allgosts.ru07. МАТЕМАТИКА. ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ07.100. Микробиология

ГОСТ Р 57989-2017 Продукция пищевая специализированная. Методы выявления патогенных микроорганизмов на основе полимеразной цепной реакции

Обозначение:
ГОСТ Р 57989-2017
Наименование:
Продукция пищевая специализированная. Методы выявления патогенных микроорганизмов на основе полимеразной цепной реакции
Статус:
Действует
Дата введения:
01/01/2019
Дата отмены:
-
Заменен на:
-
Код ОКС:
07.100.30, 67.050

Текст ГОСТ Р 57989-2017 Продукция пищевая специализированная. Методы выявления патогенных микроорганизмов на основе полимеразной цепной реакции


ГОСТ Р 57989-2017

Группа Н59



НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ



ПРОДУКЦИЯ ПИЩЕВАЯ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННАЯ



Методы выявления патогенных микроорганизмов на основе полимеразнойцепной реакции



Specialized food products. Methods for the detection of foodbornepathogens based on polymerase chain reaction


ОКС 07.100.30
67.050

Датавведения 2019-01-01

Предисловие

Предисловие

1РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением науки"Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии ибезопасности пищи" (ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии"),Федеральным бюджетным учреждением науки "Центральныйнаучно-исследовательский институт эпидемиологии" Роспотребнадзора(ФБУН "ЦНИИ Эпидемиологии" Роспотребнадзора)

2ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 036 "Продукцияпищевая специализированная"

3УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ ПриказомФедерального агентства по техническому регулированию и метрологииот 24 ноября 2017 г. N 1825-ст

4ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ


Правила применениянастоящего стандарта установлены в статье26 Федерального закона от 29 июня 2015 г. N 162-ФЗ "Остандартизации в Российской Федерации". Информация обизменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (посостоянию на 1 января текущего года) информационном указателе"Национальные стандарты", а официальный текст изменений и поправок- в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты".В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандартасоответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпускеинформационного указателя "Национальные стандарты". Соответствующаяинформация, уведомление и тексты размещаются также в информационнойсистеме общего пользования - на официальном сайте Федеральногоагентства по техническому регулированию и метрологии в сетиИнтернет (www.gost.ru)

Введение


Методы выявленияпатогенных микроорганизмов на основе полимеразной цепной реакцииявляются альтернативными бактериологическому посеву ипредусматривают ускоренное определение наличия или отсутствия ДНКи, соответственно, бактерий родов Salmonella,Shigella, Cronobacter (Enterobactersakazakii), энтерогеморрагических Escherichia coli,термофильных Campylobacter spp. видов C. jejuni,C. coli, C. lari, Listeria monocytogenes вопределенной массе (объеме) пищевого продукта, подвергнутогоинкубации в жидких селективных питательных средах. Предварительнаяинкубация продуктов в питательных средах является обязательнымэтапом анализа, обеспечивающим биологическое накоплениевозбудителей.

При наличииэпидемиологических данных о возможности массивного зараженияпищевого продукта искомыми возбудителями входе расследованиявспышек пищевых отравлений и инфекций допускается анализироватьинкриминированные пробы нативных (не подвергавшихся инкубации вжидких средах обогащения) пищевых продуктов с целью полученияпредварительных данных о причинном агенте вспышки. При этомположительные результаты ПЦР-анализа таких проб должныподтверждаться выделением возбудителя в культуре, а отрицательныерезультаты не должны интерпретироваться и не могут служитьоснованием для прекращения анализа проб с инкубацией.

Обнаружение патогенныхмикроорганизмов в пищевых продуктах методом полимеразной цепнойреакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией основано навыявлении последовательностей (фрагментов) ДНК, специфичных длягеномов бактерий родов Salmonella, Shigella, Cronobacter,Campylobacter, энтерогеморрагических Escherichia coli,Listeria monocytogenes. В основе метода лежит амплификациянуклеотидных фрагментов-мишеней ДНК, ферментомTaq-полимеразой в присутствии синтетическихолигонуклеотидных праймеров и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.Гибридизация флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов,присутствующих в составе реакционной смеси, с комплементарнымучастком амплифицируемой ДНК-мишени сопровождается нарастаниемфлуоресценции. Измерение интенсивности флуоресцентного сигналапозволяет регистрировать накопление продуктов амплификации.

Методы предусматриваютвысев определенных количеств исследуемых проб пищевых продуктов всоответствующие неселективные и селективные питательные среды,инкубирование посевов для накопления микроорганизмов, экстракциюДНК из культуральной жидкости, амплификацию участка ДНК целевыхбактерий со специфичными праймерами игибридизационно-флуоресцентную детекцию ампликонов, осуществляемуюв одном из двух вариантов: в режиме реального времени в ходе ПЦРлибо после завершения амплификации.

При положительныхрезультатах обнаружения патогена жизнеспособность присутствующих впродукте искомых микроорганизмов подтверждают бактериологическимпосевом с соответствующим биохимическим и серологическимтипированием или ПЦР-анализом парных проб (прошедшей и не прошедшейкультуральное обогащение) в режиме реального времени.

Методы выявленияпатогенных микроорганизмов на основе полимеразной цепной реакции сгибридизационно-флуоресцентной детекцией могут использоваться длятестирования бактериальных культур микроорганизмов, выделенных изпищевых продуктов бактериологическими методами, с цельюподтверждения их принадлежности к родам Salmonella, Shigella,Cronobacter, Campylobacter (видов С. ejuni, С. coli, С.lari), Listeria (вида L. monocytogenes),энтерогеморрагическим Е. coli в качестве дополнительных кбиохимическим и серологическим методам идентификации.

1Область применения


Настоящий стандартраспространяется на специализированную пищевую продукцию иустанавливает методы выявления патогенных бактерий родовSalmonella, Shigella (в комплексе с энтероинвазивными Е.coli), Cronobacter, энтерогеморрагическихверотоксигенных Escherichia coli, термофильныхCampylobacter spp. видов С. jejuni, С. coli, С. lari,а также Listeria monocytogenes на основе полимеразной цепнойреакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией.

2Нормативные ссылки


Внастоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующиедокументы:

ГОСТ12.1.007 Система стандартов безопасности труда. Вредныевещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ12.1.018 Система стандартов безопасности труда.Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общиетребования

ГОСТ1341 Пергамент растительный. Технические условия

ГОСТ1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторнаястеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие техническиеусловия

ГОСТ2768 Ацетон технический. Технические условия

ГОСТ3118 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ4148 Реактивы. Железо (II) сернокислое 7-водное. Техническиеусловия

ГОСТ4198 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Техническиеусловия

ГОСТ4233 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ4328 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ5556 Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия

ГОСТ5962 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья.Технические условия

ГОСТ6038 Реактивы. D-глюкоза. Технические условия

ГОСТ6687.0 Продукция безалкогольной промышленности. Правила приемкии методы отбора проб

ГОСТ6709 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ ISO7218 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных.Общие требования и рекомендации по микробиологическимисследованиям

ГОСТ7702.2.0 Продукты убоя птицы, полуфабрикаты из мяса птицы иобъекты окружающей производственной среды. Методы отбора проб иподготовка к микробиологическим исследованиям

ГОСТ9412 Марля медицинская. Общие технические условия

ГОСТ9792 Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины,говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правилаприемки и методы отбора проб

ГОСТ ISO10272-1 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных.Методы обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp. Часть 1.Метод обнаружения

ГОСТ10444.1 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок,индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическоманализе

ГОСТ ISO11133 Микробиология пищевых продуктов, кормов для животных иводы. Приготовление, производство, хранение и определение рабочиххарактеристик питательных сред

ГОСТ11683 Пиросульфит натрия технический. Технические условия

ГОСТ12026 Бумага фильтровальная лабораторная. Техническиеусловия

ГОСТ12302 Пакеты из полимерных пленок и комбинированных материалов.Общие технические условия

ГОСТ13646 Термометры стеклянные ртутные для точных измерений.Технические условия

ГОСТ13805 Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей.Технические условия

ГОСТ14919 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафыбытовые. Общие технические условия

ГОСТ ISO16140 Микробиология продуктов питания и кормов для животных.Протокол валидации альтернативных методов

ГОСТ16317 Приборы холодильные электрические бытовые. Общиетехнические условия

ГОСТ 17206 Агар микробиологический.Технические условия

ГОСТ21237 Мясо. Методы бактериологического анализа

ГОСТ21239 Инструменты хирургические. Ножницы. Общие требования иметоды испытаний

ГОСТ ISO22118 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных.Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для обнаружения и количественногоучета патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах. Техническиехарактеристики

ГОСТ23932 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общиетехнические условия

ГОСТ25336 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы,основные параметры и размеры

ГОСТ26313 Продукты переработки фруктов и овощей. Правила приемки иметоды отбора проб

ГОСТ26669 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб длямикробиологических анализов

ГОСТ26809.1 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методыотбора и подготовка проб к анализу. Часть 1. Молоко, молочные,молочные составные и молокосодержащие продукты

ГОСТ26809.2 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методыотбора и подготовка проб к анализу. Часть 2. Масло из коровьегомолока, спреды, сыры и сырные продукты, плавленые сыры и плавленыесырные продукты

ГОСТ27987 Анализаторы жидкости потенциометрические ГСП. Общиетехнические условия

ГОСТ 28489 Микроскопы световые. Терминыи определения

ГОСТ29227 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипеткиградуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ30390 Услуги общественного питания. Продукция общественногопитания, реализуемая населению. Общие технические условия

ГОСТ30712 Продукты безалкогольной промышленности. Методымикробиологического анализа

ГОСТ30726 Продукты пищевые. Методы выявления и определенияколичества бактерий вида Escherichia coli

ГОСТ31339 Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Правилаприемки и методы отбора проб

ГОСТ31598 Стерилизаторы паровые большие. Общие техническиетребования и методы испытаний

ГОСТ31659 Продукты пищевые. Метод выявления бактерий родаSalmonella

ГОСТ31747 Продукты пищевые. Методы выявления и определенияколичества бактерий группы кишечных палочек (колиформныхбактерий)

ГОСТ31761 Майонезы и соусы майонезные. Общие техническиеусловия

ГОСТ31904 Продукты пищевые. Методы отбора проб длямикробиологических испытаний

ГОСТ32010 Продукты пищевые. Метод выявления бактерий родаShigella

ГОСТ32031 Продукты пищевые. Методы выявления бактерий ListeriaMonocytogenes

ГОСТ32189 Маргарины, жиры для кулинарии, кондитерской,хлебопекарной и молочной промышленности. Правила приемки и методыконтроля

ГОСТ32261 Масло сливочное. Технические условия

ГОСТ32262 Масло топленое и жир молочный. Технические условия

ГОСТ32901 Молоко и молочная продукция. Методы микробиологическогоанализа

ГОСТ32951 Полуфабрикаты мясные и мясосодержащие. Общие техническиеусловия

ГОСТ Р12.1.019 Система стандартов безопасности труда.Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видовзащиты

ГОСТ РEH 13060 Стерилизаторы паровые малые

ГОСТ Р51448 (ИСО 3100-2-88) Мясо и мясные продукты. Методы подготовкипроб для микробиологических исследований

ГОСТ Р53228 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологическиеи технические требования. Испытания

СП1.2.036-95 Порядок учета, хранения, передачи итранспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности

СП1.3.2322-08 Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групппатогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней

Примечание - Припользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действиессылочных стандартов (сводов правил) в информационной системеобщего пользования - на официальном сайте Федерального агентства потехническому регулированию и метрологии в сети Интернет или поежегодному информационному указателю "Национальные стандарты",который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и повыпускам ежемесячного информационного указателя "Национальныестандарты" за текущий год. Если заменен ссылочный документ, накоторый дана недатированная ссылка, то рекомендуется использоватьдействующую версию этого документа с учетом всех внесенных в даннуюверсию изменений. Если заменен ссылочный документ, на который данадатированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этогодокумента с указанным выше годом утверждения (принятия). Если послеутверждения настоящего стандарта в ссылочный документ, на которыйдана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающееположение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуетсяприменять без учета данного изменения. Если ссылочный документотменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него,рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.

3Термины, определения и сокращения

3.1 Термины иопределения

Внастоящем стандарте применены термины по ГОСТ ISO16140, ГОСТ ISO22118.

3.2 Сокращения

Внастоящем стандарте применены следующие сокращения:

ЗПВ - забуференнаяпептонная вода;

ФБР - фосфатно-буферныйраствор;

ТСБДЭ - триптон-соевыйбульон с дрожжевым экстрактом;

ТСАДЭ - триптон-соевыйагар с дрожжевым экстрактом;

RVS-бульон - средаРаппапорта-Вассилиадиса с соей;

МКТ-бульон -Мюллер-Кауфман тетратионатный бульон;

МПБ - мясо-пептонныйбульон;

МПА - мясо-пептонныйагар;

ПЦР-FEP - полимеразнаяцепная реакция с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктовамплификации по конечной точке;

ПЦР-FRT - полимеразнаяцепная реакция с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктовамплификации в режиме реального времени;

ВКО - неконкурентныйвнутренний контрольный образец на основе рекомбинантной ДНК;

Ct (пороговый цикл) -значение цикла амплификации, при котором регистрируется пересечениекривой накопления флуоресцентного сигнала с установленной пороговойлинией.

4Средства измерения, оборудование и реактивы

4.1Оборудование и средства измерения


Анализаторпотенциометрический с диапазоном измерения рН от 3,0 до 8,0 сточностью ±0,01 ед. рН при температуре 25°С по ГОСТ27987.

Баня водяная стерморегулятором, позволяющая поддерживать температуру от 0 до100°С.

Бокс абактериальнойвоздушной среды (ПЦР-бокс) или ламинарный шкаф класса биологическойбезопасности II тип А.

Весы лабораторные общегоназначения, 2 класса точности, с наибольшим пределом взвешивания1000 г по ГОСТ Р53228.

Встряхивательвибрационный типа "Вортекс" со скоростью вращения до 3000об/мин.

Денситометр длябактериальных суспензий.

Дистиллятор,обеспечивающий качество дистиллированной воды, соответствующейГОСТ6709.

Дозаторы пипеточныеавтоматические с переменным объемом дозирования от 0,1 до 1000ммс точностью ±0,8%.

Гомогенизаторбактериологический перистальтического типа.

Инкубаторы-анаэростатыили другие устройства, создающие анаэробные условиякультивирования.

Микроскоп биологическийбинокулярный с увеличением 900-1000 с иммерсионной системой по ГОСТ 28489.

Микроцентрифуганастольная типа эппендорф (частота вращения не менее 13000мин).

Камера морозильная,обеспечивающая температуру не выше минус 20°С.

Насос вакуумный(водоструйный).

Облучатель бактерицидныйнастенный с мощностью бактерицидных ламп 30 Вт ипроизводительностью (95% обеззараживания) не менее 300 м/час.

Отраслевой стандарт длявизуальной оценки мутности ОСО-42-28-85П N 10 по [1].

Амплификаторпрограммируемый для проведения качественного и количественногоанализа ДНК методом полимеразной реакции в режиме "реальноговремени" и "по конечной точке", с использованием различныхкомбинаций реагентов-флуорофоров и с возможностью регистрациифлуоресцентного сигнала не менее чем по четырем каналам.

Системы экстракцииДНК/РНК роботизированные.

Система (аппарат) длямембранной фильтрации.

Стерилизатор паровоймедицинский (автоклав) по ГОСТ РЕН 13060, ГОСТ31598.

Термостат твердотельныйдля пробирок типа эппендорф вместимостью 1,5 см, диапазон температур от 25 до 100°С.

Термостат электрическийсуховоздушный с диапазоном рабочих температур от 20 до 60°С иотклонением от заданной температуры не более ±1°С.

Холодильник стемпературой от 2 до 8°С с морозильной камерой не выше минус 16°Сдля хранения выделенных проб ДНК по ГОСТ16317.

Часы механическиесигнальные по ГОСТ14919.

Шкафсушильно-стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру вдиапазоне от 50 до 200°С с погрешностью ±2°С.

4.2Лабораторная посуда и материалы


Бумага фильтровальнаялабораторная по ГОСТ12026.

Вата медицинскаягигроскопическая по ГОСТ5556.

Колбы стеклянныеплоскодонные конические или круглые различной вместимости поГОСТ1770.

Контейнеры стерильные изполимерных материалов с крышками для отбора проб.

Марля медицинская поГОСТ9412.

Микропробирки для ПЦРстерильные тонкостенные 0,2 см (плоская крышка, коническое дно) - дляамплификаторов с детекцией через дно пробирки; 0,2 см (куполообразная крышка) - дляамплификаторов с детекцией через крышку.

Наконечники одноразовые сфильтром для дозаторов с переменным объемом дозирования от 0,1 до1000 мм.

Ножницы медицинские поГОСТ21239.

Оптические стандартыМакФарланда N 1, 2, 3.

Пакеты полимерные длястерилизации лабораторных принадлежностей и обеззараживанияотходов.

Пакеты бумажные длястерилизации лабораторных принадлежностей.

Пакеты полимерные поГОСТ12302.

Петли бактериологическиекалиброванные на 1 мм.

Пергамент по ГОСТ1341.

Пипетки градуированныевместимостью 1, 2, 5 и 10 см по ГОСТ29227.

Пробирки типа эппендорфвместимостью 0,5 и 1,5 см.

Пробки силиконовые,целлюлозные, ватно-марлевые для стеклянных колб, флаконов,пробирок.

Планшеты иммунологические96-луночные стерильные.

Пробирки центрифужныеконические стерильные вместимостью 15 и 50 см.

Пробирки стеклянные типовП1, П2 по ГОСТ25336.

Пробирки Дархама(поплавки) стеклянные.

Термометр ртутный сдиапазоном измерения от 0 до 100°С (цена деления шкалы 1°С) поГОСТ13646.

Термоконтейнер(сумка-холодильник).

Фильтры мембранныемикроцеллюлозные стерильные N 3.

Фильтрующие насадки нашприц.

Флаконы и колбыстеклянные по ГОСТ25336 вместимостью 250, 500, 1000, 2000 см.

Халаты, шапочки, маски,бахилы одноразовые, перчатки резиновые или латексныенеопудреные.

Чашки биологические(Петри) стеклянные или одноразовые из полимерных материаловдиаметром 90 или 100 мм по ГОСТ23932.

4.3Реактивы, питательные среды, дезинфицирующие средства

4.3.1 Реагенты дляПЦР

Комплекты реагентов(наборы) для выделения ДНК/РНК из пищевой продукции.

Комплекты реагентов дляроботизированных систем экстракции ДНК/РНК (силика магнитная, буферлизирующий, буферы для экстракции).

Комплекты реагентов(наборы) для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентнойдетекцией, обеспечивающие аналитическую чувствительность на уровне1x10 ГЭ/см в отношении выявляемых фрагментов ДНКпатогенных бактерий Cronobacter sakazakii,энтерогеморрагических E.coli, Shigella spp., Salmonellaspp., Campylobacter spp. (видов C.jejuni, C.coli,C.lari) и Listeria monocytogenes, содержащие: смесиолигонуклеотидных праймеров на участки ДНК бактерий ифлуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов, комплементарныхучасткам амплифицируемых ДНК-мишеней; полимеразу (TaqF), смесьбуфера и нуклеозидтрифосфатов, ДНК-буфер, положительные контрольныеобразцы этапа ПЦР со специфическими фрагментами ДНК искомыхмикроорганизмов и внутренним контрольным образцом, отрицательныйконтрольный образец и внутренний неконкурентный контрольный образецэтапа выделения, минеральное масло для ПЦР.

4.3.2 Реактивы,питательные среды для селективного обогащения микроорганизмов и ихкомпоненты

Агар микробиологическийпо ГОСТ 17206.

Ацетон по ГОСТ2768.

Добавка ростоваяаэротолерантная на основе натрия пировинограднокислого, железа (II)сернокислого, натрия метабисульфита для кампилобактерий по[2].

Бриллиантовыйзеленый.

Бульон Дойла длянакопления кампилобактерий по [2].

Бульон глюкозный сбриллиантовым зеленым и желчью.

Бульон лактозный сбриллиантовым зеленым и желчью.

Бульон Мак-Конки сглюкозой.

Бульон Престона длянакопления кампилобактерий по [2].

Бульон селенитовый вмодификации Лейфсона.

Бульон Фрейзераполуконцентрированный.