ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО
ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ГОСТ Р
71137—
2023
ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
Метод определения фосфолиполитической активности
Издание официальное
Москва
Российский институт стандартизации
2023
ГОСТ Р 71137—2023
Предисловие
1 РАЗРАБОТАН Ассоциацией «Технологическая платформа БиоТех2030» (Ассоциация «ТП Био-Тех2030»)
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 326 «Биотехнологии»
3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 6 декабря 2023 г. № 1524-ст
4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Правила применения настоящего стандарта установлены в статье 26 Федерального закона от 29 июня 2015 г. № 162-ФЗ «О стандартизации в Российской Федерации». Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе «Национальные стандарты», а официальный текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.rst.gov.ru)
©Оформление. ФГБУ «Институт стандартизации», 2023
Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии
II
ГОСТ Р 71137—2023
Содержание
1 Область применения..................................................................1
2 Нормативные ссылки..................................................................1
3 Термины и определения...............................................................2
4 Сущность метода.....................................................................2
5 Условия проведения измерений.........................................................3
6 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы...........3
7 Подготовка к анализу..................................................................4
8 Отбор проб..........................................................................6
9 Проведение анализа..................................................................6
10 Обработка результатов...............................................................6
11 Контроль точности результатов измерений...............................................9
III
ГОСТ Р 71137—2023
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
Метод определения фосфолиполитической активности
Enzyme preparations for the food industry. Method for determining phospholipolytic activity
Дата введения — 2024—03—01
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на ферментные препараты для пищевой промышленности и устанавливает метод определения ферментативной активности индивидуальных фосфолипаз А1 (фосфатидилхолин 1-ацилгидролаз) и А2 (фосфатидилхолин 2-ацилгидролаз) и содержащих их ферментных препаратов.
Настоящий стандарт разработан с целью сравнительной оценки фосфолипазной активности коммерчески доступных фосфолипаз А1 (фосфатидилхолин 1-ацилгидролаз) и А2 (фосфатидилхолин 2-ацилгидролаз) и не распространяется на фосфолипазы и их ферментные препараты с неизвестными оптимальными значениями pH и температуры.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 8.135—2004 Государственная система обеспечения единства измерений. Стандарт-титры для приготовления буферных растворов — рабочих эталонов pH 2-го и 3-го разрядов. Технические и метрологические характеристики. Методы их определения
ГОСТ 61 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ 199 Реактивы. Натрий уксуснокислый 3-водный. Технические условия
ГОСТ 245 Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия
ГОСТ 450 Кальций хлористый технический. Технические условия
ГОСТ 1770 (ИСО 1042—83, ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 4172 Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный. Технические условия
ГОСТ 4328 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 5962 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
ГОСТ 25336 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и
размеры
ГОСТ 25794.1
Реактивы. Методы приготовления титрованных растворов для кислотно-основного
титрования
ГОСТ Р 57248 Препараты ферментные. Правила приемки и методы отбора проб
ГОСТ Р 58144 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ Р ИСО 5725-6—2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике
ГОСТ OIML R 76-1 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
Издание официальное
1
ГОСТ Р 71137—2023
Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1 гидролиз: Расщепление исходного соединения на более простые в присутствии молекул воды.
3.2
ферментативный гидролиз: Гидролиз высокомолекулярных соединений под воздействием катализаторов белковой природы — гидролитических ферментов (гидролиз, класс 3).
[ГОСТ 31488—2012, пункт 3.2]
3.3
субстрат: Соединение или вещество, на которое воздействует данный фермент. [ГОСТ 31488—2012, пункт 3.3]
3.4 фосфатидилхолин 1-ацилгидролазы (фосфолипазы А^: Ферменты класса гидролаз, катализирующие отщепление SN-1 ацильных цепей фосфолипидов; код фермента в соответствии с международной классификацией — ЕС 3.1.1.32.
3.5 фосфатидилхолин 2-ацилгидролазы (фосфолипазы А2): Ферменты класса гидролаз, катализирующие отщепление SN-2 ацильных цепей фосфолипидов; код фермента в соответствии с международной классификацией — ЕС 3.1.1.4.
3.6 единица активности фосфолипазы (ILU, ME, U): Количество фермента, выраженное в миллиграммах и обеспечивающее высвобождение 1 мкмоль свободной жирной кислоты в течение 1 мин при заданных условиях.
3.7 удельная активность фосфолипазы, ILU/r(cM3) или U/г (см3): Количество единиц активности в 1 г сухого порошка фосфолипазы или в 1 мл ферментного препарата.
4 Сущность метода
Метод основан на гидролизе лецитина фосфолипазой А1 или А2 или их ферментными препаратами в присутствии ионов Са2+ в течение заданного периода времени с последующей остановкой реакции этиловым спиртом и на определении полученных свободных жирных кислот (СЖК) титриметрическим (потенциометрическим) методом.
Примечание — Активность фермента является относительной характеристикой, свойственной ферменту в конкретных условиях проведения измерения (температура, pH, тип субстрата и эмульгатора).
Активность фермента, измеренная согласно данному методу, может быть использована для сравнения только с активностью других ферментов, измеренной аналогично.
Активности ферментов, подлежащие сравнению, должны быть измерены в строго идентичных условиях. Неточное соблюдение условий измерения, указанных в настоящем стандарте, их изменение, замена реактивов и/или использование реактивов с чистотой ниже указанной может привести к получению невоспроизводимых или недостоверных результатов сравнения.
2
ГОСТ Р 71137—2023
5 Условия проведения измерений
При выполнении измерений соблюдают следующие условия: температура воздуха (20 ± 5) °C, относительная влажность — не более 80 % (условия измерений должны соответствовать требованиям, изложенным в паспортах или иных документах на используемые оборудование и материалы).
6 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы
6.1 Средства измерений
Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 с пределами допускаемой абсолютной погрешности ±0,001 г.
Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 с пределами допускаемой абсолютной погрешности ±0,01 г.
Секундомер механический 2-го класса точности.
Титратор автоматический с процессором, дозирующим устройством (бюреткой) вместимостью 10 или 20 см3 и мешалкой. Если используют другое устройство, то процедура должна быть адаптирована для соответствующего устройства. Устройство должно осуществлять динамическое титрование (быстрое в начале, медленное вблизи конечной точки), что необходимо для минимизации времени титрования при достижении режима медленного титрования вблизи конечной точки.
pH-электрод для водного титрования для прямого измерения pH в диапазоне от 0 до 14 ед.
Дозаторы одноканальные переменной вместимости от 0,1 до 1,0 см3, от 0,5 до 5,0 см3 и/или микродозаторы с переменным объемом от 0,1 до 1,0 см3 и от 0,5 до 5,0 см3.
Цилиндры мерные любого исполнения и объема сценой наименьшего деления 1 см3 по ГОСТ 1770.
Колбы мерные наливные любого исполнения, вместимостью 25, 500, 1000 см3, любого класса точности по ГОСТ 1770.
6.2 Реактивы и материалы
Спирт этиловый 96 %-ный по ГОСТ 5962.
Гексан, х. ч., с содержанием основного вещества не менее 99 %.
Лецитин обезжиренный соевый или подсолнечный (содержание ацетоннерастворимых веществ не менее 95 %).
Тритон Х-100 с содержанием основного вещества не менее 95 %.
Кальций хлористый с содержанием основного вещества не менее 96,5 % по ГОСТ 450.
Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный (NaH2PO4 • 2Н2О) по ГОСТ 245.
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный (Na2HPO4 • 12Н2О) по ГОСТ 4172.
Раствор натрия гидроксида молярной концентрации 0,05 моль/дм3 (0,05 н), приготовленный с использованием гидроокиси натрия по ГОСТ 4328 или фиксанала.
Раствор натрия гидроксида молярной концентрации 0,1 моль/дм3 (0,1 н), приготовленный с использованием гидроокиси натрия по ГОСТ 4328 или фиксанала.
Раствор гидроокиси натрия молярной концентрации 1 моль/дм3 (1 н), приготовленный с использованием гидроокиси натрия по ГОСТ 4328.
Кислота ледяная уксусная по ГОСТ 61.
Раствор ледяной уксусной кислоты концентрации 6 г/дм3, приготовленный с использованием ледяной уксусной кислоты по ГОСТ 61.
Натрий уксуснокислый 3-водный по ГОСТ 199.
Растворы буферные калибровочные (не менее трех), позволяющие провести калибровку электрода в диапазоне проведения измерений таким образом, чтобы все измеряемые значения pH находились между нижней и верхней точками калибровочных значений. Буферные растворы готовят из стандарт-титров по ГОСТ 8.135—2004 (пункт 3.4) с погрешностью ±0,03 pH или согласно рекомендациям изготовителя.
Дистиллированная вода по ГОСТ Р 58144.
3
ГОСТ Р 71137—2023
6.3 Вспомогательное оборудование
Мешалка магнитная с магнитным вкладышем для перемешивания с термоплитой или водяная баня любого типа, оборудованная магнитным перемешивающим устройством, которая обеспечивает поддержание температуры в диапазоне 35 °C—50 °C с точностью до 1 °C.
Стаканы стеклянные по ГОСТ 25336 или пластиковые любого типа и исполнения вместимостью 250 и 1000 см3.
Колбы типа Кн любого исполнения вместимостью 100, 250, 500 см3 по ГОСТ 25336.
Стаканы для титрования вместимостью до 100 см3 или колбы типа Кн любого исполнения вместимостью 100 см3 по ГОСТ 25336.
Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования и посуды, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов, по качеству не ниже указанных.
7 Подготовка к анализу
7.1 Подготовка автоматического титратора к работе
Автоматический титратор готовят к работе и проверяют правильность измерений pH в соответствии с руководством по эксплуатации. Проводят градуировку электрода в соответствии с руководством по эксплуатации с использованием буферных калибровочных растворов непосредственно в день анализа.
После каждого измерения электрод промывают сначала в гексане, затем в дистиллированной воде.
7.2 Приготовление раствора гидроокиси натрия молярной концентрации 1 моль/дм3
Раствор готовят в мерной колбе 2—1000—2 путем внесения (40,00 ± 0,01) г гидроокиси натрия по ГОСТ 4328, добавления 500 см3 дистиллированной воды, перемешивания до полного растворения и последующего доведения раствора водой до метки. Раствор хранят в закрытой емкости в течение 1 мес в холодильнике при температуре (4 ± 2) °C.
7.3 Приготовление раствора гидроокиси натрия молярной концентрации 0,1 моль/дм3
Раствор готовят в мерной колбе 2—1000—2 путем внесения (4,00 ± 0,01) г гидроокиси натрия по ГОСТ 4328, добавления 500 см3 дистиллированной воды, перемешивания до полного растворения и последующего доведения раствора водой до метки. Раствор хранят в закрытой емкости в течение 2 нед в холодильнике при температуре (4 ± 2) °C.
Примечание — Допускается использование стандарт-титра для изготовления данного раствора.
7.4 Приготовление раствора гидроксида натрия молярной концентрации 0,05 моль/дм3
Раствор готовят в мерной колбе вместимостью 500 или 1000 см3 путем двукратного разбавления раствора гидроокиси натрия молярной концентрации 0,1 моль/дм3. Раствор хранят в закрытой емкости в течение 2 нед в холодильнике при температуре (4 ± 2) °C. Титр приготовленного раствора устанавливают по ГОСТ 25794.1 непосредственно перед анализом.
7.5 Приготовление раствора ледяной уксусной кислоты концентрации 6 г/дм3
Раствор готовят в мерной колбе 2—1000—2 путем внесения 5,71 см3 ледяной уксусной кислоты по ГОСТ 61, прибавления 500 см3 дистиллированной воды, перемешивания и доведения раствора до метки. Раствор хранят в закрытой емкости в течение 1 мес в холодильнике при температуре (4 ± 2) °C.
7.6 Приготовление буферного раствора с заданным значением pH
Готовят буферный раствор заданного значения pH, соответствующего оптимальному pH фосфолипазы. Если оптимальный pH фосфолипазы является промежуточным по отношению к приведенным растворам, готовят раствор с более низким pH по одному из способов, приведенных в 7.6.1—7.6.4, и 4
ГОСТ Р 71137—2023
доводят значение pH до необходимого с помощью раствора гидроокиси натрия молярной концентрации 0,1 моль/дм3 или раствора гидроокиси натрия молярной концентрации 1 моль/дм3.
Примечание — pH приготовленного раствора следует проверить с использованием калиброванного электрода титратора. Если измеренный pH полученного раствора не соответствует ожидаемому, доводят значение pH до необходимого с помощью раствора гидроокиси натрия молярной концентрации 0,1 моль/дм3 или раствора гидроокиси натрия молярной концентрации 1 моль/дм3.
7.6.1 Приготовление 50 мМ натрий-ацетатного буферного раствора с pH 4,0 или pH 5,0
В стакан вместимостью 1000 см3 помещают 6,82 г 3-водного ацетата натрия (CH3COONa • ЗН2О), добавляют 500 см3 дистиллированной воды, перемешивают. Раствор доводят до нужного pH концентрированной ледяной уксусной кислотой или раствором ледяной уксусной кислоты с концентрацией 6 г/дм3 или раствором гидроокиси натрия молярной концентрации 1 моль/дм3, затем разбавляют водой до 1000 см3 и повторно перемешивают. Буферный раствор хранят в закрытой емкости в течение 3 нед в холодильнике при температуре (4 ± 2) °C.
7.6.2 Приготовление 50 мМ натрий-фосфатного буферного раствора с pH 6,0
В стакан вместимостью 1000 см3 помещают 7,50 г 2-водного фосфорнокислого однозамещенного натрия (NaH2PO4 • 2Н2О) и 0,70 г 12-водного фосфорнокислого двузамещенного натрия (Na2HPO4 • 12Н2О), добавляют 500 см3 дистиллированной воды, перемешивают, затем разбавляют водой до 1000 см3 и повторно перемешивают. Раствор хранят в закрытой емкости в течение 3 нед в холодильнике при температуре (4 ± 2) °C.
7.6.3 Приготовление 50 мМ натрий-фосфатного буферного раствора с pH 7,0
В стакан вместимостью 1000 см3 помещают 3,90 г 2-водного фосфорнокислого однозамещенного натрия (NaH2PO4 • 2Н2О) и 8,95 г 12-водного фосфорнокислого двузамещенного натрия (Na2HPO4 • 12Н2О), добавляют 500 см3 дистиллированной воды, перемешивают, затем разбавляют водой до 1000 см3 и повторно перемешивают. Раствор хранят в закрытой емкости в течение 3 нед в холодильнике при температуре (4 ± 2) °C.
7.6.4 Приготовление 50 мМ натрий-фосфатного буферного раствора с pH 8,0
В стакан вместимостью 1000 см3 помещают 0,41 г 2-водного фосфорнокислого однозамещенного натрия (NaH2PO4 • 2Н2О) и 16,97 г 12-водного фосфорнокислого двузамещенного натрия (Na2HPO4 • 12Н2О), добавляют 500 см3 дистиллированной воды, перемешивают, затем разбавляют водой до 1000 см3 и повторно перемешивают. Раствор хранят в закрытой емкости в холодильнике при температуре (4 ± 2) °C в течение 3 нед.
7.7 Приготовление эмульсии лецитина
На весах в химический стакан или коническую колбу объемом 250 см3 вносят (5,00 ± 0,01) г лецитина, (5,00 ± 0,01) г тритона Х-100 и 0,05 г хлористого кальция. С помощью цилиндра доводят массу раствора до объема (100 ± 0,01) г буфером с оптимальным для конкретной фосфолипазы pH. Смесь перемешивают на магнитной мешалке до однородного состояния со скоростью, позволяющей избежать чрезмерного образования пены.
После этого в коническую колбу объемом 100 см3 с помощью мерного цилиндра вносят 55 см3 полученной эмульсии и помещают на магнитную мешалку. Скорость устанавливают таким образом, чтобы избежать чрезмерного образования пены. Перемешивание осуществляют вплоть до начала анализа.
Примечания
1 Объемы и навески приведены из расчета на проведение одного измерения. Перед началом исследования необходимо определить количество проб, которые должны быть проанализированы вдень исследования, и исходя из него скорректировать объем итогового раствора таким образом, чтобы по окончании исследования оставалось около 50 мл эмульсии.
2 Эмульсию готовят и используют в день исследования. Полученный раствор хранению не подлежит.
3 Тип используемого субстрата оказывает влияние на относительную активность фосфолипазы. Если существует необходимость сравнить активности фосфолипаз А1 (фосфатидилхолин 1-ацилгидролаз) или А2 (фосфатидилхолин 2-ацилгидролаз) с использованием типа субстрата, отличного от предложенных лецитинов, анализ следует проводить с использованием этого типа субстрата. В данном случае при оформлении протокола анализа необходимо указать использованный тип субстрата.
5
ГОСТ Р 71137—2023
7.8 Приготовление раствора сухого фермента/ферментного препарата
В мерную колбу вместимостью 25 см3 вносят эквивалентное количество сухого порошка фосфолипазы или жидкого фермента/ферментного препарата, которое соответствует 625 U согласно паспорту фермента или другим имеющимся данным. Массу сухого порошка, мг, или аликвоту жидкого фермента, мм3, записывают, приливают 10 см3 буферного раствора с оптимальным для исследуемой фосфолипазы pH, приготовленного по 7.6, перемешивают, доводят до метки и повторно перемешивают. Приготовленный раствор используют либо сразу, либо помещают в холодильник для проведения анализа в течение дня. Раствор хранению не подлежит.
Примечания
1 Сухие и жидкие ферменты/ферментные препараты хранят согласно рекомендациям изготовителя.
2 При необходимости допускается использование других концентраций раствора для титрования с обязательным определением титра приготовленного раствора.
8 Отбор проб
Отбор проб проводят по ГОСТ Р 57248.
9 Проведение анализа
В семь стаканов для титрования или колб типа Кн вместимостью до 100 см3 вносят по 10 см3 96 %-ного этанола.
Примечание — Этанол применяют для ингибирования фосфолипазы. Семь стаканов для титрования или колб используют в качестве шести проб, характеризующих строго определенное время взаимодействия системы фермент — субстрат и одной контрольной пробы (пробы без добавления фермента).
Коническую колбу вместимостью 100 см3 с 55 см3 эмульсии, приготовленной по 7.7, преинкубиру-ют на водяной бане при температуре, оптимальной для исследуемой фосфолипазы с точностью ±1 °C в течение 15 мин с постоянным активным магнитным перемешиванием.
По истечении этого времени, не выключая перемешивания, из колбы отбирают 5 см3 субстрата, не подвергавшегося фосфолиполизу, переносят в коническую колбу или стакан для титрования (контрольная проба) с этанолом и перемешивают. Затем в колбу с оставшимся субстратом вносят 1 см3 раствора фермента, приготовленного по 7.8, для инициации фосфолиполиза и включают секундомер.
Ровно через 3, 5, 10, 15, 20 и 25 мин переносят по 5 см3 раствора фермента и эмульсии в шесть соответствующих титровальных стаканов или колб с ингибитором и незамедлительно активно перемешивают. Во все семь стаканов или колб (шесть точек и одна контрольная проба) добавляют одинаковое количество дистиллированной воды таким образом, чтобы обеспечить достаточное погружение электрода для его правильной работы.
Примечание — Возможно уменьшение интервала отбора смеси фермента и эмульсии для последующего ингибирования до 1 мин при необходимости экономии времени, если указана та концентрация раствора фермента, которая позволяет добиться графика, аналогичного приведенному в 10.2.
Образцы титруют последовательно раствором гидроксида натрия с молярной концентрацией 0,05 моль/дм3 до регистрации точки эквивалентности (момента изменения потенциала, соответствующего максимуму производной). Объемы титранта, пошедшего на титрование, записывают.
Примечание — Перед титрованием допускается внесение указанного объема титранта ко всем пробам, например при использовании буферного раствора pH ниже 7,0.
10 Обработка результатов
10.1 Содержание свободных жирных кислот Сп, образовавшихся в процессе взаимодействия фермента и субстрата, мкмоль/см3 эмульсии, вычисляют по формуле
r _(V„-Vl) N-1000 (1)
6
ГОСТ Р 71137—2023
где Vn — объем NaOH, пошедший на титрование проб, содержащих инактивированный фермент, см3;
\/1 — объем NaOH, пошедший на титрование холостой пробы, см3;
N— измеренная нормальность используемого титранта NaOH (около 0,05 н);
1000 — коэффициент пересчета для перевода размерности из кубических дециметров, дм3, в кубические сантиметры, см3;
5 — объем эмульсии в пробе, см3.
Примечание — Тип используемого оборудования, реактивы и опыт оператора могут оказывать влияние на конечный результат. Поэтому при необходимости проведения сравнительных анализов различных фосфолипаз А1 (фосфатидилхолин 1-ацилгидролаз) и А2 (фосфатидилхолин 2-ацилгидролаз) и ферментных препаратов, содержащих указанные активности, эти анализы следует проводить строго в условиях повторяемости.
10.2 Предварительный контроль полученных результатов проводят путем построения графика зависимости содержания высвободившихся жирных кислот, мкмоль/см3, пробы от времени, мин, взаимодействия фермента с субстратом, который должен иметь следующий вид (см. рисунок 1)1\
Рисунок 1 — Общий вид графика нарастания содержания свободных жирных кислот в зависимости от времени взаимодействия фермента с субстратом (нарастающая кривая с логарифмическим ускорением до точки перегиба с дальнейшим выходом на плато)
Примечание — Если при построении графика его вид не соответствует представленному на рисунке 1, то проводят повторный анализ с использованием большей или меньшей концентрации фермента в растворе, приготовленном по 7.8. В частности, вид графика, близкий к линейному, может свидетельствовать о недостаточной концентрации фермента.
10.3 Полученные значения времени и содержания СЖК преобразуют путем вычисления двойных обратных координат (замене полученных значений на обратные):
*П=А (2)
где Хп —значения, обратные интервалам времени, мин-1;
tn — временной интервал, мин;
Yn — значения, обратные концентрациям свободных жирных кислот см3/мкмоль пробы.
О График может быть построен с использованием подходящего программного обеспечения (например, пакета программ Microsoft Excel или аналогичного).
7
ГОСТ Р 71137—2023
По полученным значениям строят линейный график зависимости Yn от Хп, вычисляют его формулу и квадрат коэффициента корреляции R2, который должен быть не менее 0,98, как показано на рисунке 21\
Рисунок 2 — Зависимость содержания свободных жирных кислот, мкмоль/см3, пробы от времени, мин, взаимодействия фермента с субстратом в обратных координатах
Примечания
1 Более высокая или более низкая активность фермента относительно ожидаемой, как правило, приводит к отклонению графика от линейности. В этом случае для более точных результатов следует провести повторный анализ с использованием более разбавленного или концентрированного фермента по процедуре, описанной в 7.8.
2 Ручное перемешивание в процессе инкубирования системы фермент — субстрат и/или другие отклонения от описанной процедуры анализа могут приводить к получению нетипичных графиков и затруднять получение линии тренда с заданным коэффициентом корреляции.
10.4 Гидролитическую активность фосфолипазы U, мкмоль/(см3 эмульсии • мин), при оптимальных условиях вычисляют по формуле
где а — коэффициент перед х линейного графика зависимости Yn от Хп.
10.5 Удельную активность фосфолипазы или ферментного препарата фосфолипазы Дуд, U/r (см3), или мкмоль/(мин • г белка), или мкмоль/(мин • см3 раствора фермента), определяют как количество единиц активности в 1 г сухого порошка фосфолипазы или в 1 см3 раствора фермента и вычисляют по формуле
££М.1ООО1 (5)
у т
где U — гидролитическая активность фосфолипазы, полученная по 10.4, мкмоль/(см3 эмульсии • мин);
50 — объем использованного субстрата эмульсии, см3;
b — добавленный к реакционной смеси объем приготовленного по 7.8 раствора фермента, см3;
т — масса навески сухого фермента или объем ферментного препарата в 1 см3 раствора, приготовленного по 7.8, мг (мм3);
1000 — коэффициент переведения размерности из миллиграммов, мг, в граммы, г (или из кубических миллиметров, мм3, в кубические сантиметры, см3).
Примечания
1 т вычисляют путем деления навески сухого порошка фосфолипазы или отобранного объема ферментного препарата на объем мерной колбы, равный 25. Значение корректируют соответственно, если использовали более разбавленный или концентрированный раствор.
2 Возможно выражение удельной активности в пересчете на миллиграмм белка, если установлено его содержание в сухом ферменте или ферментном препарате. В этом случае вместо т необходимо привести указанное
1> График может быть построен с использованием подходящего программного обеспечения (например, пакета программ Microsoft Excel или аналогичного).
8
ГОСТ Р 71137—2023
содержание белка. При этом при оформлении протокола анализа обязательно следует указать единицы измерения и что использовали в качестве знаменателя (массу навески препарата или массу белка в нем).
За окончательный результат измерений фосфолипазной активности или удельной активности фосфолипазы принимают среднеарифметическое двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости.
11 Контроль точности результатов измерений
11.1 Повторяемость
Расхождение между результатами двух независимых единичных определений, выполненных на идентичном испытуемом материале, в одной лаборатории, одним оператором, на одном оборудовании за короткий промежуток времени, не должно превышать 28,7 % среднеарифметического значения результатов анализа при доверительной вероятности 0,95.
11.2 Воспроизводимость
Расхождение между результатами двух единичных определений, выполненных одним методом, на идентичном испытуемом материале, в разных лабораториях, разными аналитиками, на различном оборудовании, не должно превышать 43,1 % при доверительной вероятности 0,95.
11.3 Точность
Правильность и точность настоящего метода устанавливают в каждой отдельно взятой лаборатории с использованием любого коммерчески доступного образца фермента (контрольная проба или стандартный образец лаборатории). Оценку необходимо проводить в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-6—2002 (раздел 6).
9
ГОСТ Р 71137—2023
УДК 577.15:543.06:006.354
ОКС 07.100.30
Ключевые слова: ферментные препараты, фосфолипаза А^ фосфатидилхолин 1-ацилгидролаза, фосфолипаза А2, фосфатидилхолин 2-ацилгидролаза, ферментативный гидролиз, субстрат, свободные жирные кислоты
10
Редактор Л. С. Зимилова
Технический редактор В.Н. Прусакова
Корректор М.И. Першина
Компьютерная верстка А.Н. Золотаревой
Сдано в набор 14.12.2023. Подписано в печать 22.12.2023. Формат 60x84%. Гарнитура Ариал.
Усл. печ. л. 1,86. Уч.-изд. л. 1,68.
Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта
Создано в единичном исполнении в ФГБУ «Институт стандартизации» , 117418 Москва, Нахимовский пр-т, д. 31, к. 2.
