allgosts.ru11. ЗДРАВООХРАНЕНИЕ11.100. Лабораторная медицина

ГОСТ Р ИСО 21474-1-2021 Медицинские изделия для диагностики in vitro. Мультиплексные молекулярные методы для определения содержания нуклеиновых кислот. Часть 1. Терминология и общие требования к оценке качества нуклеиновых кислот

Обозначение:
ГОСТ Р ИСО 21474-1-2021
Наименование:
Медицинские изделия для диагностики in vitro. Мультиплексные молекулярные методы для определения содержания нуклеиновых кислот. Часть 1. Терминология и общие требования к оценке качества нуклеиновых кислот
Статус:
Действует
Дата введения:
04.01.2022
Дата отмены:
-
Заменен на:
-
Код ОКС:
11.100.10

Текст ГОСТ Р ИСО 21474-1-2021 Медицинские изделия для диагностики in vitro. Мультиплексные молекулярные методы для определения содержания нуклеиновых кислот. Часть 1. Терминология и общие требования к оценке качества нуклеиновых кислот

>

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ


НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ


ГОСТ Р

ИСО 21474-1—

2021


Медицинские изделия для диагностики in vitro

МУЛЬТИПЛЕКСНЫЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТОДЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Часть 1

Терминология и общие требования к оценке качества нуклеиновых кислот

(ISO21474-1:2020, IDT)

Издание официальное

Москва Российский институт стандартизации 2021

Предисловие

  • 1 ПОДГОТОВЛЕН Ассоциацией специалистов и организаций лабораторной службы «Федерация лабораторной медицины» (Ассоциация «ФЛМ») (Комитетом по молекулярной диагностике инфекционных и неинфекционных заболеваний «ФЛМ») на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 4

  • 2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 380 «Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы ин витро»

  • 3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 28 октября 2021 г. № 1359-ст

  • 4 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 21474-1:2020 «Медицинские изделия для диагностики in vitro. Мультиплексные молекулярные методы для определения содержания нуклеиновых кислот. Часть 1. Терминология и общие требования к оценке качества нуклеиновых кислот» (ISO 21474-1:2020 «In vitro diagnostic medical devices — Multiplex molecular testing for nucleic acids — Part 1: Terminology and general requirements for nucleic acid quality evaluation», IDT).

Международный стандарт разработан Техническим комитетом ТК 212 «Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы in vitro» Международной организации по стандартизации (ИСО).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им национальные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА.

Дополнительные сноски в тексте стандарта, выделенные курсивом, приведены для пояснения текста оригинала

  • 5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Правила применения настоящего стандарта установлены в статье 26 Федерального закона от 29 июня 2015 г. № 162-ФЗ «О стандартизации в Российской Федерации». Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе «Национальные стандарты», а официальный текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.rst.gov.ru)

© ISO, 2020

© Оформление. ФГБУ «РОТ», 2021

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

Содержание

  • 1 Область применения

  • 2 Нормативные ссылки

  • 3 Термины и определения

  • 4 Общие требования

  • 5 Процедура получения нуклеиновой кислоты

Приложение А (справочное) Оценка целостности РНК

Приложение В (справочное) Оценка целостности ДНК

Приложение С (справочное) Использование ПЦР для оценки амплифицируемой ДНК из образцов FFPE

Приложение D (справочное) Образец микроРНК

Приложение ДА (справочное) Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов национальным стандартам

Библиография

Введение

В первом поколении таких медицинских изделий, как тесты для молекулярной диагностики, основанных на детекции нуклеотидных последовательностей, в качественном или количественном формате определяли единственную последовательность [например, вирусная РНК, матричная РНК (мРНК) или геномная ДНК (дДНК)] в биологическом образце. В мультиплексных молекулярно-биологических тестах в одной пробирке определяют сразу несколько нуклеотидных последовательностей, представляющих интерес. По мере развития технологий и выявления клинической значимости новых биомаркеров в клиническую практику активно разрабатывают и внедряют новые мультиплексные диагностические тесты.

Анализ клинических образцов по нескольким параметрам выполняют в несколько последовательных этапов или одновременно. Образцы собирают, транспортируют и хранят, после чего из них выделяют нуклеиновые кислоты с последующей очисткой или без нее. Затем измеряют количество нуклеиновых кислот и оценивают качество (при необходимости), разбавляют (при необходимости) и подвергают мультиплексным молекулярным тестам. В современной клинической практике мультиплексные тесты направлены на детекцию специфических ДНК- или РНК-мишеней с помощью мультиплексных ПЦР-исследований, микрочипов, а также методов, основанных на масс-спектрометрии или массивном параллельном секвенировании.

Существующие требования к качеству нуклеиновых кислот для молекулярного анализа с единственной мишенью (например, для моноплексной ПЦР [1], [2]) не всегда применимы к мультиплексным молекулярным тестам. Вследствие конкуренции за несколько нуклеотидных мишеней мультиплексные методы более чувствительны к качеству и количеству выделенных нуклеиновых кислот, чем методы с единственной мишенью. Разнообразие биологических, физических и химических свойств каждого образца на мультиплексный анализ будет влиять сильнее, чем на анализ с единственной мишенью. Это может привести к ненадежным результатам и затруднять ход лечения. Таким образом, к оценке качества образцов для мультиплексных молекулярных тестов следует подходить с особенным вниманием.

Сбор, транспортирование и подготовку образцов для медицинских лабораторий рассматривают в национальных и международных документах, в частности в ISO/TS 20658 «Лаборатории медицинские. Требования к отбору, транспортировке, получению и обработке образцов» [3], «Руководство по контролю качества образцов для молекулярных методов. Сбор, транспортировка и пробоподготовка образцов» (Япония, JCCLS) [4], «Руководство по контролю качества образцов для молекулярных методов (часть 2). Новые технологии и контроль качества образцов» (Япония, JCCLS) [5], и для конкретных типов биологических образцов — в серии международных стандартов ИСО 20166 [6], ИСО 20184 [7] и ИСО 20186 [8].

Настоящий стандарт описывает терминологию и общие требования к качеству нуклеиновых кислот, используемых в мультиплексных молекулярных тестах, с целью обеспечения воспроизводимости результатов таких тестов.

Примечание — Методические указания, требования и критерии эффективности, изложенные в настоящем стандарте, призваны обеспечить получение сопоставимых, точных и воспроизводимых результатов в разных лабораториях.

ГОСТ Р ИСО 21474-1—2021

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Медицинские изделия для диагностики in vitro

МУЛЬТИПЛЕКСНЫЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТОДЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Часть 1

Терминология и общие требования к оценке качества нуклеиновых кислот

In vitro diagnostic medical devices. Multiplex molecular testing for nucleic acids. Part 1. Terminology and general requirements for nucleic acid quality evaluation

Дата введения — 2022—04—01

  • 1 Область применения

Настоящий стандарт содержит условия и общие требования к оценке качества нуклеиновых кислот, которые являются аналитами в мультиплексных молекулярных тестах, в ходе которых идентифицируют не менее двух целевых нуклеотидных последовательностей. Настоящий стандарт применим ко всем мультиплексным молекулярным методам с использованием для исследования медицинских изделий для диагностики in vitro и тесты LDT. Настоящий стандарт содержит информацию как для качественного, так и для количественного определения целевых нуклеотидных последовательностей.

Настоящий стандарт представляет собой руководство по мультиплексным молекулярным методам, которые позволяют обнаружить или количественно определять целевые нуклеотидные последовательности (мишени) человека или патогенных микроорганизмов, выделенных из биологических образцов, полученных от человека. Настоящий стандарт применим к любому диагностическому молекулярному исследованию in vitro, проводимому в медицинской (клинико-диагностической) лаборатории, а также предназначен для потребителей услуг лабораторий, разработчиков и изготовителей в области лабораторной диагностики, биобанков, учреждений и коммерческих организаций, осуществляющих биомедицинские исследования, и вышестоящих организаций. Настоящий стандарт не применим к исследованиям в области метагеномики.

Примечание — Процедура исследования, разработанная в лаборатории для внутреннего пользования, обычно называется «тест, разработанный в лаборатории», «LDT» или «in-house test».

  • 2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты [для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированных ссылок — последнее издание (включая все изменения)]:

ISO 15189:2012, Medical laboratories — Requirements for quality and competence (Лаборатории медицинские. Частные требования к качеству и компетентности)

  • 3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями.

Издание официальное

ИСО и МЭК ведут терминологические базы данных для использования в области стандартизации по следующим адресам:

  • - платформа онлайн-просмотра ИСО: http://www.iso.org/obp;

  • - Электропедия МЭК: http://www.electropedia./org.

  • 3.1 точность (accuracy): Степень близости результатов испытаний или измерений к истинному значению измеряемой величены.

Примечание 1 — Термин «точность» применительно к совокупности результатов мультиплексного исследования включает совокупность случайной составляющей и общей систематической ошибки или компонента смещения (ИСО 3534-2:2006, 3.3.1).

[Руководство ИСО/МЭК 99:2007, 2.13, с изменениями — примечание 1, примечание 2 и примечание 3 удалены, добавлено новое примечание 1]

  • 3.2 алгоритм (algorithm): Набор правил или вычислений, которые применяют к результатам исследования, чтобы получить результат для интерпретации или учета.

  • 3.3 аллель (allele): <генетика> Любая из нескольких форм гена, ответственного за наследственную изменчивость.

Примечание 1 — Аллель также может быть определен как:

  • 1) одна из альтернативных форм полиморфной последовательности ДНК, которая не обязательно относится к гену;

  • 2) одна из альтернативных форм гена, которая может занимать данный локус.

  • 3.4 соотношение аллелей (allelic ratio): Отношение конкретного аллеля (см. 3.3) к общему числу аллелей (см. 3.3) в популяции, обычно выраженное в виде дроби.

Примечание 1 — Например, если данный аллель (см. 3.3) составляет 40 % от общего числа аллелей (см. 3.3), в данном локусе аллельное соотношение составляет 0,4.

Примечание 2 — Аллельное соотношение является синонимом частоты аллелей.

  • 3.5 аналит (analyte): Компонент, представленный в названии измеряемой величины.

[ИСО 17511:2020, 3.1, с изменениями — пример удален]

  • 3.6 химическая чистота (chemical purity): Степень загрязнения химическими веществами, влияющими на мультиплексный анализ.

Примечание 1 — Чистота нуклеиновой кислоты для ПЦР — отсутствие органических и белковых примесей, прошедших стадию экстракции, а также отсутствие контаминирующих нуклеиновых кислот.

  • 3.7 метод ДНК-микрочипов (DNA microarray DNAchip): Твердый субстрат, на который напрямую или опосредованно наносится смесь проб ДНК, что позволяет исследовать большое количество биологического материала с использованием высокопроизводительных методов скрининга.

[ИСО 16578:2013, 3.3]

  • 3.8 документированная процедура (documented procedure): Установленный способ осуществления деятельности или выполнения процесса, которые документируются, внедряются и поддерживаются в том числе участием в межлабораторных сличениях (см. 3.13).

  • 3.9 метод оценки качества (evaluation method): Способ оценки качества для заданной нуклеиновой кислоты.

  • 3.10 срок годности (expiry date expiration date): Верхний предел временного интервала, в течение которого при хранении материала в определенных условиях могут быть гарантированы его функциональные характеристики.

Примечание 1 — Сроки годности, приписанные реагентам (см. 3.16), калибраторам, контрольным материалам и другим компонентам, основаны на свойствах стабильности, определенных опытным путем.

[ИСО 18113-1:2009, 3.17, с изменениями — примечание 2 и примечание 3 удалены]

  • 3.11 внешний стандарт измерения; стандартный образец (external measurement standard; reference standard): Материал или субстрат, подготовленный для проверки совместимости методов мультиплексного анализа, значения свойств которого определяются как опорное значение на основе совместной экспериментальной работы под руководством научной или технической группы.

Примечание 1 — Как правило, речь идет о мультиплексном молекулярном анализе.

Примечание 2 — Стандарт может быть использован в качестве альтернативы внешнему эталону измерений.

[ИСО 16578:2013, 3.9, с изменениями — добавлены примечание 1 и примечание 2]

  • 3.12 предусмотренное применение; использование по назначению (intended use; intended purpose): Объективное намерение изготовителя изделия для диагностики in vitro в отношении применения продукта, процесса или услуги, отраженное в спецификациях, инструкциях и информации, предоставленной изготовителем изделия для диагностики in vitro.

[ИСО 18113-1:2009, 3.31, с изменениями — примечание 1 и примечание 2 удалены]

  • 3.13 межлабораторное сличение1) (interlaboratory comparison): Организация, выполнение и оценивание измерений или испытаний одного и того же или нескольких подобных образцов двумя или более лабораториями в соответствии с заранее установленными условиями.

[ИСО/МЭК 17043:2010, 3.4]

  • 3.14 устройство для in vitro диагностики; IVD устройство (/л vitro diagnostic instrument; IVD instrument): Оборудование или прибор, предназначенные изготовителем для применения как медицинское изделие для диагностики in vitro (см. 3.15).

[ИСО 18113-1:2009, 3.26, с изменениями — примечание 1 исключено]

  • 3.15 медицинское изделие для диагностики in vitro2) (in vitro diagnostic product; in vitro diagnostic medical device; IVD medical device): Реагенты, инструменты и системы, предназначенные для использования в диагностике заболеваний или других состояний, включая определение состояния здоровья, с целью лечения или предотвращения заболевания или его последствий.

[21CFR809.3 Федерального закона США о продуктах питания, лекарствах и косметике]

  • 3.16 реагент для диагностики in vitro (IVD реагент) (in vitro diagnostic reagent): Химические, биологические или иммунологические компоненты, растворы или препараты, предназначенные изготовителем для применения в качестве медицинского изделия для диагностики in vitro (см. 3.15).

[ИСО 18113-1:2009, 3.28, с изменениями — примечание 1 удалено]

  • 3.17 тесты, разработанные лабораторией3) (laboratory developed tests; LDTs): Тип диагностических изделий in vitro, предназначенных для клинического применения, которые разработаны, изготовлены и используются в рамках одной лаборатории.

Примечание 1 — Его часто называют «внутренним тестом».

[CLSI QSRLDT]

  • 3.18 предел обнаружения (limit of detection; LOD): Значение измеренной величины, полученное с применением методики измерения, для которой вероятность ложного утверждения об отсутствии компонента в материале есть р, при условии, что а есть вероятность ложного утверждения о его присутствии.

Примечание 1 — Международный союз теоретической и прикладной химии (IUPAC) рекомендует аир оценивать в равной мере как 0,05.

Примечание 2 — Это относится к LOD, когда тесты оценивают наличие или отсутствие нескольких анализируемых веществ (см. 3.5), а не множественный молекулярный тест (см. 3.26).

Примечание 3 — Предел обнаружения, LOD, альтернативно определяется как: 1) наименьшее количество нуклеиновой кислоты, которое можно достоверно секвенировать и отличить от ее отсутствия, как правило, в пределах установленного доверительного предела; 2) минимальная обнаруживаемая аллельная фракция в данном образце.

[CLSI ММ09 2014]

  • 3.19 предел обнаружения для платформы микрочипа; предел обнаружения для мультиплексной молекулярной тестовой платформы; LODP (limit of detection for microarray platform; limit of detection for multiplex molecular test platform; LODP): Наименьшее относительное количество внешнего эталона измерения (см. 3.11) (или референсного материала), которое можно последовательно обнаружить экспериментально с 95 %-ным уровнем достоверности при известном (определенном/оцененном) количестве копий и/или концентрации внешнего эталона измерения (см. 3.11) (или референсного материала).

Примечание 1 — Как правило, речь идет о мультиплексном молекулярном анализе.

Примечание 2 — LODP может быть использован для оценки эксплуатационных характеристик, заменяющих предел обнаружения (см. 3.18) для мультиплексного анализа.

[ИСО 16578:2013, 3.9, с изменениями — добавлены примечание 1 и примечание 2]

  • 3.20 массивное параллельное секвенирование (massive parallel sequencing): Метод, позволяющий проводить высокопроизводительное секвенирование ДНК с использованием концепции параллельной обработки очень большого числа молекул.

Примечание 1 — К примеру, но не ограничиваясь ими, технологии с миниатюризированными и распараллеленными платформами для секвенирования от тысяч до миллионов коротких считываний (~50—400 пар оснований) или полимеразная платформа для ДНК-секвенирования в реальном времени, позволяющая длительное считывание (средняя длина ~10 000-1000 пар оснований).

  • 3.21 микроРНК (microRNA): Одноцепочечная РНК длиной от 17 до 25 нуклеотидов, относящаяся к посттранскрипционной регуляции экспрессии.

  • 3.22 множественные последовательности аналита(ов) (multiple sequences of analyte(s)): Часть образца с несколькими последовательностями нуклеиновых кислот, измеренными одновременно.

  • 3.23 мультиплексные молекулярные тесты (multiplex molecular test): Диагностические тесты in vitro, которые одновременно оценивают идентичность последовательностей и/или количество нескольких, а именно двух или более нуклеиновых кислот-мишеней, определяемых в одной серии исследования, на основе методов, таких как мультиплексная ПЦР (см. 3.25), множественная гибридизация, микрочипы и массивное параллельное секвенирование (см. 3.20).

Примечание 1 — «Мультиплекс» определяется как «тест, в котором две или более цели одновременно обнаруживают с помощью общего процесса подготовки образца, амплификации целевой последовательности или сигнала, аллельной дискриминации (см. 3.3) и коллективной интерпретации» (CLSI/MM17-A [24]).

Примечание 2 — Цели, представляющие интерес, определяют как мишени обнаружения, представляющие интерес, и исключают контрольный материал из числа целей.

  • 3.24 мультиплексный молекулярный тест качества нуклеиновой кислоты (multiplex molecular test quality nucleic acid): Матрица нуклеиновой кислоты, обладающая соответствующим свойством, обеспечивающим проведение мультиплексного молекулярного теста (см. 3.23), таким как достаточная длина, количество, химическая чистота (см. 3.6), структурная целостность (см. 3.40) и наличие необходимой последовательности нуклеиновых кислот.

  • 3.25 мультиплексная ПЦР (multiplex PCR): Метод ПЦР, который использует несколько пар праймеров, объединенных в одной реакционной смеси, для получения нескольких ампликонов одновременно.

[ИСО 16577:2016, 3.117]

  • 3.26 мультиплексные молекулярные тесты (multivariable molecular test): Молекулярные тесты, которые объединяют значения нескольких переменных с помощью функции интерпретации для получения единого, специфичного для пациента результата, включая «классификацию», «оценку» и/или «индекс».

Примечание 1 — Это обычно основано на платформе мультиплексных молекулярных тестов.

Примечание 2 — Это предназначено для использования в диагностике заболеваний или других состояний, а также в лечении, снижении осложнений или профилактике заболеваний.

Примечание 3 — Термин «мультиплексные», используемый в статистике, подразумевает оценку нескольких результатов, а не использование нескольких переменных для оценки одного результата.

  • 3.27 патоген (pathogen): Инфекционный агент, вызывающий заболевания.

Примечание 1 — Патоген включает в себя некоторые вирусы, вироиды, прионы, бактерии, грибы или паразитов.

[ИСО 15714:2019, 3.1.2, с изменениями]

  • 3.28 качество ДНК, необходимое для проведения ПЦР (PCR quality DNA): Матрица ДНК достаточной длины, количества, химической чистоты (см. 3.6) и структурной целостности (см. 3.40) для амплификации методом ПЦР.

[ИСО 24276:2006, 3.2.3, с изменениями — добавлено слово «количество»]

  • 3.29 преаналитический этап; процедуры перед исследованием (preanalytical phase; preexamination procedures): Процедуры, которые начинаются в хронологическом порядке: назначение клиницистом исследования, включение исследования в заявку, подготовка пациента к исследованию, взятие первичной пробы, транспортирование ее в лабораторию и перемещение внутри лаборатории, выделение аналита — и заканчиваются началом аналитического исследования.

[ИСО 15189:2012, 3.15, с изменениями — добавлены слова «выделение аналита»]

  • 3.30 первичная проба; образец (primary sample; specimen)4); Отдельная порция биологической жидкости или тканей, взятая для исследования, изучения или анализа одной или нескольких величин или свойств, которые предполагается приписать целому.

Примечание 1 — Рабочая группа по глобальной гармонизации (GHTF) использует термин «образец» в руководящих документах по гармонизации, обозначая пробу биологического происхождения, предназначенную для исследования в медицинской лаборатории.

Примечание 2 — В некоторых документах ИСО и СЕН «образец» определен как «биологическая проба, взятая из тела человека».

Примечание 3 — В некоторых странах термин «образец» используют вместо первичной пробы (или ее порции), которая является пробой, подготовленной для транспортирования в лабораторию (или получаемую лабораторией) и предназначенной для исследования.

[ИСО 15189: 2012, 3.16]

  • 3.31 диапазон уверенного сигнала (range of reliable signal): Способность (в пределах заданного диапазона) представлять результаты, прямо пропорциональные концентрации и/или числу копий внешнего стандарта (см. 3.11) (или референсного материала).

Примечание 1 — Это используется в основном для количественных, но не качественных тестов.

Примечание 2 — Также используется линейный диапазон или аналитический измеримый диапазон.

[ИСО 16578:2013, 3.9, с изменениями — добавлены примечание 1 и примечание 2]

  • 3.32 диапазон, включаемый в отчетность (reportable range): Область генома, в которой последовательность приемлемого качества может быть получена в ходе лабораторного исследования.

Примечание 1 — Отчетный диапазон также определяется как «диапазон тестовых значений, в течение которого связь между измерительным откликом прибора, комплекта или системы обоснована» (US CFR 493).

  • 3.33 референсный диапазон (reference range); Диапазон вариаций последовательностей, который ожидается обнаружить в биологической референтной популяции.

  • 3.34 обратная транскрипция; ОТ (RT; reverse transcription): Синтез ДНК с матрицы РНК с использованием фермента обратной транскриптазы в сочетании с ОТ-праймером в присутствии дезоксирибонуклеотидтрифосфатов.

[ИСО 22174:2005, 3.3.1]

  • 3.35 ОТ-ПЦР (RT reverse transcription): Метод, состоящий из двух реакций: обратной транскрипции (ОТ) РНК в ДНК и последующей ПЦР.

[ИСО 22174:2005, 3.4.2]

  • 3.36 качество РНК для ОТ-ПЦР (RT-PCR quality RNA): Матрица РНК, длина и количество которой достаточны для проведения реакции обратной транскрипции (см. 3.34) и ПЦР.

[ИСО 22174:2005, 3.2.4, с изменениями]

  • 3.37 проба (sample): Одна или несколько частей (порций), которые взяты из первичной пробы (образца).

[ИСО 15189:2012, 3.24, с изменениями — пример удален]

  • 3.38 стабильность (stability): Способность медицинского изделия IVD (см. 3.15) сохранять свои эксплуатационные характеристики в определенных пределах в течение промежутка времени и условиях, установленных изготовителем.

Примечание 1 — Стабильность применяется к:

  • - реагентам IVD (см. 3.16): калибраторы и регуляторы при хранении, транспортировании и использовании в условиях, указанных изготовителем;

  • - лиофилизированным материалам после восстановления, рабочим растворам, материалам после открытия запечатанной упаковки в том случае, если они приготовлены, использовались и хранились в соответствии с инструкциями изготовителя по применению.

Примечание 2 — Стабильность реагента IVD (см. 3.16) или измерительной системы обычно определяется относительно времени:

  • - длительности временного интервала, в течение которого метрологическое свойство изменилось в пределах установленной величины;

  • - изменения свойств в течение установленного интервала времени.

[ИСО 18113-1:2009, 3.68, с изменениями — слова «Измерительные приборы или измерительные системы после калибровки» в примечании 1 и примечании 3 исключены]

  • 3.39 стабильность образца (specimen stability): Способность образца сохранять установленные характеристики качества при длительном хранении в заданных условиях.

[ИСО 23833:2013, 5.5.10, с изменениями — текст «изменения химического состава при электронной бомбардировке, т. е. сопротивление изменению интенсивности соответствующих характерных рентгеновских лучей, наблюдаемое в течение времени воздействия электронного пучка на образец» заменен на «качества при длительном хранении»]

  • 3.40 устойчивость структуры (structural integrity): Степень сохранности нуклеиновой кислоты, отражающей исходное состояние.

  • 3.41 валидация (validation): Подтверждение выполнения требований, необходимых для конкретного использования или применения, посредством представления объективных свидетельств.

Примечание — Термин «валидирован» используют для обозначения соответствующего статуса.

[ИСО 9000:2015, 3.8.13, с изменениями — примечание 1, примечание 3 удалены]

  • 3.42 верификация (verification): Подтверждение посредством представления объективных свидетельств, что установленные требования были выполнены.

Примечание 1 — Термин «верифицировано» используется для обозначения соответствующего статуса.

Примечание 2 — Верификация может включать такие действия, как:

  • - выполнение альтернативных расчетов,

  • - сравнение новой проектной спецификации с аналогичной проверенной проектной спецификацией,

  • - проведение испытаний и демонстраций, а также

  • - рассмотрение документов до их выдачи.

[ИСО 9000:2015, 3.8.13, с изменениями — примечание 1 и примечание 3 удалены]

  • 4 Общие требования

    • 4.1 Общие положения

      4.1.1 Требования преаналитического этапа

      Общие положения о системах менеджмента качества медицинских лабораторий, и в частности о сборе и обработке образцов, приведены в ИСО 15189:2012, 4.2, 5.4.4, 5.4.7 и ISO/TS 20658 [3]. Должны соблюдаться требования к лабораторному оборудованию, реагентам и расходным материалам в соответствии с ИСО 15189:2012, 5.3; также могут применяться требования ИСО 15189:2012, 5.5.1.2 и 5.5.1.3.

Преаналитический этап обычно состоит из следующих процессов:

  • - сбор, хранение и транспортирование образцов/проб;

  • - предварительная обработка образцов проб;

  • - экстракция и очистка нуклеиновых кислот.

Эти факторы в значительной степени влияют на качество образца и последующие результаты испытаний. Детали особенностей преаналитических процедур для молекулярных исследований описаны в [6]-[8], [25]—[30].

Одним из основных факторов преаналитического этапа исследований, оказывающих существенное влияние на результаты аналитических тестов, являются биологические изменения аналита (РНК, ДНК) в образце: индукция генов, подавление экспрессии генов, апоптоз и т. д. Эти эффекты могут зависеть от продолжительности тепловой и холодовой ишемии5) и температуры окружающей среды до фиксации формалином. Эти факторы являются основным источником неправильных или ненадежных результатов аналитических тестов [6]—[8], [30]. Таким образом, транспортирование ткани перед хранением или фиксацией в формалине должно проводиться в кратчайшие сроки и, возможно, при низкой температуре или под вакуумом.

Мультиплексные молекулярные тесты — это тесты IVD или медицинские устройства, которые измеряют последовательность двух или более нуклеиновых кислот одновременно. Для мультиплексных молекулярных тестов необходимо применение образца высокой степени качества.

  • 4.1.2 Качество образцов

Источник6) образца, сбор, обработка, экстракция и очистка должны быть валидированы и верифицированы (при необходимости) для того, чтобы убедиться, что качество нуклеиновой кислоты подходит для всех аналитов или мишеней, которые планируют выявить в исследовании. Панель мишеней для мультиплексного анализа включает мишени, представленные в высокой или низкой концентрации.

Изменчивость биологических, физических и химических свойств каждого образца может влиять на качество получаемой нуклеиновой кислоты и, следовательно, на результаты мультиплексных молекулярных анализов. Однако нецелесообразно оценивать все влияния для каждого образца. Лаборатория должна обеспечить получение каждого биологического образца способом, который не допускал бы изменчивости свойств. В случае, если этого нельзя избежать, влияние изменчивости свойств должно оцениваться соответствующим способом, таким как включение в анализ образца внутреннего контроля.

  • 4.1.3 Качество нуклеиновых кислот

Качество нуклеиновой кислоты для мультиплексного молекулярного теста определяют как матрицу нуклеиновой кислоты с соответствующими свойствами, которые гарантируют измерение в ходе мультиплексного молекулярного теста. В то время как общие соображения по оценке качества нуклеиновых кислот совпадают для классических (моно-) и мультиплексных тестов, существуют особые правила для мультиплексных молекулярных тестов из-за потенциальной интерференции или взаимодействия между несколькими мишенями и/или компонентами теста.

Качество выделенной из образца нуклеиновой кислоты зависит от ряда факторов — в частности, от количества, химической чистоты, длины и структурной целостности, а также содержания (копий-ности) интересующей мишени. Влияние качества следует учитывать в отношении таких параметров анализа, как предел обнаружения и линейный диапазон каждого аналитического метода.

Качество нуклеиновой кислоты для мультиплексного молекулярного теста необходимо оценивать способами, подходящими для используемого метода измерения.

Оценка качества должна определять репрезентативный профиль выделенной нуклеиновой кислоты, обусловленный длиной, количеством, химической чистотой и структурной целостностью или обнаружением, или количеством репрезентативных генов (например, генов внутреннего контроля).

Материалы управления технологическими процессами необходимо использовать для мониторинга как преаналитических, так и аналитических процессов, где это уместно и доступно. Такие материалы следует использовать для мониторинга процедур экстракции и очистки нуклеиновых кислот. Для определения качества нуклеиновых кислот каждой целевой последовательности следует учитывать внутренний контроль.

Примечание — Руководство CLSI ММ17-А содержит рекомендации по различным аспектам верификации и валидации мультиплексного тестирования [24].

  • 4.2 Мультиплексный молекулярный тест для оценки качества нуклеиновых кислот

    4.2.1 Оценка качества нуклеиновых кислот для мультиплексных молекулярных тестов

    Термин «ДНК качества ПЦР» описан в ИСО 22174, ИСО 16577 и ИСО 20395. В ИСО 16577 характеризуется как матрица ДНК достаточной длины, качества и структурной целостности для амплификации с помощью ПЦР, а «РНК качества ОТ-ПЦР», также описанная в ИСО 22174, представляет собой образец РНК достаточной длины в количестве, пригодном для обратной транскрипции и ПЦР. Понятия «ДНК качества ПЦР» и «РНК качества ОТ-ПЦР» не применимы к мультиплексным молекулярным методам измерения, включая методы ПЦР или РТ-ПЦР, микрочипы и массивное параллельное секвенирование.

Учитывая, что мультиплексный молекулярный тест является молекулярно-биологическим методом, способным одновременно обнаруживать несколько нуклеотидных последовательностей даже более короткой длины, должны быть разработаны методы оценки качества мультиплексного молекулярного теста нуклеиновой кислоты, подходящие для каждой измерительной системы.

Качество нуклеиновых кислот должно быть определено перед проведением мультиплексного молекулярного теста. Метод, с помощью которого определяют качество нуклеиновых кислот, будет зависеть от нескольких факторов, таких как используемый мультиплексный метод, известное или ожидаемое количество нуклеиновой кислоты, присутствующей в образце, и нуклеиновая кислота, подлежащая анализу (ДНК или РНК). Пользователь должен выбрать наиболее подходящий способ в зависимости от мультиплексного молекулярного теста, который будет использоваться.

Для определения количества, концентрации, чистоты и возможного разрушения нуклеиновой кислоты в образце можно использовать спектрофотометрические и/или флуориметрические методы и/или гель- или капиллярный электрофорез. Качество нуклеиновых кислот следует оценивать на основе распределения размеров, выявленных при электрофорезе нуклеиновых кислот, обнаружения или количества референсных генов [например, генов внутреннего контроля, включая гены домашнего хозяйства (house-keeping genes)]. Для определения качества каждой целевой последовательности нуклеиновой кислоты с целью контроля процесса можно использовать обогащенные внутренние контроли (т. е. образцы, в которые был добавлен интересующий аналит в точно известном количестве). Существуют методы, доступные для оценки качества нуклеиновой кислоты, присутствующей в растворе, как описано в приложениях А—D.

Пример 1 — Качество РНК можно оценить по электроферограмме с помощью соотношения 28S:18s рибосомальной РНК (рРНК) образца, содержащего общую РНК, числа целостности РНК (значения RIN) или балла целостности РНК (RIS) [31], [32].

Несмотря на то, что показатели качества на основе рРНК популярны для тех, кто проводит анализ РНК, они не всегда могут быть полезны для оценки качества мРНК [33].

Пример 2 — Соотношения А260/А280 и А260/А230 могут быть использованы для оценки чистоты РНК.

В случае, если мультиплексные молекулярные тесты предназначены для обнаружения или количественной оценки мишеней различной длины, следует убедиться, что матрица нуклеиновой кислоты имеет достаточное качество для амплификации во всем диапазоне размеров мишеней. Это может быть достигнуто с помощью ПЦР-реакции с наборами праймеров, которые обеспечивают получение фрагментов, оценивающих нижний и верхний диапазоны размеров мишени. Качество матрицы нуклеиновой кислоты, пригодной для анализа, затем может быть оценено на основе распределения размеров, полученных ПЦР-фрагментов с помощью капиллярного или гель-электрофореза.

Для некоторых мультиплексных молекулярных тестов критическим аспектом обеспечения качества образца нуклеиновой кислоты является определение наличия интересующей нуклеиновой кислоты. Например, мультиплексный анализ мишени нуклеиновой кислоты, содержащейся в небольшом количестве в конкретном исходном образце или организме, должен гарантировать, что образец содержит нуклеиновую кислоту из этой(этого) ткани/организма. Подтверждение может быть получено в результате мультиплексного теста, а также предварительным исследованием образца нуклеиновой кислоты, взятого на мультиплексный анализ.

Примечание — Для улучшения обнаружения жизнеспособных патогенов можно использовать одновременное определение рРНК или мРНК. Другой подход может быть рассмотрен для обработки бактерий с помощью интеркаляторов ДНК, которые проникают в инактивированные клетки и ингибируют ПЦР-амплификацию, но исключаются из жизнеспособных клеток.

Образец нуклеиновой кислоты должен иметь достаточное количество интересующей последовательности для выявления всех вариаций, присутствующих в популяции. При применении мультиплексных молекулярных тестов для обнаружения или количественной оценки различных последовательностей должно быть обеспечено достаточное количество нуклеиновой кислоты, требуемое в данном методе измерения, в том числе для определения последовательности, присутствующей в меньшем количестве, чем другие.

Пример — При проведении мультиплексной амплификации лигированных зондов (MLPA, Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) используют два денатурированных фрагмента (D-фрагменты) для выявления слабой денатурации ДНК вследствие солевых загрязнений образца.

  • 4.2.2 Оценка количества нуклеиновых кислот

Методы оценки количества нуклеиновых кислот должны быть выбраны в соответствии с ходом эксперимента, использующего мультиплексный молекулярный тест.

В ходе определения количества очищенных нуклеиновых кислот для мультиплексных молекулярных тестов должно быть измерено соотношение целевых участков генома к количеству референсного образца, соответствующих калибровочных и контрольных образцов для сравнения относительного значения нескольких переменных. В этом случае принцип подсчета — определение отношения (в процентах) двух последовательностей ДНК или РНК, в том числе целевой последовательности и контрольного гена или материала (внутренние контрольные гены, референсный материал). Это подтверждение может быть включено в мультиплексный тест или получено в ходе отдельного исследования.

  • 5 Процедура получения нуклеиновой кислоты

    • 5.1 Общие положения

Используемый метод экстракции нуклеиновой кислоты должен быть подходящим для получения количества и качества нуклеиновой кислоты, необходимых для последующего анализа.

Оценка нуклеиновых кислот должна проверяться на предмет их пригодности в мультиплексной молекулярной тестовой системе в ее окончательной конфигурации, а не в отдельных одноплексных реакциях, из которых состоит мультиплексный тест.

  • 5.2 Подготовка образцов

    5.2.1 Общие положения

    В преаналитическом этапе существует множество стадий обработки образцов, включая сбор, фиксацию, хранение, транспортирование, подготовку и обработку. Поскольку эти факторы преанали-тического этапа значительно влияют на качество образца и последующие результаты испытаний, необходимо обеспечить соответствующее обращение с образцом [6]—[8], [30].

По мере увеличения числа мишеней в мультиплексном анализе увеличение числа ложноотрицательных результатов для определенных последовательностей может создавать проблемы. В частности, следует оценить качество мишени с наименьшим присутствием таких нуклеиновых кислот в образце, поскольку конкуренция за компоненты реакции может влиять на содержащиеся в малом количестве мишени более значительно, чем на более распространенные.

Пример 1 — В мультиплексных тестах для выявления подтипов вируса папилломы человека при цервикальной инфекции во время сбора образцов можно получить некачественный образец слизистой из шейки матки, например без достаточного количества клеток человека. Это может привести к ложноотрицательному результату теста вследствие непригодного образца. Для проверки отрицательного результата теста в образцах, которые потенциально являются низкокачественными, одновременное обнаружение последовательности генома человека может быть использовано в качестве внутреннего контроля анализа.

Пример 2 — В мультиплексных тестах для определения соматических видов рака относительное снижение интересующих мишеней может происходить, когда доля ненеопластических клеток, таких как воспалительные инфильтраты или эндотелиальные клетки, больше, чем неопластических клеток, что приводит к недооценке или ложноотрицательным результатам определения целевой последовательности.

Пример 3 — В мультиплексных тестах для обнаружения микробных патогенов при инфекции дыхательных путей плохое качество нуклеиновой кислоты, обусловленное высокой вязкостью образца, может возникать во время сбора и подготовки респираторных образцов, что приводит к ложноотрицательным тестам для вида с низкой концентрацией в образце. Проблема может быть сведена к минимуму путем обработки образца NALC (И-ацетил-Ь-цистеин) и щелочной протеазой.

По мере увеличения числа определяемых мишеней ложноположительные результаты, не имеющие клинической значимости, становятся все более проблематичными, поэтому биологический образец должен быть отобран и обработан таким образом, чтобы избежать ложноположительных результатов, обусловленных контаминацией. Минимизировать проблему поможет использование количественного измерения с применением значения cut-off.

Пример 1 — В мультиплексных тестах для обнаружения бактериальных патогенов в инфекции кровотока контаминация может произойти во время сбора крови, что приводит к ложноположительным результатам теста вследствие присутствия нормальной флоры кожи человека, таким как коагулазонегативный стафилококк. Контаминацию можно уменьшить применением асептических методов при взятии крови, включая антисептику кожи, гигиену рук и предварительно упакованные наборы. Появление в крови нежизнеспособных бактерий может происходить после антимикробной терапии, что приведет к положительным тестам на соответствующие микроорганизмы. Следует избегать взятия крови сразу после введения антимикробных препаратов, что может уменьшить влияние ДНК нежизнеспособных бактерий.

Пример 2 — В мультиплексных тестах для обнаружения видов микобактерий при инфекции дыхательных путей загрязнение может происходить во время сбора респираторных образцов, что приводит к положительным тестам присутствия бактерий окружающей среды, таким как М. gordonae, М. chelonae или М. simiae. Это может быть уменьшено с помощью стерильного аппарата для сбора образцов, такого как бронхоскоп.

  • 5.2.2 Подготовка тканей

Когда методы, основанные на реакциях ферментативной амплификации, используют для мультиплексных молекулярных тестов, ингибиторы, присутствующие в образцах тканей, могут мешать обнаружению или количественной оценке мишеней, представленных в малом количестве, но представляющих интерес по сравнению с более распространенными мишенями. Поэтому ингибиторы должны быть сведены к минимуму настолько, насколько это возможно, чтобы обеспечить измерение каждой интересующей последовательности.

Необходимо оценить наличие и долю опухолевых клеток, чтобы обеспечить интерпретацию результатов теста и установить, необходимо ли обогащение опухолевых клеток в такой степени, чтобы провести оценку каждой интересующей последовательности.

Для образцов FFPE фиксация формалином сопровождается фрагментацией и химической модификацией нуклеиновых кислот, поэтому желательно проводить фиксацию формалином в соответствующем фиксирующем реагенте (т. е. стандартном буферном растворе формалина), при низкой температуре и в кратчайшие сроки [2], [6], [20].

Примечание — Рабочие процессы для предварительного исследования различных типов образцов, таких как фиксированные в формалине и заключенные в парафин (FFPE/ замороженные ткани и кровь, описаны в ИСО 20166 [6], ИСО 20184 [7] и ИСО 20186 [8].

Примечание — Нейтральный буферный формалин (НБФ) обычно используется для процесса фиксации.

Примечание — ДНК, полученная из более старых фиксированных формалином парафиновых блоков (например, более трех лет), часто демонстрирует отсутствие дезаминирования цитозина до урацила, что приводит к переходу C:G в Т:А в последовательностях ДНК. Обработка урацил-ИХ-гликозилазой может устранить урацил-содержащие молекулы ДНК в таком образце. В качестве альтернативы оценка коэффициентов перехода к трансверсии данных последовательностей путем массивного параллельного секвенирования может быть использована для обнаружения значительного дезаминирования.

При работе с образцами тканей небольшого объема, например полученными путем тонкоигольной аспирации, следует учитывать стохастическое смещение, поскольку количество геномных эквивалентов, присутствующих в образце, может быть достаточным для последовательного обнаружения вариантов или организмов с низким присутствием генома или аллелей.

При фиксации формалином и подготовке тканей для мультиплексного выявления соматических видов рака может происходить перекрестное попадание ткани от одного пациента в тканевый препарат другого пациента. Это может привести к положительному результату теста для данного пациента, хотя последовательность нуклеиновых кислот принадлежит образцу другого пациента. Следует позаботиться о том, чтобы свести к минимуму этот риск, обрабатывая ткань на чистой поверхности и используя одноразовые устройства или расходные материалы (например, лезвие, прокладку и контейнер). Если перекрестная контаминация неизбежна, то должен быть разработан соответствующий контроль мультиплексных анализов.

Примечание — Включение полиморфных геномных областей (например, используемых в судебных анализах) в целевые области анализов методом массивного параллельного секвенирования может быть использовано для оценки наличия более чем одного генома пациентов в секвенируемых образцах.

  • 5.2.3 Экстракция и очистка нуклеиновых кислот

Метод экстракции или очистки нуклеиновых кислот выбирают с учетом влияния типов образцов и матриц на каждый мультиплексный метод, которому будут подвергать экстрагированную или очищенную нуклеиновую кислоту.

При измерении с использованием некоторых высокочувствительных мультиплексных методов потенциальная контаминация нуклеиновой кислоты реагентами, пробирками и пластиковой посудой может привести к ложноположительным результатам. Использование специально разработанных и изготовленных материалов для этих типов анализов должно быть рассмотрено с целью минимизации контаминации нуклеиновыми кислотами. Кроме того, потенциальная перекрестная контаминация образцов может привести к ложноположительным результатам. Должен быть установлен протокол подготовки и обработки образцов/проб, который должен быть задокументирован и соблюден, чтобы свести к минимуму влияние такого перекрестного загрязнения.

При работе с образцами с ожидаемо низким содержанием нуклеиновой кислоты, чтобы минимизировать потери образца, следует использовать изделия и принадлежности из специализированного лабораторного пластика, например «низкоадсорбирующего пластика» для снижения связывания нуклеиновых кислот.

Примечание — Некоторые материалы для изготовления пробирок связывают нуклеиновые кислоты. Полиалломерные пробирки в качестве емкости для реагентов поглощают меньше ДНК по сравнению с обычными полипропиленовыми пробирками для микроцентрифуги, которые сорбируют до 100 нг ДНК. Средство, такое как 0,02 %-ный полиэтиленгликоль монолаурат, на каждой стадии реакции снижает адсорбцию ДНК на стенках пробирок [30].

При применении мультиплексного молекулярного теста для обнаружения или количественной оценки мишеней нуклеиновых кислот к потере определенных мишеней нуклеиновых кислот и, как следствие, к ложноотрицательным результатам тестирования может привести снижение эффективности экстракции. Необходимо позаботиться о том, чтобы обеспечить воспроизводимую эффективность экстракции для всех мишеней нуклеиновых кислот, подлежащих тестированию в мультиплексных анализах.

Потенциальное загрязнение нуклеиновых кислот ингибиторами также может привести к ложноотрицательному результату в мультиплексных анализах. Для предотвращения этого явления необходимо эффективно удалять ингибиторы.

Примечание — При агрессивном разрушении клеточных стенок или тканей организма с помощью стеклянных шариков нуклеиновые кислоты имеют тенденцию к фрагментации.

  • 5.2.4 Метод оценки качества

Для оценки качества нуклеиновых кислот существует несколько методов, таких как спектры поглощения для определения количества, отношение поглощения от 260 (А260) до 280 нм (А280) для оценки чистоты и гель-электрофорез для оценки длины или целостности фрагмента [31]. Эти значения, однако, не являются надлежащим показателем качества образца для мультиплексных молекулярных тестов, например соотношение А260/А280 при оценке фрагментов для секвенирования.

Примечание — Во всех протоколах подготовки образцов для массивного параллельного секвенирования исходным материалом является ДНК, например, в виде изолированной геномной ДНК и/или комплементарной ДНК (кДНК), полученной в ходе обратной транскрипции, или иммунопреципитированного хроматина. Для преобразования материала в секвенируемую библиотеку исходную ДНК фрагментируют, фрагменты сортируют по размеру и к фрагментам определенной длины в соответствии с используемым протоколом секвенирования лигируют адаптеры. Определение концентрации ДНК и качества фрагментов для секвенирования с помощью соотношения А260/А280 (например, 2,00) не подходит в качестве показателя чистоты подготовленного образца, так как оставшиеся праймеры, свободные нуклеотиды и фрагменты с неверно лигированными адаптерами неотличимы от желаемых, продуктивных фрагментов. Вместо этого для специфического измерения двухцепочечной ДНК необходимы другие методы, такие как использование интеркалирующего флуоресцентного красителя.

Соотношение А260/280 может дать важную информацию. Если соотношение А260/280 выходит за пределы диапазона, указанного аналитическим испытанием (выброс)7), образец следует удалить. Например, значение < 1,60 может быть весомым признаком того, что в этом образце присутствуют потенциально мешающие соединения, такие как белок, фенол, гуанидин или другие реагенты. Соотношение 260/280 также может быть полезно для определения чистоты продукта ПЦР после очистки для удаления избыточных праймеров/ssD/VA и т. д.

Примечание — Значение А260 также используется для измерения выхода суммарной нуклеиновой кислоты. Это может быть использовано для определения загрязнения геномной ДНК, когда это значение неожиданно велико. Например, когда вирионы ВИЧ измеряют в образцах плазмы крови, высокое значение А260 может быть индикатором загрязнения геномной ДНК из лейкоцитов.

Прямые методы оценки состояния фрагментации ДНК включают прямое подтверждение путем электрофореза, оценку ПЦР-амплификации фрагментов ДНК известной длины [например, внутренний контроль (ген Р-глобина или рецептора витамина D) или внесение референсного материала] или оценку реакции амплификации с использованием delta Cq (количественное определение цикла, также известного как пороговый цикл, значение Ct в количественной ПЦР в реальном времени).

Длина фрагментов для секвенирования может быть оценена по разделению фрагментов разного размера при капиллярном электрофорезе или с помощью набора клонированных и секвенированных по Сэнгеру фрагментов.

Для оценки фрагментации РНК методы включают прямое измерение конформации РНК с помощью электрофореза в агарозном геле в денатурирующих условиях. Кроме того, целостность экстрагированной РНК может быть оценена по экспрессии рРНК и генов внутреннего контроля, включая гликоральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GAPDH) или бета-актин. При использовании этих генов для нормализации они должны быть валидированы, чтобы убедиться, что они подходят для конкретного теста. Для оценки качества РНК доступны значения RIN или RIS и/или отношение 185-единицы к 288-единице рРНК, полученной в результате электрофореза.

Примечание — Анализ показателей качества, алгоритм RIN и рРНК, не всегда является точным индикатором естественной деградации мРНК, особенно в образцах FFPE. Для РНК из FFPE использование парафинового алгоритма метрики РНК (PERM), основанного на формуле, аппроксимирующей взвешенный анализ площади под кривой электроферограммы извлеченной РНК, считается лучше, чем RIN [34].

Примечание — Целью секвенирования РНК является определение содержания РНК в образце количественно. Секвенирование РНК достигается путем выделения интересующей РНК фракции (или селективного удаления незначимых фракций), превращения в двухцепочечную кДНК и использования в реакциях секвенирования.

Использование внутреннего контроля, присутствующего на всех этапах экстракции, амплификации и детекции, может быть необходимо для оценки качества нуклеиновых кислот, эффектов ингибиторов и эффективности методов экстракции. Внутренний контроль может быть разработан специально для обнаружения каждой интересующей цели. Мультиплексные молекулярные тесты с таким внутренним контролем могут быть использованы для оценки количества определенных шаблонов в образце, для идентификации патогена, генотипирования или мультиплексного анализа мутаций.

Приложение А (справочное)

Оценка целостности РНК

Методы оценки целостности РНК с использованием формата капиллярного электрофореза включают число целостности РНК, RIN, и оценку целостности РНК, RIS [2], [31], [32]. RIN получают электрофорезом и используют для оценки интактности РНК, показывая детальную картину распределения фрагментов РНК по размерам [2], [35]. Разработан программный алгоритм, способный оценивать качество РНК лучше, чем рибосомные соотношения. Для электрофореза широко используют автоматические системы в сочетании с микрофлюидными чипами, индуцированным напряжением, разделением размеров и с детекцией флуоресценции. Молекулы РНК окрашивают интеркалирующим красителем и обнаруживают с помощью вышеуказанной автоматической системы. Данные RIN также анализируют по электроферограммам в системе. На электроферограммах и геле деградация рРНК отражается сдвигом в сторону более коротких фрагментов. RIN образца назначается в диапазоне от 10 (интактный) до 1 (полностью деградированный). Еще одним способом определения целостности РНК является расчет RIS с помощью системы QIAxcel (Qiagen) с использованием капиллярного электрофореза высокого разрешения и программного алгоритма, отличного от RIN.

Приложение В (справочное)

Оценка целостности ДНК

Алгоритм DNA Integrity Number (DIN) был разработан для того, чтобы обеспечить объективный и стандартизированный инструмент для надежной оценки целостности ДНК. DIN определяет фрагментацию образца геномной ДНК путем оценки распределения сигнала по всему диапазону размеров и применяет автоматически рассчитанное число. Для обеспечения численной оценки образцы сортируют в соответствии с их распределением сигнала по шкале DIN от 1 до 10. Высокий DIN указывает на высокоинтактную дДНК, а низкий DIN — на сильно деградированный образец дДНК [2], [36].

Приложение С (справочное)

Использование ПЦР для оценки амплифицируемой ДНК из образцов FFPE

ДНК, извлеченная из фиксированных формалином тканей, фрагментирована и содержит повреждения, которые являются источниками артефактов ее последовательности. В частности, обширная фрагментация значительно уменьшает количество матриц, доступных для ПЦР-амплификации. Второй серьезной проблемой, связанной с ДНК FFPE, является появление артефактов последовательности, то есть видимых изменений последовательности, которых нет в исходном образце.

Фрагментация — распространенная форма повреждения ДНК, обнаруживаемая в тканях, фиксированных формалином. Было показано, что фрагментация ДНК в фиксированных формалином тканях растет с увеличением времени хранения и снижением pH формалина, используемого для фиксации тканей [37]. Таким образом, одно и то же количество ДНК FFPE из разных образцов может содержать существенно различающееся количество ампли-фицируемых матриц в зависимости от степени повреждения.

Индуцированные формальдегидом сшивки ДНК снижают стабильность двухцепочечной ДНК, что приводит к частичной денатурации ДНК. Формальдегид легко окисляется до муравьиной кислоты в реакции с кислородом воздуха. Образование муравьиной кислоты снижает pH формалина. Таким образом, для поддержания нейтрального уровня pH в формалин следует добавить буферный раствор. /V-гликозидные связи пуриновых оснований и сахаров подвержены гидролизу при низком pH, что способствует образованию лишенных оснований (abasic) участков ДНК.

Среди артефактов последовательности, обнаруженных в ДНК FFPE, переходные варианты C:G > ТА являются наиболее частым типом однонуклеотидной вариации SNV. Артефакты последовательности чаще обнаруживают при тестировании ДНК FFPE с низким количеством копий, как правило, при использовании протоколов на основе амплификации. Варианты артефактов C:G > Т:А могут быть заметно снижены после обработки ДНК в парафине УДГ перед ПЦР-амплификацией, что свидетельствует о повреждении урацила как одного из основных источников артефактов C:G > ТА вариантов в ДНК в парафине. Высокий уровень артефактов C:G > Т:А SNVs, найденных в сайтах метилирования CpG ДНК из парафина, убедительно указывает на дезаминирование оснований 5-метилци-стозина.

Качество ДНК FFPE для ДНК-анализа может быть оценено с помощью ПЦР-реакции с наборами праймеров, которые производят короткие и длинные фрагменты (100, 200, 300 и 400 пар нуклеотид) из неперекрывающихся целевых сайтов в конкретном гене, таком как GAPDH. Образцы могут быть классифицированы на основе наибольшего из возможных обнаруженных продуктов ПЦР, а именно 100, 200, 300 и 400 пар нуклеотид.

Минимизация артефактов последовательности имеет решающее значение для точного обнаружения активных мутаций в фиксированных формалином тканях. Предлагаемые стратегии минимизации артефактов последовательности обобщены в таблице С.1 [38].

Таблица С.1 — Стратегии минимизации артефактов последовательностей ДНК FFPE

Шаг

Стратегия

Выделение ДНК

Оценка чистоты опухоли и выявление патологоанатомом участков, обогащенных опухолью.

Макродиссекция или вырезание сердцевины из обогащенных опухолью участков.

Использование достаточного количества ткани, когда это возможно, чтобы гарантировать выделение достаточного количества ДНК для последующего молекулярного тестирования.

Термическая обработка для удаления индуцированных формальдегидом сшивок и облегчения последующего переваривания тканей протеиназой.

Расширенная обработка протеиназой К для переваривания тканей и удаления белков, сшитых с ДНК

Оценка ДНК

Оценка количества двухцепочечной ДНК с помощью флуориметрии.

Количественная оценка амплифицируемых шаблонов с использованием количественной qPHK или цифровой ПЦР, особенно для массивного параллельного секвенирования. Используют размеры ампликонов, соответствующие среднему размеру ампликонов в анализе секвенированием

Окончание таблицы С. 1

Шаг

Стратегия

Подготовка библиотеки образцов

Удаление урацила in vitro перед ПЦР-амплификацией ДНК FFPE.

Использование анализов, генерирующих короткие ампликоны, для увеличения количества матриц для ПЦР.

Обогащение цели на основе захвата таргетной ДНК, узнаваемой по уникальным последовательностям начальных и конечных сайтов.

Использование праймеров, специфичных для каждой нити ДНК-матрицы, в подходе обогащения мишеней на основе амплификации.

Молекулярная маркировка ДНК-матриц для идентификации артефактов последовательности

ПЦР-амплификация

Использование специфических ДНК-полимераз (например, Pfu и КАРА), которые имеют низкую эффективность обхода повреждений ДНК, таких как урацил и участки, лишенные оснований.

Использование высокоточной ДНК-полимеразы для уменьшения ошибок полимеразы

Валидация вариантов последовательностей из МП на основе ампликона

Запуск каждого теста в двух повторностях для использования отдельных пулов матриц. Применение ортогональных (статистически независимых) методов для клинически значимых мутаций

Приложение D (справочное)

Образец микроРНК

Качество образцов РНК для анализа микроРНК можно оценить по концентрации, измеренной на спектрофотометре, и по чистоте, проанализированной электрофорезом.

Целостность РНК может быть проанализирована в соответствии с приложением А в качестве дополнительной оценки качества. В целом количество микроРНК невелико; например, РНК примерно 1 нг или менее получают из 300 см3 (мл) плазмы крови или сыворотки [39], [40]. Целостность согласно приложению А не применяют к показателю для представления качества образца РНК, извлеченного из плазмы крови, поскольку он не содержит рРНК. В частности, использование сыворотки в качестве материала для малой экстракции РНК приведет к малому профилю РНК, который сильно отличается от профиля пациента, так как активация тромбоцитов во время свертывания крови индуцирует процессы, значительно изменяющие профиль.

Процесс оценки качества необходим из-за значительной чувствительности образцов микроРНК к РНКазе, которую трудно инактивировать. Процесс оценки качества перед измерением помогает обеспечить надежность результатов измерений, поскольку даже малейших количеств РНКазы достаточно для деградации образца.

Приложение ДА (справочное)

Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов национальным стандартам

Таблица ДА.1

Обозначение ссылочного международного стандарта

Степень соответствия

Обозначение и наименование соответствующего национального стандарта

ISO 15189:2012

IDT

ГОСТ Р ИСО 15189—2015 «Лаборатории медицинские.

Частные требования к качеству и компетентности»

Примечание — В настоящей таблице использовано следующее условное обозначение степени соответствия стандарта:

- IDT — идентичный стандарт.

Библиография

  • [1] ISO 22174:2005, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR)forthe detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions [Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для обнаружения пищевых патогенов. Общие требования и определения]

  • [2] ISO 20395:2019, Biotechnology — Requirements for evaluating the performance of quantification methods for nucleic acid target sequences — qPCR and dPCR (Биотехнология. Требования к оценке эффективности методов количественной оценки целевых последовательностей нуклеиновых кислот — qPCR и dPCR)

  • [3] ISO/TS 20658, Medical laboratories — Requirementsfor collection, transport, receipt, and handling of samples (Медицинские лаборатории. Требования к сбору, транспортировке, приему и обработке образцов)

  • [4] Japanese Committee for Clinical Laboratory Standards. An Approved Guideline for the Quality Management of Specimens for Molecular Methods: The Procurement, Transport, and Preparation of Specimens. 2012. http://jccls. org/english/preview.html

  • [5] Japanese Committee for Clinical Laboratory Standards. An Approved Guideline for the Quality Management of Specimens for Molecular Methods (Part 2) New Technologies and Sample Quality Control. 2017. http://jccls.org/ english/preview.html

  • [6] ISO 20166, Molecular in vitro diagnostic examinations — Specifications for pre-examination processes for formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissue [Молекулярные диагностические исследования in vitro. Требования к процессам преаналитического этапа исследования зафиксированных в формалине и залитых парафином образцов тканей (FFPE)]

  • [7] ISO 20184, Molecular in vitro diagnostic examinations — Specifications for pre-examination processes for frozen tissue (Молекулярные диагностические исследования in vitro. Технические условия на процессы предварительного исследования замороженной ткани)

  • [8] ISO 20186, Molecular in vitro diagnostic examinations — Specifications for pre-examination processes for venous whole blood (Молекулярные диагностические исследования in vitro. Технические условия для предварительных исследований венозной цельной крови)

  • [9] ISO 3534-1, Statistics — Vocabulary and symbols — Part 1: General statistical terms and terms used in probability (Статистика. Словарь и символы. Часть 1. Общие статистические термины и термины, используемые в теории вероятностей)

  • [10] ISO/IEC Guide 99:2007 (Руководство ИСО/МЭК 99: 2007)

  • [11] ISO 17511:2020, In vitro diagnostic medical devices — Requirements for establishing metrological traceability of values assigned to calibrators, trueness control materials and human samples (Медицинские изделия для in vitro диагностики. Требования к установлению метрологической прослеживаемости значений, присвоенных калибраторам, материалам контроля истинности и образцам человека)

  • [12] ISO 18113-1, In vitro diagnostic medical devices — Information supplied by the manufacturer (labelling) — Part 1: Terms, definitions and general requirements [Медицинские изделия для in vitro диагностики. Информация, предоставленная изготовителем (маркировка). Часть 1. Термины, определения и общие требования]

  • [13] ISO 16578:2013, Molecular biomarker analysis — General definitions and requirements for microarray detection of specific nucleic acid sequences (Молекулярный анализ биомаркеров. Общие определения и требования к обнаружению специфических последовательностей нуклеиновых кислот с помощью микрочипов)

  • [14] ISO/IEC 17043, Conformity assessment — General requirements for proficiency testing (Оценка соответствия. Основные требования к проведению проверки квалификации)

  • [15] 21CFR CFR — Code of Federal Regulations Title 21: In vitro diagnostic products for the for human use 809.3 2018

  • [16] CLSI Quality System Regulations for Laboratory Developed Tests: A Practical Guide for the Laboratory, CLSI document QSRLDT. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2015

  • [17] CLSI Nucleic Acid Sequencing Methods in Diagnostic Laboratory Medicine Approved Guideline — Second Edition. CLSI document MM09-A2. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2014

  • [18] ISO 16577:2016, Molecular biomarker analysis — Terms and definitions (Молекулярный анализ биомаркеров. Термины и определения)

  • [19] ISO 24276:2006/Amd.1:2013, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — General requirements and definitions/ — Amendment 1 (Пищевые продукты. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Общие требования и определения. Поправка 1)

  • [20] 42 CFR CFR — Code of Federal Regulations Title 42: Establishment and verification of performance specifications. 494. 1253; 2018

  • [21] ISO 15714:2019, Method of evaluating the UV dose to airborne microorganisms transiting in-duct ultraviolet germicidal irradiation devices (Метод оценки УФ-дозы для воздушно-капельных микроорганизмов, проходящих через внутрипроводные устройства ультрафиолетового бактерицидного облучения)

  • [22] ISO 23833:2013, Microbeam analysis — Electron probe microanalysis (EPMA) — Vocabulary [Микропучковый анализ. Электронно-зондовый микроанализ (ЕРМА). Словарь]

  • [23] ISO 9000:2015, Quality management systems — Fundamentals and vocabulary (Системы менеджмента качества. Основные положения и словарь)

  • [24] CLSI, Verification and Validation of Multiplex Nucleic Acid assays, and Edition; CLSI guideline MM17. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2018

  • [25] ISO 20837:2006, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR)forthe detection of food-borne pathogens — Requirements for sample preparation for qualitative detection [Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для обнаружения патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах. Требования к подготовке образцов для качественного обнаружения]

  • [26] Matsuda Y, Fujii Т, Suzuki Т, Yamahatsu К, Kawahara К, Teduka К, Kawamoto Y, Yamamoto T, Ishiwata T, Naito Z, Comparison of fixation methods for preservation of morphology, RNAs, and proteins from paraffin-embedded human cancer cell-implanted mouse models. J Histochem Cytochem. 59(1), 2011, pp. 68—75

  • [27] Srinivasan M, Sedmak D, Jewell S, Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 161,2002, pp. 1961—71

  • [28] Shabihkhani M, Lucey GM, Wei B, Mareninov S, Lou JJ, Vinters HV, Singer EJ, Cloughesy TF, Yong WH, The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings. Clin Biochem., 47(4-5), 2014, pp. 258—66

  • [29] Linnarsson S., Recent advances in DNA sequencing methods — General principles of sample preparation. Exp Cell Res., 316(8), 2010, pp. 1339—43

  • [30] Compton CC, Robb JA, Anderson MW, Berry AB, Birdsong GG, Bloom KJ, Branton PA, Crothers JW, Cushman-Vokoun AM, Hicks DG, Khoury JD, Laser J, Marshall CB, Misialek MJ, Natale KE, Nowak JA, Olson D, Pfeifer JD, Schade A, Vance GH, Walk EE, Yohe SL, Preanalytics and Precision Pathology: Pathology Practices to Ensure Molecular Integrity of Cancer Patient Biospecimens for Precision Medicine. Arch Pathol Lab Med. 2019 Nov; 143(11): 1346-1363

  • [31] Schroeder A, Mueller O, Stocker S, Salowsky R, Leiber M, Gassmann M, Lightfoot S, Menzel W, Granzow M, Ragg T, The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 2006 Jan 31; 7:3

  • [32] Kanani P, Shukla Y.M., Modi A.R., Subhash N., KumarS., Standardization of an efficient protocol for isolation of RNA from Cuminum cyminum. Journal of King Saud University — 31(4), 2019, 1202—1207

  • [33] Vermeulen J, De Preter K, Lefever S, Nuytens J, De Vloed F, Derveaux S, Hellemans J, Speleman F, Vandesompele J., Measurable impact of RNA quality on gene expression results from quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 2011 May; 39(9):e63. doi: 10.1093/nar/gkr065

  • [34] Chung JY, Cho H, Hewitt SM, The paraffin-embedded RNA metric (PERM) for RNA isolated from formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Biotechniques. 2016; 60(5) :239—44

  • [35] Integrity Number R.N.A. (RIN) — Standardization of RNA Quality Control https://www.agilent .com/cs/library/ applications/5989—1165EN.pdf

  • [36] Integrity Number D.N.A. (DIN) with the Agilent 2200 TapeStation System and the Agilent Genomic DNA ScreenTape Assay, https://www.agilent.com © ISO 2020 —All rights reserved 21

  • [37] Groelz D, Viertler С., Pabst D., Dettmann D, Zatloukal K., Impact of storage conditions on the quality of nucleic acids in paraffin embedded tissues. PLoS One. 2018; 13(9): e0203608

  • [38] Do H, Dobrovic A., Sequence artifacts in DNAfrom formalin-fixed tissues: causes and strategies for minimization. Clin Chern. 2015, 61 (1 ):64—71

  • [39] Kosaka N., Yoshioka Y., Hagiwara K.,Tominaga N., OchiyaT.(2013), Circulating MicroRNAs: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology vol. 1024, pp. 1—9

  • [40] Ichikawa M., Akiyama H.(2013), Circulating MicroRNAs: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology vol. 1024, pp. 247—253

УДК 57.085.2:006.354

ОКС 11.100.10


Ключевые слова: медицинские изделия для диагностики IVD, терминология, мультиплексные молекулярные методы, оценка качества нуклеиновых кислот

Редактор Л.В. Каретникова Технический редактор В.Н. Прусакова Корректор Л. С. Лысенко Компьютерная верстка Е.А. Кондрашовой

Сдано в набор 01.11.2021. Подписано в печать 01.12.2021. Формат 60x847s. Гарнитура Ариал. Усл. печ. л. 3,26. Уч.-изд. л. 2,64.

Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта

Создано в единичном исполнении в ФГБУ «РСТ» , 117418 Москва, Нахимовский пр-т, д. 31, к. 2.

1

) В Российской Федерации наряду с данным термином применим термин «межлабораторные сравнительные испытания».

2

) В ГОСТ Р ИСО 18113-1—2015 «Медицинские изделия для диагностики in vitro. Информация, предоставляемая изготовителем (маркировка). Часть 1. Термины, определения и общие требования» используется термин с определением: «медицинское изделие для диагностики in vitro (МИ IVD): Медицинское изделие, предназначенное изготовителем для применения при исследованиях in vitro образцов, взятых из тела человека единственно или главным образом для получения информации, которая может быть использована для целей диагностики, мониторинга или совместимости, включающее в себя реагенты, калибраторы, контрольные материалы, емкости для сбора и хранения проб и относящиеся к ним инструменты или приборы или другие предметы».

3

) В Российской Федерации применение незарегистрированных медицинских изделий для клинического применения запрещено.

4

) В Российской Федерации для характеристики биологических жидкостей используют термин «первичная проба (проба)», для характеристики биологических тканей — термин «образец (часть образца)».

5

) В ГОСТ Р ИСО 20166-1—2021 «Молекулярные диагностические исследования in vitro. Требования к процессам преаналитического этапа исследования зафиксированных формалином тканей в парафиновых блоках (FFPE). Часть 1. Выделенная РНК» приведены определения терминов «холодовая ишемия (экстракорпоральное хранение)» и «тепловая ишемия (интракорпоральная ишемия)».

6

) Источник — состояние образца до начала проведения исследования (заморожен, помещен в парафин и т. д.).

7

) Выброс — результат измерения, существенно отличающийся от других значений выборки (см. ГОСТ Р ИСО 16269-4—2017 «Статистические методы. Статистическое представление данных. Часть 4. Выявление и обработка выбросов»).