    Salmonella typbimurium ТА100;

•    Salmonella typbimurium TA1535;

•    Salmonella typbimurium TA1537 или TA97. или TA97a;

•    и Salmonella typbimurium TA102 или Escherichia coli WP2 uvrA. или Escherichia со// WP2 uvrA (pKM101).

Одним из отличий от рекомендаций, изложенных е ОЕСО и IWGT, является то. что ло имеющемуся опыту испытаний лекарственных средств, однократного теста Эймса оценки обратных бактериальных мутаций достаточно при определенноотрицательном или положительном результате, а также при уело* вии проведения испытания в полном соответствии с протоколом, включая все штаммы с метаболической активацией и без нее. соответствующий диапазон доз. удовлетворяющий критериям для выбора максимальной дозы и соответствующий положительный и отрицательный контроль. Кроме того, при испытании лекарственных средств как включение тарелки, так и метод предварительной инкубации может быть целесообразен для данного однократного эксперимента (примечание 7). Спорные или слабоположительные результаты могут указывать на целесообразность повторного проведения испытания, возможно в рамках модифицированного протокола, например, с установлением соответствующих интервалов между уровнями доз.

Примечание 7

Некоторые химические вещества проще выявить при помощи высевания в терепки или методом предварительной инкубации несмотря на то. что различия носят обычно количественный, е не качественный характер (Getehouae et at.. 1994). Опыт в фармацевтической области, в рамках которого препараты изучапив рамках обоих протоколов, не привели к получению разных результатов для двух методов, и в отчете IWG Г (Gatehouse в tel.. 1994) примеры химических классов, которые причислены к более просто определяемым в рамках протоколе преинкубации. обычно не относятся к классу лекарственных средств и показывают положительный результат в исследованиях генотоксичности in vivo. К ним относятся короткоцепочечные алифатические нитрозвмины. двухвалентные металлы, альдегиды (например, формальдегид, кротонапьдегид). азокрасители (например, желтый краситель для масла), пирролизидиновые алкалоиды, аллилные вещества (влпилизотиоци-анam. аллилхлорид) и нитровещества (ароматические, алифатические).

3.3 Рекомендованные протоколы для проведения испытаний на клетках млекопитающих

Рекомендации по протоколам изложены в руководстве OECD (1997) и в публикациях IWGT (например. Kirsch-VoWers et al., 2003: Moore et al.. 2006). Также имеются рекомендации no интерпретации результатов MLA (Moore et al.. 2006). включая применение глобального поправочного коэффициента. Здесь приведены некоторые различия от приведенных здесь рекомендаций при испытании лекарственных средств, в частности, при выборе максимальной концентрации (см. подробности ниже).

3.3.1 Выбор максимальной концентрации

Максимальная концентрация

Максимально рекомендованная концентрация составляет 1 мМ или 0.5 мг/мл, в зависимости от того, что ниже, при отсутствии ограничений, обусловленных растворимостью в растворителе или питательной среде или цитотоксичностью (примечание 8).

Лримечение8

Обоснование максимальной концентрации 1 мМ для анализов в клетках млекопитающих т v/tro включает следующие компоненты. Батарея тестов включает тест Эймса и анализ т vivo. Данная батарея позволяет оптимизировать определение генотоксических канцерогеное, не опираясь на результаты отдельных тестов. Существует низкая вероятность того. чтосоответствующиевещества(канцерогены.повреждающиеДНК). не выявляемые в тесте Эймсе или анализе генотоксичности in vivo, определимы в анализе в клетках млекопитающих т vitro в концентрациях более 1 мМ. Во-вторых, предельный уровень г мМ позволяет поддержать идентификацию элементе риска выше клинического воздействия известных лекарственных средств, включая вещества, концентрирующиеся в тканях (Goodman & Gilman. 2001). что также выше уровней, обычно достигаемых в доклинических исследованиях tn vivo. Подтверждено, что в случае некоторых препаратов длядостижения терапевтического эффекта требуются достаточно высокие клинические концентрации. Хотя спонсорам может быть интересно сравнение активности с зарегистрированными препаратами, возможно, даже свыше 1 мМ. для определения безопасности для человека наибольшую актуальность имеют анализы т vivo. Для лекарственных средств с нестандартно низкой молекулярной массой (например, менее 200) следует рассмотреть возможность достижения более высоких концентраций исследуемого препарата.

Предел растворимости

В случае ограничивающих характеристик растворимости максимальной концентрацией, при условии ограничения со стороны цитотоксичности, должна быть наиболее низкая концентрация, при которой в культурах присутствует минимальный осадок, при условии отсутствия побочного влияния на расшиф

6

ГОСТ Р 57130—2016

ровку. Оценка преципитации может осуществляться на глав или при помощи инструментальных методов. таких как световая микроскопия, отслеживая осадок, который сохраняется либо появляется в процессе культивирования (к концу терапии).

Цитотоксичность

При проведении цитогенетических анализов in vitro хромосомных аберраций в метафазе либо мик-роядерных проб цитотоксичность может приводить к снижению роста клеток не более чем на 50 % (примечания 9 и 10). Для MLA максимальной дозой должна быть доза, вызывающая 80—90 %-ную цитотоксичность, измеряемая по RTG е пределах 20—10 % (примечание 9).

Примечание 9

Несмотря на то. что некоторые генотоксичные канцерогены не определимы в рамках анализов ееиоток-сочности in vitro, хроме случаев, когда исследуемые концентрации индуцируют определенную степень цитотоксичности. препараты, повреждающие ДНК. обычно определяют лишь при среднем уровне токсичности (Greenwood at а!.. 2004). По мере роста цитотоксичности другие механизмы, помимо прямого повреждения ДНК веществом или его метаболитами, могут привести к получению «положительных» результатов, обусловленных цитотоксичностью, а не генотоксичностью. Подобная косвенная индукция повреждения ДНК вследствие повреждения не ДНК-структур. вероятнее всеео. может возникнуть при концентрации. превышающей определенный лоров. Нарушения клеточных процессов не предполагаются при более низких фармакологически актуальных концентрациях.

В цитогенетических анализах даже слабые клестогены с канцерогенными свойствами дают положительный результат, не достигая 50 %-ного снижения числа клеток. С другой стороны, вещества, не обладающие повреждающим ДНК аффектом, мутагенным либо канцерогенным потенциалом, могут вызывать поломку хромосом в токсических концентрациях. Для цитогенетических анализов т vitro, анализа хромосомных аберраций и микроядерной пробы in vitro целесообразным является предельное снижение роста на 50 %.

Для цитогенетических анализоввклеточных линиях изменение популяции клетокс течением времени (за счет измерения изменения числа клеток во время культивирования относительно контроля, например, методом удвоения популяции (PD. примечание 10). является полезным параметром оценки цитотоксичности, поскольку известно, что подсчет числе клеток может привести к недооценке токсичности. Для культур лимфоцитов подавление пролиферации, не превышающее около 50 %. считается достаточным, что может быть определено по митотическому индексу (МИ) для анализа аберраций в метафазе и по индексу, основанному на блокировкецитокинеза длямикроядерныхтестов\пчПго. Кроме того. для микроядерного теста in vitro, поскольку микроядра оценивают в интерфазе после митотического деления, необходимо подтвердить прохождение клетками клеточного цикла. Этого можно достичь за счет использования цитохалазина В для обеспечения ядерного деления, а не клеточного деления, так что микроядра можно оценить в двухъядерных клетках (предпочтительный методе случае анализа в лимфоцитах). Для клеточных линий могут применяться другие методы. показывающие пролиферацию клеток, включая рост популяции с течением времени (PD). как описано выше (Kirsch-Votdersetat.. 2003).

Для MLA достаточной чувствительности можно достичь за счет ограничения максимальной концентрации. близкой к 20% относительного общего роста (RTG) (10—20 %) для методов с использованием как мягкого агара, так и микролунок (Moore eta!.. 2002). Анализ опубликованных данных с использованием текущих критериев определил малое количество веществ с положительным результатом MLA только в концентрациях менее 20 % RTG. представляющих собой канцерогены для крыс, при зтом отсутствуют убедительные свидетельства генотоксического канцерогенеза для данной категории. По общему мнению, необходимо с осторожностью подходить к интерпретации результатов при увеличении мутации ниже 20 % RTG. и результат не считался бы положительным при увеличении мутантной фракции лри И0% RTG.

Таким образом, следует с осторожностью подходить к интерпретации результатов в виде снижения роста/выживаемости или превышающих 50 % для цитогенетического анализа либо 80 % — для MLA. Установлено. что оивнка клеток, обрабатываемых лри данном уровне цитотоксичности/клональной выживаемости, может привести к повышению чувствительности, но и кболее высокому риску нерелевантных положительных результатов, батарейный подход к анализу генотоксичности должен обеспечить необходимую чувствительность. не опираясь на индивидуальные анализывклетках грызунов in vitro лри высокой цитотоксичности.

Для достижения соответствующегодиапазона токсичности необходимо проведение предварительного исследования лолодбору диапазона дозе широкомдиапазоне концентраций, но при проведении анализа аеноток-сичностизачастую важно использовать различные концентрации сдостаточно близкими интервалами (менее чем двукратная степень разведения). Дополнительные концентрации возможно исследоветь. ноне все концентрации следует оценивать на предмет генотоксичности. Не предлолагаетсялроведения множественных экспериментов до достижения четкого 50 %-ного снижения роста либо четкого 80 %-ного снижения #?Г<3.

Примечание 10

Для цитогенетических анализов т vitro целесообразно использовать параметры относительного роста клеток с целью оценки токсичности, поскольку при подсчете клеток токсичность может быть недооценена (Greenwoodetal.. 2004). Приломощи расчетного удвоения популяции (см. Глоссарий) для оценки 50 %-ного уровня

7

ГОСТ Р 57130—2016

снижений росте было установлено. что частоте положительных результатов для веществ без мутагенного или канцерогенного потенциале снижена, в то время «ек вещества, действующие заснет прямого взаимодействия с ДНК. обеспечивают надежные положительные результаты.

3.3.2    Дизайн исследования/Протоколы испытаний

В целях цитогенетической оценки повреждений хромосом в клетках метафаэы in vitro, протокол испытания должен включать проведение испытаний с метаболической активацией и без. с использованием соответствующего положительного и отрицательного контроля. Терапия исследуемыми препаратами должна иметь продолжительность от 3 до 6 часов, а время пробоотбора должно приблизительно в

1.5 раза превышать обычный клеточный цикл от начала терапии. Непрерывная терапия без метаболической активации продолжительностью, приблизительно в 1.5 раза превышающей нормальный клеточный цикл, должна проводиться при получении отрицательных или сомнительных результатов обоих циклов краткосрочной терапиис метаболической активацией и без нее. Аналогичные принципы распространяются на микроядерную пробу in vitro, стем отличием, что время пробоотбора. как правило, составляет 1,5—2 нормальных клеточных цикла от начала терапии, чтобы обеспечить возможность полного прохождения клетками митоза и вхождения в следующую интерфазу. Для обоих цитогенетических анализов in vitro может потребоваться модификация протокола определенным типам химических веществ, которые проще определить при более длительной терапии, отсрочивании пробоотбора или периода восстановления, например, некоторые нуклеоэидные аналоги и некоторые нитроэамикы. В метафаэном анализе аберраций информацию о плоидическом статусе получают за счет регистрации частот полиплоидных (включая эндоредуплицироеанные) метафаз в виде процента от числа клеток в метафаэе. Для MLA протокол испытания должен включать проведение испытаний с метаболической активацией и без с соответствующим положительным и отрицательным контролем при продопжительноститерапии исследуемым препаратом 3—4 часа. Длительная терапия без метаболической активации продолжительностью около 24 часов должна проводиться в случае получения отрицательного или сомнительного результата обоих краткосрочных циклов терапии с метаболической активацией и без нее. Стандартный MLA должен включать (i) положительный контроль, индуцирующий, главным образом, малые колонии, и (ii) изменение размера колоний для положительного контроля, контроль растворителей и минимум одну положительную концентрацию исследуемого компонента (при наличии), включая культуру, характеризующуюся наибольшей частотой выявления мутаций.

Для исследований на клетках млекопитающих in vitro должны использоваться встроенные подтверждающие элементы, подобные перечисленным выше (например, различная продолжительность терапии, тесты с метаболической активацией и без нее). После подобных анализов дальнейшие подтверждающие испытания в случае получения определенно отрицательных или положительных результатов. как правило, не требуются. При получении сомнительных или слабоположительных результатов могут потребоваться повторные тесты, возможно, в рамках модифицированного протокола, например, с установлением иных интервалов исследуемых концентраций.

3.3.3    Положительный контроль

Одновременное проведение тестов на положительных контрольныхобразцах важно, однакотесты на клетках млекопитающих с целью выявления генетической токсичности в достаточной степени стандартизированы. так что использование положительных контрольных образцов обычно ограничивается использованием их в случае метаболической активации (при одновременном проведении ответами без активации) с целью продемонстрировать активность системы метаболической активации и восприимчивости тест-системы.

4 Рекомендации по проведению испытаний in vivo

4.1 Тесты, проводимые с целью определения хромосомных повреждений in vivo

Для определения кластогенов подходит либо анализ хромосомных аберраций, либо измерение микроядеркых полихроматических эритроцитов в костном мозге in vivo. Для проведения микроядерной пробы в костном мозге в качестве модели подходят и крысы, и мыши. Микроядра также можно исследовать в незрелых (например, полихроматических) эритроцитах в периферической крови мышей либо в новообразованных ретикулоцитах в крови крыс (примечание 3). Аналогичным образом также могут использоваться незрелые эритроциты животных любого другого вида, характеризующиеся аналогичной чувствительностью к определению индукторов кластогенов/анеуплоидии в костном мозге или периферической крови (примечание 3). При условии надлежащей валидации могут использоваться системы автоматизированного анализа (визуальный анализ и проточная цитометрия) (OECD. 1997; Hayashi etal..

8

ГОСТ Р 57130—2016

2000; 2007). Анализ хромосомных аберраций также можно провести в периферических лимфоцитах, полученных от грызунов, получавших терапию (примечание 11).

Примечание 11

В некоторых случаях полезно исследовать хромосомные аберрации в метафаза а лимфоцитах, взятых от испытуемых животных после одного или нескольких введений исследуемого вещества, а также могут использоваться клетки костного мозга в метафазе. Поскольку лимфоциты циркулирующей крови не размножаются. предполагается, что вещества, требующие репликации для выявления генотоксического действия (например, некоторые нуклеозидные аналоги), не должны выявляться в клетках данного типа. Поскольку некоторые лимфоциты имеют достаточновысокую продолжительность жизни, в лринципе. существует потенциал аккумуляции непарного повреждения ДНК т vivo, который может привести к аберрациям при стимуляции деления клеток т vitro. Анализ лимфоцитов in vivo полезен при контроле показаний кластогенности. но в целом другиетквни. такие как печень, представляют собой более информативную замену теста микроядер в гемопоэтических клетках, поскольку концентрации препарате и метаболитов в печени зачастую выше.

4.2 Другие испытания гонотоксичности In vivo

Аналогичные испытания in vivo, описанные в качестве второго испытания в рамках стандартного набора тестов (вариант 2). могут использоваться в качестве контрольных испытаний для получения необходимого набора данных для оценки результатов анализов in vitro или in vivo (примечания 11 и 12). Несмотря на то. что тип эффектов, наблюдаемых in vitro, и знание механизма может помочь при выборе анализа in vivo, проведение исследований хромосомных аберраций или генных мутаций эндогенных генов в большинстве тканей нецелесообразно проводить стандартными методами. Несмотря на то, что мутации можно определять в трансгенах грызунов, это подразумевает более продолжительную терапию (например, в течение 26 дней) для экспрессии, фиксации иаккумуляции мутаций, особенно в тканях с медленно делящимися клетками (примечание 12). Таким образом, во втором анализе in vivos качестве суррогатной конечной точки проводят оценку повреждения ДНК. Анализы с наиболее полным опубликованным опытом и рекомендациями в рамках протоколов включают анализы поломки нитей ДНК. в том числе анализ единичной клетки методом гель-электрофорез («Кометный анализ») и анализ разрывов ДНК. анализы трансгенных мутаций на мышах/л vivo и анализы ковалентного связывания ДНК(любой из которых может применяться во многих тканях, примечание 12). и анализ репаративного синтеза ДНК в печени (анализ UDS).

Примечание 12

Включение второго анализа Ln vivo в батарею тестов должно обеспечить отсутствие гонотоксичности за счет использования тканей, в которых достигаются высокие концентрации препарата ufunu егометаболи-тов. небольшое чиспо канцерогенов, предполагающих генотоксичность. обеспечили достижение положительных результатов теста в печени, но имели отрицательный результат цитогенетического анализа т vivo в костном мозге. Эти примеры, вероятно, отражают отсутствие необходимой метаболической активности либо отсутствие поступления реактивных промежуточных продуктов в гемопоэтические клетки костного мозга.

Анализ разрывов нитей ДНК. ДНК-аддукты и мутации трансгенов имеют преимуществом возможность использования во многих типах тканей. Протоколы, согласованные на международном уровне, лохе не разрабо-таныдлявсех анализов tn vivo.хотя существует достаточныйопыт и опубликованные данные, и рекомендации протокола в отношении анализов поломки нитей ДНК (кометный анализ и анализ методом щелочной эпюции). аддукт ДНК (ковалентное связывание) и анализе мутации на трансгенных грызунах, помимо анализа UOS. Для вещества с положительным результатом анализа MLA in vitro и индуцирующего преимущественно крупные колонии, а также не вызывающего поломку хромосом в метафазном анализе in vitro, вместо анализа разрыва нитей ДНК следует рассмотреть анализ мутаций in vivo, например, анализ мутаций на трансгенных мышах. Анализ UDS считается полезным. главным образом, для веществ, индуцирующих объемные аддукты ДНК либо с положительным результатом теста Эймса. Поскольку цитотоксичность провоцирует разрыв нитей ДНК. во избежание искажения результатов анализа разрыве нитей ДНК следует провести тщательную оценку цитотоксичности. Это явление хорошо описано в отношении теста методом шапочной злюции т vitro (Storeretal.. 1996). при этом не полностью валидировено для хометноео анализа. В принципе, анализ разрыва нитей ДНК может применяться в рамках токсикологических исследований многократных дозе необходимым уровнем доз и продолжительностью пробоотбора.

Поскольку печень зрелых животных не отличается высокой митотической активностью, для второго анализа часто используют не цитогенетическую конечную точку, но при наличии делящихся гелатоцитов. например, после частичной гелатзктомии. либо у молодых крыс (Hayashi et а!.. 2007). возможно проведение микроядврного анализа в печени, позволяющего выявить известные генотоксические вещества.

9

ГОСТ Р 57130—2016

4.3 выбор доз в рамках анализа in vivo

Обычно анализ проводят с использованием трех уровней доз (Hayashi et al., 2005).

4.3.1    Краткосрочные исследования

Для краткосрочных исследований{1—3 дозы) максимально рекомендованная доза для исследова-ний генотоксичности представляет собой предельную дозу 2000 мг/кг при условии хорошей переноси* мости либо максимально переносимую дозу, определяемую (например, для микроядерного анализа (OECD)) как дозу, вызывающую признаки токсичности такой степени выраженности, чтобы более высокие дозы при сохранении аналогичного режима дозирования привели бы к летальному исходу. Аналогичные рекомендации действуют в отношении кометного анализа (Hartmann et al.. 2003) и трансгенного анализа мутаций (HeOdle et al.. 2000). Подавление продукции эритроцитов костным мозгом также следует учитывать при выборе дозы. Интервалы между более низкими дозами, как правило, в два-три раза ниже заданного.

4.3.2    Исследования многократного применения

Вариант 1 набора

В случае если анализ генотоксичности in vivo интегрирован в токсикологическое исследование многократного применения, дозы, как правило, считаются подходящими, если токсикологическое исследование отвечает критериям исследования, подкрепляющего клинические исследования с участием человека, что может отличатьсяот критериев выбора дозы в руководстве OECD при проведении микроя-дерной пробы in vivo. Это относится и к случаям отрицательных результатов анализа на клетках млекопитающих in vitro («несвойственно положительный», см. раздел 5).

Пострегистрационные исследования или набор тестов по варианту 2

При проведении пострегистрационных исследований с целью проверки любого из показаний по генотоксичности или при использовании 2-го варианта без проведения анализа на клетках млекопитающих in vitro следует учитывать несколько факторов для определения целесообразности максимальной дозы для оценки генотоксичности. Любого из нижеприведенных критериев достаточно для того, чтобы подтвердить, что максимальная доза в токсикологическом исследовании (обычно на крысах) подходит для микроядерной пробы и для других оценок генотоксичности:

i.    Максимально допустимая доза (МПД) на основании физико-химических свойств препарата в основе (при условии, что МПД для данной основы аналогична МПД. достигаемой при остром введении; примечание 13).

ii.    Предельная доза 1000 мг/кг для исследований продолжительностью 14 дней и больше, при условии удовлетворительной переносимости.

iii.    Максимально возможная концентрация достигается за счет достижения ллато/насыщения концентрации либо за счет накопления вещества. Напротив, при существенном снижении концентрации исходного препарата с течением времени (например. £ 50 % снижение от начальной концентрации) исследование может быть дисквалифицировано (за исключением случаев, когда доступен образец крови. взятый в первые несколько дней). Если данный эффект наблюдается у животных одного пола, как правило, у животных с меньшей концентрацией не будет проводиться оценки в конце исследования, за исключением случаев повышения концентрации интересующего метаболита.

iv.    Максимальная доза составляет 50 % от максимальной дозы, используемой в экспериментах по однократному приему, т. е. приближена к минимальной летальной дозе, если подобные острые данные доступны по какой-либо иной причине (максимальная доза для микроядерных проб при однократном приеме, описанных в руководстве OEDC в качестве дозы, выше которой можно ожидать летальности), аналогичные рекомендации предоставляют и для других анализов in vivo (например. Hartmann et al.. 2003).

Выбор максимальной дозы на основании только коэффициента концентрации (многократное и клиническое воздействие) без признаков токсичности не является достаточно обоснованным.

Примечание 13

Это. как правило. актуально для распространенных осноа. таких как водный раствор иетилиеплюпозы. но для таких основ, как Твин 80. вводимый объем может быть в 30 раз ниже, чей в острых экспериментах.

4.3.3    Испытуемые препараты, оказывающие токсическое действие на кровь и костный

мозг

Многие вещества, индуцирующие анеуплоидию. такие как мощные веретенные яды. определимы в микроядерных пробах костного мозга или крови in vivo только в узком диапазоне доз, приближенных к токсическим. Это справедливо и для некоторых кластогенов. 8 случае, если токсикологические данные свидетельствуют о тяжелой токсичности в отношении эритроцитов (например, выраженная супрессия

Ю

ГОСТ Р 57130—2016

полихроматических эритроцитов (ПХЭ) либо ретикулоцитов). интервал между учитываемыми дозы должен быть не более чем е 2 раза ниже максимальной цитотоксической дозы. Если подходящие дозы не включены в исследование продолжительностью несколько недель, дополнительные данные могут помочь выявить анеугены и некоторые токсичные кластогены любым из следующих способов:

i. По мере увеличения продолжительности терапии при выраженном нарастании токсичности рекомендовано раннее взятие образцов крови (на 3—4-й день). Например, если в микроядерной пробе в рамках многонедельного анализа используется кровь или костный мозг и ретикулоциты классифицируют. выраженная гематотоксичность может повлиять на способность к выявлению микроядер. т. е. доза, индуцирующая определимый рост микроядер после однократного введения, может бытьчрезмерно токсичной в случае анализа при многократном введении (Hamada et al., 2001). Ранние образцы могут использоваться для обеспечения выявления кластогенов и потенциальных анеугенов (см. примечания 14 и 15).

и. Микроядерная проба в клетках млекопитающих in vitro.

iii. Микроядерная проба в костном мозге при однократном введении.

Примечание 14

Необходимо с осторожностью подходить к токсикологическим исслвдоеаниям. включающим взятие дополнительных образцов крови, например, для определения концентрации. Кровотечение может привести к искажению результатов микроядерного анализа, поскольку эритропозз. стимулируемый взятием крови, может спровоцировать рост числа микроядерных эритроцитов.

Примечание 15

Рост числа микроядер может произойти и без ееедения генотоксического агенте вследствие нарушения зритролозза (например, регенеративная анемия, экстрамедуллярный гемопоэз, стресс и голо- о гепертермия (анализ Tweats el а!.. 2007.1)). В крови изменение функции селезенки, влияющее на клиренс микроядерных клеток из крови, могло привести к незначительному росту циркулирующих микроядерных эритроцитов.

4.4 Демонстрация концентраций в целевых тканях при отрицательных результатах анализов in vivo

Исследования in vivo играют важную роль в разработке стратегии исследований генотоксичности. Ценность результатов исследований in vivo напрямую связана с подтверждением достаточной концентрации испытуемого вещества в целевой ткани. Это особенно актуально при получении отрицательных результатов анализа in vivo, если испытания in vitro убедительно доказали наличие генотоксичных свойств или в случае, если не проводится анализ на клетках млекопитающих in vitro. Доказательством достаточной концентрации могут быть признаки токсичности в исследуемой ткани либо токсикокинети-ческие данные, представленные в следующем разделе.

4.4.1 В случае положительного результата испытания генотоксичности in vitro (или если исследование не проводилось)

Оценка концентраций, достигнутых in vivo, должна проводиться при максимальной дозе или при других релевантных дозах на животных того же вида, линии и при аналогичном пути дозирования, используемого в рамках анализа генотоксичности. В случае, если оценку генотоксичности проводят в рамках токсикологических анализов, информация о концентрациях обычно доступна в рамках токсикологической оценки.

Оценка концентрации in vivo может проводиться по одному из следующих методов:

i.    Цитотоксичность:

a.    Для цитогенетических анализов: За счет достижения существенного изменения пропорции незрелых эритроцитов в числе общего пула эритроцитов в целевой ткани (костный мозг или кровь) в дозах и при времени пробоотбора в рамках микроядерной пробы или за счет измерения значительного снижения митотического индекса в рамках анализа хромосомных аберраций.

b.    Для других анализов генотоксичности in vivo: Токсичность в печени или изучаемых тканях, например, методом гистолатологическойоценки или индикаторов токсичности по показателям биохимического анализа крови.

ii.    Воздействие препарата:

a.    Измерение материала препарата в крови и плазме. Ткани костного мозга характеризуются высокой перфузией, а уровень лекарственного материала в крови или плазме в целом аналогичен такому в костном мозге. Предполагается, что системное воздействие препаратов на печень наблюдается независимо от пути введения.

b.    Прямое измерение материала, свяэанногос препаратом, вцелевых тканях, либо ауторадиографическая оценка тканевых концентраций.

п

ГОСТ Р 57130—2016

Если системные концентрации одинаковы или ниже ожидаемой клинической концентрации, могут использоваться альтернативные стратегии, такие как:

i.    Использование иного пути введения:

ii.    Использование разных видов животных с более высокими концентрациями:

ш. Использование иной ткани или анализа (см. раздел 2.3.4. «Ограничения по использованию стандартных испытаний in wo»).

При невозможности достижения достаточной концентрации (например, вещества с малой сте-пенью доступности в целевых тканях) традиционные испытания генотоксичности in vivo проводить нецелесообразно.

4.4.2 Отрицательные результаты испытаний генотоксичности in vitro

Если анализы in vitro не показывают генотоксического потенциала, in vivo (системную) концентрацию можно оценить одним из вышеуказанных методов или вычислить по результатам стандартных исследований всасывания, распределения, метаболизма и выведения (ADME) на грызунах, проводившихся в иных целях.

4.5    Пробоотбор/время проведения анализов /л vivo

Выбор времени пробоотбора в микроядерных пробах in vivo и испытаниях хромосомных аберраций и испытаний UDS должен осуществляться в соответствии с OECD (1997).

Вслучае. когда микроядерный анализ интегрируют в исследования продолжительностью несколько недель, отбор образцов крови или костного мозга может производиться на следующий день после последнего введения (см. рекомендации вотношении дополнительного времени пробоотбора выше).

Для других анализов генотоксичности время пробоотбора следует выбирать е соответствии с конечными точками, например, анализ поломок ДНК/нитей ДНК обычно производят через несколько (например, через 2—6) часов после последнего введения дозы препарата несколько раз в сутки. В случае однократного введения два момента пробоотбора следует использовать через несколько часов и через 24 часа после окончания терапии.

В принципе исследования любой продолжительности можно считать приемлемыми, учитывая достаточность максимальной дозы / концентрации.

4.6    Количество анализируемых животных

Количество анализируемых животных определяют в соответствии с текущими рекомендациями в отношении микроядерной пробы (OECD) или иных анализов генотоксичности и. как правило, их общее число не соответствует числу животных, получавших терапию в рамках токсикологического исследования. Животные, используемые для анализа генотоксичности. должны в случайном порядке отбираться из группы животных в токсикологическом исследовании.

4.7    Использование самцов/самок грызунов в исследованиях генотоксичности in vivo

В случае проведения испытаний препаратов, применяемых с учетом пола, анализ может проводиться на животных соответствующего пола. Испытания in vivo с краткосрочным протоколом обычно проводятся на животных одного пола. При проведении краткосрочных испытаний может быть рассмотрена возможность использования животных обоих полов, если существующие данные о токсичности, метаболизме и концентрациях препарата (Смам. или AUC) указывают на токсикологически значимое межполовое различие у биологического вида, используемого при проведении испытаний. В противном случае для испытаний острой генотоксичности предпочтительнее использовать только самцов. В случае если испытание генотоксичности проводится в рамках токсикологического исследования многократных доз на животных обоего пола, образцы могут быть взяты у животных обоих полое, однако при отсутствии существенных межполовых различий в отношении токсичности/метаболизма оценку следует проводить по животным одного пола. Уровень доз для животных, проходящих оценку, должен соответствовать критериям выбора необходимого уровня доз (см. разделы 4.3.2 и 4.3.3).

Аналогичные принципы применимы к другим анализам генотоксичности in vivo.

4.8    Путь введения

Путем введения обычно является ожидаемый клинический путь. т. е. перорально, внутривенно или подкожно, но он может быть соответствующим образом модифицирован для достижения необходимых системных концентраций, например, для препаратов толикального пути введения (см. раздел 2.3.4).

4.9    Использование положительного контроля в исследованиях in vivo

В исследованиях in vivo считается достаточным использовать положительный контроль лишь периодически, а не параллельно с каждым анализом после подтверждения компетентности лаборатории в отношении применения данного анализа (примечание 16).

12

ГОСТ Р 57130—2016

Примечание 16

Положительный контроль для краткосрочных исследований генотоксичности или исследований повторных доз:

Для микроядерных (и других цитогенетических) анализов цель положительного контроля заключается в подтверждении того, чтобы лица, проводящие оценку слайдов, иоглисеысокой степенью надежности выявить микроядерный рост. Это достижимо за счет использования образцов периодических исследований (через каждые несколько месяцев) малых групп животных (одного попа), получающих острую терапию с положительным контролем. При ручной оценке такие слайды могут быть включены в кодированные слайды, оценивавшиеся дпя каждого исследование. Положительные контрольные слайды не должны быть очевидными дпя аналитиков на основании свойстаокрашиванияпибо частоты микроядер. В случае автоматическойоценки для каждого анализа должны использоваться соответствующие образцы дпя контроле качества.

Дпя других генотоксических анализов in чЫо иепь положительного контроля заключается а подтверждении надежного определения нарастания поломок ДНК/мутагенности при помощи анализа на выбранном биологическом виде, ткани и в рамках выбранного протокола. После того, как лаборатория показала способность непрерывно выявлять соответствующие положительные контрольные вещества в множестве независимых экспериментов, периодическое выполнение положительных контрольных экспериментов в целом является достаточным при условии неизменности условий эксперимента. Однако в настоящее время наличие одновременного положительного контроля дпя кометного анализа крайне желательно.

5 Рекомендации по оценке результатов испытаний и стратегий контрольных

испытаний

Сравнительные исследования убедительно показали, что каждая тест-система in vitro позволяет достичь ложноотрицательных и ложноположительных результатов в отношении характеристик канце-рогвнности у грызунов. Батареи тестов генотоксичности (in vitro и in vivo) позволяют определить канцерогены. механизм которых обусловлен непосредственно генетическими поломками, как в случае большинства известных канцерогенов человека. Следовательно, эти батареи тестов не способны выявить канцерогены, не обладающие генотоксичесхими свойствами. Условия проведения экспериментов, например вследствие ограниченной мощности систем активации метаболизма in vitro, могут привести к ложноотрицательным результатам. Применение батареи тестов направлено на снижение риска получения ложноотрицательных результатов для веществ с генотоксическим потенциалом. С другой стороны, положительный результат анализа генотоксичности не всегда означает, что данное вещество представляет собой опасность для человека с точки зрения генотоксичности/канцерогенности.

Несмотря на то, что положительные данные in vitro могут указывать на подлинные генотоксические свойства препарата, соответствующие данные in vivo в большинстве случаев позволяют установить биологическую значимость результатов, полученных in vitro. Кроме того, в связи с существованием нескольких непрямых механизмов генотоксичности. развивающихся лишь при небольшом повышении концентраций, возможно определить безопасный уровень (порог) для классов препаратов с признаками подобных механизмов (см. пункт 5.2 ниже. MGIIerand Kasper. 2000; Scott et al.. 1991; Thybaud etal.,2007).

5.1    Оценка биологической актуальности

Нижеизложенные рекомендации предполагают, что испытание проводилось с необходимым интервалом между дозами, уровнем токсичности и т. д.

Небольшой рост явной генотоксичности/л vitro или in проследует оцениватьсточки зрения воспроизводимости и биологической значимости. Примеры результатов, не имеющих биологической значимости. включают.

i.    Небольшой статистически значимый рост, по сравнению с отрицательным контролем или растворителем. но не выходящий за рамки доверительных интервалов соответствующего исторического контроля для данного испытательного центра.

ii.    Слабый/сомнитепьный невоспроизводимый ответ.

При условии удовлетворения одному из вышеназванных условий, есть основания предполагать отсутствие генотоксического потенциала, результаты испытания считают отрицательными и не имеющими биологической актуальности, при этом дальнейших анализов проводить не требуется.

5.2    Оценка результатов, полученных в испытаниях in vitro

При оценке положительных результатов испытания бактериальной мутагенности следует учитывать чистоту испытуемого вещества с целью определения обусловленности положительного результата контаминантом.

13

ГОСТ Р 57130—2016

5.2.1    Оценка положительных результатов, полученных в рамках анализа

бактериальной мутации In vitro

Поскольку положительные результаты теста Эймса указывают на химическую активность ДНК. обширные лострегистрационные испытания с целью оценки мутагенного и канцерогенного потенциала in vitro необходимы для оценки потенциального риска при терапии пациентов, за исключением случаев, когда это обосновано соответствующим анализом оценки риска/пользы.

Имеются некоторые хорошо изученные примеры артефактного роста колоний, не являющихся истинно ревертантными. Они могут быть обусловлены контаминацией аминокислотами (т. е. представлением гистидина для штаммов Salmonella typiUmurium или триптофаном для штаммов Escherichia coif). следовательно, анализ бактериальной реверсии не подходит для пептида, который может подлежать распаду. В некоторых случаях положительные результаты анализов бактериальной мутации могут не указывать на наличие генотоксического потенциала in vivo у человека, например в случае специфического бактериального метаболизма, например активация бактериальными нитроредуктазами.

5.2.2    Оценка положительных результатов анализов на клетках млекопитающих In vitro

Рекомендации по оценке совокупности данных и пострегистрационных испытаниях при получении

положительных результатов анализа генотоксичности обсуждаются в отчетах IWGT (например. Thybaud et al.. 2007). Кроме того, в научной литературе представлен ряд условий, которые могут привести к положительному результату анализа in vitro сомнительной значимости. Следовательно, любой положительный результат анализов in vitro следует оценивать с учетом совокупности данных, перечисленных ниже. Дан неполный список, однако он позволяет принять решение.

i.    Данные условия не проявляются in vivo (pH; осмоляльность, преципитат).

(Следует учесть, что предельное значение 1 мМ позволяет избежать увеличения осмоляльности и если исследуемое вещество изменяет уровень pH. желательно скорректировать pH до нормального уровня pH в необработанных культурахв период терапии).

ii.    Эффект развивается только при наиболее токсичных концентрациях.

При анализе MLA рост на г 80% приводиткснижениюЯТС.

В цитогенетических исследованиях in vitro при подавлении роста на г 50 %.

В случае удовлетворения одному из вышеуказанных условий, если существующие данные свидетельствуют об отсутствии генотоксического потенциала, можно придерживаться стандартной батареи тестов (вариант 1). Таким образом, однократного испытания in vivo будет достаточно.

5.2.3    Оценка отрицательных результатов In vitro

Для отрицательных результатов анализов in vitro в особых случаях следует рассмотреть возможность проведения дополнительных анализов (приведен неполный список, примеры даны лишь для помощи при принятии решений). Структура вещества или известные свойства метаболизма указывают на то. что стандартная технология метаболической активации in vitro (например, печень грызунов S9) может быть недостаточной, структура либо подтвержденные свойства активности вещества указывают на возможную целесообразность использования иных методов/систем.

5.3    Оценка результатов, полученных в испытаниях In vivo

Испытания in vivo имеют преимущество анализа всасывания, распределения и выведения, не учитываемых в испытаниях in vitro, но потенциально актуальны и при применении у человека. Кроме того, характеристики метаболизма более актуальны in vivo, по сравнениюссистемами. обычно используемыми in vitro. Если результаты анализов in vivo и in vitro не согласуются между собой, различие можно учесть/объяснитъ в индивидуальном порядке (имеется в виду различие метаболизма, быстрого и эффективного выведения вещества in vivo).

Анализы генотоксичности in vivo также потенциально могут дать ложноположительные результаты. не свидетельствующие об истинной генотоксичности. Например:

i.    Микроядерный рост может возникнуть без введения генотоксического вещества в связи с нарушением эритропоэза (Tweats et al.. 2007.1).

ii.    Данные об аддукции ДНК следует интерпретировать в свете известного фонового уровня эндогенных аддуктов.

ii. Непрямые эффекты, связанныестоксичностью, могут повлиять на результаты анализов разрыва нитей ДНК (например, методом щелочной элюции или кометного анализа).

Таким образом, при оценке данных генотоксичности важно учесть все токсикологические и гематологические результаты (примечание 15). Непрямые эффекты, связанныес токсикологическими изменениями. могут иметь резерв безопасности и не являться клинически значимыми.

14

ГОСТ Р 57130—2016

5.4 Стратегии последующей разработки при получении положительных результатов

5.4.1    Последующая работа по результатам испытаний в клетках млекопитающих

In vitro

В следующем обсуждении представлены отрицательные результаты теста Эймса на бактвриаль-ныв мутации.

5.4.1.1    Последующие механистические/in vivo испытания

В случае недостаточного объема информации об отсутствии актуальности рекомендованные последующие испытания лри положительном результате анализа на клетках млекопитающих необходимы для получения экспериментальных результатов в дополнительных исследований in vitro (см. i ниже) шш за счет проведения двух соответствующих анализов in vivo (см. пункт ii ниже) следующим образом:

i.    Механистическая информация, которая свидетельствует оботсутстеии совокупности данных об отсутствии актуальной генотоксичности in vitro, например, данные о том. что испытуемое вещество, индуцирующее хромосомные аберрации или мутации в MLA. не повреждает ДНК (например, другие отрицательные результаты испытаний мутации/повреждения ДНК в дополнение к тесту Эймса: структурные аспекты), либо имеется свидетельство непрямого механизма, который может быть неактуальным in vivo или иметь пороговое значение (например, подавление синтеза ДНК. реактивный кислород, продуцируемый только в высоких концентрациях) (Galloway et al., 1998: Scott et al.. 1991; Muller and Kasper. 2000). Сходные исследования могут использоваться для последующего анализа положительных результатов в микроядерной пробе in vitro, либо в данном случае свидетельства включают известный механизм, указывающий на потерю хромосом/анеуплоидию либо эксперименты по окрашиванию центромеров (примечание 17), подтверждающие выпадение хромосомы. Полиплоидия — часто встречаемый результат анализов хромосомных аберраций in vitro. Несмотря на то. что анеугены способны к индукции полиплоидии, только полиплоидия не указывает на амеугенный потенциал и может свидетельствовать об отклонении клеточного цикла, и также часто характеризуется ростом цитотоксичности. В случае полиплоидии в отсутствие структурной хромосомной поломки в анализе in vitro

ii.    Аналогичные исследования могут использоваться для отслеживания положительного результата микроядерного анализа in vitro или в этом случае имеются свидетельства, включающие известный механизм выявления хромосомной поломки/анеуплоидии либо эксперименты по окрашиванию (примечание 17). При проведении исследований хромосомных аберраций/л и(гочастообнаруживается полиплоидия. Хотя анеугены способны индуцировать полиплоидию, сама по себе она не указывает на анеугвнный потенциал и может попросту свидетельствовать© нарушении клеточного цикла, при этом ее часто ассоциируют с ростом цитотоксичности. В случае полиплоидии, но при отсутствии структурных хромосомных поломок в анализе in vitro, как правило, отрицательный результат микроядерной пробы in vivo, при условии соответствующего воздействия, дает достаточное подтверждение отсутствия потенциала индукции анеуплоидии.

Ш. Если вышеуказанная механистическая информация и совокупность имеющихся данных подтверждает отсутствие генотоксичности. для подтверждения отсутствия генотоксической активности используют лишь один анализ in vivo, при условии соответствующего воздействия. Как правило, речь идето цитогенетическом анализе, а микроядерный анализ in vivo используют для дальнейших анализов хромосомных поломок.

При отсутствии достаточных данных или механистической информации для исключения соответствующего генотоксического потенциала, обычно проводят два испытания in vivoc соответствующими конечными точками и в соответствующих тканях (обычно две различные ткани) с целью достичь достаточной степени воздействия в моделях in vivo.

Либо

iv. Проводятся два соответствующих анализа in vivo с использованием разных тканей и подтверждающих степень воздействия.

Таким образом, отрицательные результаты соответствующих анализов in vivo с достаточным обоснованием измеряемых конечных точек и подтверждением степени воздействия (см. раздел 4.4.1) считаются достаточными для подтверждения отсутствия значительного генотоксического риска.

Примечание 17

Для того. чтобы определить, вызвана ли микроядерная индукция в первую очередь потерей хромосомы либо поломкой хромосомы, микроядра могут быть окрашены tn vitro либо т vivo для установления наличия центромеров. например, в рамках анализа флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с зондами к последовательностям ДНК в центромерном участке, либо меченым антителом к белкам, содержащим кинетохору. Если большинство индуцированных микроядерсодержат центромеры, зто свидетельствует об утрате хромосомы (следует учесть, что даже мощные яды трубочек, такие как колхицин и винбластин. продуцируют кинето-

15

ГОСТ Р 57130—2016

хор-положительные микроядра не е 100 %. в чаше е 70—80 % и являются основными анеугенами для оценки риска). Альтернативный подход заключается в проведении анализа in van или in vivo структурных аберраций в метафазе. В случае отрицательного результата можно предположить, что индукция микроядер связана с утратой хромосом.

5.4.1.2    Дальнейшие анализы после получения положительного результата анализа in vitro, е зависимости от активации S9

В случае, когда положительные результаты наблюдаются только в присутствии системы активации S9. вначале следует подтвердить, чтоэтот результат достигнут только вследствие метаболической активации, а не иных различий в условиях (например, низкий уровень или отсутствие сыворотки в миксе S9n^10% сыворотки в неактивированных культурах). Вэтом случае стратегия последующих испытаний направлена на определение соответствия результатов исследований in vitro условиям in vivo и главным образом будет опираться на результаты анализов in vivo в печени (примечание 18).

Примечание 18

Стандартный индуцированный микс $9 имеет более высокое возможности к активации, чем S9 человека, при этом в нем отсутствует способность к детоксификации во второй фазе, за исключением случаев воздействия специфических кофакторов. Кроме того, неспецифическая активация может возникнуть in vitro при высоких концентрациях субстрата (см. Kirhland et at.. 2007). Полезными могут оказаться испытания геноток-сичности S9 человеке либо других релевантных систем активации. Анализ профиля метаболитов в рамках испытаний генотоксичностипосравнению с известными профилями метаболитов в доклиническом виде (либо в неиндуцированных микросомах либо гелатоцитах. либо in vivo) или в препаратах, полученных от человеке. также может помочь определить актуальность результатов испытания (Ки etal.. 2007). а последующие исследования сконцентрируются на исследованиях в печени in vivo, вещество, для которого были достигнуты положительные результаты in vitro для S9. могут не вызывать генотоксичности т vivo, поскольку метаболит не формируется, формируется в очень малых количествах либо метаболически детоксифицирован, либо быстро выводится, что свидетельствует об отсутствии риска in vivo.

5.4.2    Дальнейшие анализы в случае положительной микроядерной пробы in vivo

Вслучав увеличения числа микроядвр/л vivo следует провести оценку всех токсикологическихдан-

ных для установления вероятности того, что основной причиной или сопутствующим фактором может быть негенотоксический эффект (примечание 15). В случае неспецифических эффектов нарушения эритропоэза или физиологии (например, гипо/гипертермия) более целесообразным может стать анализ хромосомных аберраций in vivo. При подозрении на «реальный» рост следует использовать стратегии, показывающие на обусловленность роста выпадением либо поломкой хромосом (примечание 17). Имеются свидетельства того, что индукция анеуппоидии. например веретенными ядами, приводит к нелинейному эффекту дозы. Следовательно, возможно установить пороговую концентрацию, ниже которой не предполагается выпадения хромосом, и установить наличие соответствующего коэффициента надежности, по сравнению с клиническими концентрациями.

Таким образом, оценка генотоксичесхого потенциала вещества должна учитывать всю совокупность полученных данных и учитывает пользу и ограничения анализов in vitro и in vivo.

5.5 Последующий анализ генотоксичности применительно к результатам опухолевого

роста в биологическом анализе канцерогенности

Дополнительные анализы генотоксичности в соответствующих моделях могут проводиться для веществ, показавших отрицательный результат в рамках стандартной батареи тестов, но при этом показавших опухолевый рост в биологических анализах канцерогенности при недостаточности свидетельств. подтверждающих негенотоксический механизм развития опухоли. Чтобы лучше понять способ действия, дополнительные анализы могут включать модифицированные условия метаболической активации в испытаниях in vitro или включать анализы in vivo с целью определения генетического повреждения в целевыхорганах опухоли, например, анализ разрыва нитей ДНК (например, кометный анализ либо анализ методом щелочной элю ции). анализ UOS в печени, анализ ковалвнтногосвязывания ДНК(напри-мер. с последующей меткой Э2Р). индукция мутаций в трансгенах либо молекулярная характеристика генетических изменений генов, связанныхс опухолью (Kasper et al.. 2007).

6 Термины

Аддукт ДНК {ONA adduct)

Продукт ковалентного связывания химического вещества с ДНК

Анализ ДНК методом щелочной элюции (Alkaline elution аааау)

См. анализ разрыва нитей ДНК

16

ГОСТ Р 57130—2016

Анализ единичной клетки методом

гель-электрофорезе

{Single Cell Cel Electrophoresis assay)

Комет-анализ. См. анализ разрыва нитей ДНК

Анализ разрыва нитей ДНК (DNA strand break test)

Щелочная обработка, позволяющая конвертировать некоторые типы повреждений ДНК в разрывы нитей, которые могут быть определены методом щелочного элюирования с измерением скорости прохождения через фильтр или при помощи анализа единичной клетки методом гель-элек-трофорезв либо кометного анализа (при котором клетки, помещенные в тонкий слой геля на стекла микроскопа, подвергают воздействию электрического тока, заставляющего болев короткие участки ДНК мигрировать из ядра в «хвост кометы») Степень миграции ДНК измеряют визуально под микроскопом на окрашенных клетках

Анеуплоидия (Aneuploldy)

Числовое отклонение модельного числа хромосом в клетке или в организме

выживаемость (в контексте испытаний мутагенности)

(Survival (In the context of mutagenicity testing))

Доля живых клеток среди мертвых, обычно олределяемвя путем окрашивания и методом подсчета колоний по истечении определенного интервала времени

Генетическая конечная точка (Cenetic endpoint)

Точный тип либо клвсс генетического изменения (например, генетических мутаций, хромосомных аберраций, разрыва нитей ДНК. репарации ДНК. формирования аддукта ДНК и т.д.)

Генотоксичность

(Genotoxiclty)

Широкий термин, относящийся к любому вредному изменению генетического материала, независимо от механизма индукции данного изменения

Замена основания (Base substitution)

Замена одного и более оснований в нуклеотидной последовательности. Это может привести к изменению белка

Кластоген (Clastogen)

Вещество, приводящее к структурной поломке хромосом, обычно определяемое методом световой микроскопии

Клеточная пролиферация (Cel proliferation)

Способность клеток к делению и формированию дочерних клеток

Комет-анвлиэ (Comet assay)

См. анализ лоломох нитей ДНК

Конфлюентность культуры (Culture con fluency)

Количественное определение плотности клеток в культуре методом визуальной инспекции

Микроядро (Micronucleus)

Элемент клетки, содержащий нуклварную ДНК. Она может содержать целую хромосому либо сломанную центрическую, либо ацентрическую часть хромосомы

Митотический индекс (Mitotic index)

Процент клеток в разных стадиях митоза среди клеток, не находящихся в митозе (интерфазе) а препарате (стекло)

Мутация гена (Gene mutation)

Определимое необратимое изменение одного гена либо его регулирующих последовательностей. Изменения могут представлять собой точечные мутации, вставки либо делеции

Мутация со сдвигом рамки (Frameshift mutation)

Мутация (изменение генетического кода), при которой одно основание или два соседних основания добавляются (встраиваются) либо удаляются из нуклеотидной последовательности гена. Это может привести к образованию измененного либо процессированного белка

OOP (относительный общий рост) (RTG (relative total growth))

Данный параметр оценки цитотоксичности учитывает относительный рост суспензии (на основании потери клеток и роста клеток с начала лечения до второго дня после окончания терапии), умноженный на относительную эффективность посева на этапе клонирования мутантного квантироаания

Плазмида (Plasmid)

Генетический элемент в дополнение к нормальному бактериальному геному. Плазмида может быть включена в хромосому-хоэяин либо может быть сформирован экстрахромосомный элемент

Полиплоидия (Polyploidy)

Числовое отклонение модального числе хромосом в клетке с приблизительно кратким увеличением гаплоидного числа. Эндоредуллика-ция — это морфологическая форма полиплоидии, при которой хромосомные пары связаны в метвфаэе в виде «диплохромосом»

17

ГОСТ Р 57130—2016

Полихроматический эритроцит (Polychromatic erythrocyte)

Незрелый эритроцит в промежуточной стадии развития, содержащий рибосомы. который можно отличить от зрелых нормохроматических эритроцитов (без рибосом) по окрашиванию пятен РНК

Разрыв нитей ДНК (ONA strand breaks)

Расщепление одной или двойной нити ДНК

Рекомбинация (Recombination)

Поломка и сбалансированное либо несбалансированное воссоединение ДНК

Репаративный синтез ДНК

(РСД (Unscheduled ONA synthesis

(UOS)>

Синтез ДНК. происходящий на определенной стадии клеточного цикла, кроме S-фазы. в ответ на повреждение ДНК. Как правило, он связан с экс-цизионной репарацией ДНК

Репарация ДНК (ONA repair)

Реконструкция оригинальной последовательности ДНК после повреждения ДНК

Точечные мутации (Point mutations)

Изменения генетического кода, обычно ограничиваемые единственной парой основания ДНК

Трвнсген (Transgene)

Экзогенный или чужеродный ген. встроенный в геном соматических или зародышевых клеток

Удвоение популяции или рост культуры

(Population doubhng or culture growth)

Можно рассчитать разными способами, например: Удвоение популяции (PD) * логарифм соотношения конечного количества (N) и начального (исходного) количества (Хо). разделенный на логарифм 2. Таким образом: PD ■ |tog(N. Хо)]. log 2

Центромерой кетохор (Centromere/kmetochore)

Структуры в хромосомах, отвечающие за связь сестринских хромвтид и присоединение нитей веретена, перемещающих дочерние хромосомы к полюсам и обеспечивающих включение в дочерние ядра

Цитогенетический анализ (Cytogenetic evaluation)

Анализ хромосомных структур в митозе или мейозе методом световой микроскопии или микроядерного анализа

Числовые хромосомные изменения (Numerical chromosome changes)

Количество хромосом, отличное от оригинального гаплоидного или диплоидного набора хромосом, для клеточных линий число хромосом, отличное от модального хромосомного набора

Эффективность клонирования (Cloning efficiency)

Способность единичных клеток к формированию клонов. Обычно определяют после высевания небольшого количества клеток в соответствующей среде

18

ГОСТ Р 57130—2016

Библиография

1    Ashby J. Paton О. The influence of chemical structure on the extent and sites of carcinogenesis for 522 rodent carcinogens and 55 different human carcinogen exposures.Mutat Res 1994.256:3—74.

2    CorviR. AlbenimS. HartungT. HoffmannS. MaunciO. PfuhterSetal.ECVAM Retrospective Validation of the in vitro micronucleus test (MNT). Mutagenesis 2008; 23:271—283.

3    Gatehouse D. Haworth S. Cebula T. Gocke E. KierL. Matsushima T et al. Report from the working group on bacterial mutation assays: international wo rkshopon standardisation of genotoxicity testprocedures. Mutat Res 1994; 312:217—33.

4    Goodman & Gilman. The pharm8colog»cetbeeis of therapeutics. Hardman JG.LimbirdLE. Gilman AG. editors. 10th ed. New York: McGraw-Hill Professional 2001.

5    Greenwood SK. Hill R8. Sun JT. Armstrong MJ. Johnson ТЕ. Gera JP etal. Population Doubling: A simple and more accurate estimation of cell growth suppression in the in vitro assay for chromosome) aberrations that reduces irrelevant positive results. Environ Mol Mutagen 2004:43: 36—44

6    Hamada S.. Sutou S. Monta T. Wakala A. Asanami S. Hosoya S et al. Evaluation of the rodent micronucleus assay by a 28-day treatment protocol: summary of the 13th collaborative study by the collaborative study group for the micronucleus test (CSGMT)fEnvironmentai Mutagen Society of Japan {JEMS) — Mammalian Mutagenicity Study Group (MMS). Environ Mol Mutagen 2001 ;37:93—110.

7    Hartmann A. Agurell E, Beevers C. 8rendler-Schwaab S. Burlinson 8. Clay P et al. Recommendations for conducting them vivo alkaline Comet assay. Mutagenesis 2003:18:45—51.

8    Hayashi M. MacGregor JT. Gatehouse OG. Adler I. Blakey OH. Oertinger SO et al. M vivo rodent erythrocyte micronucleus assay. II. Some aspects of protocol design including repeated treatments, integration with toxicity testing, and automated sconng. Environ Mol Mutagen 2000:35: 234—52.

9    Hayashi M. MacGregor JT. Gatehouse DG. Blakey OH. Oertinger SD. Abramsson-Zetterberg L et al. in vivo erythrocyte micronucleus assay, ill. Validation and regulatory acceptance of automated sconng and the use of rat peripheral blood reticulocytes, with discussion of non-hematopoietic target celts and a single dose-level limit test. Mutat Res 2007:627: 10—30.

10    Heddle JA. Dean S. Nohmi T. Boerrigter M, Casciano O. Douglas GR et al. In vivo transgenic mutation assays. Environ Mol Mutagen 2000:35:253.

11    Hotchkiss CE. Bishop ME. Oertinger SD. Slikker W. Moore MM. MacGregor JT. Plow cytometric analysis of micron uctei in peripheral blood reticulocytes IV: an index of chromosomal damage in the rhesus monkey (macaca muiatta). Toxicol Sci 2008:102: 352—8

12    Kasper P. Uno Y. Mauthe R. Asano N. Douglas G. Matthews E et al. Follow-up testing of rodent carcinogens not positive in the standard genotoxicrty testing battery: IWGT workgroup report. Mutat Res 2007:627:106—116.

13    Kenelly JC. Waters R. Ashby J. Lefevre PA. Burlinson B. Benford DJ et al. in vivo rat liver UDS assay. In: Supplementary Mutagenicity Tests. UKEMS Recommended Procedures. Kirkland DJ. FoxM. editors. Cambridge Unrverslty Press 1993; 52—77.

14    Kirkland О J.PfuhierS. TweatsO. AardemeM. CorviR. DarroudiF etal. How to reduce false positive results when undertaking in vitro genotoxicfty testing and thus avoid unnecessary follow-up animal tests: report of the ECVAM workshop. Mutat Res 2007:628: 31—55.

15    Kirsch-Volders M, Sofuni T. Aardema M. Albertini S. Eastmond D. Fenech M et al. Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutat Res 2003:540:153—63.

16    Ktssling GE. Oertinger SD. Hayashi M. MacGregor JT. Sensitivity of the erythrocyte mlcronucleus assay, dependence on numberof cells scored and inter-animal variability. Mutat Res 2007:634:235—40.

17    Ku WW. Bigger A. Brambilla G. Glatt H. Gocke E. Guzzie PJ et al. Strategy for genotoxicity testing-metabolic considerations. Mutat Res 2007:627: 59—77.

18    MacGregor JT. Bishop ME. McNamee JP. Hayashi M. Asano N, Wakata A et al. Flow Cytometric analysis of micronuclei in peripheral blood reticulocytes: II. An efficient method of monitoring chromosomal damage m the rat. Toxicol Sci 2006:94: 92—107.

19    Moore MM. Honma M. Clements J. Harnngton-8rockK. Awogl T. BolcsfoldiG etal. Mouse lymphoma thymidine kinase locus gene mutetion assay: follow-up International workshop on genotoxicity test procedures — New Orleans. Louisiana. April 2000. Environ Mol Mutagen 2002; 40:292—9.

20    Moore MM. Honma M. Clements J. BolcsfoldiG. Burlinson B.Cifone M etal. Mouse lymphome thymidine kinase gene mutation assey. follow-up meeting of the international workshop on genotoxicity testing — Aberdeen. Scotland. 2003 — Assay acceptance cntene. positive controls, and date evaluation. Environ Mol Mutagen 2006:47:1—5.

21    Muller L. Kasper P. Human biological relevance and the use of threshold arguments in regulatory genotoxicity assessment: experience with pharmaceuticals. Mutat Res 2000:464:9—34.

22    OECD Guidelines for Genetic Toxicology 1997.

23    Scott D. Galloway SM. Marshall RR. Ishidate M Jr. Brusick D. Ashby J et al. Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC task group 9. Mutat Res 1991:257:147—204.

19

ГОСТ Р 57130—2016

24    StorerRD. McKelvey TW.Kraynak AR.Ella MC.8ernumJE. Harmon LS el al. Revaluation of the /о vim alkaline eluhonfrat hepstocyie assay for ONA damage: improved criteria for assessment of cytotoxicity and genotoxictty and results for 81 compounds. Mutat Res 1996:368:59—101.

25    Su2uki H. Ikeda N. KobayashiK. Terashtma Y.Shimada Y. Suzuki T etal. Evaluation of liver and penpheral blood micronucleus assays with 9 chemicals using young rats. A study by the Collaborative Study Group forthe Micronucleus Test (CSGMT)/Japanese Environmental Mutagen Society (JEMS) — Mammalian Mutagenicity Study Group (MMS). Mutat Res 2005:583:133—45.

26    Thybaud V. Aardema M. Clements J. Deerfield K. Galloway S. Hayashi M etal. Strategy for genotoxicity testing: hazard Identification and nsk assessment in relation tom vitro testing. Mutat Res 2007:627:41—58.

27    Tweats DJ. Biakey O. Heflich RH. Jacobs A. Jacobsen SO. Monta T et al. Report of the IWGT working group on strategies and interpretation of regulatory in vivo tests. I. increases in micronucleated bone marrow cells in rodents that do not indicate genotoxic hazards. Mutat Res 2007:627:78—91.

28    Tweats DJ. Biakey D. Heflich RH. Jacobs A. Jacobsen SO. Monta T et al. Report of the IWGT working group on stretegy/interpretation of regulatory in vivo tests. II. identification of m v/vo-only positive compounds in the bone marrow micronucleus test. Mutat Res 2007:627:92—105.

29    Wakata A. Miyamae Y. Sato S.Su2uki T. Monta T.AsanoN etal. Evaluation of the rat micronucleus test with bone marrow and peripheral blood: summary of the 9th collaborative study by CSGMT/JEMS. MMS. Environ Mol Mutagen 1998:32:64—100.

УДК 615.038:615.012/.014:615.2:006.354    OKC 11.120.01

11.020

Ключевые слова: лекарственные средства для медицинского применения, доклинические исследования, генотоксичность. интерпретация полученных данных

Редактор С.А. Константинова Техническим редактор В. Н. Прусакова Корректор EJ]. Дупънова Компьютерная верстка А.Н. Золотаревой

Сдано е набор 13.10,2016. Подписано а печать 21.10.2016. Формат 60 ■ 84^. Гарнитура Ариел.

Уел. печ л. 2.79. Уч.-изд. л. 2.52. Тираж 25 экз. Зак. 2613.

Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта

Издано и отпечатано во ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ». 123995 Москва. Гранатный лер.. 4.