allgosts.ru07. МАТЕМАТИКА. ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ07.100. Микробиология

ГОСТ Р 54330-2011 Ферментные препараты для пищевой промышленности. Методы определения амилолитической активности

Обозначение:
ГОСТ Р 54330-2011
Наименование:
Ферментные препараты для пищевой промышленности. Методы определения амилолитической активности
Статус:
Действует
Дата введения:
01/01/2013
Дата отмены:
-
Заменен на:
-
Код ОКС:
07.100.30

Текст ГОСТ Р 54330-2011 Ферментные препараты для пищевой промышленности. Методы определения амилолитической активности



ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ


ГОСТР

54330-

2011


НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИ ЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Методы определения амилолитической активности

Издание официальное

Москва

Стандарта кформ 2012


Предисловие

Цели и принципы стандартизации е Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0—2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения»

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением всероссийским научно-исследовательским институтом пищевой биотехнологии Россельхозакадемии {ГНУ ВНИИПБТ Росссельхозакаде-мии)

2    ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 176 «Спиртовая, дрожжевая и ликероводочная продукция»

3    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН в ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 15 июня 2011 г. N9128-ст

4    ВВЕДЕН 8ПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется е ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ. 2012

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

Содержание

4    Метод определения амилолитической активности ферментных препаратов — источников

Поправка к ГОСТ Р 54330—2011 Ферментные препараты для пище вой промышленности. Методы определения амилолитической активности

В каком месте

Напечатано Должно быть

Наименование стандарта на английском языке

Enzyme preparations. Methods for Enzyme preparations for food industry, determination of amylase activity Methods for determi nation of amylase

activity

(ИУСМвЭ 2015 г.)

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ Методы определения амилолитической активности Епгуте preparations. Methods (or determination of amytase activity

Дата введения — 2013—01—01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на ферментные препараты и ферментсодержащие смеси (источники а-амилазы и глюкоамипаэы с использованием в качестве субстрата крахмал), используемые в пищевой промышленности, и устанавливает методы определения амилолитической активности.

Установленные в настоящем стандарте методы могут быть использованы для определения актив* костей «-амилазы (амилолитическая) в диапазоне значений от 0 до 100000 ед. АС/г и глюкоамилазы (глюкоамилазная) в диапазоне значений от 0 до 100000 ед. ГлСУг.

примечания

1    Амилолитическую активность исследуемых ферментных препаратов (ФП) обеспечивают ферменты, «•амилаза и глюкоамилаза, катализирующие гидролиз крахмала.

2    Системные названия ферментов:

•    и-1.4-гпюквн-4-глюканогидролаза (ЕС 3.2.1.1) [1] — «-амилаза — фермент с андогенным механизмом действия. катализирующий гидролиз и-1.4-гликозидных связей крахмала с образованием «-декстринов, олигосахаридов и мальтозы:

•    »-1.4-глюквн-глюкогидролвза (ЕС 3.2.1.3) (1| — глюковмилвза — фермент с акзогенным механизмом действия. катализирующий гидролиз «-1.4 и «-1.6-гликозидных связей крвхмвла. декстринов, олигосахаридов, последовательно отщепляя при атом остатки молекулы глюкозы от нередуцирующих концов субстрате с образованием глюкозы.

2 Нормативные ссылки

8 настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р ИСО 5725-1—2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ Р ИСО 5725-2—2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

ГОСТ 61—75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия ГОСТ 83—79 Реактивы. Натрий углекислый. Технические условия ГОСТ 199—78 Реактивы. Натрий уксуснокислый 3-еодный. Технические условия ГОСТ 1770—74 (ИСО 1042—83. ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры. мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118—77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия ГОСТ 4159—79 Реактивы. Йод. Технические условия

ГОСТ 4172—76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-еодный. Технические условия

Издание официальное 4198—75 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия 4201—79 Реактивы. Натрий углекислый кислый. Технические условия 4204—77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ

гост гост гост гост гост гост гост гост гост гост гост гост гост гост и размеры ГОСТ испытаний


4207—75 Реактивы. Калий железистосинеродистый 3-водный. Технические условия

4232—74 Реактивы. Калий йодистый. Технические условия

5845—79 Реактивы. Калий-натрий виннокислый 4-еодный. Технические условия

6038—72 Реактивы. D-глюкоза. Технические условия

6709—72 Вода дистиллированная. Технические условия

10163—76 Реактивы. Крахмал растворимый. Технические условия

12026—76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

13867—68 Продукты химические. Обозначения чистоты

18481—81 Ареометры и цилиндры стеклянные. Общие технические условия

20264.0—74 Препараты ферментные. Правила приемки и методы отбора проб

24363—80 Реактивы. Калий гидроокись. Технические условия

25336—82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры 28498—90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы

ГОСТ 29227—91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования—на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями:

3.1    гидролиз: Расщепление исходного соединения на более простые в присутствии молекул воды.

3.2    ферментативный гидролиз: Расщепление высокомолекулярных соединений при участии катализаторов белковой природы — гидролитических ферментов.

3.3    субстрат: Соединение или вещество, на которое воздействует данный фермент.

3.4    крахмал: Высокомолекулярный полисахарид, е котором остатки глюкозы соединены а-глико-эидными связями, состоящий из амилозы и амилопектина.

3.5    прогидролизованный крахмал: Крахмал, подвергнутый действию амилолитичесхих ферментов. различной степени деструкции в зависимости от активности фермента.

3.6    системные названия ферментов: Названия, указывающие природу химической реакции, катализируемой данным ферментом, в соответствии с современной классификацией (КФ), принятой Международной комиссией по ферментам.

3.7    амилолитический комплекс: u-амилазы микробного происхождения, катализирующие гидролиз крахмала, продуцентами которых являются бактерии и мицелиальные грибы.

3.8    бактериальные а-амилазы: Ферменты, которые катализируют гидролиз крахмала до декстринов различной степени полимеризации.

Примечание — Оптимум действия ывэофильных u-амилаз проявляется при температуре 60 X—70 *С; термосгвбильных а-амилаз — при температуре более 60 *С.

3.9    грибные а-амилазы: Ферменты, которые катализируют расщепление субстрата с более глубокой степенью гидролиза, чем бактериальные: при этом образуются как низкомолекулярные декстрины, так и мальтоза и глюкоза.

3.10    Ферментативная активность: Количество фермента, катализирующее гидролиз 1 мкмоля субстрата в определенных условиях.

4 Метод определения амилолитической активности ферментных
препаратов — источников а-амилазы (АС)

4.1    Сущность метода

4.1.1    Метод основан на количественном определении прогидролизованного крахмала в результате его гидролиза ферментами амилолитичесхого комплекса до декстринов различной молекулярной массы в стандартных условиях (температура 30 *С. значение pH 6.0 — для бактериальных и 4.7 — для грибных а-амилаз. продолжительность гидролиза 10 мин).

4.1.2    За единицу амилолитической активности (АС) принято такое количество фермента, которое при определенных значениях pH (6.0 — для бактериальных и 4.7 — для грибных н-амилаэ) и температуре 30 *С за 1 мин катализирует гидролиз 1 г крахмала до декстринов различной молекулярной массы, что составляет 30 % крахмала, введенного в реакцию. Активность выражается в ед. АС/г (для порошкообразного) или в ед. АС/см (для жидкого) анализируемого ферментного препарата.

4.1.3    Количество прогидролизованного крахмала определяется колориметрическим методом по степени окраски остаточного крахмала раствором йода.

4.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы, материалы

4.2.1 Для определения амилолитической активности используют следующие средства измерений. вспомогательное оборудование, посуду, реактивы, материалы:

•    весы лабораторные с пределом наибольшей допускаемой погрешности однократного взвешивания 10,15 мг,

•    фотоэлектроколориметр (ФЭК) или спектрофотометр любого типа, обеспечивающий измерения в диапазонах длин волн от 440 до 450 нм и от 660 до 670 нм с погрешностью измерения коэффициента пропускания не более 1 % в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм:

•    рн-метр любого типа для измерения в диапазоне pH от 0 до 14 с пределом допускаемой погрешности в эксплуатации ± 0.1 единицы pH;

•    холодильник бытовой;

•    мешалку магнитную любой марки, которая обеспечивает скорость вращения до 800 мин- ’;

•    ультратермостат или водяной термостат с точностью регулирования температуры ± 1 вС;

•    баню водяную любого типа, которая обеспечивает поддержание температуры (100 ± 1) *С с точностью регулирования температуры ± 1 °С;

•    секундомер с емкостью шкалы счетчика 1 мин. ценой деления 1 с и погрешностью ± 1.5 с;

•    пипетки автоматические емкостью от 0.1 до 1.0 см и от 0.2 до 5.0 см с наконечниками:

•    встряхиватель V-3 типа Вортекс или аналогичный для перемешивания жидкости со скоростью вращения от 50 до 3400 об./мин;

•    термометры ртутные стеклянные лабораторные от 0 вС до 50 *С и от 0 вС до 100 ‘’С с ценой деления шкалы 0.5 вС по ГОСТ 28498:

•    ареометры общего назначения по ГОСТ 18481;

•    стаканы и колбы стеклянные лабораторные В-1-150 ТС. В-1-800 ТС. Кн-1-100-14/23 ТС по ГОСТ 25336;

•    стаканчики для взвешивания (бюксы) СВ-19/9 по ГОСТ 25336;

•    воронки В-75-140 ХС по ГОСТ 25336;

-    пробирки П1-14-120 ХС или П1-16-150 ХС по ГОСТ 25336;

•    колбы мерные 1-25-2.1-50-2.1-100-2.1-200-2.1-250-2.2-1000-2 по ГОСТ 1770;

-    цилиндры 1-25-2.1-50-2.1-100-2. 1-250-2 по ГОСТ 1770;

•    пипетки стеклянные 1-2-2-1.1-2-2-2.1-2-2-5.1-2-2-10 по ГОСТ 29227;

•    бумагу фильтровальную лабораторную по ГОСТ 12026;

•    крахмал растворимый по ГОСТ 10163;

•    натрий уксуснокислый по ГОСТ 199;

•    кислоту уксусную по ГОСТ 61;

•    натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный по ГОСТ 4172;

•    калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198;

•    кислоту соляную по ГОСТ 3118;

•    йод кристаллический по ГОСТ 4159;

•    калий йодистый по ГОСТ 4232;

•    воду дистиллированную по ГОСТ 6709.

4.2.2    Все реактивы должны относиться к подгруппе чистоты 2 (х. ч.) или 3 {ч. д. а.).

4.2.3    Допускается применение средств измерений, вспомогательного оборудования с аналогия* ными метрологическими и техническими характеристиками, а также реактивов по качеству не хуже вышеуказанных.

4.3    Подготовка к анализу

4.3.1    Приготовление раствора крахмала с массовой долей 1,0 % (субстрат)

1.00 г крахмала в пересчете на абсолютно сухое вещество помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 25 см3 дистиллированной воды и перемешивают. Затем добавляют в колбу еще 25 смдистиллированной воды, помещают колбу в кипящую водяную баню не менее чем на 15—20 мин, непрерывно перемешивая содержимое до полного растворения крахмала. После этого содержимое колбы охлаждают, добавляют 10 см3 ацетатного буферного раствора с pH 4.7 по 4.3.2 (для препаратов грибного происхождения) или фосфатною буферного раствора с pH 6.0 по 4.3.3 (для препаратов бактериального происхождения), объем жидкости доводят до метки дистиллированной водой при температуре 20 *С и содержимое колбы перемешивают. Для полученного раствора крахмала характерна легкая опалесценция.

Раствор крахмала готовят в день проведения анализа.

4.3.2    Приготовление ацетатного буферного раствора молярной концентрации 1,0 моль/дмс pH 4,7 из растворов уксуснокислого натрия и уксусной кислоты

4.3.2.1    Приготовление раствора с (CH3COONa) молярной концентрации 1.0 моль/дм3 (раствор А)

В мерную колбу вместимостью 1 дм3 помещают (82.00 ±0.01) г (или (136,00 ± 0.01) г

CH3COONa ЗН20) безводного уксуснокислою натрия и растворяют приблизительно в 300 см3 дистиллированной воды. Затем доводят до метки дистиллированной водой при температуре 20 *С и перемешивают.

Срок хранения раствора в закрытой стеклянной посуде при температуре 4 “С — не более четырех недель.

4.3.2.2    Приготовление раствора с (СН3СООН) молярной концентрации 1,0 моль/дм3 (раствор Б)

В мерную колбу вместимостью 1 дм3 вносят 58 см3 ледяной уксусной кислоты, приливают около

300 см3 дистиллированной воды, доводят до метки дистиллированной водой при температуре 20 °С и снова перемешивают.

Срок хранения раствора в закрытой стеклянной посуде при температуре 4 *С — не более четырех недель.

4.3.2.3    Для приготовления ацетатного буферного раствора в колбе смешивают растворы уксуснокислого натрия (раствор А) и уксусной кислоты (раствор Б) в равных объемах, создавая значение pH смеси, равное 4.7. При необходимости доводят pH раствора до 4.7 одним из исходных растворов.

Срок хранения буферного раствора в закрытой стеклянной посуде при температуре 4 *С — не более четырех недель.

4.3.3    Приготовление фосфатного буферного раствора молярной концентрации 1/15 моль/дмс pH 6,0 из растворов натрия фосфорнокислого двузамещекного и калия фосфорнокислого одноза-мешенного

4.3.3.1    Приготовление раствора с (Na2HP04 12Н20) молярной концентрации 1/15 моль/дм3 (раствор А)

В мерную колбу вместимостью 1 дм3 помещают (23,8710.01) г натрия фосфорнокислого двузаме-щенного. содержащего 12 молекул воды, растворяют в 300 см3 дистиллированной воды и доводят объем до метки дистиллированной водой при температуре 20 *С

4.3.3.2    Приготовление раствора с (КН2Р04) молярной концентрации 1/15 моль/дм3 (раствор Б)

В мерную колбу вместимостью 1 дм3 помещают (9,087 1 0,001) г калия фосфорнокислого одноза-мощенного, растворяют в 300 см3 дистиллированной воды и доводят объем до метки дистиллированной водой при температуре 20 *С.

4.3.3.3    Для приготовления фосфатного буферного раствора молярной концентрации 1/15 моль/дм3 с pH 6,0 растворы А и Б смешивают в соотношении 1:9.

Величину pH проверяют на pH-метре. В случае отклонения pH фосфатного буферного раствора от

6.0 его доводят до нужного значения раствором А или Б.

Срок хранения буферного раствора в закрытой стеклянной посуде при температуре 4 *С — не более четырех недель.

4.3.4    Приготовление соляной кислоты с (HCI) молярной концентрации 0,2 моль/дм3

16.4    см3 концентрированной соляной кислоты наливают в мерную колбу вместимостью 1 дм3 и доводят объем до метки при температуре 20 *С дистиллированной водой.

4.3.5 Приготовление раствора йода

4.3.5.1    Приготовление основного раствора йода

(0.5010,01} г йода и (5.0010.01) г йодистого калия растворяют в стаканчике для взвешивания с притертой пробкой в небольшом количестве воды. Содержимое перемешивают на магнитной мешалке при плотно закрытой крышке бюкса.

Раствор после полного растворения йода переносят количественно в мерную колбу с притертой крышкой вместимостью 200 см3 и объем доводят дистиллированной водой при температуре 20 *С до метки.

Раствор йода хранят в склянке из темного стекла с притертой пробкой — не более 1 мес.

4.3.5.2    Приготовление рабочего раствора йода

20 см3 основного раствора йода (см. 4.3.5.1) разводят раствором соляной кислоты (см. 4.3.4) мо-лярной концентрации ОД моль/дм3 при анализе препаратов грибного и бактериального происхождения в меркой колбе объемом 1 дм3.

Перед употреблением рабочего раствора проверяют его оптическую плотность на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре в диапазоне длин световых волн к - 440—450 нм в кюветах с толщи-кой поглощающего свет слоя 10 мм. Оптическая плотность рабочего раствора йода, измеренная в сравнении с дистиллированной водой, должна иметь значение 0,2210,01. В случае отклонения от этого значения добавляют раствор соляной кислоты молярной концентрации 0.2 моль/дм3 или основного раствора йода до достижения нужной величины оптической плотности.

4.4    Подготовка пробы

4.4.1    Отбор проб — по ГОСТ 20264.0.

Анализируемые пробы ферментных препаратов в форме порошка или жидком виде используют без предварительной подготовки.

4.4.2    Приготовление основного раствора анализируемой пробы ферментного препарата

8 стаканчик для взвешивания помещают 0.100 г порошкообразного ферментного препарата или

1,00 г жидкого ферментного препарата и суспендируют в небольшом количестве дистиллированной воды. Суспензию количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят объем до метки дистиллированной водой при температуре 20 ®С и тщательно перемешивают.

4.4.3    Приготовление рабочего раствора анализируемой пробы ферментного препарата

Рабочий раствор анализируемого ферментного препарата готовят из основного раствора по 4.4.2

путем дальнейшего разведения его в дистиллированной воде таким образом, чтобы при определении активности коэффициент С (см. 4.6.1). характеризующий степень гидролиза крахмала, находился в пределах 0,02—0.07.

Каждую пробу анализируют два раза в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-1 и ГОСТ Р ИСО 5725-2.

Раствор готовят в день определения. Длительность использования рабочего раствора ферментного препарата не должна превышать 1 ч с момента приготовления во избежание потерь его ферментативной активности.

4.5    Проведение анализа

4.5.1    В две пробирки размером 18 к 200 мм вносят по 10 см3 субстрата 1 %-ного раствора крахмала по 4.3.1. Содержимое пробирок прогревают в ультратермостате при температуре (30,011.0) X в течение 5 мин.

4.5.2    В две пробирки с субстратом добавляют по 5,0 см3 рабочего раствора анализируемой пробы ферментного препарата по 4.4.3. предварительно прогретого при температуре 30 ®С. тщательно перемешивают и включают секундомер, отмечая начало ферментативной реакции. Реакционную смесь инкубируют при температуре (30.0 ± 1,0) вС в течение 10 мин (с точностью, определяемой по секундомеру от начала ферментативной реакции).

4.5.3    По окончании реакции отбирают 0.5 см3 инкубационной смеси и вносят в колбу с 50 см3 рабочего раствора йода по 4.3.5.2. Содержимое колбы перемешивают и измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколоримегре или спектрофотометре при длине световой волны ). = 670 нм в кюветах при толщине поглощающего свет слоя 10 мм в сравнении с дистиллированной водой, получая значение оптической плотности Ог (см. 4.6.1).

4.5.4    В качестве контроля используют 1 %-ный раствор крахмала объемом 10 см3, в который вместо раствора анализируемого фермента добавляют 5,0 см3 дистиллированной воды. Полученную смесь прогревают при температуре 30 *С в течение 10 мин. Затем все дальнейшие действия проводят аналогично 4.5.3. получая значение оптической плотности D, (см. 4.6.1).

4.5.5 После добавления к рабочему раствору йода инкубационной смеси раствор приобретает фиолетовую окраску различной интенсивности в зависимости от количества нелрогидролизованного крахмала; цвет контрольного раствора — синий.

4.6 Обработка результатов

4.6.1 Степень гидролиза крахмала С определяют по разности оптической плотности контрольного раствора (см. 4.5.4) и анализируемого раствора (см. 4.5.3). С вычисляют по формуле

С =


Pi-Da

о.

0.1.

(1)


где D, — оптическая плотность контрольного раствора;

D2 — оптическая плотность анализируемого раствора;

0.1 — масса крахмала, взятого на анализ (см. 4.5.1). г.

Если коэффициент С. характеризующий степень гидролиза крахмала, меньше 0.02 или больше 0,07. то анализ повторяют, подбирая другое разведение анализируемой пробы так. чтобы раствор содержал большее или меньшее количество фермента соответственно.

4.6.2 Расчет амилолитической активности в анализируемой пробе

4.6.2.1 Расчет амилолитической активности в анализируемом препарате бактериального происхождения

а) Амилолитическую активность препаратов бактериальной меэофильной а-амилазы (ДС^). ед. АС/г (для порошкообразного препарата) или ед. АС/смэ (для жидкого препарата), рассчитывают по формуле

(2)


5.885 С - ОД017 АСЫ =-d.

где 5,865; 0.0017 — коэффициенты расчетного уравнения, полученные при математической обработке экспериментальных данных зависимости массы прогидролизованного крахмала от массы фермента, взятого для анализа, в пересчете на 1 ч действия фермента:

С — коэффициент, характеризующий степень гидролиза крахмала (см. 4.6.1); п— масса ферментного препарата с учетом разведения по 4.4.3. взятая для испытания. г;

d — плотность ферментного препарата по ГОСТ 18481 (для жидкого препарата), г/см3, б) Амилолитическую активность для препаратов бактериальной термостабильной и-амилазы (АС61), ед. АС/г (для порошкообразного препарата) или ед. АС/смэ (для жидкого препарата), рассчитывают по формуле

6.6136 С -0Д192

АСй, --d.    (3)

л

где 6.6138: 0.0192 — коэффициенты расчетного уравнения, полученные при математической обработке экспериментальных данных зависимости массы прогидролизованного крахмала от массы фермента, взятого для анализа, в пересчете на 1 ч действия фермента:

С — коэффициент, характеризующий степень гидролиза крахмала (см. 4.6.1);

п — масса ферментного препарата с учетом разведения по 4.4.3. взятая для испытания, г;

d — плотность ферментного препарата по ГОСТ 18481 (для жидкого препарата), г/смэ.

4.6.2.2 Расчет амилолитической активности в анализируемом препарате грибной а-амилаэы Амилолитическую активность для препаратов грибной а-амилазы (АСГ). ед. АС/г (для порошкообразного препарата) или ед. АС/см* (для жидкого препарата), рассчитывают по формуле

7.264С-0Д377

АС: =-d.    (4)

где 7.264; 0,0377 — коэффициенты расчетного уравнения, полученные при математической обработке экспериментальных данных зависимости массы прогидролиэованного крахмала от массы фермента, взятого для анализа, в пересчете на 1 ч действия фермента. При значении амилолитической активности не более 100 ед. АС/г (см3) вычисления проводят до первого десятичного знака. При значении амилолитической активности не менее 100 ед. АС/г (см3) вы* числения проводят до целых чисел.

4.6.3 Оформление результатов измерений

За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов двух па* раллельных определений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости.

Результат анализа представляют в виде

Х±Д приР = 0.95.

где X — среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, признанных приемлемыми (4.7.1). ед. АС/г (для порошкообразного препарата) или ед. AC/см3 (для жидкого препарата):

д— значение границ абсолютной погрешности измерений, ед. АС/г (для порошкообразного препарата) или ед. AC/см3 (для жидкого препарата), определяемое по формуле

Д = 0.016Х.    (5)

где 6— границы относительной погрешности результата анализа амилолитической активности в анализируемой пробе приР = 0.95составляют±8%.

4.7 Сходимость и воспроизводимость результатов

4.7.1    Результаты измерений, полученные в условиях повторяемости (сходимости), признаются удовлетворительными, если выполняется условие приемлемости

(6)

X

где X, и Хг — результаты двух параллельных определений, полученные в условиях повторяемости при Р - 0,95, ед. АС/г (для порошкообразного препарата) или ед. AC/см3 (для жидкого препа-_ рата);

X — среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, ед. АС/г (для порошкообразного препарата) или ед. AC/см3 (для жидкого препарата); г— предел повторяемости (сходимости) при Р = 0.95. равный 8 %.

4.7.2    Результаты измерений. полученные в условиях воспроизводимости по ГОСТ Р ИСО 57215-1. признаются удовлетворительными, если выполняется условие приемлемости

|Х,1Хг1100^СРМ5.    (7)

X

где X, и Хг — окончательные результаты измерений, полученные в двух лабораториях в точном соответствии с методикой, ед. АС/г (для порошкообразного препарата) или ед. АС/смэ (для жидкого препарата);

X — среднеарифметическое значение двух окончательных результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости, ед. АС/г (для порошкообразного препарата) или ед. AC/см3 (для жидкого препарата):

C£>o9s “ критическая разность, равная 10 %.

5 Метод определения глюкоамилазной активности (ГлС)

5.1    Характеристика метода

5.1.1    Метод основан на количественном определении глюкозы, образующейся при гидролизе крахмала глюкоамилазой в стандартных условиях (температура 30 *С. значение pH 4.7. продолжительность гидролиза 10 мин).

5.1.2    Глюкоамилазная активность (ГлС) характеризует способность ферментного препарата катализировать расщепление растворимого крахмала до глюкозы и выражается числом единиц активности в 1 г (1 см3) препарата.

5.1.3    За единицу глюкоамилазной активности принято такое количество фермента, которое способно катализировать гидролиз растворимого крахмала при температуре 30 °С и значении pH 4.7. высвобождая за 1 мин 1 мкмоль глюкозы. Активность выражается в ед. ГлС/r (для порошкообразного) или ед. ГлС/см3 (для жидкого) анализируемого ферментного препарата.

5.1.4    Количество глюкозы, образующейся в результате ферментативного гидролиза крахмала, определяют глюкозооксидазным методом, основанным на действии ферментов глюкозооксидазы и пе-роксидазы.

Фермент глюкозооксидаза катализирует окисление 0-D-глюкозы кислородом воздуха до глюконовой кислоты с образованием перекиси водорода. Оба конечных продукта образуются в количествах. эквимолярных окисленной глюкозе. Перекись водорода под действием фермента пероксидазы окисляет ферроцианид калия (калий железистосинеродистый), который переходит в феррицианид калия. окрашенный в лимонно-желтый цвет, интенсивность окраски которого пропорциональна количеству глюкозы.

5.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и реактивы

5.2.1    Для определения глюкоамилазной активности применяют средства измерений, аппаратуру, лабораторную посуду, материалы, реактивы, указанные в 4.2.1. со следующими дополнениями:

•    фотоэлектроколориметр (ФЭК) или спектрофотометр любого типа, которые обеспечивают измерения при длине волны X = 400 нм с погрешностью измерения коэффициента пропускания не более 1 % (не более 0.01 единицы оптической плотности) в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм:

•    калий железистосинеродистый по ГОСТ 4207;

•    й(+)-глюкозу по ГОСТ 6038:

-    натрий уксуснокислый по ГОСТ 199;

•    калия гидроокись (кали едкое) по ГОСТ 24363;

-    глюкозооксидазу с активностью 100000—250000 ед7г;

•    пероксидазу с активностью 250000—300000 ед ./г.

-    воду дистиллированную по ГОСТ 6709.

5.2.2    Все реактивы должны относиться к подгруппе чистоты 2 (х. ч.) или 3 (ч. д. а.).

5.2.3    Допускается применение средств измерений, вспомогательного оборудования с аналогичными метрологическими и техническими характеристиками, а также реактивов по качеству не хуже вышеуказанных.

5.3    Подготовка к анализу

5.3.1    Приготовление раствора крахмала массовой долей 1.0 % (субстрат)

1.00 г крахмала в пересчете на абсолютно сухое вещество помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 25 смэ дистиллированной воды и перемешивают. Затем добавляют в колбу еще 25 см3 воды, помещают колбу с содержимым в кипящую водяную баню не менее чем на 15—20 мин. непрерывно перемешивая содержимое до полного растворения крахмала. После этого содержимое колбы охлаждают, добавляют 10 см3 ацетатного буферного раствора с pH 4.7 по 5.3.2, объем жидкости доводят до метки дистиллированной водой при температуре 20 *С и содержимое колбы перемешивают. Для полученного раствора крахмала характерна легкая опалесценция.

Раствор крахмала готовят в день проведения анализа.

5.3.2    Приготовление ацетатного буферного раствора молярной концентрации 1 моль/дм3 с pH 4.7 из растворов уксуснокислого натрия и уксусной кислоты

5.3.2.1    Приготовление раствора с (CH3COONa) молярной концентрации 1.0 моль/дм3 (раствор А)

В мерную колбу вместимостью 1 дм3 помещают (82,00 1 0.01) г безводного уксуснокислого натрия

или (136.00 ±0.01) г CH3CO0Na -3H2O) и растворяют приблизительно в 300 см3 дистиллированной воды. Затем доводят до метки дистиллированной водой при температуре 20 *С и перемешивают.

5.3.2.2    Приготовление раствора с (СН3СООН) молярной концентрации 1.0 моль/дм3 (раствор Б)

В мерную колбу вместимостью 1 дм3 вносят 58 см3 ледяной уксусной кислоты, приливают около

300 см3 дистиллированной воды, перемешивают и доводят до метки дистиллированной водой при 20 °С. и снова перемешивают.

5.3.2.3    Для приготовления ацетатного буферного раствора в колбе смешивают растворы уксуснокислого натрия (раствор А) и уксусной кислоты (раствор Б) в равных объемах, создавая значение pH смеси, равное 4.7. При необходимости доводят pH раствора до 4.7 одним из исходных растворов.

Срок хранения буферного раствора в закрытой стеклянной посуде при температуре 4 вС — не более четырех недель.

5.3.3    Приготовление фосфатного буферного раствора молярной концентрации

1.0    моль/дм3 с pH 7,5 из растворов калия фосфорнокислого однозамещенного и едкого калия

5.3.3.1    Приготовление раствора с (КНгРО*) молярной концентрации 1.0 моль/дм3 (раствор А).

(136.00 ± 0.01) г безводного фосфорнокислого однозамещенного калия растворяют в 500 см3 дистиллированной воды, доводят объем раствора при температуре 20 *С до 1 дм3 и тщательно перемешивают.

5.3.3.2    Приготовление раствора с (КОН) молярной концентрации 1.0 моль/дм3 (раствор Б)

(56.00 10,01) г едкого калия растворяют в мерной колбе вместимостью 1 дм3 приблизительно в

500 см3 дистиллированной воды, перемешивают, доводят объем до метки дистиллированной водой при температуре 20 *С и тщательно перемешивают.

5.3.3.3    Для приготовления фосфатного буферного раствора молярной концентрации

1.0    моль/дм3 с pH 7.5 растворы А и Б смешивают в равных объемах.

величину pH проверяют на pH-метре. 8 случае отклонения pH фосфатного буферного раствора от

7.5 его доводят до нужного значения растворами А или Б.

Срок хранения буферного раствора в закрытой стеклянной посуде при температуре 4 вС — не более четырех недель.

5.3.4    Приготовление глюкоэооксидаэного реактива

Глюкоэооксидазный реактив готовят, используя раствор жвлезистосинеродистого калия массовой долей 0.1 % и раствор глюкоэооксидаэы.

5.3.4.1    Приготовление раствора железистосинеродистого калия массовой долей 1.0 % (раствор А)

(0,050 1 0,001) г жвлезистосинеродистого калия количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 смэ и растворяют в дистиллированной воде. Объем раствора доводят до метки дистиллированной водой при температуре 20 вС и перемешивают.

Раствор готовят непосредственно перед определением.

5.3.4.2    Приготовление раствора глюкозооксидаэы (раствор Б)

(5.0—6.0) мг глюкозооксидаэы растворяют фосфатным буферным раствором с pH 7.5 по 5.3.3 в меркой колбе вместимостью 50 см3 и затем добавляют 2.0 мг пероксидазы. Объем доводят до метки фосфатным буферным раствором.

Количество окисляемых ферментов с учетом их активности берут из такого расчета, чтобы в 50 см3 содержалось 500—600 ед. активности глюкозооксидаэы. а пероксидазы — 600 ед. активности.

Срок хранения полученного раствора в темной склянке в холодильнике — не более 3 сут.

5.3.4.3    Приготовление рабочего раствора С

Рабочий раствор С готовят смешиванием равных объемов растворов А и Б.

Срок хранения полученного раствора в темной склянке в холодильнике — не более 3 сут.

5.3.5    Приготовление градуировочных растворов глюкозы

5.3.5.1    Приготовление основного градуировочного раствора глюкозы массовой концентрации 1 мг/см3

В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают (0.1000 ± 0,0002) мг глюкозы, растворяют в дистиллированной воде, тщательно перемешивают и доводят объем до метки дистиллированной водой при температуре 20 *С.

5.3.5.2    Приготовление рабочих градуировочных растворов глюкозы

Из основного раствора глюкозы отбирают поочередно по 5, 10 и 15 см3 е мерные колбы вместимостью 100 см3 каждая и доводят объем до метки дистиллированной водой при температуре 20 *С. Полученные растворы соответствуют содержанию глюкозы 50. 100 и 150 мкг глюкозы в 1 см3 соответственно.

Эти растворы используют для построения градуировочного графика.

Рабочие градуировочные растворы глюкозы готовят в день построения градуировочного графика, при этом берут по три параллельных разведения для приготовления раствора глюкозы каждой концентрации.

5.3.6 Построение градуировочного графика

В три пробирки размером 16 х 150 мм вносят по 1.0 см3 рабочих градуировочных растворов глюкозы различных массовых концентраций, добавляют по 3 см3 рабочего раствора С (см. 5.3.4.3). В кон» трольную пробу (контроль на реактив С) вместо раствора глюкозы вносят 1 см3 дистиллированной воды. Оставляют пробирки на 45 мин при температуре 20 *С для развития окраски. Интенсивность окраски растворов глюкозы измеряют на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре е диапазоне длины световой волны 400 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм в сравнении с контрольной пробой на реактив С.

Рабочая зона градуировочного графика должна находиться в области содержания глюкозы в промеряемых растворах 50—150 мкг.

Оптическая плотность раствора должна быть близка к значениям 0,1010.01; 0,20 ±0.01; 0.3010.01.

По полученным значениям строят градуировочный график зависимости оптической плотности (поглощения) от содержания глюкозы в промеряемых растворах (мкг).

Для построения каждой точки градуировочного графика вычисляют среднеарифметическое значение оптической плотности трех параллельных измерений.

На оси абсцисс (X) откладывают содержание глюкозы в промеряемых растворах (т) в мкг; на оси ординат (У) — соответствующие значения оптической плотности (£>) при к - 400 нм.

У

Градуировочный график строят каждый раз при приготовлении нового глюкозооксидаэного реактива no 5.3.4. раствора глюкозы по 5.3.5. а также при замене прибора.

5.4    Подготовка пробы

5.4.1    Отбор проб — по ГОСТ 20264.0.

Анализируемые пробы порошкообразных или жидких ферментных препаратов допускается использовать без предварительной подготовки.

5.4.2    Приготовление основного раствора анализируемой пробы ферментного препарата В стаканчик для взвешивания помещают 0,100 г порошкообразного ферментного препарата или

100 г жидкого ферментного препарата и суспендируют в небольшом количестве дистиллированной воды. Суспензию количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят объем до метки дистиллированной водой при температуре 20 ®С и тщательно перемешивают.

5.4.3    Приготовление рабочего раствора анализируемой пробы ферментного препарата Рабочий раствор анализируемого ферментного препарата готовят из основного раствора по 5.4.2

путем разведения его дистиллированной водой в зависимости от предполагаемой активности таким образом. чтобы при ее определении оптическая плотность раствора после проведения реакции с глюкозо-оксидазным реактивом находилась в пределах градуировочной кривой.

Каждую пробу анализируют два раза в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-1 и ГОСТ Р ИСО 5725-2.

Растворы готовят в день определения.

5.5    Проведение анализа

5.5.1 В две пробирки размером 16 х 150 мм вносят по 2.0 см3 субстрата (см. 5.3.1). Содержимое пробирок прогревают в ультратермостате при температуре (30,0 ± 1.0) *С в течение 5 мин.

5.5.2    В пробирки с субстратом добавляют по 1.0 см3 рабочего раствора анализируемой пробы ферментного препарата (см. 5.4.3). предварительно прогретого при температуре 30 *С, тщательно перемешивают и включают секундомер, отмечая начало ферментативной реакции. Реакционную смесь инкубируют при температуре (30.0 ±1,0) *С в течение 10 мин, отмечая время точно по секундомеру от качала ферментативной реакции.

5.5.3    По окончании реакции 1 см3 смеси переносят в другую сухую пробирку, помещают в кипящую водяную баню, выдерживают в течение 3 мин (для инактивации фермента) по секундомеру, после чего содержимое пробирки охлаждают холодной водой. Затем к смеси добавляют 3 см3 раствора С. перемешивают и выдерживают 45 мин при комнатной температуре для развития окраски.

5.5.4    Интенсивность желтой окраски соединения, образующегося в результате действия глюкоэо-оксидаэного реактива (см. 5.3.4). измеряют на фотоэлекгроколориметре или спектрофотометре в диапазоне длин еолнХ= 400 нм в кюветах с толщиной поглощающего сеет слоя 10 мм против контрольной пробы на фермент (см. 5.5.5). Значение оптической плотности должно лежать в пределах, соответствующих массе глюкозы в промеряемом растворе от 25 до 125 мкг.

Если при измерении интенсивности окраски анализируемой пробы полученные значения не соответствуют указанному диапазону, то опыт повторяют с меньшим или большим количеством основного раствора ферментного препарата (см. 5.4.2), используемого для приготовления рабочего раствора (см. 5.4.3).

5.5.5    Контрольная проба на фермент

Около 2 см3 рабочего раствора ферментного препарата (см. 5.4.3) выдерживают в кипящей водяной бане в течение 10 мин (для инактивации фермента). К 2 см3 раствора крахмала по 5.3.1 добавляют охлажденного после инактивации 1 см3 рабочего раствора анализируемой пробы ферментного препарата и выдерживают в термостате в течение 10 мин. Затем в сухую пробирку отбирают 1 см3 содержимого контрольной пробирки и последующие операции осуществляют по 5.5.3.

5.6 Обработка результатов

5.6.1 Глюкоамилазную активность ГлС в анализируемой пробе, ед. ГлС/г (для порошкообразного препарата) или ед. ГлС/см3 (для жидкого препарата), вычисляют по формуле

ГлС =.


т-3

-d.


(8)


т, 180 10


где т — массовая доля глюкозы, образовавшейся в реакционной смеси за счет действия фермента, найденная по градуировочному графику, мкг;

3 — коэффициент, учитывающий трехкратное разбавление рабочего раствора ферментного препарата непосредственно в реакционной смеси: т, — масса ферментного препарата с учетом разведения по 5.4.3, взятая для испытания, г;

180 — молекулярная масса глюкозы, мкг/мкмоль;

10 — время гидролиза, мин:

d— плотность ферментного препарата по ГОСТ 18481 (для жидкого препарата), г/см3.

При значении глюкоамилаэной активности не более 100 ед. ГлС/г (см3) вычисления проводят до первого десятичного знака. При значении глюкоамилаэной активности не менее 100 ед. ГлС/г (см3) вычисления проводят до целых чисел.

5.6.2 Оформление результатов измерений

За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости.

Результат анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде

X ± Д при Р - 0.95.

где X — среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, признанных приемлемыми (5.7.1). ед. ГлС/г (для порошкообразного препарата) или ед. ГлС/см3 (для жидкого препарата):

л— значение границ абсолютной погрешности измерений, ед. ГлС/г (для порошкообразного препарата) или ед. ГлС/см3 (для жидкого препарата), определяемое по формуле

(9)


0.01 6-Х.

где 8— границы относительной погрешности результата анализа глюкоамилазной активности в анализируемом образце при Р = 0.95 составляют ± 8 %.

5.7 Сходимость и воспроизводимость результатов

5.7.1    Результаты измерений, полученные в условиях повторяемости (сходимости), признаются удовлетворительными, если выполняется условие приемлемости

*Hi2!,00*r.    (Ю)

X

гдеХ, и Х2 — результаты двух параллельных определений, полученные в условиях повторяемости при Р - 0,95. ед. ГлС/г (для порошкообразного препарата) или ед. ГлС/см3 (для жидкого препарата);

X — среднеарифметическое значение двух параллельных определений, ед. ГлС/г (для порошкообразного препарата) или ед. ГлС/см3 (для жидкого препарата): г— предел повторяемости (сходимости), равный 8 %.

5.7.2    Результаты измерений. полученные в условиях воспроизводимости по ГОСТ Р ИСО 57215-1. признаются удовлетворительными, если выполняется условие приемлемости

|Х,1Хг1100£СРоаЕ.    (11)

X

где X, и Хг — окончательные результаты измерений, полученные в двух лабораториях в точном соответствии с методикой, ед. ГлС/г (для порошкообразного препарата) или ед. ГлС/см3 (для _ жидкого препарата);

X — среднеарифметическое значение двух окончательных результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости, ед. ГлС/г (для порошкообразного препарата) или ед. ГлС/см3 (для жидкого препарата);

СО095 — критическая разность, равная 10 %.

6 Требования к условиям измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны соблюдаться следующие условия:

температура окружающего воздуха.......(20 ± 1) *С;

относительная влажность воздуха .......(70 ±10)%.

атмосферное давление..........(84.0 * 106.7) кЛе.

напряжение в сети................(220 ±10) В

Библиография

(1)    Enzyme Nomenclature, recommendations of the nomenclature Committee of the IUB//N.Y.. Academic Press — 1964

(2)    Полыгалина Г.В.. Чередниченко 8.C.. Римареаа Л.8. Определение активности ферментов, справочник. — М.: ДеЛи принт. 2003

УДК 577.15:543.06:006.354    ОКС 07.100.30    Н09    ОКСТУ 9291

Ключевые слова: препараты ферментные, активность а-амилазы. глюкоамилаэы, методы определения с использованием субстрата растворимого крахмала, гидролиза его при 30 ‘'С

Редактор М.Е. Никулина Технический редактор в.Н. Прусакова Корректор 8.И. Варениоаа Компьютерная верстка в.Н. Грищонко

Сдано в набор 26.12.20М. Подписано о печать 17.01.20t2 Формат 60x84'/!. Гарнитура Ариап. Уел. печ. п. 2.32.

Уч.*иад. л. 1.85. Тираж 178 эха За*. 42

ФГУП «СТАНДАР ТИН ФОРМ». 12Э995 Москва. Гранатный пер.,4.  Набрано ао ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» на ПЭВМ

Отпечатано а филиале ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» — тип. «Московский печатник», 105082 Москва. Ляпин пер., в.

Изменение № 1 ГОСТ Р 54330—2011 Ферментные препараты для пищевой промышленности. Me* тоды определения амилолитической активности

Утверждено и введено в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 25.03.2015 № 159-ст

Дата введения — 2015—09—01

Раздел 2. Исключить ссыпку:

«ГОСТ 5845—79 Реактивы. Калий-натрий виннокислый 4-водный. Технические условия».

Пункт 4.1.2. Заменить слова: «за 1 мин» на «за 1 ч».

Пункты 4.7.2. 5.7.2. Первый абзац. Заменить ссылку: «ГОСТ Р ИСО 57215-1» на «ГОСТ Р ИСО 5725-2».

Пункт S.5.5. Заменить слова (после слов «водяной бане»): «в течение 10 мин» на «в течение 1 ч».

(ИУС N9 7 2015 г.)

1