allgosts.ru07. МАТЕМАТИКА. ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ07.100. Микробиология

ГОСТ Р 55027-2012 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp. Часть 3. Полуколичественный метод

Обозначение:
ГОСТ Р 55027-2012
Наименование:
Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp. Часть 3. Полуколичественный метод
Статус:
Действует
Дата введения:
01/01/2014
Дата отмены:
-
Заменен на:
-
Код ОКС:
07.100.30

Текст ГОСТ Р 55027-2012 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp. Часть 3. Полуколичественный метод

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

НАЦИОНАЛЬНЫЙ

СТАНДАРТ

РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

ГОСТР

55027-

2012/ISO/TS

10272-3:2010

МИКРОБИОЛОГИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

И КОРМОВ для животных

Горизонтальный метод обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp.

Часть 3

Полуколичественный метод

ISO/TS 10272-3:2010

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. — Part 3: Semi-quantitative method

(IDT)

Издание официальное

Москва

Стенда ртинформ 2013

ГОСТ Р 55027—2012/ISOfTS 10272-3:2010

Предисловие

Цели и принципы стандартизации е Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N9 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0—2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения »

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН ОАО «Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации» (ОАО «8НИИС») на основе аутентичного перевода на русский язык международного документа, указанного в пункте 4

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом ло стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность»

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТ8ИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 24 октября 2012 г. № 555-ст

4 Настоящий стандарт является идентичным международному документу ИСО/ТУ 10272-3:2010 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp. Часть 3. Полуколичествекный метод» (ISO/TS 10272-3:2010 «Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. — Part 3: Semi-quantitative method») с учетом технической поправки ISCVTS 10272-3:2010/Cor.1:2011.

Техническая поправка выделена в тексте (таблица 3) вертикальной чертой.

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместоссылочных международных стандартов и документов соответствующие им национальные стандарты Российской Федерации. сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется е ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — е ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ. 2013

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

ГОСТ Р 55027—2012/ISO/TS 10272-3:2010

Содержание

1 Область применения...................................................1

2 Нормативные ссылки..................................................1

3 Термины и определения................................................2

4 Принцип...........................................................2

5 Питательные среды и реактивы............................................2

6 Аппаратура.........................................................3

7 Отбор проб.........................................................4

в Приготовление испытуемой пробы..........................................4

9 Методика..........................................................4

10 Расчет и выражение результатов..........................................7

11 Протокол испытания..................................................8

Приложение А (обязательное) Диаграмма методики................................9

Приложение В (обязательное) Состав и приготовление питательных сред и реактивов.........10

Приложение ДА (справочное) Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов

и документов ссылочным национальным стандартам Российской Федерации

(и действующим в этом качестве межгосударственным стандартам)..........15

Библиография........................................................16

in

ГОСТ Р 55027—2012/JSO/TS 10272-3:2010

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МИКРОБИОЛОГИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ И КОРМОВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ Горизонтальный метод обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp.

Часть 3

Полуколичествекный метод

Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp.

Part3. Semi-quantitative method

Дата введения — 2014—01—01

1 Область применения

Настоящийстандартустанавлиеает метод полуколичествемного определения Campytobacferspp.

Настоящий стандарт распространяется:

• на пищевую продукцию и корма для животных:

• на пробы окружающей среды в области производства и обращения пищевой продукции.

Настоящий стандарт не применяют при контроле некоторых видов пищевой продукции и кормов.

2 Нормативные ссылки

Следующие ссылочные нормативные документы являются обязательными при применении дан* кого стандарта. Для датированных ссылок применяется тол ькоуказанное издание. Для недатированных ссылок применяется последнее издание стандарта {включая любые изменения).

ИСО 6887 (все части) Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследо* ваний (ISO 6887 Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination {all part))

ИСО 7218 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям (ISO 7218 Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for microbiological examinations)

ИСО/ТУ 11133*1 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указа* ния по приготовлению и производству питательных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления питательных сред в лаборатории (ISO/TS11133*1 Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production of culture media — Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory)

ИСО/ТУ 11133*2:2003 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству питательных сред. Часть 2. Практические руководящие указания по определению эффективности питательных сред (ISO/TS11133-2:2003 Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production of culture media — Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media)

Издание официальное

1

ГОСТ Р 55027—2012/ISO/TS 10272-3:2010

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями.

3.1 Campylobacter (Campylobacter) (Микробиология Campylobacter пищевых продуктов и кормов для животных): Род микроорганизмов, образующих характерные колонии на твердых селективных средах. когда их инкубируют микроаэробным способом при температуре 41.5 °С. но не при 25 *С. и которые обладают характерной подвижностью, биохимическими свойствами и способностью к росту, описанными в тех случаях, когда испытания проводятся в соответствии с настоящим стандартом.

Примечание — Наиболее место встречающимися видами являются Campylobacter fejum и С. сой. вместе с тем были описаны и другие виды (С. Ian, С. upaahensis и некоторые другие).

3.2 полуколичественное определение (semi-quantitative determination) (Микробиология Campylobacter пищевых продуктов и кормов для животных): Определение уровня загрязнения Campylobacter в том случае, когда ожидается небольшое количество, или если уровень сопутствующей флоры относительно высок.

4 Принцип

4.1 Общие положения

Для полуколичественного определения Campylobacter spp. необходимо выполнение операций, описанных в 4.2—4.4 (см. рисунок А.1}.

4.2 Обогащение в селективной жидкой среде

Пробу для анализа и ее десятичные разбавления инокулируют или разбавляют в жидкой обогатительной среде (бульон Болтона) и гомогенизируют.

Обогатительную среду инкубируют при 37 вС в течение 4—6 ч и затем при 41.5 *С в течение (44 ±4)ч.

4.3 Изоляция и отбор для подтверждения

Из культур, полученных no 4.2. твердую селективную среду, основанную на модифицированном агаре с углем, цефоперазоном и деэоксихолатом (mCCD агар), инокулируют, инкубируют при 41,5 *С в микроаэробной атмосфере и проверяют после (44 ± 4) ч с целью обнаружения присутствия колоний, которые по своим характеристикам предположительно являются Campylobacterspp.

4.4 Подтверждение

Колонии, предположительно являющиеся Campylobacter spp.. пересевают на неселективный колумбийский кровяной агар и затем подтверждают при помощи исследования под микроскопом и надлежащих биохимических испытаний, и испытаний на рост. Дополнительно вид Campylobacterspp. идентифицируют путем специфических биохимических испытаний и испытаний на чувствительность к антибиотикам.

5 Питательные среды и реактивы

5.1 Общие положения

Для получения информации об общепринятой лабораторной практике см. ИСО 7218, ИСО/ТУ11133-1 и ИСОУТУ11133-2.

Примечание — Вейду наличия большого количестеа питательных сред и реактивов и для ясности изложения. их составы и процедуры приготовления приведены в приложении В

5.2 Жидкая обогатительная среда: бульон Болтона

См.В.1.

5.3 Селективная среда для чашек Петри: модифицированный агар с углем, цефоперазоном

и деэоксихолатом (mCCD агар)

См. В.2.

2

ГОСТ Р 55027—2012/ISO/TS 10272-3:2010

5.4 Среды и реактивы для подтверждения и идентификации

5.4.1 Колумбийский кровяной агар

См. 8.3.

5.4.2 бульон для бруцелл

См. 8.4.

5.4.3 Реактив для обнаружения оксидазы

См.В.5.

5.4.4 Раствор пероксида водорода, 3 % (объемная доля)

5.4.5 Реактивы для определения гидролиза гиплурата

См. 8.6.

5.4.6 Кровяной агар Мюллера-Хинтона

См. 8.7.

5.4.7 Диски с налидиксовой кислотой и цефалотииом

Каждый тип диска содержит по 30 мкг реактива.

5.4.8 Дискисиндоксилацетатом

См. 8.8.

6 Аппаратура

Используют обычную микробиологическую лабораторную аппаратуру (см. ИСО 7218) и. в частности. нижеприведенную.

6.1 Оборудование для сухой стерилизации (сушильный шкаф) или влажной стерилизации (автоклав).

См. ИСО 7218.

6.2 Сушильный шкаф, ламинарный боксилитермостат.способныефункционировать в диапазоне температур от 37 ”С до 55 вС.

6.3 Термостат, работающий при температуре (25 ± 1) *С,{37 ± 1) "С и (41.5 ± 1) *С.

6.4 Баня водяная, работающая при температуре (37 ± 1) ®С.

6.5 Баня водяная, работающая в диапазоне температур от 47 вС до 50 ‘С.

6.6 рН-метр.сточностьюдоО.1 ед. pH при температуре 25 *С.

6.7 Емкости, в частности, культуральные пробирки с размерами 18 мм х 180 мм и 9 мм х 180 мм, пробирки для гемолиза с размерами 13 мм х 75 мм. бутылкиснетоксичными металлическими крышками и/или колбы подходящей вместимости с соответствующими крышками.

6.8 Чашки Петри, стеклянные или пластиковые, с диаметром 90 мм — 100 мм.

6.9 Пипетки градуированные, поставляющие полный объем, с широким отверстием, номинальной вместимостью 1 см3 и 10 см3, градуированные с ценой деления 0.1 см3, ИСО 835 класс А [1). и пастеровские пипетки. ИСО 7712 [2].

6.10 Соски резиновые, или любая другая безопасная система, которую можно адаптировать к градуированным пипеткам.

6.11 Петли стерильные, из платиново-иридиевогоили никелево-хромового сплава либопластико-вые. с диаметромприблиэительноЗмм. и проволоки из того же материала или стеклянная, или пластиковая палочка.

Петля из никелево-хромового сплава не пригодна для использования в испытании на оксидаэу (см. 9.5.6).

6.12 Пинцет, тонкий, с закругленными краями, из нержавеющей стали.

6.13 Микроскоп предпочтительно с фазовым контрастом (для наблюдения характерной подвижности Campy/obacferspp.).

6.14 Оборудование, пригодное для достижения микроаэробной атмосферы собъемными долями: кислорода (5 ±2) %. диоксида углерода (10 ± 3) %, альтернативного водорода <. 10 %. с соблюдением баланса азота. Используют надлежащие герметичные контейнеры, чтобы удерживать чашки Петри и/или колбы, или бутылки вместимостью примерно 350 см3, используемые для обогатительного бульона. например, бактериологические анаэробные сосуды.

Применение 1 — Соответствующая михроаэробная атмосфере может быть получена при использовании имеющихся а продаже газогенераторных комплектов; следует в точности соблюдать икструкиии изготовителя.

3

ГОСТ Р 55027—2012/ISO/TS 10272-3:2010

особенно те из них. которые касаются объема сосуда и вместимости газогенераторного комплекта. В качестве альтернативы можно использовать заполнение сосуда надлежащей газовой смесью перед инкубацией.

Примечание 2 — В качестве альтернативы инкубации а микровэробной атмосфере, обогатительный бульон можно инкубировать в бутылках с винтовыми крышками, колбах или пробирках, заполнив их обогатительным бульоном, оставляя свободное пространство величиной менее 20 мм и тщательно закупоривая крышками.

7 Отбор проб

В лабораторию должна поступать репрезентативная проба. Она не должна подвергаться повреждению или изменению в период транспортирования или хранения.

Отбор проб не является частью метода, установленного в настоящем стандарте. Рекомендуется конкретный стандарт, распространяющийся на данную продукцию. Если не существует конкретного стандарта, рекомендуется, чтобы заинтересованные стороны достигли согласия по данному вопросу.

Принимая во внимание, что Campyiobacterspp. весьма чуествительныкзамораживанию. но наиболее устойчивы при низких температурах, рекомендуется, чтобы пробы хранились при температуре (3 ± 2) *С и анализировались в кратчайшие сроки. Также принимают меры по предотвращению высыхания проб.

8 Приготовление испытуемой пробы

Испытуемуюпробулриготовляютесоответствии соответствующей частью ISO 6887. распространяющейся на определенный вид продукции. Если не существует соответствующейчасти ISO 6887. рекомендуется. чтобы заинтересованные стороны достигли согласия поданному вопросу.

9 Методика

9.1 Общие положения

См.рисунок А.1.

9.2 Проба для анализа, исходная суспензия и разбавления

9.2.1 Вводят пробу для анализа в количестве хг или хсм3 (минимум 15гили 15см3) из испытуемой пробы (раздел 8} в восьмикратный объем (120 см3 минимум) обогатительной среды — бульон Болтона (5.2) и гомогенизируют.

Полученная суспензия является исходной суспензией.

9.2.2 Переносят 90 см3 исходной суспензии (9.2.1) в бутылку вместимостью 100 см3. Это соответствует 10 г пробы для анализа. При подсчете результатов это разбавление соответствует 10'.

9.2.3 Переносят 10 см3 исходной суспензии (9.2.1) в культуральную пробирку. При подсчете результатов это разбавление соответствует 10°. После следующей стадии разбавления (9.2.4)остается 9 см3 этого разбавления. Это соответствует 1 г пробы для анализа.

9.2.4 Делают обычную серию 10-кратных разбавлений (например, до 10-4) из 10° разбавления (9.2.3), перенося по 1,0 см3 в пробирки, содержащие 9.0см3 бульона Болтона. Из наибольшего разбавления отбрасывается 1,0 см3, поскольку все пробирки должны содержать по 9.0 см3. При подсчете результатов эти разбавления соответствуют 10*’, 1(Иит. д.

9.3 Обогащение

Инкубируют пробы для анализа и разбавления (9.2.2, 9.2.3 и 9.2.4) в микроаэробной атмосфере (6.14) при 37 ®С от 4 ч до 6 ч, затем при 41.5 *С в течение (44 ±4) ч.

9.4 Изоляция

9.4.1 Используя каждую из культур, полученных в обогатительной среде (9.3), инокупируют стерильной петлей (6.11) поверхность слоев с селективной изолирующей средой на основе mCCD агара (5.3).

9.4.2 Инкубируют слои (9.4.1) при 41.5 *С в микроаэробной атмосфере (6.14).

9.4.3 После инкубации в течение (44 ± 4) ч исследуют слои с целью выявления типичных и/или подозрительных колоний Campylobacter spp.

ГОСТ Р 55027—2012/ISO/TS 10272-3:2010

Типичные колонии на mCCD агаре имеют сероватый цвет, часто с металлическим блеском, они плоские и влажные и имеют тенденцию к разрастанию. Разрастание колоний выражено меньше на более сухих поверхностях агара. Могут встречаться и другие формы колоний.

9.5 Подтверждение вида Campylobacter spp.

9.5.1 Общие положения

Поскольку рассматриваемые бактерии быстро разрушаются на воздухе, необходимо незамедлительно следовать процедурам, описанным в 9.5.2—9.5.6.

9.5.2 Отбор колонии для подтверждения

9.5.2.1 Для подтверждения с каждого слоя (9.4.3) отбирают по меньшей мере одну колонию, рассматриваемую в качестве типичной или подозрительной колонии Campylobacterspp., исследуют морфологию и подвижность с помощью микроскопа (9.5.3.1) и продолжают тем же способом с еще четырьмя колониями, если первая дала отрицательный результат.

9.5.2.2 Производят посев каждой из отобранных колоний на слой колумбийского кровяного агара (5.4.1). чтобы дать развиться четко изолированным колониям. Слои инкубируют вмикроаэробной атмосфере при 41.5 *С в течение 24 ч — 48 ч. При исследовании морфологии, подвижности, микроаэробного роста при 25 °С, аэробного роста при 41.5 ®С и присутствия оксидаэы используют чистые культуры.

9.5.3 Исследование морфологии и подвижности

9.5.3.1 Суспендируют одну колониюсослоя колумбийского кровяного агара (9.5.2.2)в1 см3 бульона для бруцелл (5.4.2) или солевого раствора пептона и исследуют морфологию и подвижность при помощи микроскопа (6.13).

9.5.3.2 Для дальнейшего исследования сохраняют все культуры (9.5.2.2), в которых обнаружены изогнутые бациллы со спиральной «штопорообраэной» подвижностью (9.5.3.1).

9.5.4 Исследование роста при температуре 25 °С (микроаэробного)

Используя колонии, изолированные в 9 5.2.2. инокулируют при помощи петли (6.11) поверхность слоя колумбийского кровяного агара (5.4.1)).

Инкубируют слой при 25 вС вмикроаэробной атмосфере (6.14) в течение (44 ±4)ч.

Исследуют слой с целью выявления видимого роста колоний Campylobacter spp.

9.5.5 Исследование роста при температуре 41,5 *С (аэробного)

Используя колонии, изолированные в 9.5 2.2. инокулируют при помощи петли (6.11) поверхность слоя колумбийского кровяного агара (5.4.1).

Инкубируют слой при температуре 41.5 *С в аэробной атмосфере в течение (44 ± 4) ч.

Исследуют слой с целью выявления видимого роста колоний Campylobacter spp.

9.5.6 Обнаружение оксидазы

Используя петлю из платиново-иридиевого сплава, пластиковую петлю или стеклянную палочку (6.11). отбирают порцию четко изолированной колонии из каждой отдельной чашки (9.5.2.2) и наносят на фильтровальную бумагу, смоченную реактивом для обнаружения оксидазы (5.4.3). Появление розовато-лилового. фиолетового или темно-синего цвета в течение 10 с свидетельствует о положительной реакции. Если используется имеющийся в продаже набор дляанализа оксидазы. необходимо следовать инструкциям изготовителя.

Подтверждают результаты, используя положительный и отрицательный контроль. Примерами подходящих контрольных штаммов являются Pseudomonas aeruginosa NCTC 10662 (положительный контроль) и Escherichia cofi NCTC 9001 (отрицательный контроль).

9.5.7 Интерпретация

Campylobacter spp. дает результаты согласно таблице 1.

Таблица 1— Характеристики Campylobacter spp.

Морфология (9.5.3)

Малые искривленные бациллы

Подвижность (9.5.3)

Характерная

Микроаэробныйрост при температуре 25 ‘С (9.5.4)

-

Аэробный рост при температуре 41.5 *С (9.5.5)

-

Оксидаза (9.S.6)

Campylobacter spp. присутствует, если по меньшей мере одна колония демонстрирует вышеуказанные характеристики.

S

ГОСТ Р 55027—2012/ISO/TS 10272-3:2010

9.6 Идентификация вида Campylobacterspp. (альтернативная процедура)

9.6.1 Общие положения

Из видов Campylobacter spp.. произрастающих при температуре 41.5 *С, чаще всего встречаются С. jejuni и С. со//. Вместе с тем были описаны другие виды (С. lari, С. upsaliensis и некоторые другие); характеристики, приведенные в таблице 2. позволяют провести их дифференциацию.

Таблица 2 — Характеристики аиров Campylobacter а рр.

Характеристика

С. Jejuni

С. со*

С. lari

C. upsaliensis

Каталазе (9.6.2)

отрицательная или в слабой форме

Налидиксовая кислота (9.6.3)

S*>

R/SBI

S

Цефалотин (9.6.3)

R

R

R

S

Гидролиз гиппурата (9.6.4)

-

-

-

Индоксилацатат (9.6.5)

+

+

-

Обозначения: ♦ » положительная: - ■ отрицательная: S * чувствительный: R * устойчивый.

•’ Было обнаружено увеличение устойчивости к налидиксовой кислоте штаммов С. Jejuni и С. coll. ь> Существуют одновременно чувствительные и устойчивые штаммы С. tan. в| Существуют гиппурвт-отрицательные штаммы С. jajuni.

9.6.2 Обнаружение каталазы

Для каждой колонии, отобранной в соответствии с 9.5.2.2. наносят петлю культуры в каплю раствора пероксида водорода (5.4.4) на чистом предметном стекле.

Испытание считается положительным, если в течение 30 с появляются пузырьки.

Подтверждают результаты, используя положительный и отрицательный контроль. Примерами подходящих контрольных штаммов являются Staphylococcus aureus NCTC 8532 (положительный контроль) и Enterococcus faecalis NCTC 775 (отрицательный контроль).

9.6.3 Определение чувствительности к налидиксовой кислоте и цефалотину

Для каждой колонии, отобранной в соответствии с 9.S.2.2, используют петлю (6.11) с целью приготовления суспензии в бульоне для бруцелл (5.4.2) плотностью 0.5 по шкале МакФарланда.

Разбавляют суспензию в соотношении 1:10 тем же бульоном.

Заливают суспензией поверхностьслоя с5 % (объемная доля) кровяногоагара Мюллера-Хинтона

(5.4.6) .

Выдерживают в течение 5 мин. затем сливают избыток суспензии.

Высушивают чашки всушильном шкафу (6.2) при температуре 37 *С в течение 10 мин.

Помещают на поверхность агара диск с налидиксовой кислотой (5.4.7) и диск с цефалотином

(5.4.7) .

Инкубируют чашки крышками вверх при температуре 37 *С в течение (22 ± 2) ч в микроаэробной атмосфере (6.14).

Интерпретируют результаты бактериального роста следующим образом:

- рост, который наблюдается при контакте с диском, классифицируется как устойчивый;

- при наличии зоны любых размеров, обусловленной ингибированием роста, он классифицируется как чувствительный.

9.6.4 Определение гидролиза гиппурата

Для каждой колонии,отобраннойе соответствии сЭ.5.2.2. используют петлю(6.11 )сбольшим количеством инокулята с целью приготовления суспензии в пробирке для гемолиза (6.7), содержащей 0.4 смэ раствора гиппурата натрия (5.4.5). при этом обращают особое внимание, чтобы исключить попадание агара.

Встряхивают с целью тщательного перемешивания и инкубируют в течение 2 ч на водяной бане (6.4) при температуре 37 "С или в течение 4 ч в термостате при 37 *С.

Осторожно добавляют 0.2 см3 раствора нингидрина (5.4.5) на поверхность раствора гиппурата натрия. Избегают встряхивания.

Интерпретацию производят после дополнительного инкубирования в течение 10 мин на водяной бане (6.4)лри37 *С или в термостате при 37 *С.

Темно-фиолетовый цвет свидетельствует о положительной реакции.

6

ГОСТ Р 55027—2012/ISO/TS 10272-3:2010

Светло-фиолетовый цвет или отсутствие окраски свидетельствуют об отрицательной реакции.

Подтверждают результаты, используя положительный и отрицательный контроль. Примерами подходящих контрольных штаммов являются С. jejuni NCTC 11351 (положительный контроль). С. coli NCTC 11366 (отрицательный контроль).

9.6.5 Определение гидролиза индоксилацетата

Помещают колонию, отобранную в соответствии с Э.5.2.2. на диск с индоксилацетатом (5.4.8) и добавляют каплю стерилизованной дистиллированной воды. Для проведения отчетливой реакции требуется полная петля материала колоний.

8 случае гидролиза индоксилацетата в течение 5—10 мин наблюдается изменение цвета в сторону темно-синего. Отсутствие изменения цвета свидетельствует о том, что гидролиза не было.

Подтверждают результаты, используя положительный и отрицательный контроль. Примерами подходящих контрольных штаммов являются С. jejuni NCTC 11351 (положительный контроль), С. lari NCTC 11352 (отрицательный контроль).

9.6.6 Интерпретация

Виды Campylobacter spp.. показывающие рост при 41.5 *С. могут быть идентифицированы в соответствии с таблицей 2.

10 Расчет и выражение результатов

10.1 Метод расчета

Полуколичественный метод основан на количественном обнаружении в отобранных разведениях. Поэтому результат приводится в диапазонах, соответствующих таблице 3.

Пуассоновское распределение используется для оценки диапазона концентраций, которые согла-суютсяссерией результатов. Например, если истинная концентрация 0.005 КОЕ/г, то вероятность положительного результата для 10’ разведения составляет 5 %. Если истинная концентрация 3 КОЕ/г. то вероятность положительного результата для 10° разведения составляет 95 %. Однако если для 101 разведения наблюдается положительный результат, а для 10° разведения и более высоких разведений — отрицательный результат, то истинная концентрация, вероятно, находится в диапазоне между 0.005 КОЕ/г и 3 КОЕ/г.

Таблица 3 — Диапазоны результатов для серии разбавлений

Количество, г

Рост подтвержденных Campylobacter spp.

10'

-

10°

-

-

10'1

-

-

-

+

10'*

-

-

-

-

Ю-*

-

4-

10“*

-

-

-

-

-

-

Н8Ч/Г

0

0,23

2.3

23

230

2400

*

Го

0

0,019

0,19

1.9

19

190

580

Г,

0.33

2.7

27

270

2700

30 000

У.

Если все испытания дали отрицательный результат, этот результат необходимо изложить как НВЧ * 0/г (верхний доверительный предел. Т, 0.33/г); если все испытания дали положительный результат, зтот результат необходимо изложить как НВЧ » *> (нижний доверительный предел. Го 580/г).

10.2 Прецизионность

Межлабораторное совместное испытание, включающее полуколичественное определение Campylobacter spp.. как описано в настоящем стандарте, было организовано в 2005 году Нордическим комитетом по анализу пищевых продуктов (NMKL). Испытание проводилось в 14 европейских лабораториях на сыром курином мясе и молоке. Каждая из проб пищевых продуктов была проанализирована при различных уровнях загрязнения плюс отрицательный контроль. Специфичность лолуколичественного

7

ГОСТ Р 55027—2012/ISO/TS 10272-3:2010

метода составляла 100%. Общая чувствительность метода была 82.1 %. Чувствительность обнаружения Campylobacter spp. в молоке была ниже, чем в курином мясе. Количественная оценка метода для Campylobacter spp. в курином мясе, полученная в этом совместном испытании, была совместима с диапазонами концентраций, приведенными в таблице 3.

11 Протокол испытания

Протокол испытания должен содержать по меньшей мере следующую информацию:

a) используемый метод отбора проб, если он известен;

b) используемый метод со ссылкой на настоящий стандарт:

c) используемая жидкая обогатительная среда;

d) используемая среда для изоляции;

e) выбранная температура инкубации:

f) полученные результаты испытаний;

д) все детали проведения испытаний, не установленные в настоящем стандарте или рассматриваемые в качестве альтернативных, вместе с информацией о любых факторах, которые могли повлиять на результаты испытаний:

h) всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы.

8

Приложение А

(обязательное)

ГОСТ Р 55027—2012/ISO/TS 10272-3:2010

Икпгодняи сусгжшш

Диаграмма методики

Пробя для шалим

* £ 1Bi5 + аолыицитшЛовым (Ь Ш мл)(^пшт Бшттонв.

101 рвавйяаниа ООишумрет 10 пробы для «калия

Обогащение

Изоляция

Гкщпмтат»

и идентификация

f1

90 ш исяадой «успения

Н^раамрениа В ил содержит 1 ггрсбыдпнан&лкм

Т

10 ашмоеоднаа (успакмы

л ^ ter1 (жшдаиив

1 w1tre В ил Отьома Болтона В ил содержит

I 0,1 глробыдля«тлкн1

* КУ^рямимние

1 жл11Г *В«щбугклт15огггсна Вилоодвржит

^ 0,<И г гробы для «кали*

И ТА, нярлмл до IDf4

_I

Ишубщня мшроаарибпой ашоофер» прн37"Сог4чдавч иявгеы

при41,Я*Свтвчвиив{44±4)ч

I

1лССО«яр(б.а>

Ишубацив нииромробиаД «шоофар» прн41£ "Сатвчшиб (44 ±4) ч

1

Характерные колония (В.4.1)

Поятаорждяем <ВА2 - 0Л.4) Идяшнфм«ое1|гю яыбц9) (8.8)

бцмияниа раарыктее

(Р»пел 10)

Рисунок А. 1 —Диаграмма методики

9

ГОСТ Р 55027—2012/ISO/TS 10272-3:2010

Приложение В

(обязательное)

Состав и приготовление питательных сред и реактивов

В.1 Бульон Болтона

В.1.1 Базовая среда В.1.1.1 Состав

Продукт ферментативного переваривания животных тканей

10.0 г

Гидролизат лактальбумина

5.0 г

Дрожжевой экстракт

5.0 г

Натрия хлорид

5.0 г

Натрия пируввт

0.5 г

Нвтрия пиросульфит

0.5 г

Натрия карбонат

0.6 г

а-Кетоглутвровая кислоте

1.0 г

Гемин (растворенный е 0.1 % (массовая доля) гидроксиде натрия]

0.01 г

Вода

1 000 cmj

В.1.1.2 Приготовление

Растворяют базовые компоненты или полную обезвоженную базовую среду в воде, при необходимости — путем нагреве. При необходимости корректируют pH. чтобы после стерилизации его значение для полной среды составляло 7.4 i 0.2 ед. pH при температуре 25 'С. Разливают базовую среду в колбы подходящей вместимости. Стерилизуют в автоклаве (6.1). установленном не температуру 121 *С. в течение 15 мин.

В.1.2 Стерильная лизированная дефибрин ированная кровь лошади

Используют кровь лошади, лизированную сапонином или замораживанием и последующим размораживанием.

В.1.3 Состав антибиотического раствора

Цефолеразон

0.02 г

Ванкомицин

0.02 г

Триметопримв лактат

0.02 г

Амфотерицин В

0.01 г

Смесь этанола и воды: 1*1 частей по объему

5 смэ

В.1.4 Приготовление

Растворяют компоненты в смеси этанола и воды (соотношение 1:1). В.1.5 Полная среда В.1.5.1 Соствв

Базовая среда (В.1.1)

1 000 см3

Стерильная лизированная дефибринированная кровь лошади (В.1.2)

50 см3

Антибиотический раствор (В.1.3)

5 смэ

В.1.5.2 Приготовление

К базовой среде при температуре ниже 50 *С в стерильных условияхдобавляют кровь, затем антибиотический раствор и перемешивают. Соблюдая стерильность, разливают среду в пробирки или колбы подходящей емес-

10

ГОСТ Р 55027—2012/ISO/TS 10272-3:2010

тимости (см. 9.2.2), чтобы приготовить порции, необходимые для испытания. Если обогатительную среду приготовляют заранее, ее надо хранить не более 4 ч при комнатной температуре или не более 7 дней в темном месте при(3±2) 'С.

8.1.6 Эксплуатационное испытание

Эксплуатационные характеристики бульона Болтона (8.1.S.1) необходимо испытывать в соответствии с методами и критериями, описанными в ИСО/ТУ 11133-2. Примерами подходящих контрольных штаммов являются С. jejuni NCTC11351 или АТСС 33291 со следующими критериями: > 10 колоний не тССО агаре (5.3) после инкубации в микроаэробных условиях при 41,5 *С в течение (44 ± 4)ч.

8.2 Модифицированный агар с углем, цефоперазоном и дезоксихолатом (тССО агар)

8.2.1 Базовая среда

8.2.1.1 Состав

Мясной экстракт

10.0 г

Продукт ферментативного переваривания животных тканей

10.0 г

Натрия хлорид

5.0г

Древесный уголь

4.0 г

Продукт ферментативного переваривания казеина

3.0 г

Дезоксихолат натрия

1.0г

Железа(Н) сульфат

0.25 г

Натрия пируаат

0.2S г

Агар

8.0 г—16.0 г*'

вода

1 000 см*

*' в зависимости от прочности геля агара.

8.2.1.2 Приготовление

Растворяют базовые компоненты или полную обезвоженную базовую среду в воде путем доведения до кипения. При необходимости корректируют pH. чтобы после стерилизации его значение составляло 7.4 ± 0.2 ед. pH при температуре 25 *С. Разливают базовую среду в колбы подходящей вместимости. Стерилизуют в автоклаве (6.1). установленном на 121 'С. в течение 15 мин.

8.2.2 Антибиотический раствор В.2.2.1 Состав

Цефоперазон

0.032 г

Амфотерицин В

0.01 г

вода

5 см*

8.2.2.2 Приготовление

Растворяют компоненты в воде. Стерилизуют путем фильтрации. 8.2.3 Полная среда

8.2.3.1 Состав

Базовая среда (8.2.1)

1 000 см3

Антибиотический раствор (8.2.2)

5 см!

В.2.3.2 Приготовление

Добавляют антибиотический раствор к базовой среде, охлажденной до 47 'С—50 *С. затем тщательно перемешивают. Разливают около 1бсмэполной среды постерильным чашкам Петри. Дают затвердеть. Непосредственно перед применением тщательно высушивают слои агара, предпочтительно с открытыми крышками и поверхностью агаре, направленной вниз, в сушильном шкафу (6.2) в течение 30 мин или до того момента, когда поверхность агара не будетсодержать видимой елвги. Еслиоии были приготовлены заранее, невысушенныеагвро-

11

ГОСТ Р 55027—2012/ISO/TS 10272-3:2010

вые слои следует хранить не более 4 ч при температуре окружающей среды или не более 7 сут а темноте при температуре (3 £ 2) ®С.

В.2.4 Эксплуатационное испытание

Для определения селективности или производительности см. ИСО/ТУ 11133-1. В отношении эксплуатационных критериев см. ИСОЯУ 11133-2:2003. таблице 8.S.

В.З Колумбийский кровяной агар

В.3.1 Базовая среда В.3.1.1 Состав

Продукт ферментативного переваривания животных тканей

23.0 г

Крахмал

1.0 г

Натрия хлорид

5.0 г

Агар

8.0 г — 18.0 г*1

Вода

1 000 см*

*' в зависимости от прочности геля агара.

В.3.1.2 Приготовление

Растворяют базовые компоненты или полную обезвоженную базовую среду в воде путем нагрева. При необходимости корректируют pH. чтобы после стерилизации его значение составляло 7.3 ± 0.2 ед. pH при температуре 25 *С. Разливают базовую среду в колбы подходящей вместимости. Стерилизуют в автоклаве (6.1). установленном на температуру 121 *С. в течение 1S мин.

В.3.2 Стерильная дефибринированная баранья кровь В.3.3 Полная среда В.3.3.1 Состав

Базовая среда (В.3.1)

1 000 см3

Стерильная дефибринированная баранья кровь (В.3.2)

50 см3

В.3.3.2 Приготовление

Добавляют кровь а стерильных условиях кбазовой среде, охлажденной до температуры 47 ®С—50 ®С. затем перемешивают. Разливают около 15 см3 полной среды по стерильным чашкам Петри. Дают затвердеть. Непосредственно перед применением тщательно высушивают слои вгара. предпочтительно с открытыми крышками и поверхностью агара, направленной вниз, в сушильном шкафу (6.2) в течение 30 мин или до того момента, когда поверхностьагарв не будет содержать видимой влаги. Если они были приготовлены заранее, неаысушвнныв агаровые слои следует хранить не более 4 ч при температуре окружающей среды или не более 7 сут при температуре (3 г 2) *С.

В.4 Бульон для бруцелл

В.4.1 Состав

Продукт ферментативного переваривания казеина

10,0 г

Продукт ферментативного переваривания животных тканей

10,0 г

Глюкоза

1.0 г

Дрожжевой экстракт

2.0 г

Натрия хлорид

S.0 г

Натрия гидросульфит

0.1 г

Вода

1 000 см9

В.4.2 Приготовление

Растворяют базовые компоненты или полную обезвоженную базовую среду в воде, при необходимости путем нагрева. При необходимости корректируют pH. чтобы после стерилизации его значение составляло 7.0 £ 0.2ед.рН

12

ГОСТ Р 55027—2012/ISO/TS 10272-3:2010

при 2S *С. Разливают среду порциями по 10 см* в пробирки подходящей вместимости. Стерилизуют в автоклаве (6.1). установленном на температуру 121 'С. а течение 1S мин.

В.5 Реактив для обнаружения оксидазы

В.5.1 Состав

N. N. N'. М'-Тетраметил-1.4-фенилендиамина дигидрохлорид

1.0 г

Вода

100 см*

В.5.2 Приготовление

Растворяют компонент в воде непосредственно перед использованием.

В.6 Реактивы для обнаружения гидролиза гиплурвта

В.6.1 Раствор гиппурата натрия

8.6.1.1 Состав

Натрия гиппурат

10 г

Фосфатно-буферный солевой раствор (PBS)

Натрия хлорид

8.S г

Динатрия гидрофосфат дигидрат (Na2HP04 2HjO)

6.06 г

Натрия дигидрофосфат моногидрат (NaH2PO< HjO)

2.71 г

Вода

1 000 см3

В.6.1.2 Приготовление

Растворяют гиппурат натрия в растворе PBS. Стерилизуют путем фильтрации. Разливают реактив в стерильных условиях порциями по 0.4 см3 в небольшие пробирки подходящей вместимости (6.7). Хранят при температуре примерно 20 *С.

В.6.2 Раствор нингидрина. 3.5 % (массе на объем)

8.6.2.1 Состав

Нингидрин

1.75г

Ацетон

25 см*

Бутанол

25 см3

в.6.2.2 Приготовление

Растворяют нингидрин в смеси ацетона и бутанола. Хранят раствор в холодильнике в темноте максимальное течение одной недели.

В.7 Кровяной агар Мюллера-Хинтона

В.7.1 Базоввя среда в.7.1.1 Состав

Продукт ферментативного переваривания животных тканей

6.0 г

Продукт ферментативного переваривания казеина

17.5 г

Крахмал, растворимый

1.5 г

Агар

8.0 г—18.0 г‘>

Вода

1 000 см*

11 8 зависимости от прочности геля агара.

В.7.1.2 Приготовление

Растворяют базовые компоненты или полную обезвоженную базовую среду в воде путем доведения до кипения. При необходимости корректируют pH. чтобы после стерилизации его значение составляло 7.3 £ 0.2 ед. pH при

13

ГОСТ Р 55027—2012/ISO/TS 10272-3:2010

температуре 25 *С. Разливают базовую среду в колбы подходящей вместимости. Стерилизуют в автоклаве (6.1}. установленном на температуру 121 'С. в течение 15 мин.

В.7.2 Стерильная дефибринированная баранья кровь В.7.3 Полная среда В.7.3.1 Состав

Базовая среда (В.7.1)

1 000 см3

Стерильная дефибринированная баранья кровь (В.7.2)

50 см1

В.7.3.2 Приготовление

Добавляют кровь в стерильных условиях к базовой среде, охлажденной до температуры 47 *С—50 ‘С. затем перемешивают. Разливают около 15 см* полной среды по стерильным чашкам Петри. Дают затвердеть. Непосредственно перед применением тщательно высушивают слои втара. предпочтительно с открытыми крышками и поверхностью агара, направленной вниз, в сушильном шкафу (6.2) в течение 30 мин или до того момента, когда поаерхностьвгарв не будет содержать видимой влаги. Если они были приготовлены заранее, нееысушвнные агаровые слои следует хранить не более 4 ч при температуре окружающей среды или не более 7 сут при температуре (3x2) *С.

В.8 Диски с индоксилацетатом

В.8.1 Состав

Индоксилацетат

0.1 г

Ацетон

1 см3

В.8.2 Приготовление

Растворяют индоксилацетат в ацетоне. Наносят от 25 мкл до 50 мкл этого раствора на чистые бумажные диски (диаметром от 6 мм до 12 мм). После высушивания при комнвтной темпера туре хранят диски при температуре (3 ± 2) *С в коричневых пробирках или бутылках в присутствии силикагеля.

14

ГОСТ Р 55027—2012/ISO/TS 10272-3:2010

Приложение ДА

(справочное)

Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов и документов ссылочным национальным стандартам Российской Федерации (и действующим в этом качестве межгосударственным стандартам)

Таблица ДА.1

Обозначение ссылочного международною стандарта, документа

Степень

соответствия

Обозначение и наименование соответствующего национального стандарта

ИСО 6887

9

ИСО 7216:2007

ют

ГОСТ ISO 7216—2011 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям»

ИСО/ТУ 11133-1:200©

ют

ГОСТ ISO 11133-1—2011 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качестве приготовления культурвльных сред в лаборатории»

ИСО/ТУ 11133-2:2003

ют

ГОСТ ISO 11133-2—2011 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 2. Практические руководящие указания по зкеплуатационным испытаниям культуральных сред»

* Соответствующий национальный стандарт отсутствует. До его утверждения рекомендуется использовать перевод на русский язык данного международного стандарта. Перевод данного международного стандарта находится в Федеральном информационном фонде технических регламентов и стандартов.

Примечание — В настоящей таблице использовано условное обозначение степени соответствия стандартов:

• ЮТ — идентичные стандарты.

15

ГОСТ Р 55027—2012/ISO/TS 10272-3:2010

Библиография

И) ISO 835 Посуде лабораторная стеклянная. Мерные градуированные пипетки

(7} ISO 7712 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки Пестере одноразового применения

{3} NKML Method No. 119. Thermololarent Campylobacter—Detection, semi-quentnebve and quantitative determination in foods end drinking water. Available (2009-06-09) front:

(4) Baylis. C.L.. MacPhee, S . Martin. K.W.. Humphrey. T.J.. Betts. R.P. Comparison of three enrichment media for the Isolation of Campylobacterspp. from foods. J. Appl. Microbiol. 2000, 69. pp. 884—891

(5) Bolton. F.J.. Hutchinson. D.N.. Coates. D. Blood-free selective medium for isolation of Campylobacter jejuni from feces. J. Cbn. Microbiol. 1984.19. pp. 169—171

(6) Bolton. F.J.. Sails. A.O.. Fox. A.J.. Wareing. D.R.. Greenway. O.L. Detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coh In foods by enrichment culture and polymerase cham reaction enzyme-linked immunosorbent assay. J. Food Prof. 2002. 65. pp. 760—767

(7) Corry. J.E.L.. Curtis. G.D.W.. Baird. R.M.. editors. Handbook of culture media for food microbiology. Elsevier. Amsterdam. 2003 (Progress in industrial microbiology, Vol. 37)

(8) Hutchinson, D.N., 8oRon. F.J. Improved blood free selective medium for the isolation of Campylobacter jejuni from faecal specimens. J. Cbn. Pathol. 1984. 37. pp. 956—957

(9) Josefsen. M.H.. Lubeck. P.S.. Aafcaek. B.. Hoorfar. J. Preston and Park-Senders protocols adapted for semi-quantitative Isolation of thermotolerant Campylobacter from chicken rinse. Int. J. Food Microbiol. 2003. 80. pp. 177—183

(10) Rosenqulst, H.. 8engtsson. A.. Hansen. T.B. A collaborative study on a Nordic standard protocol for detection and enumeration of thermotolerant Campylobacter in food (NMKL 119.3. Ed.. 2007). Int. J. Food Microbiol. 2007.116. pp. 201—213

УДК 663/664.777:006.354 OKC 07.100.30 H09

Ключевые слова: пищевые продукты, корма, микробиология, метод обнаружения, лолуколичестеенный метод, преэумптивные бактерии Campylobacter, культуральные среды, селективные среды, чашки Петри. инкубирование посевов, типичные колонии

Редактор Е.8. Никулине Технический редактор В.Н. Прусакове Корректор М.И. Першина Компьютерная верстка И.А. Напей киной

Сдано а набор 11.07.2013. Подписано о печет» 25.07.2013. Формат 60 « 84^. Гарнитура Ариел. Уел. печ. п. 2.32. Уч-над. п, 1.70. Тираж ПО экэ. Зак 614.

ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ*. 123995 Москва. Гранатный пер.. 4. info@gostmlo ги Набрано во на ПЭВМ.

Отпечатано а филиале ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ* — тип. «Московский печатник». 105062 Москва. Лялин пар.. 6.