База ГОСТовallgosts.ru » 07. МАТЕМАТИКА. ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ » 07.100. Микробиология

ГОСТ 31487-2012 Препараты ферментные. Методы определения ферментативной активности фитазы

Обозначение: ГОСТ 31487-2012
Наименование: Препараты ферментные. Методы определения ферментативной активности фитазы
Статус: Действует
Дата введения: 07/01/2013
Дата отмены: -
Заменен на: -
Код ОКС: 07.100.30, 65.120
Скачать PDF: ГОСТ 31487-2012 Препараты ферментные. Методы определения ферментативной активности фитазы.pdf
Скачать Word:ГОСТ 31487-2012 Препараты ферментные. Методы определения ферментативной активности фитазы.doc

Текст ГОСТ 31487-2012 Препараты ферментные. Методы определения ферментативной активности фитазы



МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

гост

СТАНДАРТ

31487-

2012

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТНЫЕ

Методы определения ферментативной активности фитазы

Издание официальное

Москва

Стандарти нформ 2012

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0—92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2—2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ») и Научно-техническим центром «Лекарства и биотехнология» (НТЦ «Лекбиотех»)

2    ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол №41 от 23-24 мая 2012 г.)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004—97

Код страны

по МК (ИСО 3166) 004—97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Азербайджан

AZ

Азстандарт

Кыргызстан

KG

Кыргызстандарт

Российская Федерация

RU

Росстандарт

Таджикистан

TJ

Т аджикстандарт

4    Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 28 сентября 2012 г. № 468-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31487—2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.

5    Настоящий стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 53360—2009

6    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта публикуется в указателе «Национальные стандарты».

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в указателе «Национальные стандарты», а текст изменений — в информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в информационном указателе «Национальные стандарты»

©Стандартинформ, 2012

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТНЫЕ

Методы определения ферментативной активности фитазы

Enzyme preparations.

Methods of phytase enzyme activity determination

Дата введения — 2013—07—01

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает методы определения ферментативной активности фитазы ферментных препаратов и ферментсодержащих смесей с использованием в качестве субстрата фитата натрия.

Примечание — Фермент фитаза — мио-инозит-гексафосфат 3-фосфогидролаза (3.1.3.8) [1], катализирует гидролитическое расщепление эфиров инозита и фосфорной кислоты (фитина), начиная с положения С3, с высвобождением фосфатов.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 61—75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия ГОСТ 199—78 Реактивы. Натрий уксуснокислый 3-водный. Технические условия ГОСТ 1770—74 (ИС01042—83, ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118—77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3765—78 Реактивы. Аммоний молибденовокислый. Технические условия

ГОСТ 4198—75 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия

ГОСТ 4204—77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4461—77 Реактивы. Кислота азотная. Технические условия

ГОСТ 6709—72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147—80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 9336—75 Реактивы. Аммоний ванадиевокислый мета. Технические условия

ГОСТ 10931—74 Реактивы. Натрий молибденовокислый 2-водный. Технические условия

ГОСТ 13867—68 Продукты химические. Обозначения чистоты

ГОСТ 20264.0—74 Препараты ферментные. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 24104—2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 24147—80 Аммиак водный особой чистоты. Технические условия

ГОСТ 25336—82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29227—91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов (и классификаторов) на территории государства по соответствующему указателю стандартов (и классификаторов), составленному по состоянию на 1 января текущего года, по соответствующим информацион-

Издание официальное

ным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3    Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1    гидролиз: Расщепление исходного соединения на два более простых в присутствии молекул

воды.

3.2    ферментативный гидролиз: Гидролиз высокомолекулярных соединений под воздействием катализаторов белковой природы — гидролитических ферментов (гидролаз, класс 3 [1]).

3.3    субстрат: Соединение или вещество, на которое воздействует данный фермент.

4    Метод определения ферментативной активности фитазы с образованием молибденовой сини

4.1    Характеристика метода

4.1.1    Метод основан на количественном определении содержания неорганических фосфатов (Р04), образующихся в результате действия фермента фитазы на субстрат — фитат натрия (натриевую соль фитиновой кислоты) при определенных стандартных условиях, путем их связывания молибдатом натрия и восстановлением двухлористым оловом с образованием окрашенного в синий цвет комплекса — молибденовой сини.

Метод используется при возникновении разногласий в качестве арбитражного.

4.1.2    За единицу фитазной активности (1 ед. ФА) принимают количество фермента, катализирующее гидролиз фитата натрия с образованием 1 мкмоля неорганического фосфата за одну минуту в стандартных условиях (температура — 37 °С, значение pH 5,5, продолжительность гидролиза — 15 мин).

4.1.3    Интенсивность окраски измеряют фотоколориметрическим методом при длине волны от 650 до 700 нм.

4.1.4    Количество выделенных неорганических фосфатов определяют по градуировочному графику, построенному какфункция оптической плотности от молярной концентрации фосфатов, мкмоль/см3.

Метод позволяет определять от 0,05 до 0,40 мкмоль/см3 фосфатов. Диапазон измерений контролируемого показателя от 500 до 8000 ед. ФА.

4.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы

4.2.1 Для определения ферментативной активности фитазы используют следующие средства измерений и оборудование:

-    фотоэлектроколориметр (ФЭК) любого типа, который обеспечивает измерения при длине волны от 650 до 700 нм, с погрешностью измерения коэффициента пропускания не более 1 % (не более 0,01 единицы оптической плотности);

-    pH-метр с набором электродов для измерения в диапазоне от 0 до 14 pH, с пределом допускаемой погрешности в эксплуатации + 0,1 pH;

-    магнитную мешалку любой марки, которая обеспечивает скорость вращения до 800 мин-1;

-    ультратермостат или водяной термостат с точностью регулирования температуры +1 °С;

-    лабораторную центрифугу любого типа, которая обеспечивает скорость вращения не менее 7000 мин-1;

-    весы лабораторные по ГОСТ24104, высокого класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г, ценой поверочного деления 0,1 мг и пределом допускаемой погрешности в эксплуатации + 0,15 мг; с наибольшим пределом взвешивания 1 кг, ценой поверочного деления 20 мг и пределом допускаемой погрешности в эксплуатации ± 30 мг;

-    водяную баню любого типа, которая обеспечивает поддержание температуры (100 ± 1) °С;

-    таймер любого типа с погрешностью ± 30 с;

-    шкаф сушильный, обеспечивающий температуру нагрева (120 + 5) °С;

-    вытяжной шкаф любого типа;

-    механическую мельницу, обеспечивающую размалывание исследуемого образца ферментного препарата до полного прохода пробы через сито;

-    сито с диаметром отверстий 1,0 мм, сделанное из металлического проволочного тканого материала.

4.2.2    Для определения ферментативной активности фитазы используют следующие лабораторную посуду и материалы:

-    колбы мерные 1(2)-50,100,200, 500,1000-2 по ГОСТ 1770;

-    воронки ВФ— 1(2)-60-ПОР 500 ТХС по ГОСТ25336;

-    пробирки П 1-14-120ХС или П 1-16-150ХС поГОСТ 25336;

-    пипетки по ГОСТ 29227;

-    пипетки автоматические с емкостью от 0,1 до 1,0 см3 с наконечниками;

-    колбы и стаканы (бюксы) СВ 19/9 и 24/10 по ГОСТ 25336;

-    стаканы В-1-25, 50,100,200,600,1000 ТС по ГОСТ 25336;

-    цилиндры 1(2,3,4)-50,100-1 поГОСТ 1770;

-    ступку и пестик фарфоровые по ГОСТ9147;

-    эксикатор любого исполнения по ГОСТ 25336.

4.2.3    Для определения ферментативной активности фитазы используют следующие реактивы:

-    воду бидистиллированную, дистиллированную дважды перегнанную или деионизированную, свободную от фосфатов;

-    калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198;

-    кислоту уксусную ледяную по ГОСТ 61;

-    натрий уксуснокислый 3-водный по ГОСТ 199;

-    натрия фитат с содержанием примеси кальция не более 2 %;

-    натрий молибденовокислый 2-водный (натрия молибдат) по ГОСТ 10931;

-    кислоту серную по ГОСТ 4204, концентрированную;

-    кислоту соляную по ГОСТ 3118, концентрированную;

-    олово(М) хлорид 2-водное (олово двухлористое).

4.2.4    Все реактивы должны относиться к подгруппе чистоты 2 (х. ч.) или 3 (ч. д. а.) по ГОСТ 13867.

4.2.5    Допускается применение других средств измерения и вспомогательного оборудования с метрологическими и техническими характеристиками, а также реактивов по качеству не ниже указанных.

4.3 Подготовка к анализу

4.3.1    Приготовление ацетатного буферного раствора молярной концентрации 0,1 моль/дмс pH 5,5 из растворов уксусной кислоты и уксуснокислого натрия

4.3.1.1    Для приготовления раствора уксусной кислоты в мерную колбу вместимостью 1 дм3 вносят 5,7 см3 ледяной уксусной кислоты, разводят приблизительно 300,0 см3бидистиллированной воды. Доводят до метки бидистиллированной водой и перемешивают.

Срок хранения при комнатной температуре — не более 1 мес.

4.3.1.2    Для приготовления раствора уксуснокислого натрия в мерную колбу вместимостью 1 дмпомещают 13,6 г уксуснокислого натрия и растворяют приблизительно в 300,0 см3 бидистиллированной воды. Затем доводят до метки бидистиллированной водой и перемешивают.

Срокхранения раствора при комнатной температуре — не более 1 мес.

4.3.1.3    Для приготовления ацетатного буферного раствора в колбе вместимостью 2 дм3 смешивают объемы растворов уксусной кислоты по 4.3.1.1 и уксуснокислого натрия по 4.3.1.2, в следующем соотношении: к 885 см3 раствора уксуснокислого натрия добавляют при энергичном размешивании 115 смраствора уксусной кислоты. При необходимости доводят pH раствора до 5,5 одним из исходных растворов.

Срокхранения при комнатной температуре не более 1 мес.

4.3.2 Приготовление раствора натрия молибдата в серной кислоте

4.3.2.1    Для приготовления раствора серной кислоты концентрации 1,25 моль/дм3 в мерную колбу вместимостью 1 дм3 вносят примерно 700,0 см3 бидистиллированной воды и постепенно добавляют 69,6 см3 концентрированной серной кислоты плотностью 1,83 г/см3, тщательно перемешивают и доводят до метки бидистиллированной водой.

4.3.2.2    Для приготовления раствора натрия молибдата в колбу вместимостью 2 дм3 помещают 18,75 г натрия молибденовокислого и растворяют в 1,00 дм3 серной кислоты по 4.3.2.1.

Срокхранения раствора в посуде темного стекла с притертой пробкой, в защищенном от света месте, при комнатной температуре — один год.

4.3.3 Приготовление рабочего раствора двухлористого олова

4.3.3.1 Для приготовления основного раствора двухлористого олова в плоскодонную стеклянную колбу вместимостью 50 см3 вносят 10,0 г двухлористого олова, добавляют 25,0 см3 концентрированной соляной кислоты и нагревают в водяной бане при температуре 100 °С (в вытяжном шкафу) до полного растворения.

Срок хранения раствора в посуде темного стекла с притертой пробкой, в вытяжном шкафу — один год. Раствор должен быть прозрачным и бесцветным.

4.3.3.2 Для приготовления рабочего раствора двухлористого олова в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,5 см3 основного раствора двухлористого олова по 4.3.3.1, доводят до метки бидистилли-рованной водой и перемешивают. Раствор должен быть бесцветным.

Рабочий раствор готовят в день проведения анализа.

4.3.4    Приготовление раствора субстрата фитата натрия молярной концентрации 5 мкмоль/см3

В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 461,9 мг фитата натрия, растворяют приблизительно в 70,0 см3 ацетатного буферного раствора по 4.3.1, доводят до метки буферным раствором и перемешивают. Раствор готовят в день проведения анализа.

4.3.5    Приготовление рабочих стандартных растворов фосфатов (Р04) для построения градуировочного графика

4.3.5.1    Для приготовления основного стандартного раствора фосфатов в мерную колбу вместимостью 1 дм3 помещают 680 мг высушенного при температуре от 100 °С до 105 °С и охлажденного в эксикаторе фосфорнокислого калия, растворяют приблизительно в 300 см3 ацетатного буферного раствора по 4.3.1, доводят до метки ацетатным буферным раствором и перемешивают.

Молярная концентрация фосфатов в стандартном растворе составляет 5 мкмоль/см3.

Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 1 мес.

4.3.5.2    Для приготовления серии разведений — рабочих стандартных растворов фосфатов из основного стандартного раствора фосфорнокислого калия по 4.3.5.1 готовят серию разведений в соответствии с таблицей 1.

Таблица 1

Объем стандартного раствора фосфорнокислого калия молярной концентрации 5 мкмоль/см3, см3

Объем ацетатного буферного раствора, см3

Молярная концентрация фосфатов в растворе, мкмоль/см3

1

99

0,05

2

98

0,10

3

97

0,15

4

96

0,20

5

95

0,25

6

94

0,30

7

93

0,35

8

92

0,40

Рабочие стандартные растворы фосфатов готовят в день построения градуировочного графика, при этом берут по три параллельных разведения для приготовления каждой концентрации фосфатов.

4.3.6 Построение градуировочного графика

В восемь пробирок вместимостью 10 см3 вносят по 2,0 см3 рабочих стандартных растворов фосфорнокислого калия различных молярных концентраций в соответствии с таблицей 1, добавляют по

2,0 см3 раствора натрия молибдата по 4.3.2 и 0,5 см3 рабочего раствора олова двухлористого по 4.3.3, тщательно перемешивают.

Одновременно готовят контрольную пробу на реактивы, для чего в пробирку вносят 2,0 см3 ацетатного буферного раствора по 4.3.1, 2,0 см3 раствора натрия молибдата по 4.3.2 и 0,5 см3 рабочего раствора олова двухлористого по 4.3.3, тщательно перемешивают.

Все пробы выдерживают 1 мин и измеряют оптические плотности на фотоэлектроколориметре при длине волны от 650 до 670 нм в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 3 мм, против контрольной пробы на реактивы.

По полученным значениям строят градуировочный график, для чего по оси ординат откладывают величины оптической плотности в единицах ОП, а по оси абсцисс — молярные концентрации фосфатов в мкмоль/см3.

Рабочая зона градуировочного графика лежит в пределах от 0,25 до 0,60 единиц оптической плотности (ед. ОП).

Для построения каждой точки градуировочного графика вычисляют среднеарифметическое значение оптической плотности трех параллельных измерений.

Градуировочный график строят для каждой новой партии реактивов, а также при замене прибора.

4.4    Отбор и подготовка проб

4.4.1    Отбор проб

Отбор проб проводят по ГОСТ 20264.0.

Анализируемые образцы в форме порошка или микрокапсулированные можно использовать без предварительной подготовки. Анализируемые образцы в форме гранул следует измельчать (например, на зерновой мельнице или в фарфоровой ступке) и просеивать через сито с диаметром отверстий не более 1 мм.

4.4.2    Приготовление основного раствора анализируемого образца

В плоскодонную стеклянную колбу помещают навеску анализируемого образца массой от 0,1 до 10 г* с точностью до 0,2 мг и суспендируют в небольшом количестве бидистиллированной воды (до 50 см3) на магнитной мешалке в течение 15 мин (порошок, микрогранулы, микрокапсулы) или 60 мин (корма, кормовые смеси). Суспензию количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят объем бидистиллированной водой до метки. Полученную суспензию центрифугируют при частоте вращения 7000 мин-1 в течение 15 мин. Для анализа используют надосадочную жидкость.

Раствор готовят в день определения.

4.4.3    Приготовление рабочего раствора анализируемого образца

Рабочий раствор готовят из основного раствора по 4.4.2 путем его разведения в бидистиллированной воде (например, в 20 раз) таким образом, чтобы при определении активности оптические плотности опытных и контрольного растворов находились в пределах рабочей зоны градуировочного графика.

4.5    Проведение анализа

4.5.1    В три пробирки (две опытные и одну контрольную) вносят по 1,0 см3 рабочего раствора анализируемого образца по 4.4.3. Пробирки помещают в ультратермостат или водяную баню с температурой (37 +1) °С и выдерживают в течение 5 мин.

4.5.2    В две опытные пробирки добавляют по 1,0 см3 раствора субстрата фитата натрия по 4.3.4, предварительно выдержанного в ультратермостате или водяной бане с температурой (37 +1) °С в течение 5 мин, и перемешивают. Пробирки помещают в ультратермостат или водяную баню с температурой (37 + 1) °С на 15 мин.

4.5.3    В контрольную пробирку вносят 1,0 см3 раствора субстрата фитата натрия по 4.3.4. В контрольную и две опытные пробирки добавляют по 2,0 см3 раствора натрия молибдата по 4.3.2 и 0,5 смрабочего раствора олова хлорида по 4.3.3 и тщательно перемешивают.

4.5.4    Пробирки (две опытные и одну контрольную) выдерживают одну минуту при комнатной температуре. Растворы колориметрируют при длине волны от 650 до 700 нм в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 3 мм, против контроля на реактивы. При необходимости (опалесценция, взвесь и т. д.) раствор центрифугируют при 7000 мин-1.

5 Метод определения ферментативной активности фитазы с образованием фосфорнованадиево-молибденового комплекса

5.1    Характеристика метода

5.1.1    Метод основан на определении содержания неорганических фосфатов (Р04), образующихся в результате действия фермента фитазы на субстрат — фитат натрия (натриевую соль фитиновой кислоты) — при определенных стандартных условиях, путем их связывания ванадиево-молибденовым реактивом с образованием фосфорнованадиево-молибденового комплекса желтого цвета.

5.1.2    За единицу фитазной активности (1 ед. ФА) принимают количество фермента, катализирующего гидролиз фитата натрия с образованием 1 мкмоля неорганического фосфата за одну минуту в стандартных условиях (температура — 37 °С, значение pH 5,5, продолжительность гидролиза — 15 мин).

5.1.3    Интенсивность окраски измеряют фотоколориметрическим методом при длине волны от 400 до415 нм.

* В зависимости от предполагаемой активности.

5.1.4 Количество выделенных неорганических фосфатов определяют по градуировочному графику, построенному как функция оптической плотности от молярной концентрации фосфатов, в мкмоль/см3.

Метод позволяет определять от 0,5 до 2,0 мкмоль/см3 фосфатов. Диапазон измерений контролируемого показателя от 500 до 8000 ед. ФА.

5.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы

5.2.1    Для определения ферментативной активности фитазы с образованием фосфорнованадие-во-молибденового комплекса применяют средства измерений, вспомогательное оборудование, кото-рыеуказаны в4.2.1 и4.2.2.

5.2.2    Для определения ферментативной активности фитазы используют реактивы по 4.2.3, а также:

-    аммоний молибденовокислый по ГОСТ 3765;

-    аммиак водный особой чистоты по ГОСТ 24147, раствор массовой доли 25%;

-    кислоту азотную по ГОСТ 4461, раствор массовой доли 25%;

-    аммония метаванадат по ГОСТ 9336;

-    воду дистиллированную по ГОСТ 6709.

5.3 Подготовка к анализу

5.3.1    Приготовление ацетатного буферного раствора молярной концентрации 0,1 моль/дм3 с pH 5,5 проводят по 4.3.1.

5.3.2    Для приготовления ванадиево-молибденового реактива в колбу вместимостью 2 дм3 помещают 0,6 г аммония метаванадата и растворяют в 440,0 см3 горячей дистиллированной воды. Раствор охлаждают до комнатной температуры и при постоянном перемешивании добавляют 560,0 см3 25 % раствора азотной кислоты и 25,0 г аммония молибденовокислого. Перемешивают до полного растворения.

Срок хранения при комнатной температуре — один год.

5.3.3    Приготовление раствора субстрата фитата натрия молярной концентрации 5 мкмоль/смпроводят по 4.3.4.

Раствор готовят в день проведения анализа.

5.3.4    Приготовление рабочих стандартных растворов фосфатов (Р04) для построения градуировочного графика проводят в следующем порядке.

5.3.4.1    Приготовление основного стандартного раствора фосфатов проводят по 4.3.5.1.

Молярная концентрация фосфатов в стандартном растворе составляет 5 мкмоль/см3.

Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 1 мес.

5.3.4.2    Для приготовления серии разведений — рабочих стандартных растворов фосфатов из основного стандартного раствора фосфорнокислого калия по 4.3.5.1 готовят серию разведений в соответствии с таблицей 2.

Таблица 2

Объем стандартного раствора фосфорнокислого калия молярной концентрации 5 мкмоль/см3, см3

Объем ацетатного буферного раствора, см3

Молярная концентрация фосфатов в растворе, мкмоль/см3

1,0

9,0

0,50

1,5

8,5

0,75

2,0

8,0

1,00

2,5

7,5

1,25

3,0

7,0

1,50

3,5

6,5

1,75

4,0

6,0

2,00

Рабочие стандартные растворы фосфатов готовят в день построения градуировочного графика, при этом берут по три параллельных разведения для приготовления каждой молярной концентрации фосфатов.

5.3.5 Для построения градуировочного графика в семь пробирок вместимостью 10 см3 вносят по 2,0 см3 рабочих стандартных растворов фосфорнокислого калия различных молярных концентраций в соответствии с табл. 2, добавляют по 4,0 см3 ванадиево-молибденового реактива по 5.3.2 и 4,0 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают.

Одновременно готовят контрольную пробу на реактивы, для чего в пробирку вносят 2,0 см3 ацетатного буферного раствора по 5.3.1, 4,0 см3 ванадиево-молибденового реактива по 5.3.2 и 4,0 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают.

Все пробы выдерживают 10 мин при комнатной температуре и измеряют оптические плотности на фотоэлектроколориметре при длине волны от 400 до 415 нм в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм, против контроля на реактивы.

По полученным значениям строят градуировочный график, для чего по оси ординат откладывают величины оптической плотности в единицах ОП, а по оси абсцисс — молярной концентрации фосфатов в мкмоль/см3.

Рабочая зона градуировочного графика лежит в пределах от 0,20 до 0,60 единиц оптической плотности.

Для построения каждой точки градуировочного графика вычисляют среднеарифметическое значение оптической плотности трех параллельных измерений.

Градуировочный график строят для каждой новой партии реактивов, а также при замене прибора.

5.4    Подготовка пробы

5.4.1    Отбор проб проводят по 4.4.1.

5.4.2    Приготовление основного раствора анализируемого образца проводят по 4.4.2.

5.4.3    Приготовление рабочего раствора анализируемого образца проводят путем разведения основного раствора по 5.4.2 в бидистиллированной воде (например в пять раз).

5.5    Проведение анализа

5.5.1    В три пробирки (две опытные и одну контрольную) вносят по 2,0 см3 рабочего раствора анализируемого образца по 5.4.3. Пробирки помещают в ультратермостат или водяную баню с температурой (37 +1) °С и выдерживают в течение 5 мин.

5.5.2    В две опытные пробирки добавляют по 4,0 см3 раствора субстрата фитата натрия по 5.3.3, предварительно выдержанного в ультратермостате или водяной бане с температурой (37 +1) °С в течение 5 мин, и перемешивают. Все три пробирки помещают в ультратермостат или водяную баню с температурой (37 + 1)°Сна 15 мин.

5.5.3    В контрольную пробирку вносят 4 см3 раствора субстрата фитата натрия по 5.3.3. В контрольную и две опытные пробирки добавляют по 4,0 см3 ванадиево-молибденового реактива по 5.3.2 и тщательно перемешивают.

5.5.4    Пробирки (две опытные и одну контрольную) выдерживают 10 мин при комнатной температуре. Растворы колориметрируют при длине волны от 400 до 415 нм, в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм, против контроля на реактивы. При необходимости (опалесценция, взвесь и т.д.) растворы центрифугируют при 7000 мин-1.

6 Обработка результатов

6.1    Молярную концентрацию фосфатов (мкмоль/см3) в опытных и контрольных растворах определяют по градуировочному графику.

6.2    Ферментативную активность фитазы ФА, ед./г, в анализируемом образце, рассчитывают по формуле

ФА = (Со~Ск),    (1)

с/

где С0 — молярная концентрация фосфатов в опытной пробе в соответствии с градуировочным графиком, мкмоль/см3;

Ск — молярная концентрация фосфатов в контрольной пробе в соответствии с градуировочным графиком, мкмоль/см3;

t — продолжительность гидролиза, мин;

с — массовая концентрация ферментного препарата, содержащаяся в реакционной смеси, г/см3, рассчитываемая по формуле

т

(2)

С =

VP

где т — масса навески ферментного препарата, г;

V — объем разведения навески при приготовлении основного раствора, см3;

Р — разведение основного раствора ферментного препарата для приготовления рабочего раство-

6.3 За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, округленное до первого десятичного знака (Х +А), ед./г, при доверительной вероятности Р= 0,95, где Д= 0,01 8Х.

Границы относительной погрешности 5 = + 7 % при доверительной вероятности Р = 0,95.

7 Сходимость и воспроизводимость результатов

7.1 Результаты измерений, полученные в условиях повторяемости (сходимости), признаются удовлетворительными, если выполняется условие приемлемости:

гдеХ, иХ2 — результаты двух параллельных определений, полученные в условиях повторяемости при _ Р = 0,95, ед./г;

X — среднеарифметическое двух параллельных определений, ед./г; г— предел повторяемости (сходимости), равный 5 %.

7.2 Результаты измерений, полученные в условиях воспроизводимости, признаются удовлетворительными, если выполняется условие приемлемости:

гдеХ1 иХ2 — результаты двух определений, выполненных в двух разных лабораториях, ед./г;

X — среднеарифметическое двух определений, выполненных в двух разных лабораториях, ед./г;

R — предел воспроизводимости, равный 10 %.

pa по 5.4.3.

|Х -Х2| <г0,01Х,

(3)

IX -Х2| <R 0,01 X,

(4)

Библиография

[1] Enzyme Nomenclature, recommendations of the nomenclature Committeteofthe IUB, N.Y., Academic Press, 1984

УДК 619:615.355:636.087.8    МКС 07.100.30    С09

65.120

Ключевые слова: препараты ферментные, ферментативная активность фитазы, метод определения активности фитазы с образованием молибденовой сини, метод определения активности фитазы с образованием фосфорнованадиево-молибденового комплекса

Редактор Н.В. Таланова Технический редактор Н.С. Гоишанова Корректор М.В. Бучная Компьютерная верстка ИЛ. Налейкиной

Сдано в набор 16.10.2012. Подписано в печать 14.11.2012. Формат 60 х 84%. Гарнитура Ариал. Уел. печ. л. 1,40. Уч.-изд. л. 1,10. Тираж 110 экз. Зак. 1032.

ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ», 123995 Москва, Гранатный пер., 4.     

Набрано во ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» на ПЭВМ.

Отпечатано в филиале ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» — тип. «Московский печатник», 105062 Москва, Лялин пер., 6.