ГОСТ Р ИСО 17822-2021 Наборы реагентов для диагностики in vitro. Процедуры исследования, основанные на амплификации нуклеиновых кислот, для обнаружения и идентификации патогенных микроорганизмов. Руководство по обеспечению качества лаборатории

    ГОСТ Р ИСО 17822-2021

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Наборы реагентов для диагностики in vitro

ПРОЦЕДУРЫ ИССЛЕДОВАНИЯ, ОСНОВАННЫЕ НА АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Руководство по обеспечению качества лаборатории

In vitro diagnostic test systems. Nucleic acid amplification-based examination procedures for detection and identification of microbial pathogens. Laboratory quality practice guide

ОКС 11.100.01

Дата введения 2022-04-01

Предисловие

1 ПОДГОТОВЛЕН Ассоциацией специалистов и организаций лабораторной службы "Федерация лабораторной медицины" (Ассоциация "ФЛМ") (Комитет по молекулярной диагностике инфекционных и неинфекционных заболеваний "ФЛМ") на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 4

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 380 "Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы ин витро"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 21 октября 2021 г. N 1214-ст

4 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 17822:2020* "Наборы реагентов для диагностики in vitro. Процедуры исследования, основанные на амплификации нуклеиновых кислот, для обнаружения и идентификации патогенных микроорганизмов. Руководство по обеспечению качества лаборатории" (ISO 17822:2020 "In vitro diagnostic test systems - Nucleic acid amplification-based examination procedures for detection and identification of microbial pathogens - Laboratory quality practice guide", IDT).

Международный стандарт разработан Техническим комитетом ТК 212 "Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы in vitro" Международной организации по стандартизации (ИСО).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им национальные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА.

Дополнительные сноски в тексте стандарта, выделенные курсивом, приведены для пояснения текста оригинала

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Правила применения настоящего стандарта установлены в статье 26 Федерального закона от 29 июня 2015 г. N 162-ФЗ "О стандартизации в Российской Федерации". Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе "Национальные стандарты", а официальный текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.rst.gov.ru)

Введение

Исследования, основанные на методах амплификации нуклеиновых кислот (МАНК), в настоящее время широко используются в лабораторной медицине для диагностики in vitro (IVD) с целью обнаружения, определения и количественной оценки патогенных микроорганизмов (патогенов). На результат исследования с применением МАНК влияют все этапы диагностического процесса (преаналитический, аналитический и постаналитический). Поэтому в настоящем стандарте рассматриваются все существенные аспекты диагностического процесса: проектирование, разработка, внедрение и применение исследования с использованием МАНК для определения конкретного патогенного микроорганизма.

В перечень методов МАНК входит технология полимеразной цепной реакции (ПЦР), а также другие технологии, основанные на амплификации, такие как петлевая изотермическая амплификация (LAMP), транскрипционно-опосредованная амплификация (ТМА), амплификация с замещением цепей (SDA) и другие.

Цель данного стандарта - внедрение в лабораторную практику серийно изготовленных медицинских изделий IVD, а также проектирование, разработка и внедрение тестов, разработанных в лабораториях (LDT).

В настоящем стандарте рассмотрены дополнительные конкретные предложения, требования и рекомендации по обнаружению патогенных микроорганизмов и отбору проб, экстракции нуклеиновых кислот, генетической неоднородности и степени безопасности, необходимой для лаборатории данной категории.

В связи с высокой аналитической чувствительностью процедур, основанных на исследовании нуклеиновых кислот, необходимо уделить особое внимание к их проектированию, разработке и использованию. Это включает в себя верификацию и валидацию эффективности клинических характеристик.

В настоящем стандарте использованы следующие выражения:

- "должен/должна/должно" указывает на требование;

- "следует" указывает на рекомендацию;

- "мог/могла/могло бы" указывает на разрешение;

- "может/могут" указывает на способность или возможность.

1 Область применения

В настоящем стандарте приведены конкретные требования к клинической лабораторной практике по обеспечению качества обнаружения, идентификации и количественной оценки патогенных микроорганизмов с использованием метода амплификации нуклеиновых кислот (МАНК).

Стандарт предназначен для использования лабораториями, которые разрабатывают и/или внедряют и используют или применяют МАНК в медицинских, исследовательских или связанных с защитой здоровья и санитарным контролем целях. Требования настоящего стандарта не применяются изготовителями в процессе разработки медицинских изделий (МИ) для диагностики in vitro (IVD). Однако его предметом являются верификация и валидация таких изделий и/или соответствующих процессов, когда они внедряются и используются лабораториями.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты [для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного стандарта, недатированных ссылок - последнее издание (включая все изменения)].

ISO 15189, Medical laboratories - Requirements for quality and competence (Медицинские лаборатории. Требования к качеству и компетентности)

ISO 15190, Medical laboratories - Requirements for safety (Лаборатории медицинские. Требования к безопасности)

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины и определения.

Терминологические базы данных ИСО и МЭК доступны по следующим интернет-адресам:

- Платформа онлайн-просмотра ИСО: доступна на http://www.iso.org/obp;

- Электропедия МЭК: доступна на http://www.electropedia.org/.

3.1 точность (accuracy): Степень близости результата испытаний или измерений к истинному значению.

Примечание 1 - На практике истинное значение заменяют принятым опорным значением.

Примечание 2 - При применении к набору результатов испытаний или измерений термин "точность" включает комбинацию случайных компонент и общей систематической ошибки или смещения.

Примечание 3 - Точность связана с комбинацией правильности и прецизионности измерений.

[ИСО 3534-2:2006]

3.2 продукт амплификации, ампликон (amplification product, amplicon): Специфический фрагмент ДНК (см. 3.17), образованный в процессе использования технологии амплификации ДНК, такой как полимеразная цепная реакция (ПЦР) (см. 3.34).

[ИСО 13495:2013, 3.3.1]

3.3 аналитическая специфичность; специфичность (analytical specificity, specificity): Способность измерительной системы, применяющей заданную методику измерения, выдавать измерения только одного или нескольких мезюрандов (см. 3.28), не зависящих ни друг от друга, ни от любой другой величины в системе, подвергаемой измерению.

Примечание 1 - Отсутствие аналитической специфичности называют аналитической интерференцией.

[ИСО 18113-1:2009, А.3.2 [21]]

Примечание 2 - Специфичность процедуры измерения не следует путать с клинической специфичностью.

[ИСО 18113-1:2009, А.3.2 [21]]

Примечание 3 - VIM (международный словарь по метрологии); JCGM 200; 2012 [22] использует термин "селективность" для этого понятия вместо "специфичность".

Примечание 4 - Для качественных и полуколичественных процедур исследования аналитическая специфичность определяется способностью получать отрицательные результаты, соответствующие отрицательным результатам, полученным эталонным методом.

[ИСО 18113-1:2009, А.3.4]

3.4 биориск (biorisk): Вероятность или возможность того, что произойдет определенное неблагоприятное событие (в контексте настоящего стандарта: случайное заражение или несанкционированный доступ, потеря, кража, неправильное использование, утечка или преднамеренное выделение), которое может привести к причинению вреда.

[Управление биорисками ВОЗ, Руководство по биолабораторной безопасности, сентябрь 2006]

3.5 биобезопасность (biosafety): Включает в себя принципы профилактики, технологии и методы, которые применяют для предотвращения непреднамеренного воздействия патогенов и токсинов или их случайной утечки.

[Управление биорисками ВОЗ, Руководство по биолабораторной безопасности, сентябрь 2006]

3.6 биозащита (biosecurity): Комплекс профилактических мероприятий и действий по снижению риска преднамеренной или непреднамеренной передачи инфекционных заболеваний.

Примечание 1 - Биозащита включает в себя предотвращение преднамеренного изъятия (кражи) биологических материалов из лабораторий.

Примечание 2 - Данные профилактические меры представляют собой сочетание систем и методов, применяемых в лабораториях для предотвращения злонамеренного использования опасных патогенов и токсинов и их распространения.

3.7 калибровка (calibration): Операция, в ходе которой при заданных условиях на первом этапе устанавливают соотношение между значениями величин с неопределенностями измерений, которые обеспечивают эталоны, и соответствующими показаниями с присущими им неопределенностями, а на втором этапе на основе этой информации устанавливают соотношение, позволяющее получать результат измерения исходя из показания.

Примечание 1 - В соответствии со Сводом Федеральных Постановлений США калибровка - это процесс тестирования и настройки прибора или испытательной системы для установления корреляции между реакцией измерения и концентрацией или количеством вещества, которое измеряется с помощью процедуры тестирования (см. 42CFR 493.1218, с изменениями) [20].

[VIM; JCGM 200; 2012]

3.8 сертифицированный стандартный образец; ССО (certified reference material; CRM): Стандартный образец (см. 3.41), одно или несколько определенных свойств которого установлены метрологически обоснованной процедурой, сопровождаемый сертификатом СО (см. 3.41), в котором приведено значение этого свойства, связанная с ним неопределенность и утверждение о метрологической прослеживаемости.

Примечание 1 - Понятие "значение" включает также номинальное свойство или такой качественный признак, как идентичность или последовательность. Неопределенности для таких признаков могут быть выражены как вероятности или доверительный интервал.

Примечание 2 - Метрологически обоснованные процедуры производства и сертификации СО (см. 3.41) описаны, в частности, в ИСО 17034 [17].

Примечание 3 - Руководство ИСО/МЭК 99:2007 [19] имеет аналогичное определение.

[Руководство ИСО 30, 2.1.2]

3.9 клиническая эффективность (clinical performance): <Лабораторная медицина> способность диагностического исследования обеспечить получение результатов, связанных с конкретным клиническим или физиологическим состоянием в целевой группе населения и для предполагаемого пользователя.

Примечание 1 - Иногда упоминается как диагностическая эффективность или клиническая обоснованность; клиническая эффективность - это гармонизированный термин, одобренный Глобальной целевой группой по гармонизации (GHTF) и ее преемником, Международным форумом по регулированию медицинского оборудования (IMDRF).

Примечание 2 - Оценка клинической эффективности часто основывается на результатах других типов клинических исследований для определения истинно положительных или истинно отрицательных результатов.

[GHTF SG5/N 6:2012, 4.4.2, с изменениями - термин "медицинское изделие" заменен на "диагностическое исследование", а термин "особенный" заменен на "конкретный"]

3.10 клиническая чувствительность; диагностическая чувствительность (clinical sensitivity; diagnostic sensitivity): <Лабораторная медицина> способность методики IVD идентифицировать присутствие целевого маркера, сочетающегося с конкретной болезнью или состоянием.

Примечание 1 - Целевой маркер определяют как процент положительных результатов в пробах (см. 3.44), где целевой маркер должен присутствовать.

Примечание 2 - Диагностическую чувствительность также выражают как процент (числовая доля, умноженная на 100), рассчитанный путем умножения числа истинно положительных (ИП) значений на 100 и деления на сумму истинно положительных (ИП) и ложноотрицательных (ЛО) значений или 100·ИП/(ИП+ЛО). Данный расчет основан на такой организации исследования, при которой у каждого субъекта исследования берут только одну пробу (см. 3.44).

Примечание 3 - Целевое состояние определяют на основе критерия, независимого от рассматриваемой методики исследования.

[ИСО 18113-1:2009, А.3.15]

3.11 клиническая специфичность; диагностическая специфичность (clinical specificity; diagnostic specificity): <Лабораторная медицина> способность методики диагностического исследования in vitro выявлять отсутствие целевого маркера, ассоциированного с конкретной болезнью или состоянием.

Примечание 1 - Также определяют как процент отрицательных значений в пробах (см. 3.44), где целевой маркер, как известно, отсутствует.

Примечание 2 - Диагностическую специфичность также выражают как процент (числовая доля, умноженная на 100), рассчитанный путем умножения числа истинно отрицательных (ИО) значений на 100 и деления на сумму истинно отрицательных (ИО) и ложноположительных (ЛП) значений или 100·ИО/(ИО+ЛП). Данный расчет основан на такой организации исследования, при которой у каждого субъекта исследования берут только одну пробу (см. 3.44).

Примечание 3 - Целевое состояние определяют на основе критерия, независимого от рассматриваемой методики исследования.

[ИСО 18113-1:2009, А.3.16]

3.12 комплементарная ДНК; кДНК (complementary DNA; cDNA): Одноцепочечная ДНК (см. 3.17), комплементарная исходной молекуле РНК (см. 3.42), синтезированная в присутствии обратной транскриптазы и служащая в качестве матрицы (см. 3.47) для синтеза ДНК-копий (см. 3.17).

3.13 контаминация (contamination): Введение/внесение/попадание нежелательного вещества или материи/субстанции.

3.14 пограничное значение (точка отсечения) (cut-off value): Значение величины, используемое как предельное для идентификации пробы/образцов (см. 3.44), указывающее на наличие или отсутствие определенной болезни, состояния или мезюранда (см. 3.28).

Примечание 1 - Точка отсечения определяет, какие результаты измерения признают положительными, а какие рассматривают как отрицательные.

Примечание 2 - Результаты измерения возле пограничного значения могут рассматривать как нерешающие.

Примечание 3 - Выбор пограничного значения определяет диагностическую специфичность (см. 3.11) и диагностическую чувствительность (см. 3.10) исследования.

3.15 денатурация (denaturation): Физическое и/или химическое воздействие, приводящее к разделению двойных спиралей нуклеиновых кислот.

Примечание 1 - Денатурация ДНК (см. 3.17) приводит к разделению двухцепочечной ДНК (см. 3.17) на одноцепочечную ДНК (см. 3.17).

[ИСО 21572:2013, 3.1.6, с изменениями - термин "денатурация белков" изменен на "денатурация", а слова "белки, представляющие интерес, или" были удалены. К данному пункту было добавлено примечание 1]

3.16 дезоксирибонуклеозидтрифосфат; дНТФ (deoxyribonucleoside triphosphate; dNTP): Раствор, содержащий дезоксиаденозин-трифосфат (дАТФ), дезоксицитидин-трифосфат (дЦТФ), дезоксигуанозин-трифосфат (дГТФ), дезокситимидин-трифосфат (дТТФ) и/или дезоксиуридин-трифосфат (дУТФ).

[ИСО 22174:2005, 3.3.7]

3.17 ДНК; дезоксирибонуклеиновая кислота (DNA; deoxyribonucleic acid): Полимер дезоксирибонуклеотидов, существующий в двухцепочечной (дцДНК) или одноцепочечной (оцДНК) форме.

[ИСО 22174:2005, 3.1.2]

3.18 ДНК-полимераза для ПЦР (DNA polymerase for PCR): Термостабильный фермент, катализирующий циклический синтез ДНК (см. 3.17).

[ИСО 22174:2005, 3.4.17]

3.19 секвенирование ДНК (DNA sequencing): Определение порядка нуклеотидных оснований (аденина, гуанина, цитозина и тимина) в молекуле ДНК (см. 3.17).

Примечание 1 - Последовательность, как правило, описывается с 5’-конца.

3.20 гибридизация (hybridization): Специфичное связывание комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот (см. 3.32) при соответствующих условиях реакции.

[ИСО 22174:2005, 3.6.3]

3.21 ингибирование (inhibition): Сокращение процесса амплификации или интерференция в процессе обнаружения, которые могут привести к ложноотрицательным результатам или уменьшению количества продукта реакции.

3.22 интерферирующие вещества (interfering substances): Эндогенные или экзогенные вещества в биологическом материале клинических проб (см. 3.44), которые могут изменить результат исследования.

[ИСО 20186:2019-1, 3.15 с изменениями]

3.23 тесты, разработанные лабораторией; LDT (in house assay; laboratory developed test; LDT): Тип диагностического исследования in vitro, который разработан, изготовлен и используется в рамках одной лаборатории.

Примечание 1 - LDT должен перед началом использования пройти валидацию для его предполагаемого использования.

3.24 линейность (linearity): Способность метода анализа в определенном диапазоне выдать аналитический сигнал или результаты, пропорциональные количеству целевой последовательности нуклеиновых кислот (см. 3.46), определяемой в клинической пробе (см. 3.44).

Примечание 1 - Для кПЦР количественный цикл (также называемый значением порогового цикла или точкой пересечения) обратно пропорционален количеству целевой последовательности нуклеиновой кислоты (см. 3.46).

Примечание 2 - Термин "линейность" часто взаимосвязан с диапазоном линейности метода и относится к способности метода выдавать ответ или результат, который непосредственно связан с концентрацией целевой последовательности нуклеиновой кислоты (см. 3.46).

[ИСО 16577:2016, 3.92, с изменениями - добавлены примечания 1 и 2 к данному пункту; "количество аналита" заменено на "количество целевой последовательности нуклеиновой кислоты" (см. 3.46)]

3.25

предел обнаружения;

LOD (limit of detection; LOD): Измеренное значение величины, полученное в соответствии с данной методикой измерений, для которого вероятность ошибочного утверждения об отсутствии компонента в материале равна

, а вероятность ошибочного утверждения о его наличии равна

.

Примечание 1 - Термин "аналитическая чувствительность" иногда используется для обозначения предела обнаружения, но такое использование в настоящее время не рекомендуется. См. ИСО 18113-1:2009, А.2.7 и А.2.8 для получения дополнительной информации.

Примечание 2 - При идентификации нуклеиновых кислот минимальное количество или присутствие целевого организма в заданном количестве определенного вещества, которое может быть достоверно обнаружено в условиях, заданных в применяемом методе.

Примечание 3 - В молекулярных методах и количественных молекулярных методах самая низкая концентрация мезюранда, которая может быть стабильно обнаружена (как правило, в >95% проб (см. 3.44), исследованных в обычных клинических лабораторных условиях и в определенном типе пробы (см. 3.44).

Примечание 4 - При количественном исследовании значение предела обнаружения концентрации должно воспроизводимо отличаться от значений, полученных в пробах (3.44), которые не содержат мезюранд.

[ИСО 18113-1:2009, А.3.14, с изменениями - добавлены новые примечания]

3.26 предел количественного определения; LOQ (limit of quantification; LOQ): Наименьшая концентрация или количество целевой последовательности нуклеиновых кислот (см. 3.46) в определенном объеме, которая(ое) может быть измерена(о) с обоснованной статистической достоверностью последовательно в условиях, определенных методикой проведения исследования.

Примечание 1 - Обычно обозначается в терминах признака или измеренного (истинного) значения, с заданным коэффициентом вариации (КВ).

[ИСО 16577:2016, 3.91, с изменениями - заменены слова "содержание аналита, представляющего интерес" на "количество целевой последовательности нуклеиновых кислот (см. 3.46)", слова "количество матрикса" на "объем", а слова "относительное стандартное отклонение (ОСО)" на "коэффициент вариации(КВ)"]

3.27 мастермикс (mastermix): Смесь реагентов, необходимых для амплификации нуклеиновой кислоты, за исключением целевой ДНК (см. 3.17) и контрольных образцов.

[ИСО 22174:2005, 3.4.18]

3.28 измеряемая величина; мезюранд (measurand): Величина, подлежащая измерению.

[VIM; JCGM 200; 2012]

Пример 1 - Количество целевого гена, измеренное методом ПЦР (см. 3.34), зависит от размера ампликона (см. 3.2) при исследовании ПЦР (см. 3.34) и размера фрагмента матрицы (см. 3.47) (~<размер ампликона).

Пример 2 - Денатурация (см. 3.15) ДНК (см. 3.17) пробы (см. 3.44) до одноцепочечной ДНК влияет на количественную оценку методом dPCR (цифровой ПЦР), поскольку две цепи рассматриваются отдельно.

Примечание 1 - Инструкции по измерению требуют знания рода величины, включая любой соответствующий компонент, и связанных с ним химических соединений.

Примечание 2 - Во втором издании VIM и в МЭК 60050-300:2001 измеряемая величина определяется как "конкретная величина, подлежащая измерению".

Примечание 3 - Измерение, включая измерительную систему и условия, при которых оно проводится, может изменить явление, тело или вещество таким образом, что величина в процессе измерения будет отличаться от мезюранда определенным образом. В этом случае необходимо вводить соответствующую корректировку.

[Руководство ИСО/МЭК 99:2007, 2.23, с изменениями - изменены примечание 3 и примеры, примечание 4 исключено]

3.29 отрицательный контроль ПЦР (negative PCR control): Реакция, выполненная с водой [без целевой матрицы (см. 3.47)], не содержащей нуклеиновых кислот и каких-либо ингибиторов ПЦР.

[ИСО 22174:2005, 3.5.6]

3.30 отрицательный контроль процесса (negative process control): Образец (см. 3.44), не содержащий исследуемого возбудителя, прошедший все этапы аналитического процесса.

Примечание 1 - Исследование нуклеиновых кислот обычно включает подготовку пробы (см. 3.44), обогащение, выделение нуклеиновой кислоты (см. 3.32) и амплификацию мишени.

[ИСО 22174:2005, 3.5.2, с изменениями - изменено примечание 1 к данному пункту]

3.31 отрицательный контроль, не содержащий образца (контроль без матрицы); NTC (no template control; NTC): Контрольный тест, содержащий все реагенты, за исключением экстрагированного тестируемого образца (см. 3.44), матрицы (см. 3.47), нуклеиновых кислот (см. 3.32).

Примечание 1 - Этот тип контроля используют для демонстрации отсутствия загрязняющих нуклеиновых кислот (см. 3.32). Вместо матрицы (см. 3.47) ДНК (см. 3.17), например, в реакцию добавляют соответствующий объем воды, свободной от нуклеиновых кислот. Иногда используют термин "контроль реагентов ПЦР" (см. 3.34).

[ИСО 20395:2019, 3.20]

3.32 нуклеиновая кислота (nucleic acid): Макромолекула, являющаяся носителем генетической информации, или выступающая в качестве посредника при передаче информации.

Примечание 1 - Существуют два типа нуклеиновых кислот - ДНК (см. 3.17) и РНК (см. 3.42).

[ИСО 22174:2005, 3.1.1]

3.33 экстракция нуклеиновой кислоты (nucleic acid extraction): Выделение нуклеиновой кислоты (см. 3.32) из биологического материала.

Примечание 1 - Как правило, проводится перед амфликацией и анализом нуклеиновой кислоты (см. 3.32).

3.34 полимеразная цепная реакция; ПЦР (polymerase chain reaction; PCR): Ферментативная реакция, позволяющая амплифицировать ДНК (см. 3.17).

[ИСО 22174:2005, 3.4.1].

3.35 полиномиальная регрессия (polynomial regression): Форма регрессии, использующая метод наименьших квадратов с применением полиномов различных степеней:

(полином первой степени или линейное приближение);

(полином второй степени) и

(полином третьей степени).

3.36 ДНК ПЦР-качества (PCR-quality DNA): Матрица (см. 3.47) ДНК (см. 3.17) достаточной длины, чистоты и количества для выполнения ПЦР (см. 3.34).

[ИСО 24276:2006, 3.2.3]

3.37 исследование, одобренное регулирующим органом* (regulatory body approved assay): Исследования, которые разработаны и внедрены изготовителем и одобрены регулирующим органом для диагностических целей.

_________________

* В Российской Федерации для диагностики IVD применяют только зарегистрированные медицинские изделия (МИ). Регистрацию МИ проводят в установленном порядке организации, уполномоченные федеральным органом исполнительной власти.

Пример - Тесты с маркировкой СЕ.

Примечание 1 - Маркировка СЕ - заявление производителя о том, что продукт соответствует требованиям релевантных директив Евросоюза.

3.38 обратная транскрипция; ОТ (reverse transcription; RT): Способ получения ДНК (см. 3.17) из матрицы (см. 3.47) РНК (см. 3.42) с использованием ферментативной активности обратной транскриптазы, связанной с одним или несколькими олигонуклеотидными праймерами при подходящих условиях.

[ИСО 16577:2016, 3.180]

3.39 модифицированный метод исследования in vitro (modified IVD labeled assays; modified IVD labeled tests): Методики, разработанные и внедренные изготовителями и одобренные регулирующим органом или отвечающие требованиям релевантных директив ЕС, но измененные при использовании в лабораториях.

Примечание 1 - В зависимости от степени изменений, внесенных в исходный метод, необходима повторная валидация этого метода.

3.40 ПЦР в реальном времени (real time PCR): Методика, сочетающая ПЦР (см. 3.34) и обнаружение меченого флуоресцентным зондом продукта амплификации в одной реакции.

3.41 стандартный образец; СО (reference material; RM): Материал, достаточно однородный и стабильный по отношению к одному или нескольким определенным свойствам, которые были установлены для того, чтобы использовать его по назначению в измерительном процессе.

Примечание 1 - "Стандартный образец" - это собирательный термин.

Примечание 2 - Свойства могут быть количественными или качественными, например отличительные характеристики веществ или соединений.

Примечание 3 - Применение может включать калибровку (см. 3.7) измерительной системы, оценку процедуры измерения, определение значений параметров других материалов и контроль качества.

Примечание 4 - В Руководстве ИСО/МЭК 99:2007 [19] приведено аналогичное определение (см. 5.13), но оно ограничивает сферу применения термина "измерение" количественными характеристиками. Однако в примечании 3 Руководства ИСО/МЭК 99:2007, 5.13 (VIM; JCGM 200; 2012 [22]) отдельно рассматриваются качественные свойства, называемые "номинальными свойствами".

[Руководство ИСО 30]

3.42 РНК; рибонуклеиновая кислота (RNA; ribonucleic acid): Полимер рибонуклеотидов, существующий в двухцепочечной или одноцепочечной форме.

[ИСО 22174:2005, 3.1.3]

3.43 устойчивость (robustness): Способность количественного анализа протекать в оптимальном режиме, вне зависимости от незначительного изменения его условий.

Примечание 1 - Обычно относится к ПЦР (см. 3.34), в которой амплификация происходит вне зависимости от незначительных изменений условий реакции, таких как концентрация ДНК (см. 3.17).

3.44 образец/проба* (sample): Одна или несколько представительных частей, взятых из системы и предназначенных для получения информации о целом.

_________________

* В Российской Федерации для характеристики биологических жидкостей используют термин "первичная проба (проба)", для характеристики биологических тканей используют термин "образец (часть образца)". В данном стандарте термин "образец" применяют к ДНК и РНК. Под пробой понимается только гомогенный материал, полученный клинической лабораторией для исследования.

Примечание 1 - Обычно относится к ПЦР (см. 3.34), в которой амплификация происходит вне зависимости от незначительных изменений условий реакции, таких как концентрация ДНК (см. 3.17).

[ИСО 16577:2016, 3.185]

3.45 база данных последовательностей (sequence database): <Биоинформатика> биологическая база данных, состоящая из последовательностей нуклеиновых кислот (см. 3.32), белковых последовательностей или других полимерных последовательностей и сопутствующей аннотации.

Примечание 1 - Аннотация может относиться к организму, видам, функциям, мутациям, связанным с конкретными заболеваниями, функциональным или структурным признакам, библиографическим ссылкам и т.д.

Примечание 2 - Последовательности генома могут находиться в открытом доступе, так как любая последовательность ДНК (см. 3.17) или РНК (см. 3.42), или белка должна быть помещена в общедоступную базу данных.

3.46 целевая последовательность; целевая последовательность нуклеиновых кислот (target sequence; nucleic acid target sequence): Специфическая последовательность ДНК (см. 3.17), которую необходимо обнаружить, например, методом ПЦР (см. 3.34).

[ИСО 16577:2016, 3.203]

3.47 матрица (template): Участок ДНК (см. 3.17) или РНК (см. 3.42), который определяет нуклеотидную последовательность вновь синтезированной цепи ДНК (см. 3.17) или РНК (см. 3.42), причем эти две цепи комплементарны.

[ИСО 16577:2016, 3.206]

3.48 однонаправленный рабочий процесс (unidirectional work; flow forward work flow): <Лабораторная медицина> принцип обращения с первичной пробой (см. 3.44), предусматривающий физическое разделение принятого биологического материала и проходящей различные этапы первичной пробы (см. 3.44) и пробы в процессе обработки, включая амплифицированную ДНК (см. 3.17), во время процедуры анализа.

[ИСО 24276:2006, 3.3.5, с изменениями - слова "Лабораторная проба (см. 3.44) - первичная и в процессе обработки его часть, подвергающаяся исследованию" заменены на "первичная проба (см. 3.44) и проба в процессе обработки (см. 3.44)", а слова "всей процедуры" заменены на "процедуры анализа"]

3.49 валидация (validation): Подтверждение, путем предоставления объективных доказательств, соответствия требованиям предназначенного применения или использования.

Примечание 1 - Термин "валидированный" используется для обозначения соответствующего статуса.

Примечание 2 - Адаптировано из ИСО 9000:2015 [31].

Примечание 3 - Дополнительную информацию см. в приложении В.

[ИСО 15189: 2012, 3.26]

3.50 верификация (verification): Подтверждение, посредством представления объективных свидетельств, того, что установленные требования были выполнены.

Примечание 1 - Термин "верифицированный" используется для обозначения соответствующего статуса.

Примечание 2 - Подтверждение может выражаться в таких действиях, как выполнение альтернативных расчетов, сравнение нового технического задания с аналогичным проверенным техническим заданием, проведение испытаний и демонстраций, а также рассмотрение документов перед началом использования.

Примечание 3 - Дополнительную информацию см. в приложении В.

[ИСО 9000:2015]

4 Основные требования к лабораториям, использующим МАНК для определения патогенных микроорганизмов

4.1 Общие требования к управлению рисками и биобезопасности в лаборатории

В клинико-диагностической лаборатории должны быть обеспечены безопасность и защита персонала лаборатории и обслуживающего персонала. Применяют требования ИСО 15190. Так как многие микроорганизмы являются патогенными, должны применяться соответствующие требования правил биобезопасности.

В клинико-диагностической лаборатории должны оценивать процесс обнаружения нуклеиновых кислот для выявления таких рисков, как отказы, эксплуатационные ошибки, опасности и опасные ситуации. Риски для пациентов и сотрудников лаборатории должны быть определены до начала исследования и нивелированы в ходе планирования работ. До и во время внедрения, а также регулярно в течение всего жизненного цикла эксплуатации риски необходимо анализировать, контролировать и устранять.

Примечание 1 - При осуществлении деятельности в клинико-диагностической лаборатории можно руководствоваться [9].

Примечание 2 - Может применяться Руководство ВОЗ по биобезопасности [11].

Примечание 3 - Общие принципы и методы управления рисками, описанные в [8], также могут быть применены в клинико-диагностической лаборатории.

Примечание 4 - Общие рекомендации по уменьшению количества лабораторных ошибок приведены в [40].

Примечание 5 - Информация о планировании контроля качества на основе принципов управления рисками приведена в [1].

4.2 Общие требования к организации процедуры обнаружения патогенов в лаборатории

Должны соблюдаться общие требования к надлежащей практике по организации деятельности лабораторий, использующих МАНК, в которые обычно входит разделение помещений, проводится деятельность до и после амплификации, и, возможно, дальнейшее разделение лабораторных этапов. Наряду с соответствующей оценкой риска следует также учитывать внутрилаборторные, касающиеся изоляции патогенов.

Следует обратить внимание на ситуации, в которых риск загрязнения образца/проб больше, чем требуется для обработки экстрагированных нуклеиновых кислот. При работе с патогенами, для которых более высок риск распространения, как правило, требуется более низкий риск при обработке выделенной нуклеиновой кислоты и исследований МАНК. Однако не следует полагать, что процедура экстракции делает образец/пробу незаразной. В связи с этим следует рассмотреть вопрос об оценке риска возникновения угрозы безопасности.

Чтобы повысить биобезопасность, инактивация патогенов должна происходить на самой ранней стадии, на которой это возможно. Однако метод инактивации должен быть утвержден, и при необходимости должны быть применены процедуры, касающиеся рисков и безопасности.

Существуют общие требования к лабораториям по управлению и предотвращению контаминации.

Можно выделить пять категорий источников загрязнения; деятельность лаборатории должна быть организована таким образом, чтобы свести к минимуму риск контаминации от каждого потенциального источника.

1) Окружающая среда

Источник загрязнения - вне лаборатории. Как правило, не является проблемой при обнаружении патогенов, в случае, когда близкородственные виды патогенов окружающей среды могут вызывать риск контаминации, в лаборатории следует задействовать процессы для выполнения необходимых требований.

Более подробная информация об однонаправленном рабочем процессе и условиях давления воздуха приведена в 7.2.2.

2) Лаборатория

Основной источник контаминации обусловлен получением лабораторией большого количества нуклеиновых кислот. При использовании МАНК это наиболее частая проблема, поскольку функция лаборатории - воспроизводство больших количеств исследуемой мишени (ампликона); это основной источник любой контаминации при использовании МАНК. Контаминация в лаборатории также может возникать из-за использования векторов, содержащих целевые последовательности. При обнаружении патогенов контаминация также может быть производной микробной культуры исследуемых патогенов. Для предотвращения и уменьшения вероятности контаминации можно разделить подготовку проб и проведение исследования от помещений, где может присутствовать большое количество генетического материала. В дальнейшем риск загрязнения должен быть снижен путем использования специального лабораторного оборудования и халатов.

3) Реагенты

Поскольку многие реагенты МАНК рекомбинантны, они могут сохранять некоторое количество бактериальной ДНК. Данная проблема особенно актуальна при использовании ортогональных генов, таких как ген рибосомной РНК 16S.

4) Исследователь

Обычно не является основным источником загрязнения для специфичного к патогену МАНК и не является носителем патогена. Потенциально, может возникнуть проблема бессимптомного носителя патогена (или близкородственных ему видов) в организме человека. Стандартные лабораторные способы защиты (например, защитная одежда, перчатки, наконечники фильтров и т.д.) могут уменьшить риск контаминации.

5) Образец/проба

Потенциальный основной источник заражения, который часто не учитывают. Если образец/пробу с высоким уровнем патогенных микроорганизмов обрабатывают вблизи биологического материала с низким уровнем (титром) или не содержащего патоген, вероятна перекрестная контаминация. Стандартные лабораторные процедуры (например, применение наконечников фильтров) могут уменьшить риск загрязнения из этого источника.

Для снижения риска контаминации должны быть разработаны и внедрены стандартные процедуры, а персонал должен пройти соответствующее обучение, которые могут включать ограничение доступа персонала и однонаправленный рабочий процесс, который начинается от мест работы с отрицательным ампликоном к местам работы с положительными ампликонами и/или использование одноразовых лабораторных халатов или другой защитной одежды. Это может быть неприменимо при использовании закрытых систем, которые проводят экстракцию, амплификацию и детекцию нуклеиновых кислот автоматически как единый рабочий процесс.

В результате загрязнение должно контролироваться соответствующим образом, позволяющим определить его влияние на результаты. Персонал, имеющий доступ в лабораторию, должен быть обучен, а обучение задокументировано.

Дальнейшая информация представлена в разделе 5.

4.3 Оборудование (включая программное обеспечение)

Оборудование, предназначенное для проведения исследований на основе амплификации нуклеиновых кислот, включая программное обеспечение, необходимое для проведения анализа, должно устанавливаться, верифицироваться, калиброваться и обслуживаться в соответствии с инструкциями изготовителя по применению и документированными лабораторными процедурами.

При необходимости должна быть верифицирована интеграция лабораторных приборов в существующую ИТ-инфраструктуру.

Пример - Подключение к базам данных, биоинформационным функциям и т.д.

Если для одного и того же теста на наличие нуклеиновой кислоты потенциально используют несколько приборов, то для обеспечения сопоставимости результатов проводят сравнение на разных приборах. В лаборатории должны верифицировать любые разработанные внутренние интерфейсы, соединяющие компоненты приборов, а также верифицировать интерфейсы, соединяющие компоненты приборов, разработанные изготовителем.

4.4 Персонал лаборатории

Персонал, участвующий в проведении исследований на основе амплификации нуклеиновых кислот, должен быть квалифицирован и обучен до соответствующего уровня компетентности, необходимого для использования конкретного МАНК и работы с конкретным патогеном, включая постоянное повышение квалификации для поддержания компетентности.

Квалификация и прохождение обучения персоналом должны быть задокументированы.

5 Планирование и практическое внедрение исследований патогенов с использованием МАНК

В общем случае требования к проекту методики/теста указываются в техническом задании. Планирование научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ включает в себя:

1 определение потребностей пользователей и требований заинтересованных сторон;

2 определение предполагаемого медицинского применения;

3 эксплуатационные требования и технические характеристики, а также другие проектные требования и технические характеристики, основанные на предполагаемом использовании;

4 оценку риска методики/теста;

5 разработку исследования и квалификацию поставщика компонентов для проведения исследования; должно включать, но не ограничиваться: сбором и обработкой образцов/проб, экстракцией нуклеиновых кислот, амплификацией нуклеиновых кислот, а также обнаружением и идентификацией нуклеиновых кислот целевого патогенного микроорганизма, структурой лаборатории, однонаправленным рабочим процессом и лабораторной практикой;

6 этап технико-экономического обоснования;

7 планирование верификации и валидации;

8 верификацию технических характеристик разработки.

Пример - Предел обнаружения, пограничные значения, аналитическая специфичность (включая перекрестную реактивность и интерференцию), точность, перенос, линейность и, в соответствующих случаях, коммутативность калибратора и отслеживаемость результатов по эталонным материалам или процедурам эталонного измерения;

9 планирование производственного процесса в лабораторных масштабах;

10 валидацию предусмотренного применения;

11 изменения во время и после разработки исследования по сравнению с проектом должны быть задокументированы.

Специфические условия для патогена должны включать, но не ограничиваться: рассмотрением генетических свойств патогена [внутренняя и межвидовая гетерогенность последовательностей, необходимая оперативная таксономическая единица (ОТЕ), специфичность при рассмотрении близкородственных видов, связь с генами резистентности].

Примеры

Использование мультиплексных панелей (например, респираторная панель).

Латентность, носительство, диапазоны референтных значений, релевантные для мультиплексных панелей, которые могут обнаруживать организмы, не включенные в дифференциальную диагностику.

5.1 Материал для контроля качества

5.1.1 Экспертиза материала для контроля качества

Для получения достоверных данных и результатов анализа крайне важен выбор и использование соответствующих средств контроля и контрольных материалов.

В лаборатории должны быть определены требования и соответствующие им технические характеристики контрольных материалов до проведения верификации/валидации. Частота использования выбранных контрольных материалов может быть основана на результатах верификации и валидации.

Для снижения вероятности получения недостоверных результатов вследствие ненадлежащего выполнения всей или части процедуры исследования должны быть использованы определенные средства контроля, в особенности процедуры обеспечения качества должны быть разработаны таким образом, чтобы свести к минимуму ложноположительные и ложноотрицательные результаты.

Внутренние контроли, контроль ингибирования для методов МАНК могут быть гомологичными внешними, гетерологичными внешними или гетерологичными внутренними. Добавленный перед подготовкой образца, внутренний контроль может также служить контролем целого процесса.

Мероприятия по контролю процесса должны применяться для предотвращения потенциальных сбоев двухосновных этапов диагностических исследований in vitro при определении нуклеиновых кислот: (1) весь рабочий процесс предварительного исследования от сбора проб/образцов до выделения нуклеиновых кислот и (2) анализ нуклеиновых кислот, включая амплификацию и идентификацию. Методика исследования на основе МАНК должна включать в себя соответствующие средства контроля для полного обеспечения качества и надежности полученных данных.

Примечание 1 - Общее руководство по контролю кПЦР и цПЦР приведено в [12] (пункт 4.4).

Обоснование выбора контрольных материалов и процедур должно быть задокументировано.

1 Отрицательный контроль

Цель отрицательного контроля состоит в том, чтобы провести исследование, не имеющее клинической цели, для оценки ложноположительных результатов, вызванных либо технической неспецифичностью, либо контаминацией. Самым простым способом его выполняя может быть осуществление безматричных реакций, однако более усовершенствованный отрицательный контроль реакции может включать нуклеиновые кислоты, которые, вероятно, также будут присутствовать в пробе/образце, например ДНК человека, чтобы также оценить специфичность.

Отрицательный контроль может быть использован для оценки всего процесса, чтобы предоставить дополнительную информацию об источнике ложноположительного результата (например, перекрестная контаминация во время обработки проб/образцов). В этой ситуации могут быть использованы соответствующие биологические образцы или искусственные заменители (например, кровь, исходные растворы), но перед использованием для оценки ложноположительных результатов должно быть установлено, что они свободны от нуклеиновой кислоты мишени патогена.

Дополнительная информация приведена в [3] и [10].

2 Положительный контроль

Целью положительного контроля является выявление ложноотрицательных результатов и оценка качества выполнения исследования. Положительный контроль может оценивать всю процедуру исследования или анализ отдельных проб/образцов. Материалом для положительного контроля может быть очищенная нуклеиновая кислота, очищенные ампликоны, векторы (например, плазмиды), содержащие целевую последовательность нуклеиновых кислот, и искусственная нуклеиновая кислота (см. таблицу 1). Если используют переносчики или амплифицированный материал, то они должны быть разбавлены до подходящей концентрации [

107 единиц/мм

(единиц/мкл)] перед выполнением ПЦР (см. рисунок 1). Это снизит вероятность контаминации от сверхконцентрированных нуклеиновых кислот.

Исходные растворы, содержащие целевой патоген, могут быть использованы в соответствующем и проверенном разведении для использования в качестве положительного контроля (например, для диагностики вирусов).

Концентрации контролей должны быть выбраны для верификации эффективности исследования в целях принятия соответствующих аналитических и клинических решений.

Для качественных методик/тестов положительный контроль (амплификация или экстракция) должен иметь концентрацию, аналогичную нижнему диапазону клинической патогенной нагрузки рассматриваемого образца.

Для количественных процедур, если полученные показания не охвачены калибровочной кривой, следует использовать положительный контроль с высокой активностью вблизи верхнего предела отчетного диапазона и низкой вблизи нижнего предела обнаружения. Калибровочная кривая может представлять собой геномную последовательность нуклеиновой кислоты или ее эквивалента (например, плазмиды, содержащие последовательно разбавленную целевую последовательность нуклеиновых кислот). Однако таким образом невозможно провести оценку динамического диапазона или откалибровать весь процесс. Следовательно, целесообразно, если это возможно, использовать цельный патоген, последовательно разбавленный в соответствующей матрице, чтобы попытаться также проконтролировать линейный динамический диапазон процедуры экстракции. Ампликон не следует использовать для построения стандартной кривой из-за потенциального переноса фрагментов димера.

Если средства контроля разработаны и изготовлены лабораторией (набор образцов матрицы с известной добавкой, внутренние средства контроля и т.д.), следует выделить и хранить достаточное количество отдельных аликвот, чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания. Должна быть также определена стабильность средств контроля, разработанных лабораторией. Эти разработанные средства контроля не должны использоваться после истечения установленного срока годности.

По возможности следует осуществлять контроль всего процесса (например, использовать средства контроля, способные также оценивать эффективность преаналитических процедур, например экстракции). Дополнительная информация приведена в таблице 1.

Контроль экстракции может представлять собой партию образцов, взятых от пациента, содержащих целевую нуклеиновую кислоту или матрицу, свободную от патогенов, специально зараженную целевыми патогенами. Матрица должна быть той же, что и в пробах/образцах, подвергающихся исследованию, или аналогичной.

Внутренний контроль и контроль ингибирования (т.е. контроль, способный обнаруживать ингибирование) должен в максимальной степени имитировать целевую последовательность, но не должен обнаруживаться при помощи данного метода анализа. Обычно контроль ингибирования - это материалы нуклеиновых кислот, с помощью которых оценивают молекулярно-биологические этапы исследования (например, ПЦР и обратную транскрипцию).

По возможности в качестве внутреннего контроля используют цельный патоген, а не только нуклеиновые кислоты. Для проведения внутреннего контроля все исследуемые образцы должны быть специально обогащены патогеном в известной концентрации.

При осуществлении внутреннего контроля должны быть продемонстрированы те же характеристики выхода, целостности и чистоты, что и для изолированных целевых последовательностей, не взаимодействующих с целевой нуклеиновой кислотой. Дополнительная информация приведена в [3], [4] и [12].

Таблица 1 - Примеры материалов для положительного и отрицательного контроля

5.1.2 Распознавание целевой последовательности

Отбор и оценка последовательностей нуклеиновых кислот для использования в качестве праймеров для амплификации с одной стороны и для использования в качестве целевых последовательностей - с другой стороны являются центральным элементом процесса верификации и валидации методов амплификации нуклеиновых кислот.

Как правило, чувствительность методов обнаружения устанавливается в основном эффективностью связывания праймера с последовательностями целевых генов. Точно так же специфичность методов обнаружения в значительной степени зависит от выбора области генома, подлежащей амплификации.

Выбор гена-мишени определяют предусмотренным применением результата исследования в соответствии с перечнем требований к нему.

Примечание 1 - Целевая последовательность нуклеиновых кислот патогена может быть геномной или векторной ДНК, информационной РНК, рибосомной РНК или геномной РНК.

Примечание 2 - Для определения широкого спектра бактерий, как правило, используют гены 16 s рРНК и гены 23 s рРНК, а гены 18 s рРНК и 28 С рРНК - для определения эукариотических патогенов.

Для мультиплексного анализа каждая целевая последовательность не должна быть сходна с другой, чтобы минимизировать перекрестную реактивность.

Если выбрана целевая область, то последовательность должна быть оценена на предмет степени ее схожести с другими организмами с использованием соответствующей базы данных последовательностей нуклеиновых кислот. Следует изучить несколько вариантов одной последовательности.

Для отбора праймеров следует знать целевую последовательность и избегать полиморфных областей, кроме случаев, когда полиморфные области используют для распознавания патогена.

Праймеры должны быть разработаны в соответствии с требованиями к проводимому исследованию, например к ПЦР, технологии изотермической амплификации или другим методам.

Следует использовать руководства по разработке, например "Минимальную информацию по публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени [16] или цифровых ПЦР [33]", когда это применимо.

5.2 Верификация и валидация

Исследования можно разделить на четыре группы:

1 одобренные методики/тесты анализа in vitro;

2 одобренные методики/тесты in vitro диагностики, модифицированные лабораторией с целью удовлетворения потребности пациента;

3 методики/тесты, разработанные лабораторией (LDT);

4 методики/тесты, предлагаемые изготовителями, предназначенные для использования только в научных исследованиях.

В таблице 2 представлены возможные мероприятия для проведения верификации или валидации исследования.

Таблица 2 - Возможные мероприятия для проведения верификации или валидации исследования

6 Верификация или валидация диагностических систем

Дальнейшая информация приведена в приложении В.

6.1 Утверждение методики исследования посредством сравнения разных методических приемов

Существует два подхода к оценке характеристик результативности исследования.

Один из подходов состоит в сравнении методов, при которых образцы/пробы подвергаются исследованию параллельно как с применением разработанного метода, так и с применением заведомо валидированного метода.

Сравнение методов применимо, если заведомо валидированный метод уже применяют в лаборатории или если лаборатория имеет доступ к результатам применения заведомо валидированного метода в другой клинической лаборатории. Предпочтительно, чтобы для сравнения методов использовались образцы/пробы, взятые от пациентов одной территории проживания.

В качестве второго подхода можно использовать специально зараженные образцы/пробы, если получить соответствующие образцы/пробы от пациентов для оценки характеристик результативности невозможно. С помощью специально зараженных образцов/проб проверяют, способен ли новый метод исследования измерить представляющий интерес аналит в случае, когда известное его количество заведомо присутствует в матрице образца. В некоторых исследованиях могут потребоваться реальные образцы/пробы, взятые от пациентов, в зависимости от анализа риска.

Специально зараженные образцы должны быть хорошо охарактеризованы, и сопроводительная документация может включать стандартные образцы, материалы контроля качества, материалы для проверки квалификации или образцы, взятые от пациентов, с известными или согласованными значениями.

7 Проектирование и разработка теста в лаборатории (LDT)

7.1 Общие положения

Этап планирования разработки теста в лаборатории должен состоять из этапа проектирования и этапа технико-экономического обоснования. На этапе технико-экономического обоснования должны быть собраны первые данные о результативности, а также должны быть использованы процессы, направленные на устранение проблем и оптимизацию для установления характеристик результативности и разработки приемлемой процедуры валидации.

Для технического обоснования на этапе планирования в лаборатории должно быть проанализировано наличие необходимого оборудования, реагентов, возможные затраты, наличие контрольных и стандартных образцов, необходимых для разработки исследования. Ожидаемая продолжительность и технико-экономическое обоснование процедуры исследования должны учитываться при проектировании и валидации метода исследования.

Примечание 1 - При введении в практическое применение методик количественного анализа/исследования с маркировкой IVD ожидаемые характеристики результативности указываются производителем. Цель принятого плана верификации - проверка технических характеристик исследования в конкретных лабораторных условиях.

Процесс разработки исследования должен включать в себя первоначальную оценку (потребности, предусмотренное применение, требования к разработке), планирование конструирования и разработки, разработку исследования, верификацию, валидацию и внедрение в лаборатории. Дальнейшая информация приведена в ИСО 20395 [12].

7.1.1 Определение потребностей потребителя/пациента и заинтересованных сторон в предполагаемом применении исследования

При планировании разработки должны быть учтены правила и этические принципы для поддержания доверительных отношений с потребителями исследования, пациентами и общественностью [5].

Условия и требования заинтересованных сторон, например регулирующих или законодательных органов, должны быть определены и задокументированы.

Потребности потребителя/пациента должны быть определены и задокументированы.

Должны быть определены процедуры сбора и обработки проб/образцов, а также критерии их принятия/отклонения.

Должно быть валидировано предусмотренное применение метода исследования, включая клиническую эффективность.

Предусмотренное применение должно определяться с учетом следующих факторов, включая, но не ограничиваясь ими:

a) цель, выгода и сфера применения метода исследования (например, скрининг, диагностика, прогнозирование, мониторинг, подтверждение диагноза);

b) целевая популяция;

c) использование полученных результатов для целей ведения пациента;

d) типы проб/образцов;

e) процедуры сбора и обработки;

f) критерии для принятия или отклонения проб/образцов.

Должно быть принято решение о том, продолжать ли планировать проектирование и разработку.

7.1.2 Общие критерии верификации исследования

В лаборатории должны быть верифицированы основные характеристики результативности одобренной методики исследования in vitro, описанные в инструкциях изготовителя, чтобы продемонстрировать эти характеристики в соответствующих условиях. Для качественных исследований (тестов) положительные и отрицательные результаты испытаний сравнивают с сопоставимым методом испытаний. Для количественных исследований (тестов) проводят сравнение результатов испытаний по всему отчетному диапазону (точности) и исследования прецизионности. Кроме того, следует верифицировать заявление изготовителя о пределах обнаружения/регистрируемого диапазона и неопределенности измерений, если это применимо, а также в лаборатории должны быть верифицированы референтные интервалы, если они указаны. Дополнительная информация приведена в приложении В.

Если лаборатория разрабатывает метод исследования (LDT) или модифицирует одобренный метод исследования in vitro, то необходимо провести верификацию, установив и задокументировав требования, например к точности, прецизионности, аналитической чувствительности, аналитической специфичности (влияние интерферирующих веществ), регистрируемому диапазону и референтным интервалам в качестве клинически применимых. Данные об интерферирующих веществах могут быть получены из открытых источников или из результатов исследований, проведенных в других лабораториях, однако в лаборатории, проводящей исследования, необходимо верифицировать эту информацию (при возможности).

Верификация должна происходить в лаборатории, где будет проводиться клиническое исследование; если верифицированный метод исследования будет применяться в другой лаборатории, то в этой лаборатории требуется определить, что перемена места или какое-либо изменение условий окружающей среды (температуры, влажности и т.д.) на характеристики результативности не повлияли.

При применении в лаборатории одобренных методов исследований in vitro выполнение условий их проведения должно быть валидировано.

Процедура верификации (например, планирование верификации, ее выполнение), данные и результаты должны быть задокументированы в соответствии с требованиями к процессу разработки исследования как часть действующей лабораторной системы менеджмента качества, а также как возможные объяснения любых расхождений в результатах. Точность, прецизионность и регистрируемый диапазон должны быть проанализированы, и, если они удовлетворительны, метод должен быть одобрен руководителем лаборатории или назначенным лицом как приемлемый для использования в качестве диагностического исследования до использования на пробах пациентов.

7.1.3 Особые критерии верификации требований технического задания для исследования

Должен быть проведен анализ риска потенциального влияния всех этапов диагностического процесса на валидность и надежность обследования.

Как правило, все этапы диагностического процесса, которые могут оказать влияние на результат исследования, должны быть определены и верифицированы, например сбор проб/образцов, транспортирование, хранение, предварительная обработка, выделение, потенциальное хранение после выделения, этапы исследования, такие как амплификация, анализ данных, представление данных.

Анализ риска должен определять влияние любых факторов, которые не могут контролироваться в течение всего диагностического процесса. Должны быть приняты меры по снижению выявленных неприемлемых рисков.

Данные, передаваемые внутри лаборатории, должны быть проверены в ходе верификации; если в дальнейшем данные передаются из лабораторной информационной системы в больничную, то точность передачи данных должна быть верифицирована после того, как первоначальные пробы/образцы были исследованы и результат был зарегистрирован.

Исследования должны включать соответствующие средства контроля, позволяющие обнаруживать ошибки на аналитических этапах рабочего процесса (см. 5.1).

Валидация должна проводиться на искусственной матрице, используемой в окончательном исследовании, и на клинических образцах.

Биологические образцы, про которые известно, что они содержат определенное количество патогенов, могут быть разбавлены соответствующей матрицей без мишеней (например, образцы смешанной сыворотки или суспензии кала), а в образцы может быть специально введен внутренний контроль.

В искусственную матрицу должен быть введен цельный патоген и внутренний контроль.

Следует избегать контаминации или введения интерферирующих веществ. В испытательную систему должен быть встроен постоянный контроль потенциальной контаминации и/или интерференции.

Для мультиплексных анализов метод должен быть валидирован в мультиплексном тесте, для использования в котором он предназначен, например в которой присутствует несколько патогенов и/или патоген и контроль.

7.1.4 Валидация предполагаемого применения

В соответствии с планом валидации лаборатории необходимо описать и задокументировать соответствующие характеристики результативности исследования при заболевании или другом клиническом контексте, оцениваемом в исследовании.

В лаборатории требуется определить те характеристики исследования, которые напрямую связаны с его клинической значимостью и клиническим применением. Эти характеристики должны быть задокументированы как характеристики клинической результативности.

Чтобы установить, определяет и/или количественно оценивает методика/гест анализируемый материал значимым с клинической точки зрения образом, следует при необходимости рассчитать отрицательную и положительную прогностическую значимость.

Примечание 1 - Типичные характеристики клинической результативности включают клиническую (диагностическую) специфичность, клиническую (диагностическую) чувствительность, диапазон измерений и референтный интервал.

В лаборатории требуется провести валидацию предусмотренного применения исследования в сравнении с существующими аналогами, если такие имеются. Если существующий аналог недоступен, в лаборатории необходимо валидировать его предусмотренное применение с помощью надлежащим образом разработанных исследований.

Результаты валидации должны быть задокументированы в лабораторном отчете о валидации. Дальнейшая информация приведена в 7.4.1.1 и в приложении В.

7.2 Анализ проведения диагностики с использованием МАНК

Доверие к результатам исследований имеет первостепенное значение в сфере лабораторной диагностики из-за психосоциальных, медико-правовых и терапевтических последствий для пациентов.

В связи с этим скрининг с использованием тестируемого метода или предварительные исследования предназначены для выявления присутствия целевого организма.

Типичные исследования на основе амплификации нуклеиновых кислот будут состоять из комбинации этапов, которые должны включать:

- сбор, транспортирование и хранение проб/образцов;

- экстракцию и очистку нуклеиновой кислоты;

- амплификацию (денатурацию, отжиг, элонгацию);

- обнаружение ортогональных генов;

- анализ и интерпретацию данных.

Важнейшей задачей на всех аналитических этапах исследования с использованием МАНК является предотвращение контаминации продуктами переноса.

7.2.1 Требования к проведению преаналитического этапа

Требования к сбору, транспортированию и хранению проб/образцов должны быть указаны в инструкции по применению. Применяют требования ИСО 15189.

Примечание 1 - Руководство по сбору, транспортированию, подготовке и хранению образцов для молекулярных методов приведено также в [6].

Особое внимание должно уделяться потенциальному воздействию сбора, транспортирования и хранения проб/образцов на этапы, необходимые для подготовки образца к экстракции нуклеиновыми кислотами.

Пример - Тип проб/образца, контейнер для проб, критерии приемлемости, процедура обработки для минимизации изменений, вызванных деградацией или загрязнением нуклеиновой кислоты, требуемое количество, требуемые добавки, условия транспортировании, условия хранения, факторы стабильности и предосторожности.

В клинико-диагностической лаборатории должны выполняться требования к сбору, транспортированию и хранению биологического материала человека в качестве инструкций в соответствующих разделах руководства по сбору или взятию проб/образцов.

Биологический материал для исследования с применением МАНК должен быть получен и помещен в зону, изолированную от испытательной. Биологический материал, взятый от пациентов, должен быть быстро обработан и надлежащим образом сохранен, чтобы свести к минимуму деградацию нуклеиновых кислот. Пробы должны принимать в лабораторию только в контейнерах установленного типа*. Дальнейшая информация представлена в приложении А.

_________________

* См. ГОСТ ISO 6710-2011 "Контейнеры для сбора проб венозной крови одноразовые. Технические требования и методы испытаний".

Повторное замораживание и оттаивание могут привести к потере целостности пробы/образца и снижению выхода нуклеиновых кислот, и поэтому этого следует избегать, если не указано и не верифицировано иное. Методы количественного анализа и обнаружения низкого уровня целевых патогенов подробно описаны в [10].

Условия, обеспечивающие надлежащую обработку и стабильность нуклеиновой кислоты после экстракции, должны быть определены, верифицированы и задокументированы в инструкции по применению. Стабильность может отличаться, если при исследовании в одних и тех же условиях используют разный биологический материал. Поэтому стабильность должна быть проверена для каждого типа биологического материала исследования. Новые патогены и необычные синдромы, как правило, требуют дополнительных исследований, чтобы определить наилучший тип и объем для проведения количественного анализа. Дальнейшая информация представлена в приложении А и [3].

Чистота, целостность и выход нуклеиновой кислоты, извлеченной из биологического материала, должны быть достаточными для предусмотренного применения. Если в пробе не содержится достаточного количества нуклеиновой кислоты, экстракция должна быть проведена повторно с использованием той же пробы, либо для экстракции должна быть отобрана другая проба.

Дополнительная информация приведена в приложении А, также дополнительная информация о получении и стабильности нуклеиновых кислот приведена в [7]. Методы оценки эффективности экстракции также приведены в [12], [14], [15].

Чтобы обеспечить достаточную чистоту, целостность и стабильность для проведения исследования, в лаборатории необходимо подготовить и хранить экстракт нуклеиновой кислоты в соответствии с инструкциями по применению.

7.2.2 Требования к проведению аналитического этапа

Лабораторные процедуры должны включать, как минимум, следующие меры предосторожности, когда это применимо, для снижения вероятности контаминации. Требования к использованию отдельного оборудования и расходных материалов не применяют, если подготовку проб, амплификацию и определение наличия патогена выполняют на новых автоматизированных приборах.

a) Средства индивидуальной защиты (СИЗ) должны использоваться в соответствии с уровнем биобезопасности (см. [1], [8], [9]):

- для зон с конкретным назначением следует использовать специальные лабораторные халаты (например, с цветовой кодировкой). Лабораторные халаты должны быть личными, должны меняться при входе или выходе из каждой зоны, регулярно сменяться, должны учитываться конкретные требования к их стирке. Также возможно использование одноразовых лабораторных халатов. Для лабораторных халатов должны быть доступны индивидуальные вешалки, которые не должны соприкасаться друг с другом;

- перчатки меняют при переходе между каждой отдельной зоной, а также дополнительно, если это необходимо, для предотвращения перекрестного загрязнения. Возможно использование перчаток с длинными рукавами, а в целях избежания аллергии предпочтительны перчатки без латекса;

- сотрудники, задействованные в исследовании, должны носить защитные очки, маску для лица, защитный экран или другие средства индивидуальной защиты, в соответствии требованиями правил биобезопасности;

- требования к бахилам или моющейся лабораторной обуви следует рассматривать для разных помещений, где это необходимо.

b) Следует использовать отдельное оборудование (включая робототехническое) и соответствующие расходные материалы, такие как фильтрованные наконечники пипеток для приготовления реагентов, подготовки биологического материала и пост-амплификационного анализа.

c) Чтобы свести к минимуму перекрестную контаминацию, рекомендуется использовать импульсное вращение для всех проб/образцов перед открытием любой ПЦР-реакционной трубки, если этого требует метод исследования.

d) Образец или экстракт нуклеиновой кислоты следует добавлять в реакционную пробирку последним - после компонентов, не относящихся к образцу (таких как мастермикс, дНТФ, праймеры, буфер и ферменты), в отдельной области или помещении, предназначенном для добавления матрицы (см. рисунок 1).

e) Пробирки с реагентами закрывают, если они не используются для манипуляций с ПЦР-ампликонами после амплификации (например, в гель-электрофорезе или секвенировании ДНК). Открывают пробирки как можно реже, и только те пробирки с материалом, которые необходимо использовать. Проводят импульсное вращение пробирок для ПЦР перед откупориванием.

f) Рекомендуется избегать перемещения оборудования (в том числе компьютерного) между различными рабочими зонами. Переносные предметы, такие как пипетки, перчатки, ручки, лабораторные книги и таймеры, являются источником загрязнения и не должны перемещаться между рабочими зонами и быть индивидуальными для каждой рабочей зоны. Кроме того, это правило относится и к документированным процедурам и другим печатным и письменным материалам, таким как рабочие листы. Любое перемещение проб/образцов и материалов, связанных с исследованием, должно быть однонаправленным (от менее загрязненных зон к наиболее загрязненным) и сведено к минимуму (см. рисунок 1).

Рисунок 1 - Пример однонаправленного рабочего процесса с использованием отдельных помещений или рабочих зон

Для пре-ПЦР, пост-ПЦР и, при необходимости, вложенной ПЦР должны использоваться как минимум две (или, в случае вложенной ПЦР, три) отдельные комнаты. Соответствующие этапы рабочего процесса (обозначенные пунктирными линиями) должны проводиться в выделенных зонах или отдельных помещениях.

Холодильники и морозильные камеры не должны быть общими для помещений/зон подготовки реагентов и проб, чтобы избежать хранения образцов и изолятов нуклеиновых кислот вместе с реагентами. Если необходимо использовать общие холодильные установки, следует установить четкое разделение (например, с помощью вторичной упаковки) [10]. Реагенты, используемые до и после амплификации, и нуклеиновые кислоты (например, образцы и продукты ПЦР) должны храниться в отдельных холодильниках или морозильных камерах, расположенных отдельно в соответствующих помещениях/зонах.

7.2.3 Требования к проведению постаналитического этапа

Последний этап рабочего процесса - интерпретация результатов исследований анализируемых проб/образца и подготовка протоколов исследования. Эти лабораторные отчеты могут поддерживаться лабораторной информационной системой, которая должна быть запрограммирована так, чтобы можно было использовать произвольный текст и предварительно заготовленные шаблоны отчетов.

Требования к протоколам исследований должны соответствовать нормативным требованиям и должны быть интегрированы в систему управления качеством лаборатории. Требования к отчетности должны быть приведены в документированных процедурах или в руководстве по качеству лаборатории.

7.3 Верификация и валидация характеристик эффективности

7.3.1 Пределы обнаружения

Полученные количественные результаты указываются в лабораторных отчетах, только если они попадают в диапазон измерений, установленный в ходе верификации или валидации.

Для качественных МАНК, как правило, определение линейного диапазона в рамках исследования, проводимого с целью верификации, не выполняется. Однако элементы этой концепции могут применяться для полуколичественных исследований, результаты которых рассматривают как качественные.

Нижняя граница линейного диапазона должна быть клинически значимой и приемлемой для клинического применения. Верхний предел линейного диапазона также должен быть клинически значимым, если это возможно.

Если результат превышает верхний предел линейного диапазона, то, возможно, необходимо развести пробу/образец в соответствующем буфере или матрице. Требуется учитывать, что низкая прецизионность будет влиять на предполагаемую линейность исследования. В связи с этим необходимо проводить исследования прецизионности в рамках исследования линейности.

В исключительных случаях взятые дополнительно пробы/образцы могут подвергнуться исследованию, чтобы достоверно определить нижний предел количественного определения.

Дальнейшая подробная информация представлена в приложении В.

Более подробное техническое руководство по валидации МАНК приведено в [12] и [41].

Чтобы определить линейный диапазон для исследований, разработанных в лаборатории, рекомендуется использовать образцы 5-10 концентраций в предполагаемом диапазоне измерений.

Для определения максимально широкого линейного диапазона можно использовать дополнительные пробы в концентрациях, превышающих ожидаемый диапазон измерений. Несмотря на возможность использования в лаборатории метода линейного регрессионного анализа для оценки данных, если связь между назначенными и наблюдаемыми значениями явно линейна, предпочтительно выбирать логарифмическую модель для приближения данных, полученных на основе ПЦР (Cq, Ct и Cp).

Примечание 1 - Логарифмическое преобразование состоит в том, что берут логарифм (обычно по основанию 10) каждого наблюдаемого значения.

Лаборатории должны отчитываться о полученных количественных результатах, только если они попадают в линейный диапазон. См. дополнительные указания по линейности для МАНК в ИСО 20395 [12].

Примечание 2 - Полиномиальный регрессионный анализ проводят для того, чтобы найти полиномиальную функцию, значения которой соответствуют данным реальной выборки, и для того, чтобы определить, существует ли значительная разница между линейным и квадратичным приближением. Применение полиномиального регрессионного анализа первого, второго и третьего порядка может быть полезным.

7.3.2 Точность теста (правильность и прецизионность)

Различные характеристики диагностической точности связаны с различными аспектами диагностической процедуры: одни характеристики используют при оценке способности метода исследования правильно идентифицировать негативные результаты, другие - при оценке его прогностической способности. Характеристики диагностической точности не являются фиксированными показателями результативности исследования: некоторые из них очень чувствительны к распространенности заболевания, другие - к его вариациям и важнейшим признакам. Кроме того, характеристики диагностической точности чрезвычайно чувствительны к программе исследования. Исследования, не соответствующие нормативным документам, как правило, имеют завышенные или заниженные показатели результативности, а сфера применимости их результатов ограничена [35].

Точность процедуры исследования выражает степень близости найденного значения и значения, которое принимается либо как условное истинное, либо как принятое опорное значение. Наблюдаемая степень близости является результатом систематической погрешности (смещения, выраженного как правильность) и случайной ошибки (выраженной как прецизионность).

7.3.2.1 Исследования правильности

Лаборатория должна проводить апробацию в течение времени, необходимого для демонстрации результативности метода в типичных лабораторных условиях.

Исследования правильности должны проводиться в соответствии с программой исследования, статистическими рекомендациями и ИСО 15189.

Для мультиплексного анализа следует использовать несколько сравнительных исследований, если ни один из методов анализа, применяемых обычно, не охватывает все анализируемые вещества мультиплексного анализа. Должен быть выбран подходящий метод анализа данных для установления правильности для каждого отдельного аналита, а также для всего мультиплексного анализа в целом.

В лаборатории требуется определить и исследовать необходимое количество образцов.

Примечание 1 - Необходимое для анализа количество образцов зависит от таких факторов, как сложность и точность анализа, распространенность мишени в указанной популяции, установленная точность референтного/сравнительного метода, схема, используемая для анализа статистических данных, приемлемый уровень статистической достоверности, а также затраты. Рекомендуется проводить исследование не менее 20 и - как правило - 40-50 и более образцов.

Верификация по оценке точности должна быть выполнена на клинических образцах (по возможности) в необходимом количестве, а распределение выборки должно быть репрезентативным для типов клинических образцов, подлежащих тестированию (например, кровь, плазма, стул, жидкости организма). Если доступных образцов не хватает для проведения анализа во всем аналитическом или заявленном диапазоне, то клинические или искусственные образцы, про которые известно, что они содержат определенное количество патогенов, могут быть разбавлены соответствующей матрицей без мишеней (например, образцы смешанной сыворотки или суспензии кала), а в эти образцы до проведения исследования может быть введен внутренний контроль.

Для определения правильности исследования лаборатории должны интерпретировать полученные данные как графически, так и статистически.

Для оценки данных сопоставления методов следует использовать как анализ диаграмм рассеивания с применением корреляционного и регрессионного анализа, так и диаграммы Блэнда-Алтмана с расчетом 95% предела согласия.

7.3.2.2 Исследования прецизионности

Исследования для определения прецизионности должны проводиться с использованием образцов с известной концентрацией аналита, если это применимо. Образцы должны быть отобраны или подготовлены в матрице, аналогичной матрице клинических образцов, насколько это возможно.

Материалы для исследования могут включать стандартные образцы, материалы контроля качества, образцы для проверки квалификации персонала или образцы пациентов в достаточном количестве для выполнения исследования.

Исследования прецизионности должны проверять повторяемость, внутрилабораторную прецизионность и воспроизводимость, если это применимо.

Повторяемость будет исследоваться путем повторного анализа одного и того же материала, с использованием одного и того же метода, одного и того же оборудования, одним и тем же оператором, в одной и той же лаборатории в течение короткого периода времени. Аналогичный подход используется для определения прецизиозности в пределах партии/прогона теста или метода анализа.

Промежуточная прецизионность будет исследоваться путем повторного анализа одного и того же материала с использованием одного и того же метода, одного и того же оборудования, одним и тем же сотрудником, в одной и той же лаборатории в течение продолжительного периода времени.

Воспроизводимость будет исследоваться путем повторного анализа одного и того же материала в разных лабораториях с использованием одного и того же метода различными сотрудниками и/или различным оборудованием. Она также известна как межлабораторная воспроизводимость.

На исследования прецизионности лаборатория отводит достаточное время и количество образцов в соответствии с предусмотренным применением теста.

Исследования прецизионности должны проводиться в соответствии с программой исследования, статистическими рекомендациями и ИСО 15189.

Лаборатории должны учитывать и включать в программу исследования прецизионности возможные значимые причины вариации, такие как различные операторы, различные партии реагентов, различные приборы.

Для методов качественного анализа исследование прецизионности должно давать оценку непрецизионности метода при концентрациях аналита вблизи предела обнаружения.

В программу исследования должен быть включен анализ образцов в концентрациях, соответствующих всему динамическому диапазону метода: одного с концентрацией аналита на пределе обнаружения, другого с концентрацией на 20% выше предела обнаружения и следующего с концентрацией на 20% ниже предела обнаружения. Анализ таких образцов может выполняться повторно до 40 раз.

Для методов количественного анализа требуется включать в исследование прецизионности, по крайней мере, один образец с высоким уровнем, один образец с низким и образец, максимально приближенный к диагностически важной точке (обычно это предел обнаружения). Более высокие уровни вариации, как правило, находятся на нижней и верхней границах диапазона измерений. Если существуют большие различия в оценках прецизионности на трех уровнях, может возникнуть необходимость в проведении исследования с дополнительными концентрациями, чтобы полностью описать прецизионность результатов анализа.

Рекомендуется выстраивать прецизионность исследования так, чтобы было возможно рассчитать вариацию внутри повторяемости измерений, промежуточной прецизионности измерений и воспроизводимости измерений, и затем на их основе можно было определить общую вариацию анализа.

Прецизионность исследования должна быть выражена с помощью статистических показателей погрешности, таких как стандартное отклонение (СО) или коэффициент вариации (КВ).

Примечание 1 - Как правило, коэффициент вариации (КВ) выражается в терминах сигнального или измеренного (истинного) значения, которое будет давать оценки с заданным коэффициентом вариации (КВ, определяемый как отношение выборочной дисперсии

к среднему

и выражаемый в процентах).

Для анализа данных результаты прецизионности исследования должны оцениваться лабораторией в соответствии с документированными критериями приемки.

Погрешность часто выражается как целевое значение ±2-3 СО, или целевое значение±процент (например, целевое значение 10%). В общем случае точность вокруг среднего значения не должна превышать 15% от коэффициента вариации, за исключением нижнего предела количественного обнаружения, для которого точность не должна превышать 20%. При определении приемлемых показателей прецизионности рекомендуется строить графики, на которых СО или КВ представлены как функция от концентрации аналита.

7.4 Аналитическая чувствительность/предел обнаружения

Как для количественных, так и для качественных исследований лаборатории должны определять предел обнаружения как самую низкую фактическую концентрацию аналита в образце, которая может быть последовательно обнаружена с приемлемой точностью. При определении аналитической специфичности в лаборатории требуется проводить исследования перекрестной специфичности и интерференции.

К организмам, вызывающим перекрестную специфичность, могут относиться организмы, которые имеют с мишенью одну гомологию последовательностей; организмы, присущие нормальной флоре и которые могут одновременно присутствовать в образце; и организмы, которые вызывают сходные болезненные состояния или клинически значимые сочетанные инфекции.

При применении метода требуется проводить исследования интерференции путем анализа влияния потенциально интерферирующих веществ, добавляемых к образцам, содержащим целевую нуклеиновую кислоту (проверка на интерференцию).

Интерференция/перекрестная реактивность устанавливается для каждого типа образца, используемого в исследовании, с использованием потенциально интерферирующего материала, соответствующего матрице образца.

Для определения специфичности исследования анализ данных должен проводиться в соответствии с общепринятыми статистическими подходами, такими как: парный t-test критерий Стьюдента, проведение повторных измерений или определение попарных различий. Анализ основан на разнице между средними показателями, определенными для тестовых и контрольных образцов, и допустимой погрешностью, которая является клинически значимой для исследования.

Примечание 1 - Для количественных исследований возможно принять предел обнаружения равным пределу количественного определения. Это возможно в том случае, если наблюдаемое смещение и погрешность предела обнаружения удовлетворяют требованиям к общей погрешности для анализируемого вещества. Однако чаще всего предел обнаружения находится ниже линейного диапазона исследования и ниже предела количественного определения. Предел обнаружения не может быть выше предела количественного определения.

Лаборатории определяют предел обнаружения метода исследования эмпирическим путем с помощью серийных разведений образцов с известной концентрацией целевого вещества в аналитическом диапазоне ожидаемого предела обнаружения.

Аналитическая чувствительность должна быть определена для каждого типа матрицы образцов, исследования которых будут регулярно проводиться в клинической лаборатории.

Лаборатории также должны проверять аналитическую чувствительность для каждого генотипа, если это представляется необходимым.

Для определения предела обнаружения лаборатории должны проверить достаточное сточки зрения статистики количество проб.

В анализе данных лаборатории должны использовать пробит-анализ для эмпирического определения самой низкой концентрации мишени, которая может быть надежно обнаружена при помощи молекулярного анализа.

Пробит-регрессионный анализ показывает значения пробита (единицы вероятности), которые преобразуются в значения С95 (концентрации, обнаруживаемой в 95% образцов), которая показывает, что предел обнаружения составляет определенное количество копий/см

(копий/мл) и что образцы, содержащие эту концентрацию, будут обнаружены в 95% тестируемых образцов.

В мультиплексных исследованиях предел обнаружения определяется для каждого аналита с использованием мультиплексного анализа.

7.4.1 Валидация исследования

7.4.1.1 Валидация отчета о результатах исследования

После сбора всех необходимых данных о валидации необходимо составить сводный отчет о валидации в лаборатории.

Этот отчет должен включать краткое изложение основных требований, полное описание используемого метода, четкое описание проводимых для валидации исследований и все полученные в их ходе результаты, подробно проанализированные.

В этом документе должны быть записаны все различные этапы рабочего процесса, которые были валидированы (например, этап предварительной экспертизы), используемые реагенты и условия, а также сотрудники, участвующие в исследовании. Этот документ будет включать критерии принятия/отклонения, подробную информацию о серии анализов/повторном анализе образца и некоторую информацию о клинической интерпретации результата исследования.

Ссылки на открытые источники должны быть приведены в дополнение к результатам местных исследований, проведенных в процессе валидации, и обоснования выводов, для которых потенциально могут отсутствовать прямые доказательства.

После завершения работы отчет должен быть оценен в соответствии с системой лабораторного менеджмента качества.

Результаты работы руководитель лаборатории должен заверить подписью и датой, что метод исследования готов (или не готов) к клиническому применению на практике.

Примечание 1 - В некоторых странах могут существовать юридические требования для регистрации лабораторных практик.

Примечание 2 - Руководство по регистрации как производителей, так и для лабораторий, приведены в ИСО/МЭК 17050-1 и ИСО/МЭК 17050-2.

Валидация исследования - разовое мероприятие, не требующее повтора, пока условия, в которых был разработан метод, не изменяются. Повторная валидация должна проводиться лабораторией, если существующий метод каким-либо образом модифицирован.

Примечание 3 - Модификации могут включать добавление возможности использовать новые типы образцов или изменения в критическом компоненте или реагенте, которые могут повлиять на результаты исследования.

7.4.1.2 Дополнения к валидации

Дополнительная валидация может быть выполнена, если в метод исследования, который уже был полностью валидирован, были внесены незначительные изменения (в зависимости от их степени), которые не меняют принцип метода. Например, если меняется устройство для сбора или контейнер для того же типа образца и ожидается, что это не окажет существенного влияния на сам образец - в таком случае требуется лишь минимальная валидация, включающая проведение испытания на точность и прецизионность на ограниченном числе образцов (например, 5-10).

8 Внедрение и использование в лаборатории разработанного теста

После завершения процесса верификации/валидации внедрение метода исследования в практику требует его интеграции в рабочий процесс и в систему менеджмента качества лаборатории.

Должна быть написана полная стандартная рабочая процедура для штатного использования метода исследования.

В клинико-диагностической лаборатории при внедрении валидированной процедуры исследования in vitro на основе нуклеиновых кислот без каких-либо изменений должна проверяться ее эффективность до того, как она будет введена в повседневное использование.

Последующие изменения в утвержденном процессе исследования должны быть валидированы. Применяют требования ИСО 15189.

До внедрения метода испытания в лаборатории должны быть процедуры регулярного контроля и обеспечения его качества (см. таблицы 1 и 2).

Требования к качеству подготовки и оценки компетентности персонала должны быть выполнены лабораторией до внедрения нового метода.

Практикующим врачам и другим потребителям лабораторных услуг должны предоставляться адекватные консультации по медицинскому применению вновь введенного метода исследования.

9 Отчет о результатах и их интерпретация

Соответствующие процедуры должны быть направлены на обеспечение своевременного представления результатов. Результаты количественных молекулярных анализов, как правило, представляют в виде количества молекул (копий, геномных эквивалентов, международных единиц) целевой нуклеиновой кислоты в определенном объеме жидкости организма, количества клеток или массы ткани.

Там, где это применимо, рекомендуется для представления результатов количественных молекулярных анализов использовать данные, представленные в формате десятичных логарифмов.

Должен быть сообщен диапазон обнаружения процедуры и четкое описание используемых единиц измерения [например, единицы/см

(единицы/мл) плазмы].

Пример - "Не обнаружено" или "Менее предела обнаружения".

Результаты качественных испытаний должны формулироваться не как "положительные" или "отрицательные", что может подвергаться неверному толкованию, а как "обнаружено" или "не обнаружено"; "присутствует" или "отсутствует".

В лаборатории должны быть внедрены и поддерживаться документированные процедуры по интерпретации результатов, которые гарантируют, что перед выдачей результаты исследований были проверены и одобрены квалифицированным персоналом. В лаборатории должна быть стандартизированная процедура с параметрами и методикой анализа данных.

В случае получения неопределенных результатов в лаборатории должна иметься процедура повторного исследования тем же или другим методом и/или запроса дополнительного образца или образца другого типа.

В качестве интерпретирующих комментариев к отчету должны быть приведены установленные предельные значения для обнаружения аналита и получения клинических результатов.

Для количественных анализов и в тех случаях, когда установленные предельные значения недоступны, в отчете должен быть указан подтвержденный линейный диапазон анализа, включая предел обнаружения и количественного определения.

В лаборатории должны быть определены критические значения результатов для всех исследований, которые существенно влияют на решения по ведению пациентов, и должна иметь документированную процедуру уведомления соответствующего клинического персонала при получении критических результатов.

В отчете должны быть указаны любые известные клинически значимые ограничения метода исследования.

Примечание 1 - Например, ограничения могут включать перекрестные реакции, смещение генотипа и наличие интерферирующих веществ, влияющих на качество результатов обследования.

Должны соблюдаться протоколы (производителя изделия для IVD или LDT). Любые преднамеренные или непреднамеренные отклонения от инструкций/протокола (например, неправильные параметры центрифугирования или дополнительный цикл замораживания - оттаивания из-за неисправности морозильной камеры) должны быть задокументированы, а процедура принятия полученного результата должна быть подробно описана.

10 Порядок обеспечения качества

Для обеспечения качества результатов исследования нуклеиновых кислот должны быть внедрены соответствующие процедуры обеспечения качества. Применяют требования ИСО 15189.

В частности, процедуры обеспечения качества должны быть разработаны таким образом, чтобы свести к минимуму ложноположительные и ложноотрицательные результаты.

После валидации результаты, полученные при помощи метода исследования, должны регулярно контролироваться лабораторией во время его использования. Должен в том числе иметь место особый контроль за работой реагента, оборудования и сотрудников, использующих различные контрольные материалы. Данные, используемые в ходе текущих мероприятий по отслеживанию производительности, должны быть задокументированы.

10.1 Мониторинг эффективности и оптимизация количественного анализа

Для внутреннего контроля результативности в лаборатории должно быть принято решение о соответствующем типе и частоте использования внутренних и внешних средств контроля, которые должны быть включены как в процесс валидации, так и в штатный процесс применения метода после валидации. Оценка таких средств контроля должна проводиться регулярно. Результаты должны оставаться в заданных пределах.

Внутренние контроли должны быть добавлены к матрице первичной пробы (сыворотка, плазма, питательные среды) и извлечены, амплифицированы, проанализированы и обнаружены независимо от мишени. Внутренние контроли должны быть обработаны в одной пробирке с мишенью.

Необходимо проводить мониторинг развития и обновления баз данных генома, особенно если новые результаты влияют на характеристики результативности исследования или интерпретацию результатов.

При использовании внутреннего контроля рекомендуется оценить влияние проведения его анализа на результативность целевого анализа, чтобы они не мешали друг другу.

Постоянное соответствие характеристик исследования принятым должно проверяться на регулярной основе. Данные этого постоянного отслеживания должны быть интерпретированы и задокументированы.

10.2 Межлабораторные сличительные (сравнительные) испытания

В рамках программы непрерывного обеспечения качества лаборатория должна регулярно участвовать в соответствующих мероприятиях по внешней оценке качества.

Если внешние мероприятия не доступны, в лаборатории необходимо внедрять внутренние программы проверки квалификации персонала на регулярной основе.

См. ИСО 15189.

Перед участием во внешней оценке качества в лаборатории должны быть тщательно оценены объем и цель ее проведения, а также метод, используемый в ее ходе для определения и/или количественного определения анализируемого вещества.

Внутренние или внешние мероприятия по проверке квалификации персонала должны проводиться не реже одного раза в год. Рекомендуется проводить мероприятия по сравнению результатов между лабораториями не реже двух раз в год.

Внешний контроль качества должен быть проведен тем же образом, что и исследование образцов пациентов, однако контрольный образец не должен находиться в одной пробирке или лунке с образцом, взятым от пациента.

Данные, полученные в ходе внешнего контроля, должны статистически оцениваться для отслеживания результатов исследований с течением времени.

Примечание 1 - Например, данные контроля, взятые по логарифму 10 и показанные на графике Леви-Дженнингса, могут быть использованы для оценки результативности исследования с течением времени.

Приложение А

(справочное)

Предложения по подготовке образца к проведению исследования

А.1 Сыворотка и плазма крови

А.1.1 Сбор проб

Для получения сыворотки периферическую кровь берут с помощью вакуумной пробирки для сбора крови, содержащей гель для отделения сыворотки. Пробирку оставляют при комнатной температуре на один час, пока не завершится коагуляция, и затем немедленно центрифугируют. Ускоритель коагуляции, добавляемый в пробирку для взятия крови, может сократить время, необходимое для коагуляции.

Для плазмы следует использовать вакуумные пробирки, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA). Не рекомендуется путать пробы крови с теми, что предназначены для клеточной иммунологии или хромосомного анализа, для которых взятие пробы крови проводится в пробирки с гепарином.

Когда кровь берется через внутривенный катетер, первые несколько миллилитров необходимо удалить из-за потенциального эффекта гепарина, в качества образца должна использоваться последующая проба крови.

Плазма крови, полученная с помощью антикоагулянтов АСД (антикоагулянт цитрат декстроза) или CPD (цитрат-фосфат-декстрозы) также может быть использована для исследований методом амплификации нуклеиновых кислот аналогично обработанной EDTA.

После вакуумного забора крови пробирки с EDTA немедленно и многократно переворачивают и перемешивают чтобы предотвратить свертывание крови до осаждения фибрина. Не должны использоваться пробирки для сбора образцов, содержащие реагент для нейтрализации гепарина, из-за его ингибирующего действия на амплификацию нуклеиновых кислот.

Неудовлетворительными и неподходящими факторами для проведения исследования являются образование осадка, обесцвечивание и дегидратация из-за замерзания. Возможные причины этих явлений включают неподходящие условия хранения, такие как длительное воздействие высокой температуры и повторяющиеся циклы замораживания и оттаивания. Если выделенные нуклеиновые кислоты были надлежащим образом сохранены, их можно использовать для повторного исследования. Количество циклов замораживания и оттаивания должно быть сведено к минимуму и задокументировано.

А.1.2 Хранение и транспортирование образцов

Признано, что образцы вируса относительно стабильны в сыворотке и плазме. После разделения образцы сыворотки и плазмы можно хранить в холодильнике (от 2°С до 8°С). Некоторые производители изделий для IVD смогли подтвердить, что, например, образец сыворотки и плазмы может храниться до семи дней при температуре от 2°С до 8°С.

Для длительного хранения рекомендуется замораживание. Например, образцы для определения ДНК вируса гепатита должны храниться: при температуре минус 20°С или ниже - для гепатита В, при температуре минус 70°С или ниже - для вируса гепатита А, С и Е.

Следует избегать перемещения образца в другой контейнер. Если образцы не будут исследованы сразу после центрифугирования, отделенную сыворотку в оригинальной пробирке для сбора крови следует сразу заморозить (при температуре минус 20°С или ниже) и хранить до использования. Для вируса гепатита С и вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) рекомендуется отделять сыворотку или плазму в течение 6 ч после взятия крови, а для вируса гепатита В лучше всего проводить отделение в течение 24 ч.

А.1.3 Контроль за интерферирующими веществами

Все взятые у человека образцы/пробы могут содержать вещества, которые потенциально могут быть "примесями"; эти вещества могут мешать амплификации и/или обнаружению целевого аналита. Примеси могут быть эндогенными или экзогенными. Примеры эндогенных примесей, которые видны, если присутствуют в достаточно высокой концентрации, включают гемоглобин, триглицериды и билирубин. Другими эндогенными интерферентами могут быть образование значительного количества продуктов патологических процессов, таких как легкие цепи в пробах пациента с миеломой или глюкоза в пробах пациента с диабетом. Эти примеси обычно не видны. Эндогенные примеси также включают вещества, используемые влечении, такие как антикоагулянты, лекарственные препараты, плазмозаменители и парентеральное питание. Эндогенные примеси также включают вещества, которые принимает пациент, включая алкоголь, рекреационные наркотики, витамины и другие пищевые добавки. Примеси могут быть и "экзогенными" - это интерференты, вносимые во время сбора образцов, в число которых может входить тальк из перчаток. Образцы должны быть собраны в специальную тару, чтобы свести к минимуму воздействие известных интерферентов (например, гепарина). Этапы экстракции иногда могут удалять примеси или инактивировать, но поскольку типов потенциальных интерферентов существует очень много, многие из которых не видны, важно продемонстрировать, что каждый образец или выделенные из каждого образца нуклеиновые кислоты могут быть амплифицированы и может быть обнаружена мишень. Обычно это проводится путем добавления контроля амплификации (внутреннего контроля) к каждому образцу. Если во время исследования количество внутреннего контроля падает ниже установленных пределов (или амплификация не происходит), можно заподозрить наличие интерферентов. Дальнейшая информация приведена в [38], [39].

Включение в состав реагентов для обнаружения внутреннего контроля позволяет оценить ингибирующий эффект в ходе реакции амплификации и снизить частоту ложноотрицательных результатов. При отсутствии внутреннего контроля эффект ингибирующих веществ может быть подтвержден оценкой эффективности амплификации после добавления известного количества плазмидной ДНК в раствор ДНК, извлеченный из образца или кДНК.

А.2 Моча

А.2.1 Сбор проб

Большинство молекулярных методов определения патогенов в образцах мочи диагностируют заболевания, передающиеся половым путем (ЗППП), такие как гонококковые инфекции, хламидиоз и другие. Следует собирать те образцы мочи, в которых с наибольшей вероятностью присутствуют ДНК и РНК патогенного генома. Для этого рекомендуется собирать утреннюю порцию мочи. В противном случае ложноотрицательные результаты из-за вымывания возбудителей при мочеиспускании в течение дня может привести к присутствию большого количества лейкоцитов, эритроцитов и отслоившихся эпителиоцитов. Это может привести к ложноотрицательным результатам.

Для диагностики цитомегаловирусной инфекции у плода или новорожденного рекомендуется использовать первичное опорожнение мочи при рождении.

А.2.2 Хранение и транспортирование образцов

Образцы мочи с подозрением на гематурию или билирубинурию и с большим количеством осадка не подлежат исследованию. Гематурия возникает из-за воспаления мочеиспускательного канала или мочевого пузыря, которое может быть вызвано либо инфекциями, либо неинфекционными этиологиями, такими как радиация. Осадок также образуются при охлаждении образцов. Образцы мочи (взятые от мужчин) используются для исследования нуклеиновых кислот на Chlamydia trachomatis и Neisseria gonococcus. Образцы мочи должны храниться в холодильнике (при температуре 2°С-8°С) и подвергаться процессу экстракции нуклеиновых кислот в течение четырех дней. При правильном извлечении стандартными методами ДНК остается стабильной в течение одной недели или дольше в охлажденном виде (при температуре 2°С-8°С), или же рекомендуется замораживание образца. Не должны исследоваться образцы мочи, ставшие мутными из-за роста бактерий. Возможные причины включают в себя отсутствие возможности хранить образцы в необходимых условиях, например хранение образцов в течение длительного времени в коллекционных контейнерах при неподходящей температуре хранения. Для длительного хранения желательно замораживание образцов.

А.2.3 Подготовка проб

Образцы с подозрением на гематурию или билирубинурию и с большим количеством осадка не подходят для проведения исследования.

Примечание - Для предотвращения контаминации компонентами клеток крови перед выделением и очисткой нуклеиновых кислот эффективно использование низкоскоростного охлажденного центрифугирования при температуре окружающей среды в течение 5 мин. Однако криоконсервированные образцы мочи иногда загрязняются гемоглобином, что неизбежно, поскольку в процессе оттаивания происходит гемолиз.

Если целью обнаружения является вирус, то супернатант может быть использован для анализа, однако если мишенью являются бактерии, то следует обратить на супернатант пристальное внимание, поскольку неправильное центрифугирование может осаждать бактериальные клетки. Более важно сделать образец однородным, многократно переворачивая пробирки для сбора образцов. Поскольку осадок часто образуются из-за охлаждения образца, образец должен быть согрет, насколько это возможно, в термостате при температуре 37°С в течение 30 мин перед взятием пипеткой и последующим анализом. Чтобы свести к минимуму воздействие примесей, целесообразно для экстракции нуклеиновых кислот выбирать реагенты, которые используют фильтры, мембраны или магнитные частицы.

Для контроля фактического ингибирующего влияния примесей на реакции амплификации нуклеиновых кислот следует использовать внутренние средства контроля, входящие в состав наборов реагентов для обнаружения. Если отсутствуют требования стандартов, желательно провести независимое испытание по определению влияния примесей и восстановления свойств после их удаления, используя плазмидную ДНК, содержащую известное количество копий, близкое к пределу обнаружения. Если эффект будет подтвержден, реакция амплификации нуклеиновых кислот может быть воспроизведена после разбавления образца нуклеиновой кислоты. Следует отметить, что проведение этой процедуры составляет некоторый риск: целевая нуклеиновая кислота может быть разбавлена до уровня ниже предела обнаружения, что приведет к ложноотрицательным результатам исследования.

А.3 Мокрота

А.3.1 Сбор проб

Образцы мокроты в основном используются для диагностики и ведения инфекционных заболеваний, таких как пневмония, заболевания, вызванные возбудителями туберкулеза, нетуберкулезными микобактериями и другими.

Для обнаружения микобактерий туберкулеза решающее значение имеет обеспечение качества образцов мокроты. Качество мокроты оценивается при макроскопическом исследовании, чтобы подтвердить наличие именно гнойной мокроты, а не слюны. Если пациенты испытывают трудности с самостоятельным отхаркиванием мокроты, следует рассмотреть возможность сбора мокроты путем аспирации с помощью всасывающих катетеров или использования желудочного сока в качестве альтернативного образца.

В противном случае следует рассмотреть возможность сбора альтернативных образцов, включая скопившуюся мокроту, желудочный сок, жидкость бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) и скарификацию бронхов.

А.3.2 Хранение и транспортирование образцов

Для исследований нуклеиновых кислот образцы мокроты должны быть обеззаражены NALC-NaOH и суспендированы в фосфатном буфере. Суспензии можно хранить в течение недели в охлажденном виде (при температуре 2°С-8°С) и в течение более длительного периода при замораживании. При правильном извлечении стандартными методами ДНК остается стабильной в течение одной недели или дольше в охлажденном виде (при температуре 2°С-8°С). Для длительного хранения желательно замораживание образцов.

Суспензии должны быть разделены на аликвоты перед криоконсервацией, повторных циклов замораживания и оттаивания следует избегать. Стабильность экстрагированных нуклеиновых кислот сильно зависит от условий экстракции.

Не подходят для исследования образцы с низкой вязкостью после хранения в неподходящих условиях, таких как длительное воздействие высокой температуры и повторяющиеся циклы замораживания и оттаивания.

Образцы, состоящие из гнойной мокроты, а не слюны, могут быть оценены макроскопическим наблюдением, и должны использоваться невязкие образцы [S(M) по классификации Миллера и Джонса]. Последнее обычно вызвано недостаточным отхаркиванием больным или ограниченным выделением мокроты. Когда в образце содержится слишком мало мокроты, целевые патогены, такие как кислотоустойчивые бактерии и нетуберкулезные микобактерии, могут быть не обнаружены, что может повлечь ложноотрицательные результаты исследования.

А.3.3 Подготовка проб

В число характеристик, делающих образец непригодным для проведения исследования, входит содержание в мокроте большого количества крови, что вызвано кровоизлияниями из пораженных участков дыхательных путей, например бронхов. Когда в мокроте содержится большое количество крови, загрязнение осадка мокроты гемоглобином после центрифугирования неизбежно, и последующее ингибирование реакции амплификации нуклеиновых кислот в ПЦР- и ТМА-анализах является проблемой. В таких случаях желательно собрать дополнительные образцы мокроты. Это особенно применимо к случаям, когда была собрана только слюна.

Оставшуюся часть мокроты, которая содержит клеточные компоненты и бактерии, окруженные слизью, следует растворить в NALC (N-ацетил-L-цистеин) или

semi-alkaline

протеазе (SAP) или дитиотреитоле по мере необходимости для устранения вязкости. Затем мокрота должна быть промыта физиологическим раствором или фосфатно-солевым буфером, центрифугирована [при

(ускорение силы тяжести) (2500 об/мин для ротора радиусом 170 мм), при температуре 4°С в течение 10 мин] и использована для экстракции нуклеиновых кислот. Если процедуры предварительной обработки образцов описаны во вкладыше, вложенном в упаковку реагентов, следуют инструкциям производителя. Если цвет осадка после промывки и центрифугирования почти белый, то возможно, что ингибирование реакции гемоглобином при последующих процедурах не произойдет.

А.4 Цельная кровь и костный мозг

А.4.1 Сбор проб

После того как определенный объем крови забирается в пробирки для сбора крови, содержащие антикоагулянт (ЭДТА и другие), пробирки следует немедленно перевернуть и осторожно перемешать. При использовании пробирок для сбора крови, содержащих антикоагулянты (ЭДТА и другие), необходимость добавлять стабилизатор отсутствует.

А.4.2 Хранение и транспортирование образцов

В случае исследований для выявления патогенов, ответственных за бактериемию или сепсис, длительное хранение образцов при температуре окружающей среды может снизить чувствительность обнаружения. Поэтому, если клетки для таких исследований хранятся длительное время, их следует хранить при сверхнизких температурах (минус 70°С или ниже). Образцы костного мозга (аспират костного мозга) указанного объема следует хранить в специальном растворе для хранения (клеточная культуральная среда, содержащая FBS) с охлаждением (при температуре 2°С-8°С).

А.4.3 Подготовка проб

В образцах, в которых наблюдаются сгустки фибрина, сбор бактерий при центрифугировании затруднен присутствием фибрина, что мешает отбору проб из жидкой фракции; это может привести к потере точности количественных измерений. Сгустки фибрина могут быть распознаны по плохой текучести содержимого пробирки или во время взятия пипеткой.

Перед экстракцией нуклеиновых кислот сгустки фибрина в образце должны быть физически разрушены до их распада, когда фибрин будет распределен по всему образцу. Поэтому, образец и фибрин должны проходить исследование после этого. В процессе экстракции ДНК добавление ДТТ (дитиотреитола) и фермента протеиназы K способствует разрушению фибрина.

Примечание 1 - Эффект, производимый гепарином, может быть уменьшен с помощью наборов для экстракции нуклеиновых кислот, которые основаны на адсорбции нуклеиновых кислот на фильтрах, мембранах или магнитных частицах с последующим вымыванием любых примесей. Однако полностью удалить примеси невозможно. Загрязнение гепарином может быть устранено путем полной переработки образца гепариназой. Поскольку количество патогенов, ответственных за бактериемию или сепсис в образце, зависит от состояния пациента во время сбора образца, персоналу, задействованному в исследовании, должна быть предоставлена соответствующая информация.

Примечание 2 - Обработка протеиназой К может повысить эффективность экстракции ДНК и в некоторых случаях обеспечить ее обнаружение в некоторых образцах, содержащих небольшое количество бактерий, ответственных за бактериемию или сепсис.

А.5 Плевральный выпот, асцит, перикардиальная жидкость, панкреатическая жидкость и жидкость бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ)

А.5.1 Сбор проб

Во время сбора образцов следует избегать попадания в пробу компонентов клеток крови. Для сбора плеврального выпота следует использовать пробирки/контейнеры, содержащую цитрат натрия или ЭДТА, так как плевральный выпот иногда свертывается после сбора из-за отложения фибрина.

А.5.2 Хранение и транспортирование образцов

Нуклеиновые кислоты должны быть выделены в день сбора образцов, в противном случае они должны быть охлаждены (до 2°С-8°С). Каждый образец должен быть охлажден (до 2°С-8°С) после сбора или заморожен (минус 70°С или ниже) для длительного хранения. Чтобы предотвратить рост бактерий в образцах после сбора, следует строго соблюдать инструкции по условиям хранения образцов. Гнойные образцы содержат совершенно разные типы бактерий, и существует вероятность, что извлечение ДНК с помощью щелочной термической обработки приведет к тому, что обнаружить патоген будет невозможно.

А.5.3 Подготовка проб

Если из-за гемолиза в образцах присутствует большое количество клеточных компонентов, включая гемоглобин, есть опасение, что чувствительность обнаружения будет снижена из-за ингибирования ПЦР-амплификации.

В образцах с фибриновыми сгустками сбор бактерий при помощи центрифугирования затруднен, и может быть затруднен точный отбор проб, что в свою очередь может привести к снижению количества и невозможности определить показатели количественного анализа. Сгустки фибрина могут быть распознаны по наблюдаемой текучести содержимого пробирки или во время взятия пипеткой. Перед экстракцией нуклеиновых кислот сгустки фибрина в образце должны быть физически разрушены до их распада, когда фибрин будет распределен по всему образцу. Затем в исследовании используется весь образец, содержащий фибрин. В процессе экстракции ДНК добавление вяжущего диссоциирующего и достаточно диспергирующего фибрина происходит по всему образцу. Затем в исследовании используется весь образец, содержащий фибрин. В процессе экстракции ДНК добавление ДТТ (дитиотреитола) и протеиназы К способствует разрушению фибрина.

Примечание 1 - В образцах, загрязненных компонентами крови, ингибирующее действие гемоглобина из эритроцитов после ПЦР-амплификации может быть устранено гемолизом путем добавления к образцу стерильной дистиллированной воды с последующим центрифугированием и извлечением ДНК из осадка. В качестве альтернативы ПЦР может быть выполнена с использованием экстрагированного разбавленного раствора ДНК для снижения концентрации ингибирующих веществ.

А.6 Лимфатические узлы и твердые ткани (биопсия или хирургическое вмешательство)

А.6.1 Сбор проб

Во время сбора образцов пораженные участки следует изолировать от здоровых участков и сохранить. Морфологическое исследование образца ткани полезно для того, чтобы отличить целевые клеточные компоненты от других компонентов и чтобы их можно было отделить и взять для исследования. Для крупных образцов или образцов чрезмерно большого размера доля пораженного участка (мишени теста) по отношению ко всему образцу будет меньше. На пораженном участке могут присутствовать другие ткани, что может снизить чувствительность обнаружения, что в конечном итоге приведет к ложноотрицательным результатам. При обнаружении микобактерий туберкулеза поражение участка может быть подтверждено морфологическим исследованием с помощью микроскопии

А.6.2 Хранение и транспортирование образцов

Образцы тканей, собранные путем биопсии или хирургического вмешательства, должны быть немедленно заморожены при сверхнизких температурах (минус 70°С или ниже), чтобы предотвратить деградацию нуклеиновых кислот вследствие аутолиза тканей. В это время желательно оставить только пораженные участки, отделив их от собранной ткани.

При выявлении микобактерий туберкулеза поражение участка может быть подтверждено морфологическим исследованием.

В случае фиксации формалином и парафином образцы тканей, собранные путем биопсии или хирургического вмешательства, должны быть как можно скорее пропитаны фиксатором. Если фиксация не может быть выполнена немедленно, желательно, чтобы образцы тканей хранились в холодильнике (4°С) и фиксировались в течение приблизительно трех часов. Транспортирование образцов тканей осуществляют оперативно при температуре 2°С-8°С.

А.6.3 Подготовка проб

На пораженном участке могут присутствовать другие ткани, что может снизить чувствительность обнаружения, что в конечном итоге приведет к ложноотрицательным результатам.

При обнаружении бактерий туберкулеза поражение участка может быть подтверждено морфологическим исследованием с помощью микроскопии.

Лазерная микродиссекция позволяет точно собрать целевые клеточные компоненты из подготовленного замороженного участка ткани на предметном стекле. Самый простой и легкий метод заключается в ручном сборе целевых клеточных компонентов - с помощью бритвы, максимально удалив ненужные клеточные компоненты из парафинового среза ткани на предметном стекле.

Существует опасение, что контаминация эритроцитами вызывает плохую амплификацию в ПЦР, что приведет к ложноотрицательным результатам при выявлении Helicobacter pylori (H.pylori) при использовании биопсийных тканей желудка и вируса гепатита С и В при использовании биопсийных тканей печени. Загрязнение эритроцитами можно обнаружить визуальным наблюдением ржавого цвета или измерением концентрации гемоглобина.

Ингибирующий эффект загрязняющих примесей после ПЦР-амплификации может быть уменьшен с помощью наборов для экстракции нуклеиновых кислот, основанных на методе очистки, в котором нуклеиновые кислоты адсорбируются на фильтрах, мембранах или магнитных частицах, а примеси вымываются и удаляются.

А.7 Кал

Ингибирующий эффект, влияние которого может быть различным, может возникать в зависимости от того, что пациент ел накануне. Это должно быть принято во внимание.

А.7.1 Сбор проб

Кал использовался в качестве образца для молекулярных методов обнаружения патогенов, в первую очередь для диагностики вирусной диареи. Образцы кала также используются для идентификации энтерогеморрагической Escherichia coli или, реже, для выявления генов веротоксина. Поскольку образцы собираются в момент, когда диарейный симптом наиболее выражен, большинство из них имеют водянистый характер. При сборе образца кала вне медицинских учреждений сбор должен проводиться строго в соответствии с инструкцией.

А.7.2 Хранение и транспортирование образцов

При отсутствии добавок, позволяющих сохранить образец кала, он должен быть заморожен при температуре минус 20°С или ниже, в зависимости от обстоятельств, в течение одного дня после взятия образца. В противном случае его качество может ухудшиться. Длительное хранение образцов при температуре окружающей среды приводит к развитию различных нецелевых бактерий, снижению чувствительности обнаружения целевого патогена и увеличению частоты неспецифических событий амплификации, что в конечном итоге приводит к ложноотрицательным результатам. Возможно также, что нуклеиновые кислоты вирусов будут деградировать под действием протеаз и нуклеаз, продуцируемых бактериями, что приведет к ложноотрицательным результатам исследования.

А.7.3 Подготовка проб

Технически трудно обнаружить ухудшение качества образцов до проведения анализа. Всегда существует вероятность того, что чувствительность обнаружения целевого патогена при исследовании методом амплификации нуклеиновой кислоты снизилась, потому что ухудшение качества не может быть легко распознано до проведения исследования.

Приложение В

(справочное)

Верификация и валидация исследования

Приложение ДА

(справочное)

Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов национальным стандартам

Таблица ДА.1

Библиография

[1]	CLSI EP23-ATM, Laboratory Quality Control Based on Risk Management; Approved Guideline; Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2011
[2]	Jennings L. et al. Recommended Principles and Practices for Validating Clinical Molecular Pathology Tests, Arch Pathol Lab Med, 2009, 133, 743-755
[3]	CLSI, MM03, Molecular Diagnostic Methods for infectious desease. 3rd ed.; Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2015
[4]	CLSI MM06-A2, Quantitative molecular methods for infectious diseases; Approved Guideline, Second edition; Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2010
[5]	CLSI QMS01-A4, Quality management system A model for Laboratory Services; Approved guideline 4th edition; Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2011
[6]	CLSI MM13-A, Collection, Transport, Preparation, and Storage of Specimens for Molecular Methods; Approved Guideline, First edition; Wayne PA, Clinical and Laboratory Standards Institute, 2005
[7]	ISO 21571:2005+Amd 1:2013, Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Nucleic acid extraction (Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот)
[8]	CLSI EP 18-A2, Risk Management Techniques to Identify and Control Laboratory Error Sources; Approved Guideline-Second Edition; Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2009
[9]	ISO 35001:2019, Biorisk management for laboratories and other related organisations (Менеджмент биорисков для лабораторий и других родственных организаций)
[10]	CLSI MM19A, Establishing molecular Testing in Clinical Laboratory Environments-Approved Guidelines; Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2011
[11]	WHO/CDS/EPR/2006.6; Biorisk management - Laboratory biosecurity guidance; September 2006
[12]	ISO 20395, Biotechnology - Requirements for evaluating the performance of quantification methods for nucleic acid target sequences - qPCR and dPCR (Биотехнология. Требования к оценке эффективности количественных методов определения последовательностей-мишеней нуклеиновых кислот. qPCR и dPCR)
[13]	JCCLS MM5-A1, An Approved Guideline for the Quality Management of Specimens for Molecular Methods: The Procurement, Transport, and Preparation of Specimens; Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2011
[14]	Devonshire A.S. et al. The use of digital PCR to improve the application of quantitative molecular diagnostic methods for tuberssculosis. BMC Infect Dis. 2016 Aug 3; 16:366
[15]	J. et al. Inter-laboratory assessment of different digital PCR platforms for quantification of human cytomegalovirus DNA. Anal Bioanal Chem. 2017 Apr; 409(10):2601-2614
[16]	Bustin SA et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009 Apr; 55(4):611-22. Translated into Chinese, Japanese and Arabic
[17]	ISO 17034:2016, General requirements for the competence of reference material producers (Общие требования к компетентности производителей стандартных образцов)
[18]	ISO Guide 30:2015, Reference materials. Selected terms and definitions (Стандартные образцы. Некоторые термины и определения)
[19]	ISO/IEC Guide 99:2007, International vocabulary of metrology - Basic and general concepts and associated terms (VIM; JCGM 200; 2012[22]) [Международный словарь по метрологии. Основные и общие понятия и соответствующие термины (VIM)]
[20]	ISO 22174:2005, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens - General requirements and definitions [Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для определения патогенных микроорганизмов. Общие требования и определения]
[21]	ISO 18113-1:2009, In vitro diagnostic medical devices - Information supplied by the manufacturer (labelling) - Part 1: Terms, definitions and general requirements [Медицинские изделия для диагностики in vitro. Информация, предоставляемая изготовителем (маркировка). Часть 1. Термины, определения и общие требования]
[22]	JCGM 200:2012, International vocabulary of metrology - Basic and general concepts and associated terms (VIM 3rd edition; JCGM 200:2008 with minor corrections)
[23]	Global Harmonization Task Force, Study Group 5 Final Document SG5/N2R8 Clinical Evaluation
[24]	ISO 21572:2013, Foodstuffs - Molecular biomarker analysis - Protein-based methods (Продукты пищевые. Анализ молекулярных биологических маркеров. Метод на основе белка)
[25]	CLSI ЕР17-А2, Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures, 2nd Edition; Approved Guideline; Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2012
[26]	ISO 11843, Capability of detection - Part 1: Terms and definitions (ISO 11843-1:1997, including Technical Corrigendum 1:2003) (Статистические методы. Способность обнаружения. Часть 1. Термины и определения)
[27]	ISO/IEC 25062:2006, (INCITS 354) Preview Software engineering - Software product Quality Requirements and Evaluation (SQuaRE) - Common Industry Format (CIF) for usability test reports [Программная инженерия. Требования и оценка качества программного продукта (SQuaRE). Общий промышленный формат (CIF) отчетов о тестировании удобства использования]
[28]	ISO 24276:2006, Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - General requirements and definitions (Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Общие требования и определения)
[29]	CLSI ММ07-А2, Fluorescence In Situ Hybridization Methods for Clinical Laboratories, 2nd Edition; Approved Guideline; Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2012
[30]	ISO 17511, In vitro diagnostic medical devices - Requirements for establishing metrological traceability of values assigned to calibrators, trueness control materials and human samples (Изделия медицинские для диагностики in vitro. Измерение величин в биологических пробах. Метрологическая прослеживаемость значений, приписанных калибраторам и контрольным материалам)
[31]	ISO 9000:2015, Quality management systems - Fundamentals and vocabulary (Системы менеджмента качества. Основные положения и словарь)
[32]	ISO 3534-2:2006, Statistics - Vocabulary and symbols - Part 2: Applied statistics (Статистические методы. Словарь и условные обозначения. Часть 2. Прикладная статистика)
[33]	Huggett JF et al., The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clin Chem. 2013 Jun; 59(6):892-902
[34]	ISO 24276:2006/Amd 2013, Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - General requirements and definitions - Amendement 1 (Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Общие требования и определения)
[35]	A.M., Measures of Diagnostic Accuracy: Basic Definitions. EJIFCC. 2009 Jan 20; 19(4):203-11. eCollection 2009 Jan.
[36]	ISO 20186-1:2018, Molecular in vitro diagnostic examination - Specification for pre-examination processes for venous whole blood - Part 1: Isolated cellular RNA (Молекулярные диагностические исследования in vitro. Требования к процессам преаналитического этапа исследования замороженных тканей. Часть 1. Изолированная РНК)
[37]	ISO 20166-1, Molecular in vitro diagnostic examinations - Specifications for pre-examination processes for formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissue - Part 1: Isolated RNA [Молекулярные диагностические исследования in vitro. Требования к процессам преаналитического этапа исследования зафиксированных в формалине и залитых парафином образцов тканей (FFPE) Часть 1. Изолированная РНК]
[38]	Burd E.M. Validation of Laboratory-Developed Molecular Assays for Infectious Diseases, Clin Microbiol Rev. 2010 Jul; 23(3): 550-576
[39]	CLSI EP 07, Interference testing in Clinical Chemistry, 3rd edition; Wayne; PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2018
[40]	ISO 22367, Medical laboratories - Application of risk management to medical laboratories (Медицинские лаборатории. Применение менеджмента риска к медицинским лабораториям)
[41]	CLSI ММ17-А2, Validation and Verification of Multiplex Nucleic Acid Assays; Second edition, Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2018