allgosts.ru65. СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО65.120. Корма для животных

ГОСТ 34108-2017 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Определение содержания микотоксинов прямым твердофазным конкурентным иммуноферментным методом

Обозначение:
ГОСТ 34108-2017
Наименование:
Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Определение содержания микотоксинов прямым твердофазным конкурентным иммуноферментным методом
Статус:
Действует
Дата введения:
01/01/2019
Дата отмены:
-
Заменен на:
-
Код ОКС:
65.120

Текст ГОСТ 34108-2017 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Определение содержания микотоксинов прямым твердофазным конкурентным иммуноферментным методом


ГОСТ 34108-2017

Группа С19



МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

КОРМА, КОМБИКОРМА, КОМБИКОРМОВОЕ СЫРЬЕ

Определение содержания микотоксинов прямым твердофазнымконкурентным иммуноферментным методом

Feeds, mixed feeds and raw material. Determination ofmycotoxins content by direct solid-phase competitiveimmunoenzymatic method



МКС 65.120

Датавведения 2019-01-01

Предисловие

Предисловие


Цели, основные принципы иосновной порядок проведения работ по межгосударственнойстандартизации установлены в ГОСТ1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основныеположения" и ГОСТ1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандартымежгосударственные, правила и рекомендации по международнойстандартизации. Правила разработки, принятия, обновления иотмены"

Сведения остандарте

1РАЗРАБОТАН Акционерным обществом "Всероссийскийнаучно-исследовательский институт комбикормовой промышленности" (АО"ВНИИКП"), Обществом с ограниченной ответственностью "ЗИП-И" (ООО"ЗИП-И")

2ВНЕСЕН Межгосударственным техническим комитетом по стандартизацииМТК 4 "Комбикорма, белково-витаминные добавки, премиксы"

3ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии исертификации (протокол от 1 июня 2017 г. N 51)

За принятиепроголосовали:

Краткоенаименование страны по МК (ИСО3166) 004-97

Код страныпо
МК (ИСО3166) 004-97

Сокращенноенаименование национального органа по стандартизации

Армения

AM

Минэкономики РеспубликиАрмения

Беларусь

BY

Госстандарт РеспубликиБеларусь

Казахстан

KZ

Госстандарт РеспубликиКазахстан

Киргизия

KG

Кыргызстандарт

Россия

RU

Росстандарт

Таджикистан

TJ

Таджикстандарт

4Приказом Федерального агентства по техническому регулированию иметрологии от 15 сентября 2017 г. N 1137-ст межгосударственныйстандарт ГОСТ 34108-2017 введен в действие в качестве национальногостандарта Российской Федерации с 1 января 2019 г.

5ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ


Информация обизменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодноминформационном указателе "Национальные стандарты", а текстизменений и поправок - в ежемесячном информационномуказателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены)или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будетопубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальныестандарты". Соответствующая информация, уведомление и текстыразмещаются также в информационной системе общего пользования -на официальном сайте Федерального агентства по техническомурегулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

1Область применения


Настоящий стандартустанавливает прямой твердофазный конкурентный иммуноферментныйметод (далее - ИФА) определения содержания микотоксинов: суммыафлатоксинов , , , (по афлатоксину ), афлатоксина , дезоксиниваленола (далее - ДОН),зеараленона, охратоксина А, Т-2 токсина, суммы фумонизинов (пофумонизину ) в кормах, комбикормах и комбикормовомсырье.

Данный метод нераспространяется на продукцию минерального происхождения иорганического синтеза.

Диапазоны измеренийприведены в таблице 4.

2Нормативные ссылки


Внастоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующиемежгосударственные стандарты.

ГОСТ12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарнаябезопасность. Общие требования

ГОСТ12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общиесанитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредныевещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ12.1.019-79* Система стандартов безопасности труда.Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видовзащиты
________________
*В Российской Федерации действует ГОСТ Р12.1.019-2009 "Система стандартов безопасности труда.Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видовзащиты".


ГОСТ12.2.007.0-75 Система стандартов безопасности труда. Изделияэлектротехнические. Общие требования безопасности

ГОСТ12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарнаятехника для защиты объектов. Основные виды. Размещение иобслуживание

ГОСТ12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системывентиляционные. Общие требования

ГОСТOIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единстваизмерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1.Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторнаястеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие техническиеусловия

ГОСТ ИСО 5725-1-2003*Точность (правильность и прецизионность) методов и результатовизмерений. Часть 1. Основные положения и определения
________________
*В Российской Федерации действует ГОСТ РИСО 5725-1-2002 "Точность (правильность и прецизионность)методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения иопределения".


ГОСТ ИСО 5725-6-2003**Точность (правильность и прецизионность) методов и результатовизмерений. Часть 6. Использование значений точности на практике
________________
** В Российской Федерациидействует ГОСТ РИСО 5725-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность)методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значенийточности на практике".


ГОСТ ISO6498-2014 Корма, комбикорма. Подготовка проб для испытаний

ГОСТ6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ6995-77 Метанол-яд. Технические условия

ГОСТ12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Техническиеусловия

ГОСТ13496.0-2016 Комбикорма, комбикормовое сырье. Методы отборапроб

ГОСТ13586.3-83 Зерно. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ13979.0-86 Жмыхи, шроты и горчичный порошок. Правила приемки иметоды отбора проб

ГОСТ16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общиетехнические условия

ГОСТ25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы,основные параметры и размеры

ГОСТ 21669-76*** Комбикорма. Термины иопределения
________________
*** В РоссийскойФедерации действует ГОСТ Р51848-2001 "Продукция комбикормовая. Термины иопределения".


ГОСТ28311-89 Дозаторы медицинские лабораторные. Общие техническиетребования и методы испытаний

ГОСТ29169-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с однойотметкой

ГОСТ29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипеткиградуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание - Припользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действиессылочных стандартов в информационной системе общего пользования -на официальном сайте Федерального агентства по техническомурегулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодномуинформационному указателю "Национальные стандарты", которыйопубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускамежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" затекущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то припользовании настоящим стандартом следует руководствоватьсязаменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отмененбез замены, то положение, в котором дана ссылка на него,применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3Термины и определения

3.1 В настоящем стандартеприменены термины и определения по ГОСТ 21669, ГОСТ ISO6498, а также следующие термины с соответствующимиопределениями:

3.1.1тест-система: Набор (комплект) специально подобранныхреактивов и составных частей, предназначенных для определенияодного или нескольких конкретных веществ.

3.1.2 основнойраствор: Раствор реактива, приготовляемый заблаговременно инеобходимый для приготовления других растворов.

4Сущность метода


Прямой твердофазныйконкурентный ИФА основан на способности микотоксиноввзаимодействовать со специфичными антителами (далее - АТ),нанесенными на поверхность ячеек планшета (иммобилизованными). Влунки планшета с иммобилизованными АТ дозируют смешанные сконъюгатом экстракты проб и градуировочные растворы, послеинкубации и отмывки носителя от несвязавшихся компонентов вносятсубстрат, в результате образуются окрашенные комплексы. Последобавления останавливающего реактива регистрируют значениеоптической плотности, которое находится в обратной зависимости отмассовой концентрации микотоксина в экстракте.

5Требования безопасности

5.1 При выполнениииспытаний необходимо соблюдать требования безопасности при работе схимическими реактивами по ГОСТ12.1.007, требования электробезопасности при работе сэлектроприборами по ГОСТ12.1.019 и ГОСТ12.2.007.0, требования, изложенные в технической документациина используемые приборы.

5.2 Работа с химическимиреактивами должна проводиться в вытяжном шкафу.

5.3 Помещение должно бытьоснащено вентиляционными системами по ГОСТ12.4.021, соответствовать требованиям пожаробезопасности поГОСТ12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ12.4.009.

5.4 Содержание вредныхвеществ в воздухе не должно превышать допустимых значений поГОСТ12.1.005.

5.5 При работе сметанолом необходимо применять средства индивидуальной защиты(перчатки и очки) от попадания препарата на кожные покровы ислизистые оболочки, а также соблюдать правила личной гигиены. Припопадании метанола на кожу или слизистые оболочки необходимонемедленно их промыть большим количеством воды.

Работы с метаноломпроводят в вытяжном шкафу при непрерывно действующейприточно-вытяжной вентиляции. Все работы с метанолом следуетпроводить вдали от огня.

5.6 Останавливающийраствор тест-системы содержит серную кислоту, при работе с нимнеобходимо использовать средства индивидуальной защиты (перчатки иочки) (см. 12.2). При попадании на кожу или слизистые оболочкиостанавливающего раствора необходимо немедленно их промыть большимколичеством воды.

6Условия проведения испытаний


При подготовке ипроведении испытаний должны быть соблюдены следующие условия:

-температура окружающей среды

от 18°С до25°С;

-относительная влажность воздуха

не более 80%при 25°С;

-напряжение в сети

(220±10)В.

7Требования к квалификации оператора


Кпроведению работ по данной методике допускаются лица, имеющиевысшее специальное или среднее специальное образование, прошедшиеобучение приемам работы на оборудовании, освоившие выполнение всехопераций, предусмотренных методикой, владеющие техникой выполненияИФА и уложившиеся в нормативы оперативного контроля при выполнениииспытаний.

8Отбор проб


Отбор проб - по ГОСТ13496.0, ГОСТ13586.3, ГОСТ13979.0 или другим нормативным документам, действующим натерритории государства, принявшего стандарт.

9Подготовка проб


Подготовка проб - поГОСТ ISO6498 со следующим дополнением.

Анализируемую пробуизмельчают таким образом, чтобы 75% размола проходило через сито сразмером стороны ячейки 0,85 мм, после чего тщательноперемешивают.

10Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы иреактивы

10.1 Применяемые приопределении массовой доли микотоксинов средства измерений,программное обеспечение, вспомогательные устройства должны иметьсвидетельства о поверке, свидетельства об аттестации, сертификатыградуировки, оформленные в соответствии с требованиями нормативныхправовых актов в области обеспечения единства измерений,действующих на территории государства, принявшего стандарт.

10.2 Фотометрылабораторные медицинские или фотометры для микропланшетовавтоматические, позволяющие проводить измерение оптическойплотности растворов, находящихся в луночных планшетах, лункахстрипа или стандартных круглых кюветах 12 мм, в диапазоне длин волн400-650 нм.

10.3 Тест-система дляпрямого твердофазного конкурентного ИФА, в состав которойвходят:

-планшет разборный микролуночный полистероловый без АТ длясмешивания реагентов (12 или 6 стрипов голубого или зеленого цветапо 8 лунок);

-планшет разборный с микролунками с иммобилизованными АТ (12 или 6безцветных стрипов по 8 лунок), упакованный в фольгированный пакетс замком;

-флакон с раствором конъюгата;

-флакон с останавливающим раствором;

-флакон с раствором субстрата;

-флакон с буферным раствором;

-флакон с промывочным раствором;

-градуировочные растворы, содержащие микотоксины разной концентрациидля градуировки тест-системы.

Примечание - Допускаетсявместо градуировочных растворов, входящих в состав тест-системы,использовать градуировочные растворы микотоксинов, приготовленные всоответствии с приложением А из стандартных образцов и образцасравнения:

-состава раствора афлатоксина (бензол-ацетонитрил) массовой концентрации10 мкг/см;

-состава раствора ДОН (ацетонитрил) массовой концентрации 20мкг/см;

-состава раствора зеараленона (бензол) массовой концентрации 20мкг/см;

-состава раствора охратоксина (бензол-уксусная кислота) массовойконцентрации 50 мкг/см;

-состава раствора Т-2 токсина (бензол) массовой концентрации 100мкг/см;

-фумонизин с содержанием основного вещества не менее98%.


Срок и условия хранениявсех реактивов, входящих в комплект тест-системы, устанавливает ееизготовитель. Не допускается замораживание реагентов.

Неиспользованные стрипы(лунки) хранят упакованными в плотно закрытом оригинальномфольгированном пакете вместе с имеющимся в нем осушителем вхолодильнике при температуре от 2°С до 8°С.

10.4 Мельницалабораторная со скоростью вращения не менее 3000 об/мин,измельчающая продукт до размера частиц не более 0,85 мм.

10.5 Весынеавтоматического действия по ГОСТOIML R 76-1 с пределами допускаемой абсолютной погрешности±0,001 г и весы с пределами допускаемой абсолютной погрешности неболее ±0,02 мг.

10.6 Шкаф сушильныйэлектрический вентилируемый, обеспечивающий поддержание температуры(130±5)°С.

10.7 Холодильник бытовойпо ГОСТ16317, позволяющий поддерживать температуру от 2°С до 8°С вхолодильной камере.

10.8 Компьютер спрограммным обеспечением для обработки результатов или калькулятор,или другое вычислительное устройство с логарифмическойфункцией.

10.9 Дозаторы пипеточныеодноканальные переменного объема 10-100 мм, 100-1000 мм, 1-5 см и восьмиканальные переменного объема 30-300мм с метрологическими характеристиками поГОСТ28311 в комплекте с одноразовыми наконечниками.

10.10 Устройство длясмешивания, отвечающее следующим требованиям: траекториявстряхивания - орбитальная; диаметр орбиты - не менее 4,0 мм;диапазон частоты вращения 800 об/мин.

10.11 pH-метр или иономерс диапазоном измерений активности водородных ионов от 0 до 14 ед.pH и пределом допускаемой абсолютной погрешности измерения не более0,05 ед. pH.

10.12 Секундомер спределом допускаемой основной абсолютной погрешности измерения врежиме секундомера не менее с дискретностью времени не менее 0,01 и сдиапазоном измерений интервалов времени от 0 до 9 ч 59 мин 59,99с.

10.13 Колбы мерные2-25(50, 100, 500, 1000)-2 по ГОСТ1770.

10.14 Пипетки 1(2)-1(1а,2, 2а)-2-1(2, 5, 10, 25) по ГОСТ29227 или пипетки 1-2-1, 1-2-5, 1-2-10 по ГОСТ29169.

10.15 Цилиндры мерные1(2)-25(50, 100, 250, 1000) по ГОСТ1770.

10.16 Колбы коническиеКн-2-100(250, 500, 1000)-29/32(34/35) ТХС по ГОСТ25336.

10.17 ВоронкиВ-56(75)-80(110) ХС по ГОСТ25336.

10.18 СтаканыН-1-100(150) по ГОСТ25336.

10.19 Бумагафильтровальная лабораторная марки ФС по ГОСТ12026 или фильтры бумажные "красная лента".

10.20 Метанол-яд поГОСТ6995, х.ч.

10.21 Стандартные образцыкормов, комбикормов или комбикормового сырья с аттестованнымсодержанием микотоксинов для контроля правильности результатов.

10.22 Пластиковые емкостидля хранения растворов.

10.23 Виалы вместимостью5-10 см для разбавления экстрактов.

10.24 Водадистиллированная по ГОСТ6709.

10.25 Сито с размеромячеек не более 0,85 мм.

Примечания

1Рекомендуется для увеличения производительности и повышенияточности измерений использование следующего оборудования:

-инкубатор для планшетов, обеспечивающий поддержание температуры от20°С до 25°С с точностью не более ±1°С;

-устройство отмывки планшетов автоматическое с диапазоном объемовмоющего раствора, заливаемого в каждую лунку от 100 до 350мм.

2Допускается использование других средств измерений сметрологическими характеристиками не хуже указанных.

3Допускается использование реактивов аналогичной или более высокойквалификации по качеству.

11Подготовка к выполнению испытания

11.1 Подготовкалабораторной посуды

Лабораторную стекляннуюпосуду моют специальными моющими средствами, например растворомгипохлорита, многократно промывают водопроводной водой,ополаскивают дистиллированной водой и высушивают в сушильномшкафу.

Запрещается:

-многократное использование одноразовой лабораторной посуды;

-использование бытовых моющих средств для мойки лабораторнойпосуды.

11.2 Подготовкаприбора к работе

Подготовкуспектрофотометра проводят в соответствии с инструкцией поэксплуатации и техническим описанием.

11.3 Общие требованияпо работе с тест-системами

Перед использованием всесоставляющие тест-системы выдерживают при температуре от 18°С до25°С не менее 30 мин.

Не допускается попаданиепрямых солнечных лучей на планшет и растворы, входящие в комплекттест-системы.

Рекомендуется помещатьпод планшет теплоизоляционный материал, например сложенное внесколько слоев бумажное полотенце, с целью устранения воздействияхолодной поверхности стола.

Следует избегатьвоздействия на планшет сильных естественных или искусственныхпотоков воздуха, вызванных, например, принудительнойвентиляцией.

Во время проведенияиспытаний при работе с субстратом следует избегать воздействия нанего прямых солнечных лучей, т.к. он разлагается на свету.

Перед использованиемжидкие реактивы перемешивают путем осторожного вращения илипереворачивания флаконов. Не допускается переливать обратно воригинальные флаконы остатки реагентов, используемых при проведенииизмерений.

Не допускаетсяиспользование реактивов после истечения срока хранения. Привыполнении измерений необходимо придерживаться определенного(указанного в методике) времени инкубации. Изменение времениинкубации может привести к неправильным результатам.

Рекомендуетсяиспользовать восьмиканальный пипеточный дозатор. В этом случаедопускается проведение анализа не более 48 экстрактов иградуировочных растворов в сумме (6 стрипов микролунок). Прииспользовании одноканального дозатора допускается анализировать неболее 16 экстрактов и градуировочных растворов в сумме (2 стрипамикролунок) в одной постановке.

Для каждого растворапредназначена отдельная лунка. Размечают координаты в планшете длявнесения растворов и разбавленных экстрактов. Схема расположениялунок в планшете приведена в приложении Б.

11.4 Приготовлениерастворов

11.4.1 Приготовлениеводного раствора метанола объемной долей 70% (раствора А)

Вмерную колбу вместимостью 100 см помещают 70 см метанола, доводят объем раствора в колбе дометки дистиллированной водой и перемешивают.

Срок хранения раствора вплотно закрытой емкости при комнатной температуре - не более 3мес.

11.4.2 Приготовлениепромывочного раствора для определения содержания ДОН

Вмерную колбу вместимостью 500 см помещают около 200 см дистиллированной воды и количественнопереносят весь объем концентрированного промывочного раствора изкомплекта реактивов к тест-системе. Объем раствора в колбе доводятдо метки дистиллированной водой и перемешивают. Приготовленныйпромывочный раствор переносят в пластиковую емкость.

Раствор хранят притемпературе от 2°С до 8°С в течение всего времени использованиятест-системы.

11.4.3 Приготовлениеградуировочных растворов микотоксинов

Для построенияградуировочной характеристики каждого микотоксина используютвходящие в соответствующий набор тест-системы пять градуировочныхрастворов различной концентрации: один раствор, не содержащиймикотоксин (далее нулевая точка) и четыре градуировочных раствораразличной концентрации микотоксина. Содержание микотоксинов вградуировочных растворах приведено в таблице А.1 (см. приложениеА).

Значения содержаниямикотоксинов, приписанные градуировочным растворам тест-системы,учитывают коэффициенты, включающие отношение навески к объемуэкстрагента, разбавления фильтрата и выражены в миллиграммах вкилограмме.

Допускается готовитьградуировочные растворы из стандартных образцов микотоксинов всоответствии с А.2-А.7 (см. приложение А).

Срок храненияградуировочных растворов микотоксинов при температуре от 2°С до 8°С- не более 1 мес.

12Проведение испытания

12.1 Приготовлениеэкстрактов микотоксинов

Взвешивают анализируемуюпробу массой около 20 г, с записью результата до второгодесятичного знака, помещают в коническую колбу вместимостью 250см, добавляют 100 см экстрагента (см. таблицу 1). Закрываютпробкой и перемешивают в течение 30 мин на устройстве длясмешивания. Полученный раствор фильтруют через бумажный складчатыйфильтр.

Примечания:

1При экстракции необходимо соблюдать соотношение массы анализируемойпробы к объему растворителя 1:5.

2Допускается использование ультразвуковой обработки (мощностьгенератора 35 Вт, рабочая частота 22 кГц) в ультразвуковой бане втечение 30 мин или проведение экстракции в блендере в течение 3 минс высокой скоростью.

3Экстракт должен иметь значение pH в интервале 6-8 единиц pH.Излишняя щелочность или кислотность экстракта может повлиять нарезультаты анализа, поэтому ее необходимо корректировать. Увеличитьзначение pH раствора можно добавлением в него 1 М растворагидроокиси калия (КОН), уменьшить значение pH можно добавлением 1 Мрастворов азотной кислоты (HNО), серной кислоты (H) или ортофосфорной кислоты (НРО).


Таблица 1

Наименованиемикотоксина

Экстрагент

Коэффициентразбавления,

Афлатоксин

Раствор А (см. 11.4.1)

2

Сумма афлатоксинов

Раствор А (см. 11.4.1)

1

ДОН

Дистиллированная вода

4

Зеараленон

Раствор А (см. 11.4.1)

5

Охратоксин А

Раствор А (см. 11.4.1)

1

Т-2 токсин

Раствор А (см. 11.4.1)

1

Сумма фумонизинов

Раствор А (см. 11.4.1)

20


Фильтрат для определениясодержания суммы афлатоксинов, охратоксина А, Т-2 токсинаиспользуют для дальнейшего проведения испытания по 12.2.

Фильтрат для определениясодержания афлатоксина разбавляют буферным раствором всоответствии с таблицей 1 и далее используют для дальнейшегопроведения испытания по 12.2. Разбавление экстракта для определениясодержания афлатоксина проводят следующим образом: в виалудозатором помещают 1 см буферного раствора, вносят 1 см фильтрата, перемешивают.

Фильтрат для определениясодержания ДОН, зеараленона, суммы фумонизинов разбавляютэкстрагентом в соответствии с таблицей 1 и далее используют длядальнейшего проведения испытания по 12.2.

Разбавление экстракта дляопределения содержания ДОН проводят следующим образом: в виалудозатором помещают 3 см дистиллированной воды, вносят 1 см фильтрата, перемешивают.

Разбавление экстракта дляопределения содержания зеараленона проводят следующим образом: ввиалу дозатором помещают 4 см раствора А, вносят 1 см фильтрата, перемешивают.

Разбавление экстракта дляопределения содержания суммы фумонизинов проводят следующимобразом: в виалу дозатором помещают 1,9 см дистиллированной воды, вносят 0,1см фильтрата, перемешивают.

12.2 Проведениеградуировки и анализа экстрактов проб

Анализ градуировочныхрастворов и экстрактов проб проводят одновременно. В рамку первогопланшета помещают необходимое количество стрипов зеленого(голубого) цвета для смешивания реактивов. В рамку второго планшетапомещают такое же количество бесцветных стрипов с иммобилизованнымиАТ.

Примечание - Допускаетсяпомещать стрипы для смешивания реактивов и стрипы симмобилизованными АТ в один планшет, при этом после смешиванияреактивов и переноса растворов стрипы для смешивания удаляют изпланшета.


Отмеряют необходимоеколичество раствора конъюгата из комплекта реактивов к тест-системе(примерно 240 мм на лунку или 2 см на стрип) и помещают в отдельную емкость(или в специальную кювету при использовании восьмиканальногопипеточного дозатора). Используя восьмиканальный дозатор,осторожно, не касаясь лунок, вносят по 200 мм раствора конъюгата в каждую лунку стриповзеленого (голубого) цвета первого планшета. В остальные лункипервого планшета одноканальным дозатором вносят по 100 мм каждого градуировочного раствора илиэкстракта пробы, используя для каждого раствора новыйнаконечник.

Примечание - Допускаетсяуменьшать объем растворов, но при этом отношение объема конъюгата кобъему экстракта (градуировочного раствора) должно быть 2:1.Объем жидкости, переносимый из лунок для смешивания в лунки сантителами, должен быть одинаковым (100 мм).


Восьмиканальным дозаторомс новыми наконечниками трижды смешивают содержимое лунокпипетированием (набирают и выпускают раствор) и быстро переносят по100 мм содержимого каждой лунки стрипа зеленого(голубого) цвета в соответствующую ей лунку бесцветного стрипавторого планшета. Инкубируют в течение времени, указанного втаблице 2.

Примечание - Необходимоизбегать встряхивания планшета с антителами, поскольку это можетпривести к разрушению сцепки между антигеном и антителом или ксмешиванию содержимого разных лунок.


Таблица 2

Наименование
микотоксина

Разбав-
ляющий
раствор

Время инкубациис раствором конъюгата, мин

Время инкубациис раствором субстрата, мин

Промывочный
раствор

Длина
волны,
нм

Афлатоксин

Раствор А (см. 12.4.1)

10

10

Дистиллированная вода

450*

Сумма афлатоксинов

Раствор А (см. 12.4.1)

15

5

Дистиллированная вода

450

ДОН

Дисти-
ллированная вода

15

5

Промывочный раствор по12.4.2

450

Зеараленон

Раствор А (см. 12.4.1)

10

10

Дистиллированная вода

450*

Охратоксин А

Раствор А (см. 12.4.1)

10

5

Дистиллированная вода

450*

Т-2 токсин

Раствор А (см. 12.4.1)

10

5

Дистиллированная вода

450*

Сумма
фумонизинов

Раствор А (см. 12.4.1)

10

5

Дистиллированная вода

450

* Допускается использованиедифференциального фильтра на 630 нм


Удаляют содержимоемикролунок, промывают лунки промывочным раствором (см. таблицу 2).Процедуру промывки планшета рекомендуется проводить с помощьюустройства для отмывки планшетов, задавая следующие параметрыпрограммы: количество циклов промывки - от трех до четырех, объемзаливаемого промывочного раствора - 300 мм. Допускается ручная промывка сиспользованием многоканального дозатора. При этом в лунки планшетавносят 4 раза по 300 мм промывочного раствора с последующим резкимпереворачиванием и встряхиванием планшета.

Планшет переворачиваютлунками вниз на фильтровальную бумагу и окончательно удаляют излунок остатки промывочного раствора легким постукиванием.

Отмеряют необходимоеколичество раствора субстрата из комплекта реактивов к тест-системе(примерно 120 мм на лунку или 1 см на стрип) и помещают в отдельную емкость.Используя восьмиканальный дозатор, вносят по 100 мм раствора субстрата в каждую лунку.Инкубируют в течение времени, указанного в таблице 2.

Отмеряют необходимоеколичество останавливающего раствора из комплекта реактивов к тест-системе (примерно 120 мм на лунку или 1 см на стрип) и помещают в отдельную емкость.Используя восьмиканальный дозатор, вносят по 100 мм останавливающего раствора в каждую лунку.Цвет раствора изменяется с голубого на желтый.

Измеряют оптическуюплотность D содержимого лунок при длине волны, указанной втаблице 2. Значения оптической плотности записывают с точностью довторого десятичного знака и заносят в форму для записи (см.приложение В).

Примечание - Передфотометрией нужно избавиться от воздушных пузырьков в лунке,поскольку они могут повлиять на результат анализа.

12.3 Построение иоценка градуировочной характеристики

На основании полученныхзначений оптической плотности с помощью специального программногообеспечения рассчитывают массовую концентрацию микотоксина вэкстракте пробы.