ГОСТ 27318-87 Животные сельскохозяйственные. Методы идентификации атипичных микобактерий

ГОСТ 27318-87

(CT СЭВ 5627-86)

Группа С79

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ

Методы идентификации атипичных микобактерий

Agricultural animals. Methods of identification of non-typical microbacteria

ОКСТУ 9809

Срок действия с 01.01.88

до 01.01.93*
______________________________
* Ограничение срока действия снято
по протоколу N б/н Межгосударственного Совета
по стандартизации, метрологии и сертификации
(ИУС N 2, 1993 год). - .

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Госагропромом СССР

ИСПОЛНИТЕЛИ

Н.П.Овдиенко, канд. вет. наук (руководитель темы); А.М.Кадочкин, канд. вет. наук; В.И.Косенко, канд. вет. наук; В.А.Шаров, канд. вет. наук; А.Н.Шаров, канд. вет. наук; В.С.Тырина, канд. биол. наук; Б.И.Антонов; Э.С.Плотников; А.В.Ткаченко-Кузьмин, канд. вет. наук

2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 02.06.87 N 1797.

3. СРОК ПРОВЕРКИ - 1992 г.

ПЕРИОДИЧНОСТЬ ПРОВЕРКИ - 5 ЛЕТ

4. СТАНДАРТ ПОЛНОСТЬЮ СООТВЕТСТВУЕТ СТ СЭВ 5627-86

5. ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

6. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

Настоящий стандарт устанавливает бактериоскопический, культуральный, биохимический, биологический и серологический методы идентификации атипичных микобактерий.

Стандарт применяют при идентификации атипичных микобактерий в ветеринарных лабораториях научно-исследовательских учреждений и республиканских производственных ветеринарных лабораториях.

1. БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД

1.1. Сущность метода заключается в способности микобактерий, окрашенных фуксином, удерживать краситель после длительного обесцвечивания в соляно-кислом спирте.

1.2. Средства испытаний

Для проведения испытаний применяют:

микроскопы биологические марки МПИ или МРП по ГОСТ 8284-78;

осветитель;

горелку газовую или спиртовую;

стекла предметные;

часы песочные на 5 мин;

петли бактериологические;

весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104-80;

пинцет;

бумагу фильтровальную;

фенол по ГОСТ 6417-72;

спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67;

кислоту соляную концентрированную по ГОСТ 3118-77, х.ч. или ч.д.а.;

натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, ч.д.а.;

калия гидроокись по ГОСТ 24363-80, ч.д.а.;

фуксин основной;

глицерин по ГОСТ 6259-75;

масло иммерсионное по ГОСТ 13739-78;

ксилол по ГОСТ 9410-78 или бензин авиационный;

фуксин Циля карболовый, раствор; готовят следующим образом: 1 г основного кристаллического фуксина растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты и 0,5 см этилового спирта. После растирания краски прибавляют при постоянном помешивании 90 см дистиллированной воды. Раствор краски через 24 ч фильтруют через бумажный фильтр.

Карболовый раствор фуксина хранят во флаконах из темного стекла с притертой пробкой.

метиленовую синь;

культуры микобактерий;

соляно-кислый спирт, раствор с массовой концентрацией соляной кислоты 3%; готовят следующим образом: 3 см концентрированной соляной кислоты добавляют к 97 см 96%-ного этилового спирта;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.

1.3. Проведение испытаний

Из отдельной колонии изучаемой культуры готовят тонкий мазок на предметном стекле, который высушивают при комнатной температуре и фиксируют над пламенем. На фиксированный препарат кладут узкую полоску фильтровальной бумаги, закрывающую мазок полностью.

На полоску фильтровальной бумаги наливают карбол фуксина Циля и нагревают до появления паров (два-три раза) в течение 5 мин (не доводя краску до кипения). Раствор краски при этом каждый раз добавляют. Дают препарату остыть, удаляют пинцетом бумагу, сливают избыток красителя и препарат промывают проточной водой.

Для обесцвечивания на предметное стекло наливают раствор соляно-кислого спирта до тех пор, пока он без окрашивания будет стекать с предметного стекла.

После обесцвечивания препарат тщательно промывают водой и окрашивают метиленовой синью в течение 3-5 мин. Затем препарат промывают водой, высушивают на воздухе и просматривают в световом микроскопе с иммерсией.

1.4. Оценка результатов

Нахождение в поле зрения микроскопа кислотоустойчивых микобактерий и отсутствие посторонних микроорганизмов является показателем чистоты испытуемой культуры.

У быстрорастущих культур микобактерий IV группы по Раньону наряду с кислотоустойчивыми встречаются и некислотоустойчивые формы микобактерий.

2. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД

2.1. Сущность метода заключается в получении при пересевах единичных колоний, определении морфологии и характера роста микобактерий на питательных средах.

2.2. Средства испытаний

Для проведения испытаний применяют:

весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104-80;

горелку газовую или спиртовую;

петли бактериологические;

термостат с автоматическим регулированием температуры;

автоклав электрический с рабочим давлением 0,15 МПа (1,5 кгс/см);

шкаф сушильный электрический для стерилизации лабораторного стекла с диапазоном изменения температуры от 50 до 220°С;

аппарат Коха для стерилизации питательных сред текучим паром;

рН-метр 340;

аппарат для встряхивания;

центрифугу лабораторную с частотой вращения 3000 мин;

лупу с увеличением и ;

штативы металлические для пробирок диаметром 16 мм;

пробирки бактериологические стеклянные по ГОСТ 1770-74;

пипетки градуированные исполнений 1, 2, 4, 5, 6 вместимостью 1, 2, 5 и 10 см 2-го класса точности по ГОСТ 20292-74;

палочки стеклянные;

пробки ватно-марлевые;

натрий хлористый по ГОСТ 4233-77, ч.д.а., раствор с массовой долей 0,85%;

магний лимоннокислый, ч.д.а.;

калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198-75, ч.д.а.;

магний сернокислый, ч.д.а.;

парафин по ГОСТ 23683-79;

L-аспарагин;

глицерин по ГОСТ 6259-75;

малахитовая зелень, раствор с массовой долей 2%;

спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67 с массовой долей 96 и 70%;

среду Левенштейна-Йенсена; готовят следующим образом: 2,4 г однозамещенного фосфорнокислого калия, 0,24 г магния сернокислого, 0,6 г магния лимоннокислого, 3,6 г L-аспарагина, 12 см глицерина растворяют в указанной последовательности в 600 см воды при слабом подогревании и стерилизуют в течение 2 ч текучим паром. К раствору добавляют 100 см яичной массы. Смесь фильтруют через марлевый фильтр, добавляют 200 см стерильного 2%-ного раствора малахитовой зелени и разливают в пробирки приблизительно по 5 см. Свертывание проводят при 85°С в течение 45 мин.

Яичную массу готовят из свежих диетических яиц, вымытых проточной теплой водой щеткой с мылом. Вымытые яйца погружают на 30 мин в 70%-ный спирт, а затем над спиртовкой в боксе разбивают стерильным пинцетом в колбу со стеклянными шариками и хорошо перемешивают;

бульон мясо-пептонный (МПБ);

воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.

Примечания:

1. Для контроля стерильности указанные среды помещают в термостат с температурой 37-38°С на 2 сут.

2 При посевах используют среды, приготовленные не более чем за 14 сут до испытания.

2.3. Проведение испытания

С целью получения единичных колоний и учета скорости роста при разных температурных режимах, а также характера роста на мясо-пептонном бульоне с поверхности отдельной колонии берут 2-5 мг испытуемой культуры микобактерий и помещают в стерильную пробирку с 1-2 см раствора хлористого натрия с массой долей 0,85%.

Взятую массу микобактерий растирают стеклянной палочкой по стенке пробирки и добавляют раствор хлористого натрия до концентрации 1 мг/см.

Взвесь культуры микобактерий высевают с помощью пипетки диаметром 3-4 мм в пять пробирок со средой Левенштейна-Йенсена и в две пробирки с мясо-пептонным бульоном. Обе пробирки с мясо-пептонным бульоном и одну пробирку со средой Левенштейна-Йенсена инкубируют при 37-38°С. По одной пробирке со средой Левенштейна-Йенсена инкубируют при 25 и 45°С. Две оставшиеся пробирки со средой Левенштейна-Йенсена ставят в термостат при 37-38°С для изучения пигментообразования.

Учет роста при различных температурах оценивают, разместив пробирки с питательными средами, инкубированными при различных температурах, рядом друг с другом, и сопоставив развитие отдельных колоний.

При оценке регистрируют, на какой питательной среде и в какой срок появляется колония бактерий, и какова ее пигментированность.

2.4. Оценка результатов

Колонии, выросшие на среде Левенштейна-Йенсена до 7 сут, а также образовавшие в течение этого срока на мясо-пептонном бульоне кольцо или пленку относят к группе IV по Раньону.

Колонии, развившиеся в сроки свыше 7 сут, относят к группам I, II и III по Раньону.

Культуры М. bovis или М. tuberculosis растут медленнее (от 21 до 70 сут).

Медленно растущие скотохромогенные микобактерии и микобактерии комплекса aviurn*-intracellulare образуют придонный рост, а микобактерии комплекса nonchromogenicum преимущественно образуют кольцо или пленку на поверхности среды в более поздние сроки.

_______________

* Текст документа соответствует оригиналу. - .

3. БИОХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД

3.1. Сущность метода заключается в определении вида культуры или отдельного комплекса микобактерий на основании изучения их биохимических свойств путем применения отдельных тестов.

3.2. Тест - пигментообразование

3.2.1. Сущность теста заключается в образовании культурой пигмента в различных условиях: в темноте и на свету.

Исследованию подвергаются только медленно растущие культуры.

3.2.2. Средства испытаний

Для проведения испытаний применяют:

лампу электрическую мощностью 100 Вт;

термостат с автоматическим регулированием температуры;

бумагу светонепроницаемую;

культуры микобактерий;

среду Левенштейна-Йенсена по п.2.2;

бульон мясо-пептонный.

3.2.3. Проведение испытания

Микробную массу в разведении соответственно 10, 10 и 10 вносят в две пробирки питательных сред. Одну пробирку с питательной средой инкубируют, завернув ее в светонепроницаемую бумагу, при полном отсутствии света при температуре 25, 37 и 45°С в течение трех недель. Другую пробирку подвергают освещению в течение 1 ч на расстоянии 1 м от источника света мощностью 100 Вт и инкубируют в течение 7 и 12 сут при тех же температурных режимах и сроках.

По истечении трех недель регистрируют выросшие на двух питательных средах колонии и их пигментированность.

3.2.4. Оценка результатов

Если колонии за время инкубирования выделили пигмент, то культуру относят к группе I по Раньону (фотохромогенная группа). Если культура образовала пигмент при полном отсутствии света, то ее относят к группе II по Раньону (скотохромогенная).

Если культура не выделила пигмента, то ее относят к группе III по Раньону (нефотохромогенная группа).

3.3. Тест - редукция нитратов

3.3.1. Сущность теста заключается в определении активности нитратредуктазы по количеству восстановленного из нитрата нитрита, определении микобактерий по изменению окраски.

3.3.2. Средства испытаний

Для проведения испытаний применяют:

лопатку платиновую;

термостат с автоматическим регулированием температуры;

автоклав электрический с рабочим давлением 0,15 МПа (1,5 кгс/см);

весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24204-80;

рН-метр 340;

пробирки бактериологические стеклянные по ГОСТ 1770-74;

натрий фосфорнокислый двухзамещенный по ГОСТ 11773-76, ч.д.а.;

калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198-75, ч.д.а.;

парадиметиламинобензальдегид, раствор с массовой долей 2% в растворе соляной кислоты с массовой концентрацией 10%;

кислоту соляную по ГОСТ 3118-77, х.ч. или ч.д.а.; раствор с массовой концентрацией соляной кислоты 10%;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.

3.3.3. Подготовка к испытанию

Готовят фосфатный буферный раствор следующим образом:

растворяют 9,47 г двухзамещенного фосфорнокислого натрия в 1 дм (раствор 1);

растворяют 9,05 г однозамещенного фосфорнокислого калия в 1 дм воды (раствор 2).

Для получения 100 см фосфатного буфера к 61,1 см раствора 1 добавляют 38,9 см раствора 2 (рН 7,0). Полученный раствор разливают по 4 см в пробирки и при 120°С автоклавируют в течение 15 мин. Раствор помещают в термостат при 37°С на 24 ч, после чего проверяют на стерильность.

3.3.4. Проведение испытания

В 1 см фосфатного буфера суспензируют 10 мг (одна платиновая лопатка) испытуемой культуры и инкубируют при 37-38°С в течение 15-16 ч.

Образование нитрата проверяют добавлением 2 капель раствора парадиметиламинобензальдегида.

3.3.5. Оценка результатов

Появление желтой окраски свидетельствует о положительной реакции. Для контроля используют виды микобактерий, дающие положительную и отрицательную реакцию на редукцию нитратов.

3.4. Тест - активность каталазы

3.4.1. Сущность теста заключается в способности клеток микобактерий образовывать в процессе роста фермент каталазу, количество которой различно у разных видов микобактерий. Каталаза разлагает перекись водорода на воду и молекулярный водород.

3.4.2. Средства испытаний

Для проведения испытаний применяют:

линейку измерительную;

пипетки градуированные исполнений 1, 2, 4, 5, 6 вместимостью 5 см 2-го класса точности по ГОСТ 20292-74;

петлю бактериологическую;

пробирки бактериологические стеклянные по ГОСТ 1770-74;

культуры микобактерий;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.

3.4.3. Проведение испытания

В пробирку с культурой, выращенной на среде Левенштейна-Йенсена при 37°С и имеющей не менее 10 мг бактериальной массы, вносят разбавленную в соотношении 1:1 водой перекись водорода в таком количестве, чтобы при наклонном положении она полностью перекрывала культуру микобактерий. Имеющееся в пробирке до внесения раствора незначительное количество конденсационной жидкости не удаляют.

Оценку реакций проводят по интенсивности образования пузырьков кислорода, образующихся в течение 5 мин после добавления раствора к культуре, и измеряют высоту столбика пены в миллиметрах при вертикальном положении пробирки.

3.4.4 Оценка результатов

Положительной реакция считается, если образуется столбик пены высотой 45 мм и более, отрицательный - если высота столбика пены менее 45 мм или если не происходит образования пузырьков кислорода в течение 5 мин.

3.5. Тест - аккумуляция железа

3.5.1. Сущность теста заключается в способности испытуемых культур изменять свой цвет при воздействии лимонно-аммиачного железа.

3.5.2. Средства испытаний

Для проведения испытаний применяют:

термостат с автоматическим регулированием температуры;

петлю бактериологическую;

железо лимонно-аммиачное;

культуры микобактерий;

среду Левенштейна-Йенсена по п.2.2.

3.5.3. Проведение испытания

К питательной среде Левенштейна-Йенсена добавляют лимонно-аммиачное железо в таком количестве, чтобы конечная концентрация его составляла 2%. На эту среду высевают испытуемые культуры и выдерживают в течение 7 сут при температуре 37°С.

3.5.4. Оценка результатов

Реакция считается положительной, если культура окрашиваются в коричневый цвет, отрицательной - если культура остается прежнего цвета.

3.6. Тест - амидазная активность

3.6.1. Сущность теста основана на дезаминировании амидов и выделении аммиака, определяемого специальными реактивами.

3.5.4.* Оценка результатов

_________________

* Нумерация соответствует оригиналу. - .

Для проведения испытаний применяют:

автоклав;

культуры микобактерий;

петлю бактериологическую;

пробирки бактериологические стеклянные по ГОСТ 1770-74;

аппарат Коха;

весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104-80;

фильтр Зейтца;

марганец сернокислый по ГОСТ 429-76, ч.д.а.;

фенол по ГОСТ 6417-72;

натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, ч.д.а., раствор с массовой долей 0,5%;

гипохлорит кальция, ч.д.а., раствор с массовой долей 1%;

кальций углекислый по ГОСТ 4530-76, ч.д.а., раствор с массовой долей 20%;

реактив Русселя, состоящий из трех компонентов (раствора сульфата марганца, фенолового раствора и раствора гипохлорита кальция). Компоненты готовят следующим образом:

раствор сульфата марганца - 66,9 мг сульфата марганца растворяют в 100 см воды;

феноловый раствор - 12,5 г фенола в 5 см воды взбалтывают и приливают 25 см раствора гидроокиси натрия с массовой долей 0,5%, взбалтывают до полного растворения фенола и доводят объем водой до 50 см;

раствор гипохлорита - к 300 см нагретой до 90°С воды прибавляют 25 г гипохлорита кальция, взбалтывают и прибавляют 135 см раствора углекислого кальция с массовой долей 20%. Доводят до кипения на несколько минут, чтобы дать аммиаку улетучиться. Полученный раствор охлаждают и доводят объем водой до 500 см.

амидный ряд: ацетамид, бензамид, карбамид, изоникотинамид, никотинамид, пиразинамид, салициламид, аллантоин, сукцинамид, мелонамид;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.

3.6.3. Проведение испытания

Из каждого амида готовят раствор из расчета 400 мг/см, стерилизуют в течение 20 мин при 100°С, а карбамид - фильтрацией через фильтр Зейтца.

0,5 см взвеси испытуемых микобактерий плотностью 20 мг/см разливают в три ряда стерильных пробирок (по 10 пробирок в каждом ряду).

10 пробирок из первого ряда в течение 20 мин выдерживают при 100°С для инактивации бактерий. Затем в три пробирки каждого вертикального ряда добавляют последовательно перечисленные амиды в количестве 0,5 см. Пробирку инкубируют в течение 10 ч при 37°С, а затем в каждую пробирку вносят растворы реагентов в следующей последовательности:

а) 0,2 см сернокислого марганца;

б) 2,0 см раствора фенола;

в) 1,0 см раствора гипохлорита натрия с массовой долей 1%.

После внесения растворов реагентов пробирки хорошо встряхивают и выдерживают в течение 20 мин при 100°С. Учет реакций проводят через 60 и 90 мин.

3.6.4. Оценка результатов

Реакцию оценивают визуально и считают положительной, если в пробирке образуется сине-зеленое окрашивание.

3.7. Тест - рост на среде с содержанием хлористого натрия с массовой долей 5%

Сущность теста основана на способности атипичных быстрорастущих микобактерий (IV группа по Раньону) и М. triviale (III группа по Раньону) расти на среде, содержащей хлористый натрий.

3.7.1. Средства испытаний

Для проведения испытаний применяют:

термостат с автоматическим регулированием температуры;

горелку газовую или спиртовую;

весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104-80;

пипетки градуированные исполнений 1, 2, 4, 5, 6 вместимостью 1, 2, 5 и 10 см 2-го класса точности по ГОСТ 20292-74;

пробирки бактериологические стеклянные вместимостью 10 см по ГОСТ 1770-74;

бактериологические петли;

натрий хлористый по ГОСТ 4233-77, раствор с массовой долей 5%;

среду Левенштейна-Йенсена по п.2.2;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.

3.7.2. Проведение испытания

К 100 см питательной среды Левенштейна-Йенсена прибавляют 5 г хлористого натрия и хорошо смешивают перед свертыванием среды. Затем питательную среду разливают по 3-3,5 см в бактериологические пробирки. Подобным способом готовят и контрольные пробирки со средой, не содержащей хлористого натрия.

На питательную среду, содержащую хлористый натрий, и на среду без него высевают по 0,2 см исследуемой культуры плотностью 2-3 мг/см.

Культуру сначала инкубируют при 35°С с ослабленной пробкой до испарения влаги с поверхности питательной среды, затем пробирки плотно закрывают и продолжают инкубацию в течение 6 недель.

3.7.3. Оценка результатов

Если в течение указанного времени появляется более 50 колоний на питательной среде, содержащей хлористый натрий, культуру считают толерантной, если менее 50 колоний - резистентной к содержанию хлористого натрия.

В контрольных пробирках должен быть хороший рост культур в виде множественных сливающихся колоний.

4. БИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ М. avium от М. intracellulare

4.1. Сущность метода заключается в воспроизведении туберкулеза при введении кроликам и курам культур М. avium.

4.2. Средства испытаний

Для проведения испытаний применяют:

весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104-80;

микроскопы биологические марки МБИ или МРБ по ГОСТ 8284-78;

осветитель;

горелку газовую или спиртовую;

часы песочные по 5 мин;

шприцы вместимостью 1-2 см;

иглы инъекционные;

стекла предметные по ГОСТ 9284-75;

флаконы стеклянные вместимостью 10 см;

петли бактериологические;

бумагу фильтровальную;

натрий хлористый по ГОСТ 4233-77, ч.д.а., раствор с массовой долей 0,85%;

турберкулин для птиц;

культуры микобактерий;

фенол по ГОСТ 6417-72;

спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67;

фуксин карболовый по п.1.2;

масло иммерсионное по ГОСТ 13739-79*;

________________

* Вероятно, ошибка оригинала. Следует читать: ГОСТ 13739-78. - .

ксилол по ГОСТ 9410-78 или бензин авиационный;

метиленовую синь;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.

4.3. Подготовка к испытанию

Приготавливают взвесь из культуры микобактерий, ранее отнесенной по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам к комплексу avium-intracellulare. Бактерийную массу в количестве 8-10 мг снимают шпателем с поверхности плотной питательной среды и переносят в стерильный флакон с резиновой пробкой, предварительно взвешенный на аналитических весах. Затем флакон вновь взвешивают и по разности между первой и массой флакона определяют массу взятой культуры. Во флаконы добавляют раствор хлористого натрия с массовой долей 0,85% из расчета 1 см на 1 мг бактерийной массы.

4.4. Проведение испытания

Для постановки биологической пробы берут двух кроликов массой 2000 г и двух кур в возрасте 5 мес, не реагирующих на введение туберкулина.

Взвесь культуры в дозе 1 см вводят кроликам в краевую вену уха, курам - в подкрыльцовую вену.

За лабораторными животными, которым введена испытуемая культура, устанавливают наблюдение в течение 90 сут.

При развитии туберкулезного процесса у кроликов и кур после введения им взвеси культуры наблюдается истощение, снижение аппетита. В случае отсутствия падежа животных убивают через 90 сут. Павших или убитых животных вскрывают и проводят осмотр внутренних органов. Из органов готовят мазки по п.1.3. Просмотр мазков проводят с помощью иммерсионной системы микроскопа.

4.5. Оценка результатов

Микобактерии птичьего вида у кроликов вызывают сепсис (тип Йенсена), характеризующийся резким увеличением селезенки. При этом гибель животного наступает через 13-30 сут.

М. avium при внутривенном заражении кур вызывают в большинстве случаев гибель их в течение 30 сут. Иногда куры выживают от 10 до 90 сут. На вскрытии павших или убитых кур обнаруживают много серо-желтых бугорков в печени и селезенке, а в мазках из них - значительное количество микобактерий туберкулеза.

5. СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД

5.1. Сущность метода заключается в определении сероваров М. avium и М. intracellulare в реакции прямой агглютинации (РА) по методу Шефера с гипериммунными сыворотками, дающими положительные результаты с гомологичными антигенами.

5.2. Средства испытаний

Для проведения испытаний применяют:

пластинки плексиглазовые с лунками;

штативы;

пипетки градуированные исполнений 1, 2, 4, 5, 6 вместимостью 1, 5 и 10 см 2-го класса точности по ГОСТ 20292-74;

рН-метр 340;

раствор буферный фосфатный, рН 7,1;

гипериммунные кроличьи сыворотки комплекса avium-intracellulare различных сероваров;

фенол по ГОСТ 6417-72, водный раствор с массовой долей 0,5%;

антигены - живые культуры микобактерий;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.

5.3. Подготовка к испытанию

Для серологической реакции используют культуры микобактерий, выросших в S форме.

В качестве антигена для реакции агглютинации применяют бактерийную массу культур микобактерий, выращенную на питательной среде в течение 21 сут.

Антиген готовят на фосфатном буферном растворе накануне проведения испытания в концентрации 0,3 мг/см с добавлением 0,5%-ного водного раствора фенола. Гипериммунные сыворотки разводят в рабочем разведении на том же растворе.

5.4. Проведение испытания

Для каждой культуры микобактерий берут по две разные сыворотки одинакового серовара. Разведенные сыворотки сероваров микобактерий комплекса avium-intracellulare в рабочем титре разливают в дозе 0,5 см в лунки вертикального ряда, за исключением последней лунки, которая служит для контроля. В горизонтальные ряды гнезд разливают по 0,5 см взвеси определяемых культур микобактерий.

В контрольные лунки наливают по 0,5 см фосфатного буфера и по 0,5 см взвеси микобактерий.

Пластинки без встряхивания помещают в термостат и инкубируют при 37°С в течение 20 ч.

Учет реакции проводят через 4 и 20 ч.

5.5. Оценка результатов

Результаты реакции оценивают в крестах:

4 креста - все агглютинационные частицы в виде зонтика осаждены на дно лунки, а надосадочная жидкость совершенно прозрачна;

3 креста - на дне лунки образовался агглютинационный зонтик, а в надосадочной жидкости наблюдается некоторая опалесценция;

2 креста - агглютинационные частицы находятся в жидкости;

1 крест - имеются следы агглютинации;

контроль - агглютинация отсутствует.

Положительной реакцией считают агглютинацию, выраженную в 4 или 3 креста, сомнительной - 2 или 1 крест и отрицательной - отсутствие агглютинации.

Схема изучения микобактерий и основные свойства видов или комплексов микобактерий приведены в приложении.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Обязательное

Таблица 1

Основные свойства видов или комплексов микобактерий

Примечание. Буквы означают: Ф - фотохромогенная окраска (пигмент); С - скотохромогенная окраска (пигмент); R - шероховатая форма колоний; S - гладкая форма колоний.

Знак "+" означает показатель положительный; "-" - отрицательный; "" преимущественно отрицательный; "±" - преимущественно положительный.

Таблица 2

Схема изучения микобактерий

Примечание. Знак "+" означает показатель положительный; "-" - отрицательный; "" -преимущественно отрицательный; "±" - преимущественно положительный.

Электронный текст документа

и сверен по:

М.: Издательство стандартов, 1987