ГОСТ Р 50480-93 Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Sаlmоnеllа

ГОСТ 30519-97
--------------------------
ГОСТ Р 50480-93

Группа Н09

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Метод выявления бактерий рода Salmonella

Food products. Method for detection of Salmonella

МКС 07.100.30
ОКСТУ 9109

Дата введения 1994-01-01

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

1 РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Всероссийским научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности (ВНИИКОП) и Техническим комитетом по стандартизации ТК 93 "Продукты переработки плодов и овощей"

2 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 26.12.93 N 24

Постановлением Госстандарта России от 16 апреля 1998 года N 122 ГОСТ 30519-97 введен в действие в качестве государственного стандарта Российской Федерации с момента принятия указанного постановления и признан имеющим одинаковую силу с ГОСТ Р 50480-93 на территории Российской Федерации в связи с полной аутентичностью их содержания

3 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

4 ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

5 ПЕРЕИЗДАНИЕ


Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления в определенной навеске продукта бактерий рода Salmonella.

1 Сущность метода

1 Сущность метода

Метод выявления бактерий рода Salmonella основан на высеве определенного количества продукта в жидкую неселективную среду, инкубировании посевов, последующем выявлении в этих посевах бактерий, способных развиваться в жидких селективных средах, образующих типичные колонии на агаризованных дифференциально-диагностических средах, имеющих типичные для бактерий рода Salmonella биохимические и серологические характеристики.

2 Отбор и подготовка проб

Отбор и подготовка проб - по ГОСТ 26668, ГОСТ 26669 или по нормативно-технической документации на анализируемый продукт.

3 Аппаратура, материалы, реактивы

Для проведения анализа применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1, а также указанные ниже:

весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104* с наибольшим пределом взвешивания 200 г, 2-го класса точности (для взвешивания реактивов);
_____________
* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001.

весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 1 кг, 4-го класса точности (для взвешивания продукта);

микроскоп световой биологический с увеличением 900-1000;

петлю бактериологическую;

стекла предметные по ГОСТ 9284;

стекла покровные по ГОСТ 6672;

термостат с диапазоном рабочих температур 28-55 °С, позволяющий поддерживать заданную температуру с допустимой погрешностью ±1 °С.

спирт изобутиловый по ГОСТ 9536;

бриллиантовый зеленый;

желчь сухую или натуральную;

контрольный штамп* бактерий рода Salmonella, не относящихся к тифозной группе;
________________
* Текст соответствует оригиналу. - Примечание "КОДЕКС".

магний хлористый по ГОСТ 4209;

мочевину по ГОСТ 6691;

сухие агглютинирующие адсорбированные поливалентные сальмонеллезные сыворотки основных групп А, В, С, Д, Е и редких групп;

феноловый красный.

4 Подготовка к анализу

4.1 Приготовление растворов и реактивов

4.1.1 Раствор бриллиантового зеленого концентрации 5 г/дм: 0,5 г бриллиантового зеленого переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в дистиллированной воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.

4.1.2 Раствор фенолового красного концентрации 4 г/дм: 0,4 г фенолового красного переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в дистиллированной воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.

4.1.3 Реактив Эрлиха: 1,0 г парадиметиламинобензальдегида растворяют в 95 см этилового спирта объемной концентрации 96% и прибавляют 80 см концентрированной соляной кислоты (=1,18-1,19 г/см).

4.1.4 Реактив Ковача: перемешивают 5,0 г парадиметиламинобензальдегида, 25 см концентрированной соляной кислоты и 75 см изобутилового спирта.

4.1.5 Спиртовой раствор -нафтола концентрации 50 г/дм: 5,0 г -нафтола помещают в колбу вместимостью 100 см, растворяют в этиловом спирте объемной концентрации 96% и доводят раствор этиловым спиртом до метки. Раствор готовят непосредственно перед применением.

4.1.6 Спиртовой раствор фенолового красного концентрации 2 г/дм: 0,2 г фенолового красного переносят в колбу вместимостью 100 см, растворяют в этиловом спирте объемной концентрации 50% и доводят раствор этиловым спиртом до метки.

4.1.7 Сухие агглютинирующие адсорбционные поливалентные сальмонеллезные сыворотки готовят перед употреблением по прописи, указанной в прилагаемом к ним наставлении.

4.2 Приготовление питательных сред

4.2.1 Забуференная пептонная вода: 10,0 г пептона, 5,0 г хлористого натрия, 9,0 г двузамещенного фосфорно-кислого натрия (NaHPO·12HO), 1,5 г однозамещенного фосфорно-кислого калия растворяют при нагревании в 1000 см дистиллированной воды, устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25 °С 7,0±0,1. Разливают по колбам в количестве, зависящем от навески анализируемого продукта (если навеска равна 25 г, то разливают по 225 см, то есть 1:9), и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.

4.2.2 Магниевая среда: готовят путем соединения трех растворов.

Приготовление раствора 1: 8,4 г пептона, 14,3 г хлористого натрия, 40 см дрожжевого экстракта, приготовленного по ГОСТ 10444.1, 2,85 г однозамещенного фосфорно-кислого калия растворяют при нагревании в 1780 см дистиллированной воды.

Приготовление раствора 2: 71,4 г хлористого магния (MgCl·6НО) растворяют при нагревании в 180 см дистиллированной воды.

Раствор 3: берут 1,8 см раствора бриллиантового зеленого, приготовленного по 4.1.1.

Приготовленные растворы соединяют, устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25 °С 7,2±0,2, разливают в колбы или флаконы по 100 см и стерилизуют при температуре (112±1) °С в течение 30 мин.

4.2.3 Селенитовая среда: готовят из двух растворов.

Приготовление раствора 1: 5,0 г пептона, 7,0 безводного двузамещенного фосфорно-кислого натрия, 3,0 г безводного однозамещенного фосфорно-кислого натрия, 4,0 г лактозы растворяют при нагревании в 1000 см дистиллированной воды, охлаждают до 45-55 °С, если необходимо, путем изменения соотношения фосфатных солей устанавливают рН 7,0±0,1. Среду разливают по 100 см в колбы или флаконы и стерилизуют текучим паром по 30 мин в течение двух дней или при температуре (112±1) °С в течение 30 мин.

Приготовление раствора 2: 10,0 г кислого селенисто-кислого натрия (NaHSeО) растворяют асептически в 100 см стерильной дистиллированной воды. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.

Приготовление среды: к 100 см раствора 1 прибавляют 4 см раствора 2.

Стерилизация приготовленной среды не допускается, так как при этом происходит редукция кислого селенисто-кислого натрия, выпадает осадок красного цвета и среда становится непригодной.

Селенитовая среда выпускается в сухом виде и готовится по прописи, указанной на этикетке.

4.2.4 Тетратионатная среда (Мюллер-Кауфман)

Приготовление основы среды: в 100 см мясо-пептонного бульона, приготовленного по ГОСТ 10444.1, помещают 4,5 г стерильного углекислого кальция. Углекислый кальций стерилизуют по ГОСТ 10444.1.

Приготовленную основу стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.

При приготовлении среды к 100 см основы среды асептически прибавляют:

10 см раствора гипосульфита натрия (NaSO·5НО);

2 см йодного раствора;

0,2 см раствора бриллиантового зеленого;

5 см раствора желчи.

Указанные растворы прибавляют к основе среды в приведенном выше порядке, перемешивая смесь после каждого прибавления.

Среду допускается использовать в течение одной недели после приготовления.

Указанные выше растворы, прибавляемые к основе среды, готовят следующим образом:

раствор гипосульфита натрия: 50,0 г гипосульфита натрия помещают в колбу вместимостью 100 см, растворяют в дистиллированной воде и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор переливают в колбу или флакон и стерилизуют текучим паром в течение 30 мин или при температуре (121±1) °С в течение 20 мин;

йодный раствор: 25,0 йодистого калия помещают в колбу вместимостью 100 см, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, прибавляют 20,0 г кристаллического йода, растворяют его. Объем раствора доводят дистиллированной водой до метки.

Раствор хранят в плотно закрытом темном сосуде;

раствор бриллиантового зеленого готовят по 4.1.1;

раствор желчи: 10,0 г сухой желчи растворяют в 100 см дистиллированной воды или используют натуральную желчь. Раствор желчи или натуральную желчь стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.

4.2.5 Дифференциально-диагностические среды (сухие):

висмут-сульфит агар (Вильсон-Блера);

среду Плоскирева;

среду Эндо;

среду Левина.

Среды готовят по прописи, указанной на этикетке.

4.2.6 Трехсахарный агар: 10,0 г пептона, 3,0 г сухого дрожжевого экстракта или 15 см дрожжевого экстракта, приготовленного по ГОСТ 10444.1, 10,0 г лактозы, 10,0 г сахарозы, 1,0 г глюкозы, 0,3 г цитрата железа (или 0,2 г аммоний-железо сульфата (NН)Fe(SO)·6НО или 0,2 г сернокислого железа FeSO·6НО), 0,3 г гипосульфита натрия, 6 см раствора фенолового красного, приготовленного по п.4.1.2, 15,0 г агара растворяют при нагревании в 1000 см мясо-пептонного бульона, приготовленного по ГОСТ 10444.1, охлаждают до 45-55 °С и устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25 °С 7,2±0,2. Среду разливают в пробирки по 6-7 см и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 10 мин.

4.2.7 Агар Кристенсена с мочевиной: среда готовится путем соединения основы среды и раствора мочевины.

Основа среды: 1,0 г пептона, 1,0 г глюкозы, 5,0 г хлористого натрия, 2,0 г безводного однозамещенного фосфорнокислого калия, 3 см раствора фенолового красного, приготовленного по 4.1.2, 15,0 агара растворяют при нагревании в 1000 см дистиллированной воды, охлаждают до 45-55 °С и устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25 °С 6,7±0,1.

Основу среды мерно разливают в колбы или флаконы и стерилизуют при температуре (121±1)°С в течение 20 мин.

Раствор мочевины концентрации 400 г/дм: 40,0 г мочевины помещают в колбу вместимостью 100 см, растворяют в дистиллированной воде, объем раствора доводят дистиллированной водой до метки.

Раствор мочевины стерилизуют фильтрацией по ГОСТ 26670 или текучим паром в течение 30 мин.

При приготовлении среды к 950 см основы прибавляют асептически 50 см раствора мочевины, разливают в стерильные пробирки по 6-7 см.

4.2.8 После стерилизации среды, приготовленные по 4.2.6 и 4.2.7, скашивают так, чтобы оставался столбик высотой 2-2,5 см.

4.2.9 Полужидкий мясо-пептонный агар: готовят по ГОСТ 10444.1 так же, как мясо-пептонный агар, но при приготовлении добавляют 4,0-8,0 г агара на 1000 см мясо-пептонного бульона, перед стерилизацией среду разливают по 6-7 см в пробирки.

4.2.10 Мясо-пептонный бульон с глюкозой: готовят по ГОСТ 10444.1. Для посевов используют среду, разлитую в пробирки по 6-7 см.

4.2.11 Бульон Хоттингера: готовят по ГОСТ 10444.1. Для посевов используют среду, разлитую в пробирки по 6-7 см.

4.2.12 Мясо-пептонный бульон с 0,05% L-триптофана: 0,05 L-триптофана растворяют в 100 сммясо-пептонного бульона, приготовленного по ГОСТ 10444.1, разливают в пробирки по 6-7 см и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.

4.2.13 Среды с углеводами (среды Гисса): готовят по ГОСТ 10444.1 или используют сухие среды с углеводами, которые готовят по прописи, указанной на этикетке.

4.2.14 Мясо-пептонный агар: готовят по ГОСТ 10444.1 или используют среду, приготовленную из сухого питательного агара.

Среду из сухого питательного агара готовят по прописи, указанной на этикетке.

5 Проведение анализа

5.1 Неселективное предварительное обогащение

Навеску продукта, в массе (объеме) которой нормативно-технической документацией на анализируемый продукт предусматривается отсутствие бактерий рода Salmonella, высевают в забуференную пептонную воду, приготовленную по 4.2.1. Соотношение массы (объема) продукта и забуференной пептонной воды 1:9.

При посеве жидких высококислотных продуктов для предотвращения снижения рН питательных сред на 0,5 и более рН продукта перед посевом доводят до 7,0±0,2.

При посеве твердых высококислотных продуктов доводят рН до 7,0±0,2 в посевах.

Доведение рН проводят асептически с помощью стерильных растворов гидроокиси натрия и соляной кислоты, приготовленных по ГОСТ 10444.1. Количество добавляемого раствора гидроокиси натрия устанавливают опытным путем.

Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 18-20 ч.

5.2 Селективное обогащение

Культуры, полученные после инкубирования по 5.1, пересевают в две среды для селективного обогащения. Для этого по 10 см культуры переносят в 100 см магниевой среды, приготовленной по 4.2.2, и в 100 см тетратионатной среды, приготовленной по 4.2.4, или по 10 см культуры переносят в 100 см селенитовой среды, приготовленной по 4.2.3, и в 100 см тетратионатной среды.

Посевы инкубируют в течение 24-48 ч на магниевой и селенитовой средах при температуре (36±1) °С, а на тетратионатной среде при температуре (43±1) °С.

5.3 Выделение и идентификация культур на агаризованных дифференциально-диагностических средах

Культуры через 24 и 48 ч инкубирования по 5.2 пересевают (по ГОСТ 26670) на три агаризованные среды, приготовленные по 4.2.5: висмут-сульфит агар, среду Плоскирева и среду Эндо (или среду Левина).

Допускается использование одной чашки каждой из сред одновременного высева с двух селективных сред.

Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24-48 ч.

После 24 ч инкубирования посевов проводят предварительный учет результатов, а после 48 ч - окончательный.

После инкубирования посевов отмечают на дифференциально-диагностических средах рост колоний, характерных для бактерий рода Salmonella:

на висмут-сульфит агаре колонии черные с характерным металлическим блеском, а также зеленоватые с темно-зеленым ободком и с пигментированием среды под колониями;

на среде Плоскирева колонии бесцветные прозрачные, но более плотные, чем на среде Эндо;

на среде Эндо колонии круглые бесцветные или слегка розоватые, прозрачные;

на среде Левина колонии прозрачные, слабо-розовые или розовато-фиолетовые.

При отсутствии в посевах на дифференциально-диагностических средах характерных для бактерий рода Salmonella колоний дают заключение об отсутствии бактерий рода Salmonella в анализируемой навеске продукта.

При наличии хотя бы на одной дифференциально-диагностической среде характерных для бактерий рода Salmonella колоний проводят их дальнейшее изучение.

5.4 Биохимическое подтверждение принадлежности выделенных характерных колоний к бактериям рода Salmonella

5.4.1 Не менее трех характерных колоний с каждой дифференциально-диагностической среды (см. 5.3) пересевают на скошенную поверхность мясо-пептонного агара или среды из сухого питательного агара, приготовленных по 4.2.14, и часть колоний пересевают штрихом по поверхности и уколом в столбик трехсахарного агара, приготовленного по 4.2.6.

Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24 ч.

5.4.2 Из отобранных по п.5.4.1 для биохимического подтверждения колоний приготовляют мазки и окрашивают по Граму.

Бактерии рода Salmonella являются грамоотрицательными палочками с закругленными концами.

5.4.3 После инкубирования посевов, как указано в 5.4.1, проводят учет результатов ферментации лактозы, глюкозы и сахарозы на трехсахарном агаре:

пожелтение скошенной части среды указывает на ферментацию лактозы или сахарозы или обоих сахаров;

пожелтение столбика среды с разрывом агара или пузырьками газа указывает на ферментацию глюкозы с образованием газа, пожелтение столбика среды без разрывов или пузырьков газа указывает на ферментацию глюкозы без образования газа;

почернение среды в столбике указывает на образование сероводорода.

Типичными для бактерий рода Salmonella являются культуры, ферментирующие глюкозу с образованием или без образования газа, не ферментирующие лактозу и сахарозу, образующие сероводород.

Дальнейшему изучению подвергают также лактозоположительные бактерии или бактерии, не образующие сероводород, но обязательно ферментирующие глюкозу с образованием или без образования газа.

5.4.4 У культур, отобранных согласно 5.4.3 и пересеянных предварительно, как указано в 5.4.1, на поверхность мясо-пептонного агара или среды, приготовленной из сухого питательного агара, изучают возможность расщепления мочевины, образования ацетоина и индола, ферментации сахарозы и маннита и подвижность.

5.4.5 Определение расщепления мочевины

Культуры пересевают штрихом на поверхность агара Кристенсена с мочевиной, приготовленного по 4.2.7.

Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24 ч.

При положительной реакции - расщеплении мочевины цвет среды от розового до светло-вишневого. Для уреазоположительных бактерий реакция часто становится видимой после 2 ч инкубирования.

Бактерии рода Salmonella не расщепляют мочевину.

5.4.6 Определение образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауера)

Культуры пересевают в мясо-пептонный бульон с глюкозой, приготовленный по 4.2.10.

Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 48 ч.

После инкубирования к 1 см отобранной культуральной жидкости прибавляют 0,6 см раствора -нафтола, приготовленного по 4.1.5, и 0,2 см раствора гидроокиси калия концентрации 400 г/дм. После прибавления каждого реактива пробирку встряхивают. Появление розового окрашивания через 15 мин указывает на положительную реакцию.

Бактерии рода Salmonella не образуют ацетоина (реакция Фогес-Проскауера отрицательная).

5.4.7 Определение образования индола

Культуры пересевают в бульон Хоттингера, приготовленный по 4.2.11, или в мясо-пептонный бульон с L-триптофаном, приготовленный по 4.2.12.

Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24 ч.

После инкубирования к посевам прибавляют по 1 см реактива Эрлиха или Ковача, приготовленных соответственно по 4.1.3 и 4.1.4.

Образование красного слоя указывает на положительную реакцию.

Бактерии рода Salmonella не образуют индол.

5.4.8 Определение ферментации маннита и сахарозы

Культуры пересевают в среды Гисса с маннитом или сахарозой, приготовленные по 4.2.13.

Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24 ч.

Бактерии рода Salmonella не сбраживают сахарозу, не сбраживают маннит. При сбраживании маннита цвет среды изменяется, образуется или не образуется газ.

5.4.9 Определение подвижности

Культуры пересевают уколом в полужидкий мясо-пептонный агар.

Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24 ч.

При росте подвижных культур отмечается диффузный рост по всему столбику агара, при росте неподвижных культур - вдоль места укола.

Большинство штаммов бактерий рода Salmonella подвижны.

5.5 Результаты биохимического подтверждения культур оценивают, пользуясь таблицей приложения.

5.6 Серологическое подтверждение принадлежности культур к бактериям рода Salmonella

Серологическое подтверждение принадлежности к бактериям рода Salmonella проводят с культурами, давшими типичные биохимические реакции согласно приложению, и предварительно пересеянными, как указано в 5.4.1, на поверхность мясо-пептонного агара или среды, приготовленной из сухого питательного агара.

5.6.1 Определение самоагглютинирующих штаммов

Помещают каплю физиологического раствора, приготовленного по ГОСТ 10444.1, на тщательно очищенное предметное стекло. Диспергируют в этой капле часть тестируемой колонии так, чтобы получилась гомогенная и густая суспензия.

Покачивают осторожно стекло в течение 30-60 с. Отмечают результаты на темном фоне, лучше с помощью увеличительного стекла. Если наблюдается в разной степени склеивание бактерий, то есть образование осадка, то считают, что тестируемые штаммы обладают самоагглютинацией.

Штаммы бактерий, обладающие самоагглютинацией, не подвергают дальнейшей серологической идентификации.

5.6.2 Определение наличия 0-антигенов

Штаммы, у которых не выявлено самоагглютинации, испытывают в реакции агглютинации с агглютинирующими адсорбированными поливалентными сальмонеллезными сыворотками основных групп А, В, С, D, Е, а затем, если не выявлено 0-антигенов с сыворотками основных групп, ставят реакцию с сыворотками редких групп.

Подготовка сывороток к постановке реакции агглютинации и методика ее проведения указаны в наставлении, прилагаемом к сывороткам.

Агглютинация (наличие 0-антигенов) проявляется в виде склеивания бактериальной массы и полного или частичного просветления жидкости.

При отрицательной реакции агглютинации культура после тщательного смешивания с каплей сыворотки образует гомогенную смесь.

5.7 При определении биохимических и серологических характеристик выделенных культур в качестве контроля используют типичный по этим показателям штамм бактерий рода Salmonella, указанный в разд.3.

6 Оценка результатов

6.1 Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

6.2 Интерпретация биохимических и серологических испытаний

Культуры, показавшие типичные биохимические и серологические реакции, относят к бактериям рода Salmonella.

Предположительно к бактериям рода Salmonella относят:

культуры, у которых не обнаружено самоагглютинации и 0-антигенов, но показавшие типичные биохимические реакции;

культуры, у которых обнаружена самоагглютинация и типичные биохимические реакции.

Культуры, у которых не обнаружено самоагглютинации, не давшие типичных биохимических и серологических реакций, не относят к бактериям рода Salmonella.

6.3 Результаты выявления бактерий рода Salmonella в определенной навеске продукта записывают: "бактерии рода Salmonella обнаружены в г (см) продукта" или "бактерии рода Salmonella не обнаружены в г (см) продукта".

- масса (объем) навески продукта, в которой выявляли бактерии рода Salmonella.

ПРИЛОЖЕНИЕ (обязательное). Биохимическая характеристика четырех подродов Salmonella и атипичных видов, входящих в подрод Salmonella I

ПРИЛОЖЕНИЕ
(обязательное)

Текст документа сверен по:
официальное издание

Молоко и молочные продукты.
Общие методы анализа: Сб. ГОСТов. -
М.: ИПК Издательство стандартов, 2004