ГОСТ EN 14152-2013 Продукты пищевые. Определение витамина В2 с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии

ГОСТ EN 14152-2013

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

МКС 67.050

Дата введения 2015-07-01

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Государственным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности" Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ "ВНИИКОП" Россельхозакадемии) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 5 ноября 2013 г. N 61-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 6 марта 2014 г. N 100-ст межгосударственный стандарт ГОСТ EN 14152-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2015 г.

Европейский стандарт разработан техническим комитетом CEN/TC 275 "Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы", секретариатом которого считается DIN.

Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов межгосударственным стандартам приведены в дополнительном приложении ДА

6 ВЗАМЕН ГОСТ 25999-83 в части раздела 2

7 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Декабрь 2019 г.

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.

В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"

1 Область применения

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использована нормативная ссылка на следующий стандарт. Для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированных - последнее издание (включая все изменения).

EN ISO 3696 Water for analytical laboratory use - Specification and test methods (ISO 3696:1987) (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)

3 Сущность метода

Метод основан на экстракции рибофлавина из пробы путем кислотного гидролиза, последующем ферментативном дефосфорилировании рибофлавина и его количественном определении с помощью ВЭЖХ с флюориметрическим детектированием [1]-[8].

4 Реактивы

4.1 Общие положения

Для проведения анализа при отсутствии особо оговоренных условий используют только реактивы гарантированной аналитической чистоты и воду не ниже первой степени чистоты по EN ISO 3696 или бидистиллированную воду.

4.2 Реактивы и растворы

4.2.1 Метанол чистотой не менее 99,8%.

4.2.2 Натрий уксуснокислый трехводный чистотой не менее 99%.

4.2.5 Кислота уксусная ледяная чистотой не менее 99,8%.

4.2.7 Кислота соляная массовой долей 35%.

4.2.11 Натрия гидроокись чистотой не менее 99%.

4.2.13 Фосфора пентоксид чистотой не менее 98%.

4.2.14 Дефосфорилирующий фермент, пригодный для гидролиза связанного рибофлавина в пробе.

Примечание - При установлении характеристик прецизионности методики использована така-диастаза*.

_______________

* Така-диастаза N Т00040 - торговое наименование изделия, выпускаемого Platz and Bauer, Waterbury, CT 06708, США. Данная информация приведена для удобства применения настоящего стандарта и не является рекламной поддержкой МГС данного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия при условии обеспечения идентичных результатов.

4.2.15 Подвижные фазы для ВЭЖХ

Варианты подвижных фаз подходящего состава приведены в пояснении к рисунку A.1 приложения A и в приложении C. В качестве подвижных фаз используют смеси метанола (см. 4.2.1) с водой, фосфатным или ацетатным буферным раствором при объемной доле метанола от 10% до 50%, а также подвижные фазы с добавлением ион-парных реагентов.

4.2.17 Тетраэтиламмония хлорид чистотой не менее 98%.

4.2.18 Натрия гептансульфонат чистотой не менее 98%.

4.3 Образцы сравнения

Рибофлавин выпускают многие производители, при этом его чистота может различаться. Это обусловливает необходимость определения концентрации градуировочного раствора рибофлавина спектрофотометрическим методом по 4.4.3.

4.3.2 Рибофлавин-5’-фосфат

4.4 Основной раствор рибофлавина

4.4.1 Меры предосторожности

Рибофлавин весьма чувствителен к свету, поэтому образец сравнения рибофлавина и его растворы необходимо защищать от действия света путем всевозможных приемов, например, путем использования для их хранения сосудов из темного стекла.

Срок хранения полученного раствора в темноте при температуре 4°C - 2 мес.

4.4.3 Определение точной концентрации основного раствора рибофлавина

10 - коэффициент, учитывающий кратность разбавления основного стандартного раствора;

4.5 Стандартные растворы

Раствор готовят в день использования.

Растворы готовят в день использования.

5 Аппаратура

При проведении анализа используют лабораторное оборудование, в частности, перечисленное ниже.

5.1 Спектрофотометр, пригодный для измерений оптической плотности в видимой области спектра при заданной длине волны, в комплекте с кюветами длиной оптического пути 1 см.

5.2 Автоклав или нагревательный прибор

Автоклав для экстракции проб с возможностью контроля температуры и давления или плитка электрическая, или баня водяная с контролем температуры.

5.3 Хроматограф жидкостный

Система для ВЭЖХ, состоящая из насоса, инжектора, флюориметрического детектора, позволяющего проводить измерения при длине волны возбуждения 468 нм и длине волны эмиссии 520 нм, и устройства регистрации и обработки аналитического сигнала, например, интегратора.

5.4 Колонка аналитическая для ВЭЖХ

Колонка внутренним диаметром от 4,0 мм до 4,6 мм, длиной от 100 мм до 250 мм, заполненная обращенно-фазовым сорбентом размером частиц от 3 мкм до 10 мкм. Допускается использовать колонку других размеров, заполненную сорбентом другого размера частиц, по сравнению с теми, что указаны в настоящем стандарте. Условия хроматографического разделения подбирают применительно к используемой колонке для обеспечения сопоставимости результатов анализов. В приложении C приведены варианты параметров хроматографического анализа, обеспечивающие приемлемую степень отделения пика рибофлавина от пиков сопутствующих компонентов матрицы пробы.

5.5 Установка для фильтрации

Фильтрование подвижной фазы перед ее использованием и раствора пробы для хроматографического анализа перед инжекцией через мембранный фильтр размером пор, например, 0,45 мкм, продлевает срок службы аналитических колонок для ВЭЖХ.

6 Проведение анализа

6.1 Меры предосторожности

6.2 Подготовка пробы

Пробу гомогенизируют, продукты твердой консистенции измельчают с помощью подходящей мельницы, после чего перемешивают. Перед измельчением пробу рекомендуется охладить, чтобы не подвергать ее длительному воздействию высоких температур.

6.3 Приготовление раствора пробы для анализа

6.3.1 Экстракция

6.3.2 Ферментативная обработка

Для установления оптимальных условий дефосфорилирования проводят процедуру ферментативной обработки проб с добавлением рибофлавин-5’-фосфата (см. 4.3.2), а также проб, аналогичных исследуемой пробе по составу матрицы и являющихся аттестованными образцами сравнения.

При использовании для дефосфорилирования така-диастазы возможно привнесение в пробу с ферментным препаратом некоторого количества рибофлавина, что необходимо учитывать при расчете результата испытания.

Примечания

1 При установлении характеристик прецизионности, приведенных в настоящем стандарте, для проведения дефосфорилирования использована така-диастаза при следующих условиях. Значение рН экстракта доводилось до 4,0 добавлением раствора ацетата натрия по 4.2.4, после чего в экстракт вносили така-диастазу из расчета 100 мг препарата на грамм пробы. Полученную смесь инкубировали при температуре от 37°C до 46°C, продолжительность инкубирования составляла от 16 до 24 ч.

2 Скорость дефосфорилирования зависит от используемого ферментного препарата и матрицы пробы [7], [10], [11].

6.3.3 Разбавление экстракта

6.4 Идентификация аналита

Пик рибофлавина на хроматограмме раствора пробы идентифицируют по совпадению его времени удерживания со временем удерживания пика рибофлавина на хроматограмме градуировочного раствора. В качестве альтернативы пик рибофлавина на хроматограмме раствора пробы идентифицируют путем ее сопоставления с хроматограммой раствора пробы с добавлением малого количества стандартного раствора рибофлавина.

Примечание - Ниже приведены условия хроматографического анализа, гарантированно обеспечивающие удовлетворительное качество хроматографического разделения и количественного определения (см. также рисунок A.1 приложения A). Альтернативные условия приведены в приложении C.

Аналитическая колонка длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная сорбентом* диаметром частиц 5 мкм.

________________

* Например, Supelco(R) LC-18-DB, пригодный для целей применения настоящего стандарта. Данная информация приведена для удобства применения настоящего стандарта, не является рекламной поддержкой МГС данного изделия и не исключает возможность использования других изделий с аналогичными свойствами.

Условия флюориметрического детектирования: длина волны возбуждения 468 нм, длина волны эмиссии 520 нм.

6.5 Количественное определение

7 Обработка результатов

Результат определения рассчитывают с использованием градуировочного графика, либо с применением соответствующей программы расчета системы обработки данных, либо используют приведенный ниже упрощенный способ расчета.

1000 - коэффициент пересчета результата из мкг/100 г в мг/100 г;

100 - коэффициент пересчета результата как содержания аналита в 100 г пробы;

8 Прецизионность

8.1 Общие положения

Значения характеристик прецизионности методики при использовании различных параметров ВЭЖХ-анализа при определении рибофлавина установлены в 1996 г. для сухого молока (CRM 421) и свиной печени сублимационной сушки (CRM 487) в результате межлабораторных испытаний, организованных Европейской Комиссией в рамках "Программы стандартных измерений и испытаний". Статистические данные, полученные в результате межлабораторных испытаний, приведены в приложении В. Значения метрологических характеристик, полученные в результате межлабораторных испытаний, могут быть не применимы к другим содержаниям аналита и другим типам матриц, по сравнению с теми, что указаны в приложении B.

8.2 Повторяемость

Значения предела повторяемости равны:

8.3 Воспроизводимость

Значения предела воспроизводимости равны:

9 Протокол результатов испытаний

Протокол результатов испытаний должен содержать как минимум следующие сведения:

a) фамилию и подпись лица, ответственного за проведение анализа;

b) всю информацию, необходимую для идентификации пробы;

c) указание использованного метода анализа со ссылкой на настоящий стандарт;

d) дату и способ отбора пробы (если известен);

e) дату поступления пробы в лабораторию;

f) дату проведения анализа;

g) результаты испытаний с указанием единиц измерения;

h) все особенности, наблюдавшиеся при проведении анализа;

i) все операции, не оговоренные в методике или рассматриваемые как необязательные, которые могли повлиять на результат испытания.

Приложение A

(справочное)

Типичная хроматограмма

Рисунок A.1 - Пример хроматограммы градуировочного раствора рибофлавина

Условия хроматографического анализа:

________________

Условия детектирования - измерение флюоресценции при длине волны возбуждения 468 нм и длине волны эмиссии 520 нм.

Приложение B

(справочное)

Данные по прецизионности методики

Таблица B.1

Примечание - Приведенные результаты международных межлабораторных испытаний получены при использовании лабораториями - участниками идентичных процедур проведения испытания и параметров ВЭЖХ-анализа, указанных в приложении С.

Приложение C

(справочное)

Альтернативные условия хроматографического анализа

В таблице C.1 приведены условия хроматографического анализа, гарантированно обеспечивающие удовлетворительное качество хроматографического разделения и количественного анализа.

Таблица C.1 - Альтернативные условия хроматографического анализа*

________________

* Приведенные в таблице марки сорбентов - примеры изделий, пригодных для целей применения настоящего стандарта. Данная информация приведена для удобства применения настоящего стандарта, не является рекламной поддержкой МГС данных изделий и не исключает возможности использования других изделий с аналогичными свойствами.

Приложение ДА

(справочное)

Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов межгосударственным стандартам

Таблица ДА.1

Библиография