ГОСТ 32277-2013 Средства воспроизводства. Сперма. Методы испытаний физических свойств и биологического, биохимического, морфологического анализов

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ. МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION. METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

ГОСТ

32277—

2013

Средства воспроизводства

СПЕРМА

Методы испытаний физических свойств и биологического, биохимического, морфологического анализов

Издание официальное

IlKIU

Стандарты иформ 2014

ГОСТ 32277—2013

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стан* дартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные поло* жения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударствен* ные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением Всероссийским научно*исследоаатель* ским институтом животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВИЖ Рос* сельхозакадемии). Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государ* стввнный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ») и Федеральным государственным бюджетным научным учреждением «Научно*исследова* тельский институт племенного дела» (ФГБНУ «8НИИллем»)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации (ТК 143)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол Isle 59*П от 27 сентября 2013 г.)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 28 октября 2013 г. № 1261-ст введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2015 года

5 Взамен ГОСТ 20909.3-75. ГОСТ 20909.4-75. ГОСТ 20909.5-75 и ГОСТ 20909.6-75

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информации онном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок - е ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ, 2014

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и рас* смотрен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

II

ГОСТ 32277—2013

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

Средства воспроизводства СПЕРМА

Методы испытаний физических свойств и биологического, биохимического, морфологического анализов

Product for reproduction.

Semen.

Physical, biological, biochemical, morphological analysis technique

Дата введения — 2015—07—01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на свежелолученмую неразбавленную, саеже пол ученную разбавленную и замороженную слерму производителей сельскохозяйственных животных (далее * сперма) и устанавливает методы испытаний физических свойств, биологического, биохимического и морфологического анализов.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007 6 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробеэопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 302-79 Термометр медицинский максимальный стеклянный. Технические условия ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, И СО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры. мензурки, колбы, пробирки. Технические условия

ГОСТ 2290-76 Бальзам пихтовый. Технические условия

ГОСТ 2874-82 Вода питьевая. Гигиенические требования и контроль за качеством ГОСТ 4014-75 Красители органические. Нигрозин водорастворимый. Технические условия ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия ГОСТ 4234-77 Реактивы. Калий хлористый. Технические условия ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия ГОСТ 4478-78 Реактивы. Кислота сульфосалициловая 2-водная. Технические условия ГОСТ ИСО 5725-1-2003 Точность (правильность и прецеэионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и анализа

ГОСТ ИСО 5725-6-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ 5962-67 Спирт этиловый ректификованный. Технические условия ГОСТ 6507-90 Микрометры. Технические условия

ГОСТ 6672-75 Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условия ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия.

ГОСТ 6995-77 Реактивы. Метанол-яд. Технические условия

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

Издание официальное

1

ГОСТ 32277—2013

ГОСТ 9293-74 Аэот газообразный и жидкий. Технические условия

ГОСТ 9307-78 Красители органические. Нигрозин слирторастворимый. Технические условия

ГОСТ 9412-93 Марля медицинская. Общие технические условия

ГОСТ 9949-76 Ксилол каменноугольный. Технические условия

ГОСТ 1202&-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 17299-78 Спирт этиловый технический. Технические условия

ГОСТ 21239-93 (ИСО 7741-86) Инструменты хирургические. Ножницы. Общие требования и методы испытаний

ГОСТ 21241-89 Пинцеты медицинские. Общие технические требования и методы испытаний ГОСТ 22280-76 Реактивы. Натрий лимоннокислый 5.5-водный. Технические условия ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 25706-83 Лупы. Типы, основные параметры. Общие технические требования ГОСТ 2777S-88 Искусственное осеменение сельскохозяйственных животных. Термины и анализа ГОСТ 29227*91 (ИСО 835-1 -81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 32222-2013 Средства воспроизводства. Сперма. Методы отбора проб

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты*, который опубликован по состоянию на 1 января текущего годе, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты)* за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, е котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей зту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ 27775.

4 Отбор проб спермы

Отбор проб - по ГОСТ 32222.

Для анализов используют свежеполученную неразбавленную и разбавленную сперму, хранившуюся при температуре 30 *С - 35 'С не более 30 мин с момента ее получения, и замороженную сперму, хранившуюся не более 30 мин после оттаивания.

5 Методы испытаний физических свойств

5.1 Определение цвета

Цвет спермы определяют визуально при хорошем естественном или искусственном освещении.

5.2 Определение объема и массы эякулята

5.2.1 Объем эякулята в кубических сантиметрах (см³) определяют е градуированных слермопри-емниках или мерной стеклянной пипеткой.

5.2.2 Массу эякулята е граммах (г) определяют взвешиванием на лабораторных весах типа ВЛТ-500 (ВТК-500) с погрешностью не более ± 0.08 г по ГОСТ 24104.

5.3 Определение pH

5.3.1 Сущность метода

pH спермы определяют потенциометрическим методом. Сущность метода заключается е измерении электродного потенциала, возникающего при погружении электрода в сперму.

5.3.2 Средства измерений, материалы и реактивы Для проведения анализа применяют:

• рН-метр-милливолыметр с диапазоном измерения от 0 до 14 ед. pH. погрешностью ± 0.04 ед. pH:

2

ГОСТ 32277—2013

• бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026;

• калий хлористый ло ГОСТ 4234:

. воду дистиллированную ло ГОСТ 6709.

Допускается использование других средств измерений с аналогичными метрологическими характеристиками. а также материалов и реактивов ло качеству не ниже вышеуказанных.

5.3.3 Проведение анализа

pH спермы определяют с помощью рН-метра-милливольтметра в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.

5.3.4 Обработка результатов

За окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение результатов двух измерений, выполненных в условиях повторяемости по ГОСТ ИСО 5725*1. Допускаемые расхож* дения между результатами двух измерений не должны превышать ± 0.1ед. pH.

5.4 Определение осмотического давления

5.4.1 Сущность метода

Сущность метода определения осмотического давления свежелолученной неразбавленной спер* мы заключается в установлении разности температур в точке таяния льда и в точке истинной кристаллизации.

5.4.2 Средства измерений, оборудование, материалы и реактивы

Для проведения анализа применяют:

- термометр лабораторный типа ТЛ-50 с конусным шлифом No 4 с диапазоном измеряемых температур от минус 30 *С до 40 *С. ценой деления 0,20 *С;

• мешалку проволочную с петлей, входящей в пробирку с размером диаметра 1.4- 1.7 см:

- штатив лабораторный;

• кольца резиновые толщиной 2-3 мм:

• лупу с увеличением 8 - 10^х по ГОСТ 25706;

• термос металлический вместимостью не менее 1000 см³;

• лед или снег;

• углекислоту твердую (сухой лед) или азот жидкий по ГОСТ 9293 или натрий хлористый по ГОСТ

4233;

• спирт этиловый технический по ГОСТ 17299:

. воду дистиллированную по ГОСТ 6709.

Допускается использование другого оборудования с техническими характеристиками и средств измерений с метрологическими характеристиками, а также материалов, реактивов и посуды по качеству не ниже вышеуказанных.

5.4.3 Подготовка к проведению анализа

5.4.3.1 Готовят термос с одной из следующих охлаждающих смесей:

• лед с поваренной солью в соотношении 3:1;

• смесь этилового спирта с сухим льдом:

• этиловый спирт, охлажденный пропусканием через змеевик паров жидкого азота.

Температуру в термосе постоянно поддерживают на уровне минус 38 ‘С - минус 40 *С.

5.4.3.2 Перед началом анализа проводят настройку термометра, устанавливая на нем нулевую точку. Для этого термометр вначале помещают в мелкораздробленный тающий лед или снег и наблюдают уровень ртути в капилляре.

Затем устанавливают нулевую точку на термометре по замерзанию дистиллированной воды, определяя ее следующим образом. Закрепляют на штативе пробирку с размером диаметра 2.2 - 2.5 см. Во вторую пробирку меньшего диаметра наливают дистиллированную воду в таком объеме, чтобы после введения в пробирку термометра с надетой на него проволочной мешалкой его ртутный резервуар был полностью погружен в воду. На пробирку с термометром и дистиллированной водой надевают два резиновых кольца. Подготовленную таким образом пробирку с термометром вставляют в пробирку, закрепленную в штативе. Пробирки с термометром опускают в термос (ванну) с охлаждающей смесью. В процессе охлаждения воду беспрерывно помешивают вертикальными движениями мешалки, постоянно наблюдая за понижением уровня ртути в капилляре. При переохлаждении воды начинает выделяться теплота кристаллизации и столбик ртути быстро поднимается до истинной температуры замерзания воды, оставаясь некоторое время на этом уровне. Температуру замерзания воды регистрируют с точностью до 0,2 *С.

3

ГОСТ 32277—2013

5.4.4 Проведение анализа

В промытую и тщательно подсушенную фильтровальной бумагой пробирку наливают сперму в та* ком количестве, чтобы ртутный резервуар термометра был полностью погружен в нее. Пробирку с тер* мометром помещают во вторую пробирку, закрепленную в штативе. Температуру замерзания спермы устанавливают no 5.4.3.2. При определении осмотического давления разных эякулятов пробирку и тер* мометр после каждого испытания тщательно ополаскивают дистиллированной водой и просушивают.

5.4.5 Обработка результатов

5.4.5.1 Осмотическое давление спермы при температуре О 'С Р₀, Па (кгс/см²), вычисляют по формуле

Р₀ = КЫ. (1)

где К - постоянный коэффициент, используемый при расчете осмотического давления, равный 1.204 Па*град'' или 12,04 кгсхсм’^град'¹;

Д/ - разность между нулевой точкой на термометре и истинной температурой замерзания спер* мы. °С.

Результат округляют до третьего десятичного знака.

Пример

Нулевая точка на термометре установлена на уровне 4.46 *С. После трехкратного измерения истинная температура замерзания спермы составляла 3.80 ^вС. 3,81 *С и 3.80 *С. Таким образом, среднеарифметическое значение температуры замерзания спермы составит 3,80 *С.

Разность температуры 4г • 4.46 - 3,80 • 0,66 *С.

Следовательно, осмотическое давление при температуре О *С вычисляют по формуле РО • 1,204 (или 12.04) 0.66 • 0.794 Па (или 7.94 кес/см2).

5.4.5.2 Осмотическое давление спермы при заданной температуре Р_п. Па (кгс/см²). вычисляют по формуле

(2)

где Г₀ - константа, равная 273^вС;

/„ - температура, при которой требуется определить осмотическое давление спермы. °С;

Р₀ - осмотическое давление при температуре 0 *С, Па (кгс/см²).

Результат округляют до второго десятичного знака. пример

Осмотическое давление спермы при температуре 39 *С составляет: Р39 ■ (273 *39)/273 ■ 0.79 (или 7.94) > 0.91 Па (или 9.1 кес/см2).

5.5 Определение концентрации сперматозоидов

Концентрацию сперматозоидов определяют в счетных камерах, с помощью измерения светорас* сеяния и специальных компьютерных программ.

5.5.1 Определение концентрации сперматозоидов в счетной камере

5.5.1.1 Сущность метода заключается в подсчете сперматозоидов в счетной камере для форменных элементов крови.

5.5.1.2 Оборудование, материалы и реактивы Для проведения анализа применяют:

• микроскоп биологический различных марок с окуляром 15* и объективом 20*;

• камеру счетную Горяева для анализа количества форменных элементов крови;

• баллон резиновый или груша резиновая;

• эритроцитарный смеситель (меланжер);

• стекла шлифованные покровные 20 * 20 по ГОСТ 6672;

• салфетки марлевые по ГОСТ 9412;

• натрий хлористый по ГОСТ 4233.3 %-ный раствор;

• спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962;

• эфир летролейный марки 40-70.

4

ГОСТ 32277—2013

Допускается использование другого оборудования с техническими характеристиками, а также материалов и реактивов по качеству не ниже вышеуказанных.

5.5.1.3 Проведение анализа

Слерму тщательно перемешивают и набирают до метки «1» в меланжер, предварительно обработанный смесью спирта и эфира в соотношении 1 : 1 и высушенный. Для разбавления спермы и обездвиживания сперматозоидов в меланжер вводят до метки «101» 3 %-ный раствор хлористого натрия (разбавление спермы в 100 раз). Зажав большим и указательным пальцами оба конца наполненного меланжера, тщательно перемешивают содержимое, переворачивая меланжер вверх и вниз не менее 60 раз.

Удалив из меланжера первые три - четыре капли, кончик меланжера обтирают марлевой салфеткой и осторожно наносят одну каплю смеси на край притертого к счетной камере шлифовального покровного стекла. Капля, затекая под стекло, заполняет камеру Горяева. Подсчет сперматозоидов проводят при таком увеличении микроскопа, чтобы в поле зрения помещалось 16 малых (один большой) квадратов. Сперматозоиды подсчитывают в 80 малых (пяти больших) квадратах, расположенных по диагонали. Для подсчета сперматозоидов, расположенных в глубине камеры, постоянно вращают ми-кровикт. Положение сперматозоидов внутри или вне квадрата определяют по месту нахождения головки. Головки, расположенные на левой и верхней линиях, относят к тому квадрату, в котором проводят подсчет. Головки можно также учитывать на правой и нижней линиях.

5.5.1.4 Обработка результатов

Концентрацию сперматозоидов спермы С, млрд/см³, вычисляют по формуле

200’

где л - количество подсчитанных сперматозоидов в 80 маленьких квадратах;

200 - постоянный коэффициент.

Пример

В 80 маленьких (пяти больших) квадратах насчитали 100 сперматозоидов центрация сперматозоидов в см3 составит

(3)

. Следовательно, кон-

Г»—тяра^ет*

:«о

5.5.2 Определение концентрации сперматозоидов путем измерения светорассеяния

5.5.2.1 Сущность метода заключается в определении оптической плотности спермы, величина которой пропорциональна концентрации сперматозоидов.

5.5.2.2 Средства измерений, материалы, посуда и реактивы

Для проведения анализа применяют:

• фотометр, спектрофотометр, фотоэлектроколориметр, позволяющие измерять оптическую плотность раствора в диапазоне длин волн от (675 ± 25) нм при допускаемой абсолютной погрешности измерения спектрального коэффициента пропускания не более ± 2 % в оптических кюветах толщиной поглощающего слоя 10 мм;

• воронка лабораторная В-56-60 ХС по ГОСТ 25336;

• пробирки типа П2Т по ГОСТ 25336 вместимостью 10 см³;

• пипетку градуированную вместимостью 10 см³ по ГОСТ 29227;

• микропипетку вместимостью 0.1 см³;

• салфетки марлевые по ГОСТ 9412;

- бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026;

• натрий лимоннокислый трехзамещенный по ГОСТ 22280.3 %-ный раствор.

Допускается использование других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также материалов, реактивов и посуды по качеству не ниже вышеуказанных.

5.5.2.3 Подготовка к проведению анализа

Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика используют слерму с высокой концентрацией сперматозоидов. из которой готовят разведения различной концентрации. Например, берут сперму с концентрацией сперматозоидов, равной 12 млрд/см³. Сперму разводят 3,5 %-ным раствором лимоннокислого

5

ГОСТ 32277—2013

натрия в соответствии с таблицей 1 из расчета приготовления разведений с интервалом концентрации сперматозоидов в растворе от 0.02 до 0.20 млрд/см³.

Таблице 1

Концентрацию сперматозоидов в каждом разведении уточняют, подсчитывая их количество в камере Горяева по 5.5.1. Измеряют оптическую плотность приготовленных разведений при (675 ± 25) нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Для построения градуировочного графика откладывают по оси абсцисс значения концентрации сперматозоидов, а по оси ординат - соответствующие им величины оптической плотности. Градуировочный график строят для каждого прибора. Проверку градуировочного графика проводят ежемесячно.

5.5.2.4 Проведение анализа

В чистую пробирку наливают 5см³ 3.5 %-ного раствора лимоннокислого натрия и микропипеткой вносят точно 0.02 см³ свежеполученной спермы быков; 0,01 см³ свежеполученной спермы баранов и козлов: 0.2 см³ свежеполученной спермы хряков и жеребцов, не допуская попадания пены или вазелина. Перед внесением спермы в раствор лимоннокислого натрия микропипетку вытирают снаружи чистой марлевой салфеткой для удаления излишка спермы. После внесения спермы микропипетку промывают в этом же растворе, набирая раствор в пипетку и выдувая его не менее трех раз. Суспензию тщательно перемешивают, осторожно переворачивая закрытый флакончик, не допуская при этом образования пены.-

Измеряют оптическую плотность суспензии, используя в качестве контрольного (фонового) раствора 3.5%-ный раствор лимоннокислого натрия.

5.5.2.5 Обработка результатов

Концентрацию сперматозоидов в миллиардах на кубический сантиметр (млрд/см³) спермы определяют при помощи градуировочного графика по соответствующему значению оптической плотности раствора.

За окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение результатов двух измерений, выполненных в условиях повторяемости по ГОСТ ИСО 5725-1. Допускаемые расхождения между результатами параллельных определений не должны превышать 10 %.

6 Методы биологических анализов

6.1 Определение подвижности сперматозоидов

6.1.1 Сущность метода

Сущность метода заключается в визуальном определении с помощью микроскопа в раздавленной капле спермы количественного соотношения сперматозоидов с прямолинейным поступательным движением (ППД) к их общему числу.

6.1.2 Оборудование, материалы, посуда и реактивы

Для проведения анализа применяют:

- микроскоп биологический увеличением 150 - 200 раз;

- столик элекгрообогрееаемый к микроскопу, обеспечивающий поддержание температуры спермы в пределах(37 ±1) *С:

• термобокс водяной или электрический, обеспечивающий поддержание температуры (37 ± 1) *С;

• корнцанг:

• пинцет анатомический по ГОСТ 21241:

6

ГОСТ 32277—2013

• ножницы по ГОСТ 21239;

• стекла предметные 26 * 100 по ГОСТ 9284:

• стекла покровные 20 * 20 по ГОСТ 6672;

• пипетки пастеровские:

• пипетки градуированные вместимостью 5 см³ 2-го класса точности по ГОСТ 29227;

- пробирки вместимостью 2 см³ по ГОСТ 25336;

• пробки резиновые для пробирок;

• салфетки марлевые стерильные;

• натрий лимоннокислый трехзамещвнный по ГОСТ 22280.2.9 %-ный раствор;

• алюминиевый сосуд Дьюара вместимостью 4-35 дм³.

Допускается использование другого оборудования с техническими характеристиками, а также материалов. реактивов и посуды по качеству не ниже вышеуказанных.

6.1.3 Подготовка к проведению анализа

6.1.3.1 От каждого свежеполученного эякулята отбирают 0.1 - 0 .5 см³ спермы; от каждой партии замороженной спермы, расфасованной в соломинки, облицованные или необлицованные гранулы, отбирают из жидкого азота по две дозы и помещают в отдельный сосуд Дьюара..

6.1.3.2 В чистую стерильную пробирку мерной пипеткой вносят 0.5 см³ 2.9 %-ного раствора лимоннокислого натрия. Затем пробирки закрывают резиновыми пробками и ставят в термостат при температуре /(37 ± 1) ^еС на срок не более 30 мин.

6.1.3.3 Соломинки или облицованные гранулы со спермой с помощью охлажденного корнцанга, а необлицованные гранулы с помощью охлажденного анатомического пинцета, вынимают из сосуда Дьюара. Соломинки или облицованные гранулы погружают в водяную баню при температуре (37 ± 1) ®С на 20 - 30 с. а затем вынимают и протирают насухо стерильной салфеткой. Ножницами отрезают оба конца соломинки или один конец облицованной гранулы. Одну дозу спермы из соломинки, облицованной гранулы или необлицованной гранулы помещают в пробирку с 2.9 %-ным раствором лимоннокислого натрия, находящуюся в термостате.

6.1.3.4 Затем объем содержимого пробирок доводят до 1 см³ 2.9 %-ным раствором лимоннокислого натрия, пробирки закрывают резиновыми пробками и перемешивают. Пробирки помещают в термостат при температуре (37 ± 1) ^вС на срок не более 30 мин.

6.1.4 Проведение анализа

На электрообогревательный столик микроскопа помещают предметное стекло и после его нагрева до температуры (37 ± 1) ®С стерильной пастеровской пипеткой из пробирки, находящейся в термобоксе. наносят небольшую каплю разбавленной спермы и покрывают стеклом. Устанавливают увеличение. дающее возможность добиться четкого изображения, и, просматривая весь препарат, выбирают участок с небольшим движением сперматозоидов. Определяют визуально в трех полях зрения соотношение сперматозоидов с прямолинейным поступательным движением (ППД) к общему количеству сперматозоидов, включая и неподвижных, а также сперматозоидов, имеющих манежное и колебательное движение. В случае оценки свежеполученной спермы допускается проведение анализа в капле неразбавленной спермы.

6.1.5 Обработка результатов

Результаты анализа представляют е процентах.

6.2 Определение выживаемости сперматозоидов при температуре (3711) “С после

оттаивания спермы

6.2.1 Сущность метода

Сущность метода заключается в определении количества сперматозоидов в замороженной сперме. сохранивших прямолинейное поступательное движение (ППД) после оттаивания и хранения в течение 5 ч в термостате при температуре (37 ± 1) *С.

6.2.2 Оборудование, материалы, посуда и реактивы

Оборудование, материалы, посуда и реактивы - по 6.1.2 и 6.2.2.

6.2.3 Подготовка к проведению анализа

Оттаянную сперму в пробирке № 2 по 6.1.3.3 инкубируют в термостате при температуре (37 ± 1) *С е течение 5 ч.

6.2.4 Проведение анализа

После 1.2 и 5 ч инкубации спермы в термостате определяют подвижность сперматозоидов по 6.1.

6.2.5 Обработка результатов

7

ГОСТ 32277—2013

Сперматозоиды имеют выживаемость не менее 5 ч. если после 5 ч инкубации спермы е термостате при температуре (37 ± 1) *С в ней обнаруживают не менее 1 % сперматозоидов с прямолинейным поступательным движением (ППД).

7 Методы биохимического анализа

7.1 Определение содержания кетоновых тел

7.1.1 Сущность метода

Сущность качественного метода анализа содержания кетоновых тел в неразбавленной свежело-лученной сперме заключается в положительной реакции нитропруссидной пробы в присутствии кетоновых тел и визуальной оценке интенсивности окрашивания.

7.1.2 Оборудование и реактивы

Для проведения анализа применяют:

- пробирки стеклянные типа П 2Т вместимостью 10 см³ по ГОСТ 25336:

• пипетки пастеровские;

• натрий нитропруссид. насыщенный раствор;

• сульфосалициловую кислоту по ГОСТ 4478,10 %-ный водный раствор.

• натрия гидрооксид (натрий едкий) по ГОСТ 4328.40 %-ный раствор:

- воду дистиллированную по ГОСТ 6709.

Допускается использование других реактивов и посуды по качеству не ниже вышеуказанных.

7.1.3 Подготовка к проведению анализа

7.1.3.1 Приготовление 10 %-ного раствора сульфосалициловой кислоты

В стеклянную пробирку вместимостью 10 см³ по ГОСТ 25336 вносят 1.00 г порошка сульфосалициловой кислоты и растворяют в 9.0 см³ дистиллированной воды.

Раствор применяют свежеприготовленным.

7.1.3.2 Приготовление 40 %-ного раствора гидроокисида натрия

В стеклянной пробирке вместимостью 10 см³ по ГОСТ 25336 растворяют 4.00 г гидрооксида натрия в 6.0 см³ дистиллированной воды.

Раствор применяют свежеприготовленным.

7.1.4 Проведение анализа

В пробирку вместимостью 10 см³ вносят 0.4 см³ неразбавленной сеежелолученной спермы, прибавляют три капли 10 %-ного раствора сульфосалициловой кислоты. Пробирку встряхивают, затем добавляют одну каплю насыщенного раствора нитропруссида натрия. Пробирку снова тщательно встряхивают после чего осторожно пастеровской пипеткой с длинным концом подслаивают на дно пробирки 0.2 - 0.3 см³ 40 %-ного раствора гидрооксида натрия.

При наличии кетоновых тел на границе соприкосновения раствора гидрооксида натрия со спермой в течение 30 с образуется окрашенное кольцо.

7.1.5 Обработка результатов

Массовую долю кетоновых тел в процентах определяют по интенсивности окрашивания кольца:

- слабо-розовое и светло-малиновое окрашивание - 0.5-2,910'³ %;

• окрашивание в малиновый цвет - 3,0 - 3.4 10’³ %:

- окрашивание в вишневый цвет - 3.5 - 4.9'10'³ %;

- окрашивание в темно-вишневый цвет - более 5 10'³ % кетоновых тел.

8 Методы морфологического анализа

8.1 Определение содержания сперматозоидов с аномальной морфологией и включений

8.1.1 Сущность метода

Сущность метода заключается в подсчете под микроскопом патологических форм сперматозоидов и включений спермы. При подсчете патологических форм сперматозоидов учитывают количество сперматозоидов с аномальной морфологией.

Примечание - К аномальным формам относят сперматозоиды с отклонениями а строении головки (микроскопическая, круглая, несимметричная, укороченная, заостренная, двойная, без мембраны или жгутика), шейки (двойная, ломаная, изогнутая, укороченная), тела (изогнутое, удвоенное, нитевидное, с цитоплазматической

8

ГОСТ 32277—2013

капелькой), жгутика (изогнутый, двойной, извитой, скрученный, рудиментарный). К включениям спермы относятся форменные элементы крови, эпителиальные клетки и тд.

8.1.2 Оборудование, материалы, посуда и реактивы

Для проведения анализа применяют:

• микроскоп биологический различных марокс увеличением 600-1350 раз (окуляр 15* и объектив 40* или 90*);

• микрометр окулярный винтовой типа АМ9-2;

• объект-микрометр по ГОСТ 6507;-

• камеру счетную Горяева для подсчета форменных элементов крови;

• секундомер электронный типа СТС-1щ с диапазоном измеряемых интервалов времени от 0.1 до 9999.99 с;

• смеситель (меланжер) эритроцитарный;

• стекла шлифовальные покровные 20 * 20 по ГОСТ 6672;

• стекла предметные 26 * 100 по ГОСТ 9284;

• колбы стеклянные по ГОСТ 1770 вместимостью 100 см³;

• стеклянные цилиндры по ГОСТ 1770 вместимостью 5-10 см³;

• пипетки пастеровские, палочки стеклянные;

• тушь черную;

- спирт этиловый ректифицированный по ГОСТ 5962;

- эфир петролейный;

• натрий хлористый по ГОСТ 4233;

• нигрозин водорастворимый по ГОСТ 4014;

• эозин;

• азур-эозин;

• краску Гимэа;

• ксилол по ГОСТ 9949;

• бальзам пихтовый по ГОСТ 2290;

• метанол по ГОСТ 6995;

. воду водопроводную по ГОСТ 2874;

. воду дистиллированную по ГОСТ 6709.

Допускается использование другого оборудования с техническими характеристиками, а также материалов. реактивов и посуды по качеству не ниже вышеуказанных.

8.1.3 Подготовка к проведению анализа

6.1.3.1 Приготовление 0.9 %-ного раствора хлористого натрия

В колбе вместимостью 100 см³ растворяют 0.9 г хлористого натрия по ГОСТ 4233 в 91.0 см³ дистиллированной воды.

Срок хранения раствора при комнатной температуре - не более 30 дней.

8.1.3.2 Приготовление 10 %-ного рабочего раствора нигрозина

В пробирке вместимостью 10 см³ растворяют 1.0 г нигрозина в 9.0 см³ дистиллированной воды.

Срок хранения раствора в темном месте при комнатной температуре - не более 30 дней.

8.1.3.3 Приготовление 10 %-ного раствора эозина

В пробирке вместимостью 10 см³ растворяют 1.0 г эозина в 9.0 см³ дистиллированной воды.

Срок хранения раствора при комнатной температуре - не более 30 дней.

8.1.4 Проведение анализа

8.1.4.1 В пробе спермы определяют концентрацию сперматозоидов по 5.5 и затем доводят ее до концентрации 0,2 - 0.4 млрд/см³, добавляя 0.9 %-ный раствор хлористого натрия. Приготавливают мазки спермы на сухих предметных стеклах, предварительно обезжиренных в течение 3 ч в смеси, состоящей из равных частей этилового спирта с петролейным эфиром.

Каплю подготовленной для анализа спермы пипеткой переносят на край предметного стекла и шлифовальным покровным стеклом делают мазок, проводя покровное стекло вдоль предметного, наклонив его на 45* в сторону, противоположную направлению движения.

Мазок подсушивают в течение 1-2 мин на воздухе и фиксируют в течение 2-5 мин метанолом или в течение 15-20 мин смесью этилового спирта с петролейным эфиром. Допускается фиксировать препарат микроскопической техникой парами осмиевой кислоты.

9

ГОСТ 32277—2013

8.1.4.2 Для лучшей видимости сперматозоидов проводят окрашивание мазка или затеняют его фон. Для создания темного фона вносят черную тушь или краску - 10 %*ный водный раствор нигро* зина. При этом сперматозоиды не окрашиваются, но их контуры на затемненном фоне ясно очерчены.

Для окрашивания сперматозоидов применяют водный 10 %-ный раствор эозина или нейтральные красители (по методу Романовского).

Окрашивание эозином

Окрашивание сперматозоидов эозином проводят, добавляя к сперме в пробирке или на предмет* ном стекле двойное или тройное количество краски. Смесь выдерживают в течение 3-5 мин. делают мазок и микроскопируют.

Окрашивание азур-эозином по Романовскому

Используют готовую краску Гимза. представляющую собой смесь в определенных пропорциях метилен-аэура. метиленового фиолетового и метиленового синего.

Перед окрашиванием приготавливают раствор краски. Для этого к 10 см^а дистиллированной воды добавляют 0.5 - 1.0 см³ краски. Окрашивание проводят в стеклянных цилиндрах, помещая в них пред* метные стекла с мазком спермы на 20 - 30 мин. Затем мазок промывают в течение 30 - 60 мин дистиллированной водой, высушивают и микроскопируют. Для длительного хранения мазков (более 6-12 мес) предметное стекло после высушивания проводят через этиловый спирт и ксилол.

Подсчет нормальных и патологических форм сперматозоидов проводят в проходящем свете микроскопа с иммерсионной системой (увеличение 600 - 1350 раз). При подсчете используют клавишный прибор для подсчета форменных элементов крови. При отсутствии счетчика ведут запись на бумаге. Подсчитывают примерно общее количество 100 - 150 сперматозоидов, учитывая отдельно количество нормальных и патологических форм.

Также при подсчете общего количества сперматозоидов учитывают число включений спермы (форменные элементы крови, эпителиальные клетки и т.д.).

8.1.5 Обработка результатов

Подсчет сперматозоидов и включений проводят не менее чем в трех мазках, суммируя отдельно количество патологических форм, нормальных сперматозоидов и включений спермы.

Содержание патологических форм сперматозоидов N_n. %. вычисляют по формуле

_ П

п + н

I00,

где П - количество патологических форм сперматозоидов, шт.:

Н - количество нормальных форм сперматозоидов, шт. Содержание включений спермы N_e . %. вычисляют по формуле

(4)

В

П +Н

100.

(5)

где В - количество включений спермы, шт.

Пример

В трех мазхех спермы всего насчитано 110 сперматозоидое. в том числе 25 патолоаичесхих и 8$ нормальных форм. Кроме тоео, насчитано семь включений.

Следовательно, содержание патологических форм вычисляют по формуле

N » ²⁵ 100 а 22.7 %

^р 25 + 85

содержание включений:

Л'

р

7

---100

25 + 85

6,3%.

8.2 Определение количества мертвых сперматозоидов

10

ГОСТ 32277—2013

8.2.1 Сущность метода

Количество мертвых слерматоэоидов определяют дифференцированным окрашиванием. Сущность метода заключается в подсчете под микроскопом окрашенных мертвых клеток.

8.2.2 Оборудование, материалы и реактивы

Для проведения испытания применяют:

• микроскоп биологический различных марок с увеличением 600 - 1350 раз (окуляр 15*. объектив 40^х или 90^х);

• рН-метр-милливольтметр типа pH-340 с диапазоном измерения от 0 до 14 ед. pH. погрешность ±0.04ед. pH;

• термостат для микроскопа, обеспечивающий поддержание температуры (37 ± 1) °С;

• весы типа В Л Т-500 (ВТК-500) с погрешностью не более ± 0.08 г по ГОСТ 24104;

• стекла предметные 26 ^х 100 по ГОСТ 9284;

• стекла покровные 18 ^х 18 по ГОСТ 6672:

• стеклянные колбы по ГОСТ 1770 вместимостью 100 см³;

- бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026:

• эозин водорастворимый;

• нигрозин водорастворимый по ГОСТ 4014;

- натрий лимоннокислый трехзамещенный по ГОСТ 22280.3 %-ный раствор;

- эфир петролейный;

- воду дистиллированную по ГОСТ 6709.

Допускается использование другого оборудования с техническими характеристиками, средств измерений с метрологическими характеристиками, а также материалов, реактивов и посуды по качеству не ниже вышеуказанных.

8.2.3 Подготовка к проведению анализа

6.2.3.1 вымытые и высушенные предметные стекла обезжиривают, выдерживают в течение 3 ч в смеси равных объемов этилового спирта с петролейным эфиром.

8.2.3.2 Приготовление 1 %-ного раствора лимонной кислоты

В колбе вместимостью 100 см³ растворяют 1.0 г лимонной кислоты в дистиллированной воде и доводят объема раствора до метки.

Срок хранения раствора при комнатной температуре - 10 дней.

6.2.3.3 Приготовление 3 %-ного раствора лимоннокислого натрия

В колбе вместимостью 100 см³ растворяют 3,0 г лимоннокислого натрия в дистиллированной воде и доводят объем раствора до метки.

Срок хранения раствора при хомкатной температуре -10 дней.

6.2.3.4 Для доведения 3 %-ного раствора лимоннокислого натрия раствора до pH = 7.2 ± 0,1 добавляют 1 %-ный раствор лимонной кислоты по 8.2.3.2. Полученный раствор используют свежеприготовленным.

6.2.3.5 Приготовление красок

1.5 г эозина и 10 г нигрозина растворяют е мерной колбе вместимостью 100 см³ в 3 %-ном растворе лимоннокислого натрия с pH 7.2 ± 0,1 до метки.

Допускается применять растворы без фоновых красок (нигрозина). При этом готовят только 1 % -5 %-ный раствор эозина на 3 %-ном растворе лимоннокислого натрия с pH 7.2 ± 0.1.

6.2.3.6 Подготовка пробы

В сперме определяют концентрацию сперматозоидов по 5.5. Сперму с высокой концентрацией сперматозоидов разбавляют до концентрации 0.2 - 0.4 млрд/ см³ 3 %-ным раствором лимоннокислого натрия.

8.2.4 Проведение анализа

На чистое, обезжиренное, подогретое до температуры (37 ± 1) "С предметное стекло наносят небольшую каплю неразбавленной или предварительно разбавленной 3 %-ным раствором лимоннокислого натрия спермы и добавляют две - три капли раствора краски, подогретой до температуры 30 'С. Сперму и краску смешивают в течение 2 - 4 с и делают тонкие мазки на трех обезжиренных стеклах.

Мазки подсушивают фильтровальной бумагой, высушивают на воздухе и микросколируют с иммерсионной системой микроскопа при увеличении 600 - 1350 раз при голубом или зеленом светофильтре.

11

ГОСТ 32277—2013

В каждом препарате подсчитывают по 100 - 150 сперматозоидов. Отдельно считают количество сперматозоидов с окрашенными и неокрашенными головками. Сперматозоиды с головками, окрашен* ными частично, относят к мертвым.

8.2.5 Обработка результатов

Количество мертвых сперматозоидов Н_с. %. вычисляют по формуле

«с

С*

с +с-

100

(в)

где С* - количество сперматозоидов с окрашенными головками, шт.;

С" - количество сперматозоидов с неокрашенными головками, шт.

За окончательный результат анализа принимают среднеарифметическое значение результатов двух измерений, выполненных в условиях повторяемости по ГОСТ ИСО 5725*1. Допускаемые расхож* декия между результатами определений не должны превышать 10 %.

8.3 Определение размеров сперматозоидов

8.3.1 Сущность метода

Сущность метода заключается в измерении сперматозоидов под микроскопом в проходящем свете при помощи окулярного микроскопа.

8.3.2 Оборудование, материалы и реактивы

Для проведения анализа применяют:

• микроскоп биологический различных марок с окуляром 15* и объективом 20* или 40*:

• микрометр окулярный винтовой типа МОВ*1*15^х;

• объект-микрометр типа ОМО с ценой деления шкалы 0,01 мм по ГОСТ 6507:

• стекла предметные 26 * 100 по ГОСТ 9264:

• стекла покровные 18 * 18 по ГОСТ 6672:

• натрий лимоннокислый трехзамещенный по ГОСТ 22280. 3 %*ный раствор:

• эозин водорастворимый или нигрозин по ГОСТ 9307.

Допускается использование другою оборудования с техническими характеристиками, средств изменений с метрологическими характеристиками, а также материалов, реактивов и посуды по качеству не ниже вышеуказанных.

8.3.3 Подготовка к проведению анализа

8.3.3.1 Масштаб линейки и окулярного винтового микрометра меняют в зависимости от применяемого окуляра, объектива и величины тубуса микрометра. Истинную величину деления линейки определяют объект-микромет-ром. Для этою на предметный столик микроскопа помещают объект-микрометр. фиксируют объектив на шкале объект-микрометра и. наблюдая в микроскоп, совмещают линейки окуляр- и объект-микрометра. Определяют, сколько делений объект-микрометра приходится на определенное число делений окуляр-микрометра.

Истинное значение деления микрометра окулярною винтового N. мкм. вычисляют по формуле

где л, - число делений объект-микрометра, умноженное на величину одного деления, мкм:

л₂ - число делений микрометра окулярною винтовою, совпадающих с числом делений объект-микрометра.

пример

Пять делений объект-микрометра покрывают 20 делений окуляр-микрометра. Одно деление объект-микрометра равно 10 мкм. А атом случав одно деление линвОки окуляр-микрометра будет равно

5 Ю _Л

N =-* 2.5/икм

20

8.3.3.2 Готовят раствор 3%-ю лимоннокислого натрия по 8.2.3.3.

8.3.3.3 Затем на 3 %-ком растворе лимоннокислою натрия готовят красящую или фоновую краску: 2 %-кый раствор эозина водорастворимого или 5 % - 10 %-ный раствор нигрозина.

12

ГОСТ 32277—2013

8.3.3.4 8 сперме определяют концентрацию сперматозоидов по 5.5. Сперму, имеющую высокую концентрацию, разбавляют до концентрации 0.2 - 0.4 млрд/см³ 3 %-ным раствором лимоннокислого натрия.

8.3.4 Проведение анализа

На обезжиренное предметное стекло наносят каплю спермы, добавляют к ней одну - две капли раствора краски, смешивают и делают один - два мазка. Мазки сушат на воздухе в течение 5 - 10 мин и микроскопируют.

Для измерения используют тубус длиной 152 мм. Окуляр-микрометр вкладывают в окуляр и винтовой окуляр-микрометр вставляют в тубус микроскопа. Измеряют сперматозоиды при увеличении 300 - 600*.

При измерении линейку окуляр-микрометра накладывают на сперматозоиды и подсчитывают количество делений, приходящихся на длину или ширину сперматозоида.

Длину (ширину) измеряют не менее чем у 20 сперматозоидов.

8.3.5 Обработка результатов

Длину 1_С или ширину £>_с одного сперматозоида, мкм. вычисляют по формуле

/_C(0_C) = N я.

(8)

где N - значение одного деления шкалы микрометра окулярного винтового, мкм:

л - число делений шкалы микрометра окулярного винтового, приходящееся на длину или ширину сперматозоида.

Результат округляют до третьего десятичного знака.

8.4 Определение целостности акросомы

8.4.1 Сущность метода

Сущность метода заключается в определении под микроскопом числа сперматозоидов с интактной или поврежденной акросомой. Целостность акросомы определяют с помощью дифференцированного окрашивания.

8.4.2 Оборудование, материалы и реактивы

Для проведения анализа применяют:

- микроскоп биологический типа МБИ или МБР с окуляром 15* и объективом 40*;

• весы типа ВЛТ-500 (ВТК-500) с погрешностью не более ± 0,08 г по ГОСТ 24104;

• термометр медицинский максимальный типа ТБ-1 Б по ГОСТ 302 с диапазоном измерения температур от 32 *С до 42 *С с пределом допускаемой погрешности 10.1 ‘С:

• стекла предметные 26 * 100 по ГОСТ 9284;

• стекла покровные 18 * 18 по ГОСТ 6672;

• стеклянные колбы по ГОСТ 1770 вместимостью 100 см³;

• эозин водорастворимый;

• нигрозин водорастворимый по ГОСТ 4014;

• натрий лимоннокислый трехзамещенный по ГОСТ 22280.3 %-ный раствор;

• воду дистиллированную по ГОСТ 6709.

Допускается использование другого оборудования с техническими характеристиками, средств измерений с метрологическими характеристиками, а также материалов, реактивов и посуды по качеству не ниже вышеуказанных.

8.4.3 Подготовка к проведению анализа

6.4.3.1 Вымытые и высушенные предметные стекла обезжиривают, выдерживая в течение 3 ч в смеси равных объемов этилового спирта с петролейным эфиром.

8.4.3.2 Приготовление красок

В мерной колбе вместимостью 100 см³ растворяют в 100 см³ дистиллированной воды. 0,67 г эозина и 5 г нигрозина.

8.4.3.3 Подготовка пробы

Сперму, имеющую высокую концентрацию, разбавляют до концентрации 0,2 - 0.4 млрд/ см³ 3 %-ным раствором лимоннокислого натрия.

8.4.4 Проведение анализа

В пробирке проводят разбавление спермы приготовленным раствором краски в соотношении 1 : 8 при температуре раствора 37 *С. Раствор спермы инкубируют в течение 10 - 15 с. После чего на

13

ГОСТ 32277—2013

чистое, обезжиренное, подогретое до температуры 37 *С предметное стекло наносят небольшую ка-плю смеси спермы и краски (10 pi) с помощью стеклянной палочки и накрывают покрывным стеклом. Приготовленный образец микроскопируют с иммерсионной системой микроскопа при увеличении 600^х.

В каждом препарате подсчитывают по 100 сперматозоидов. Отдельно считают количество спер* матозоидое с целой (неокрашенной) акросомой и с поврежденной (окрашенной) акросомой. Сперматозоиды с акросомами, окрашенными частично, относят к поврежденным.

8.4.5 Обработка результатов

Количество сперматозоидов с поврежденной акросомой А_п. %. вычисляют по формуле

где С* - количество сперматозоидов с окрашенными акросомами. шт.;

С" - количество сперматозоидов с неокрашенными акросомами. шт.

За окончательный результат, округленный до третьего десятичного знака, принимают среднеарифметическое значение результатов не менее чем трех измерений, выполненных в условиях повторяемости по ГОСТ ИСО 5725-1. Допускаемые расхождения между результатами определений не должны превышать 10 %.

9 Контроль точности результатов измерения

Контроль точности результатов измерений предусматривает проведение контроля стабильности показателей повторяемости и промежуточной прецизионности измерений с учетом требований ГОСТ ИСО 5725-6 (раздел 6).

10 Требования безопасности

10.1 При подготовке и проведении анализов необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007 и требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004.

10.2 При работе с электроприборами необходимо соблюдать требования безопасности по ГОСТ 12.1.019.

Ключевые слова: свежеполученная разбавленная сперма, свежеполученная неразбавленная сперма, замороженная сперма, термины и определения, отбор проб спермы, методы испытаний физических свойств, методы биологических анализов, методы биохимическою анализа, методы морфологического анализа, контроль точности результатов измерения, требования безопасности

(9)

УДК 619:611-031.11:001.4 (083-74)

МКС 11.220

Подписано в печать 01.11.2014. Формат 60x84V₈.

Уел. печ. л. 1.86. Тираж 33 экэ. Зак. 4047.

Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта

123995 Москва. Гранатный пер.. 4.