ГОСТ 34899-2022 Методы испытаний по воздействию химической продукции на организм человека. Сенсибилизация кожи in chemico. Методы, основанные на ключевых событиях пути неблагоприятного исхода при ковалентном связывании с белками

        ГОСТ 34899-2022

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЙ ПО ВОЗДЕЙСТВИЮ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ НА ОРГАНИЗМ ЧЕЛОВЕКА

Сенсибилизация кожи in chemico. Методы, основанные на ключевых событиях пути неблагоприятного исхода при ковалентном связывании с белками

Methods for studying the effects of chemicals on the human body In Chemico Skin Sensitisation. Methods based on key events in the pathway of adverse outcomes in covalent binding to proteins

МКС 71.040.10;

13.020.01

Дата введения 2024-05-01

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены".

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН республиканским унитарным предприятием "Белорусский государственный институт метрологии" (БелГИМ) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 сентября 2022 г. N 154-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 16 ноября 2023 г. N 1411-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34899-2022 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 мая 2024 г.

Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному документу OECD 442с:2021* "Руководство по тестированию химической продукции. Сенсибилизация кожи in chemico. Методы, направленные на ключевое событие пути неблагоприятного исхода при ковалентном связывании с белками" ("OECD Guidelines for the testing of chemicals - Key event-based test guideline for in chemico skin sensitisation assays addressing the adverse outcome pathway key event on covalent binding to proteins, MOD) путем изменения его структуры для приведения в соответствие с правилами, установленными в ГОСТ 1.5 (подразделы 4.2 и 4.3).

5 Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного документа для увязки с наименованиями, принятыми в существующем комплексе межгосударственных стандартов.

Международный документ разработан Международной организацией экономического сотрудничества и развития (OECD).

Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой указанного международного документа приведено в дополнительном приложении ДА.

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.

В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"

Введение

Руководство по проведению испытаний на основе ключевых событий при ковалентном связывании с белками

Под веществом, способным вызывать сенсибилизацию кожи, в соответствии с положениями Согласованной на Глобальном уровне Системы классификации и маркировки химической продукции Организации Объединенных Наций (СГС ООН) [1], принято понимать вещество, воздействие которого при его повторном контакте с кожей может приводить к развитию аллергической реакции. Существует соглашение относительно ключевых биологических событий, лежащих в основе появления сенсибилизации кожи. Совокупность имеющихся знаний о химических и биологических процессах, связанных с сенсибилизацией кожи, в обобщенном виде представлена как описание соответствующего пути неблагоприятного исхода (Adverse Outcome Pathway - АОР) [2], начинающегося с исходного молекулярного события, включающего ряд промежуточных событий, и заканчивающегося неблагоприятным исходом, а именно появлением признаков аллергического контактного дерматита. Данный АОР фокусирует внимание на такой химической продукции, которая реагирует с аминокислотными остатками (т.е. цистеином или лизином), например органической. В данном случае в роли исходного молекулярного события (т.е. первого ключевого события) выступает реакция ковалентного связывания электрофильных веществ с нуклеофильными центрами белков кожи. Второе ключевое событие в данном АОР развивается в кератиноцитах и включает как воспалительный ответ, так и изменения в экспрессии генов, связанных со специфическими путями передачи сигналов клеток, такими как пути, зависящие от элемента антиоксидантного/электрофильного ответа (antioxidant/electrophile response element - ARE). Третьим ключевым событием является активация дендритных клеток, и обычно она оценивается по экспрессии специфических поверхностных клеточных маркеров, хемокинов и цитокинов. Четвертое ключевое событие - это пролиферация Т-клеток.

Оценивание сенсибилизации кожи обычно проводится с использованием лабораторных животных. Классические методы исследований с использованием подопытных морских свинок, максимизационная сенсибилизирующая проба на морских свинках (Guinea Pig Maximisation Test - GPMT) Магнуссона и Клигмана либо тест Бюлера [11] позволяют оценить как фазу индукции, так и контрольную фазу исследования сенсибилизации кожи. Методы исследований с использованием мышей, такие как LLNA [12] и три его модификации, для которых не требуется применение радиоактивных веществ - LLNA:DA [13], LLNA:BrdU-ELISA и BrdU-FCM [14], оценивают только индукционный ответ и поэтому заслужили признание по сравнению с испытаниями на морских свинках с точки зрения меньшего нанесения вреда животным в сочетании с возможностью получения объективных данных измерений, иллюстрирующих течение фазы индукции для сенсибилизации кожи.

Методы исследований in chemico и in vitro, основанные на механизмах, касающихся первых трех ключевых событий АОР для сенсибилизации кожи, были приняты с целью содействия оценке потенциала опасности химической продукции для сенсибилизации кожи: настоящий метод исследования обеспечивает получение требуемой оценки исходя из данных о ковалентном связывании с белками, что соответствует первому ключевому событию; в центре внимания [15] находится процесс активации кератиноцитов [15], т.е. второе ключевое событие, а [16] в свою очередь рассказывает об активации дендритных клеток [16], третьем ключевом событии АОР для сенсибилизации кожи. Четвертое ключевое событие заключается в пролиферации Т-клеток, оценивается косвенным образом - по методу изучения реакции регионарных лимфатических узлов (Local Lymph Node Assay - LLNA), с использованием подопытных мышей [12].

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает методы испытаний in chemico, направленные на изучение механизмов, действием которых обусловлено первое ключевое событие АОР для кожной сенсибилизации, а именно ковалентное связывание с белками [2].

2 Термины, определения и сокращения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

2.1 вещество (substance): Химические элементы и их соединения, представленные в естественном состоянии или полученные при выполнении производственного процесса, включая любые добавки, необходимые для сохранения стабильности продукта, а также любые примеси, наличие которых обусловлено применяемым процессом, но исключая любые растворители, удаление которых не сказывается на стабильности вещества или на его составе [25].

2.2 воспроизводимость (reproducibility): Согласованность результатов, получаемых при повторном испытании одного и того же вещества с применением одного и того же протокола (см. "Надежность") [24].

2.3 вычисления (calculating)

Вычисление деплеции (обеднения) NAC или NAL

Деплецию (обеднение) вычисляют следующим образом:

Вычисление достоверности прогнозирования

Значения чувствительности, специфичности и точности метода вычисляют исходя из имеющегося количества истинноположительных (true positive - TP), истинноотрицательных (true negative - TN), ложноотрицательных (false negative - FN) и ложноположительных (false positive - FP) результатов.

2.4 градуировочная кривая (calibration curve): Отношение между экспериментальным значением отклика и аналитической концентрацией (также называемой стандартной кривой) известного вещества.

2.5 достоверный метод исследования (valid test method): Метод исследования, признаваемый в достаточной степени релевантным и надежным для применения в конкретной области и базирующийся на научно обоснованных принципах. Ни один метод исследования не является достоверным в абсолютном смысле и может рассматриваться как таковой только для ограниченной области применения [24].

2.6 интегрированный подход к испытаниям и оценке; IATA (Integrated Approach on Testing and Assessment): Структурированный подход, служащий для определения степени опасности (потенциала), описания характера опасности (способности) и/или оценивания безопасности (в зависимости от потенциала/способности и экспозиции) химической продукции или групп химической продукции, который заключается в стратегическом интегрировании и взвешивании всех значимых данных для обобщения информации с целью принятия решения нормативного характера о потенциальной опасности, рисках и необходимости проведения дальнейших целенаправленных и, соответственно, минимально достаточных по объему испытаний.

2.7 исследуемая химическая продукция (test chemical): Химическая продукция (вещества или смеси), которая подвергается испытаниям.

2.8 исходное молекулярное событие (molecular initiating event): Вызванное воздействием химического вещества нарушение в биологической системе, наблюдаемое на молекулярном уровне и определяемое как исходное событие в пути неблагоприятного исхода.

2.9 контрольная проба (reference control): Ничем не обработанная проба, включающая в себя все составляющие испытательной системы, содержащая растворитель или вещество-носитель и используемая наряду с пробами, содержащими исследуемое химическое вещество, и другими контрольными пробами для определения базового отклика для образцов, обработанных исследуемым химическим веществом, разведенным в том же растворителе или веществе-носителе. При параллельном использовании с отрицательной контрольной пробой также позволяет выяснить, взаимодействует ли растворитель или вещество-носитель с испытательной системой.

2.10 коэффициент вариации (coefficient of variation): Мера изменчивости, рассчитываемая для группы данных, характеризующих параллельно обрабатываемые пробы, путем деления значения стандартного отклонения на среднее значение. Значение данного коэффициента может быть выражено в процентах при умножении на 100.

2.12 надежность (reliability): Показатель того, что метод испытаний может быть реализован с получением воспроизводимых результатов в рамках одной или различных лабораторий в течение продолжительного времени при применении одного и того же протокола. Он оценивается путем вычисления внутри- и межлабораторной воспроизводимости и внутрилабораторной повторяемости [24].

2.13 однокомпонентное вещество (mono-constituent substance): Вещество, характеризуемое количественным составом, в котором одна основная структурная составляющая содержится в количестве не менее чем 80% (по массе).

2.14 опасность (hazard): Изначально присущее свойство конкретной химической продукции или ситуации, заключающееся в их потенциальной способности вызывать деструктивные последствия в случаях, когда организм, система или субпопуляция подвергаются их воздействию.

2.15 положительная контрольная проба (positive control): Используемая параллельно проба, содержащая все компоненты испытательной системы и обрабатываемая с использованием вещества, заведомо дающего положительный отклик. Чтобы обеспечить возможность учитывать изменчивость во времени ответа, получаемого для данной пробы, этот положительный отклик не должен быть слишком завышенным.

2.16 прегаптены (pre-haptens): Химическая продукция, приобретающая сенсибилизирующие свойства в результате абиотической трансформации.

2.17 пригодность системы (system suitability): Заключение о рабочих характеристиках прибора (например, чувствительности) по результатам анализа стандартного раствора, выполняемого до начала испытания аналитической партии [26].

2.18 прогаптены (pro-haptens): Химическая продукция, требующая ферментной активации для реализации своего сенсибилизирующего потенциала при воздействии на кожу.

2.19 путь неблагоприятного исхода (Adverse Outcome Pathway - АОР): последовательность событий, начиная с особенностей химической структуры, характерных для целевого химического вещества или группы однотипных химических веществ, включая исходное молекулярное событие и заканчивая неблагоприятным исходом, который можно наблюдать in vivo [2].

2.20 релевантность (relevance): Характеристика соответствия метода испытаний результату, полученному при исследованиях, а также его обоснованности и пригодности для определенных целей применения. Данная характеристика указывает пределы, в которых метод испытаний позволяет правильно измерить или спрогнозировать исследуемый биологический эффект. Релевантность включает рассмотрение точности (соответствия) метода испытаний [24].

2.21 смесь (mixture): Смесь или раствор, состоящие из двух или более веществ, в которых они не вступают в реакцию друг с другом [25].

2.22 Согласованная на Глобальном уровне Система классификации и маркировки химической продукции (ООН); СГС (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (UN); GHS): Система, предусматривающая классификацию химической продукции (веществ и смесей) в зависимости от характерных видов и уровней физической опасности, опасности для здоровья человека или опасности для окружающей среды, с применением соответствующих средств информирования, таких как пиктограммы, сигнальные слова, краткая характеристика опасности, меры по предупреждению опасности и паспорта безопасности, чтобы обеспечить информацией о ее негативном воздействии с целью защиты людей (в том числе сотрудников, работников, перевозчиков, потребителей и представителей аварийных служб) и окружающей среды [25].

2.23 специфичность (specificity): Доля всей дающей отрицательный результат/неактивной химической продукции, которая была правильно классифицирована с применением соответствующего метода испытаний. Этот показатель является мерой точности для метода испытаний, позволяющего получать однозначные результаты, и служит важной отправной точкой при оценке релевантности такого метода [24]. Формула, применяемая для определения специфичности, приведена в 2.18 (см. "Расчет достоверности прогнозирования").

2.24 точность (accuracy): Близость результата испытаний, полученного с применением соответствующего метода испытаний, к принятому эталонному значению величины. Точность является показателем результативности метода и одним из аспектов релевантности. Данный термин часто применяется как взаимозаменяемый для термина "согласованность" (concordance) для указания доли корректных результатов, полученных с применением соответствующего метода испытаний [23]. Формула, применяемая для определения точности, приведена в 2.18 (см. "Расчет достоверности прогнозирования").

2.25 установленный подход (Defined Approach - DA): Фиксированный порядок интерпретации данных (например, статистических, математических моделей), применяемый к данным (например, предварительным прогнозам in silico, данным in chemico или in vitro), которые были получены с использованием определенного перечня источников информации с целью прогнозирования.

2.26 чувствительность (sensitivity): Доля всей дающей положительный результат/активной химической продукции, которая была правильно классифицирована с применением соответствующего метода испытаний. Этот показатель является мерой точности для методов испытаний, позволяющих получать однозначные результаты, и служит важной отправной точкой при оценке релевантности таких методов [24]. Формула, применяемая для определения чувствительности, приведена в 2.18 (см. "Расчет достоверности прогнозирования").

2.27 ЭДТА (EDTA): Этилендиаминтетрауксусная кислота.

2.28 ADRA (Amino acid Derivative Reactivity Assay): Анализ реакционной способности производных аминокислот.

2.29 DPRA (Direct Peptide Reactivity Assay): Прямой анализ реакционной способности пептидов.

2.30 kDPRA (kinetic Direct Peptide Reactivity Assay): Кинетический прямой анализ реакционной способности пептидов.

2.32 EURL ECVAM (European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing): Референтная лаборатория Европейского союза по альтернативным методам испытаний на подопытных животных.

2.33 JaCVAM: Японский центр по валидации альтернативных методов.

2.34 LLNA: Метод изучения реакции региональных лимфатических узлов у подопытных мышей; описание метода опубликовано в [12].

2.35 NAC: N-(2-(1-нафтил)ацетил)-L-цистеин [6], [7], [8].

2.37 TFA (Trifluoroacetic acid): Трифторуксусная кислота.

2.38 UVCB (substances of unknown or variable composition, complex reaction products or biological materials): Вещества неизвестного или переменного состава, продукты комплексных реакций или вещества биологического происхождения.

3 Методы

3.1 Обоснование и принципы методов испытаний, представленных в настоящем стандарте по проведению испытаний на основе ключевых событий

3.1.1 В настоящее время к таким методам относятся:

- метод прямого анализа реакционной способности пептидов (Direct Peptide Reactivity Assay - DPRA) (3.2);

- метод анализа реакционной способности производных аминокислот (Amino acid Derivative Reactivity Assay - ADRA) (3.3);

- метод кинетического прямого анализа реакционной способности пептидов (kinetic Direct Peptide Reactivity Assay - kDPRA) (3.4).

3.1.2 Перечисленные методы in chemico основаны на использовании реакции ковалентного связывания с белками и считаются научно обоснованными. Метод DPRA прошел оценку в референтной лаборатории Европейского союза по альтернативным методам испытаний на подопытных животных (European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing - EURL ECVAM) и дальнейшую независимую экспертную оценку в Научно-консультативном комитете EURL ECVAM (ESAC) [3-5]. Для метода ADRA аналогичным образом было проведено валидационное исследование [6-9] с последующим вынесением независимой экспертной оценки [10], координатором которого выступил Японский центр по валидации альтернативных методов (Japanese Center for the Validation of Alternative Methods - JaCVAM). Метод kDPRA был подвергнут валидационному исследованию и представлен к независимой экспертной оценке при участии в качестве координаторов соответствующих заинтересованных предприятий промышленности [17].

3.1.3 Методы исследований, включенные в настоящий стандарт, могут различаться в части содержания процедур, используемых для получения необходимой информации, однако применение любого из них обеспечивает выполнение установленных на национальном уровне требований к результатам испытаний химических веществ на их способность реагировать с белками, чему в значительной степени способствует соблюдение принципа взаимного признания данных.

3.1.4 Корреляция реактивности белка с потенциалом сенсибилизации кожи хорошо известна. [18-20]. Тем не менее, исходя из того, что реакции с белками представляют собой лишь одно из ключевых событий АОР для сенсибилизации кожи [2], [21], сведения, получаемые с помощью методов исследований, разработанных специально для наблюдения за данным ключевым событием, могут оказаться недостаточными в случае их самостоятельного применения для подготовки заключения о наличии или отсутствии у этих веществ способности оказывать сенсибилизирующее воздействие на кожу. Поэтому данные, полученные с помощью методов испытаний, описанных в настоящем стандарте, предлагается рассматривать в рамках Интегрированного подхода к испытаниям и оценке (IATA) вместе с прочей соответствующей дополнительной информацией, полученной в результате применения методов испытаний in vitro, характеризующей иные ключевые события АОР для сенсибилизации кожи, а также информацией, полученной с применением методов, не предусматривающих непосредственного проведения испытаний, таких как компьютерное моделирование in silico или сопоставление по методу аналогий с химической продукцией, обладающей схожими химическими свойствами [21]. Опубликованы примеры использования данных, полученных с применением этих методов в рамках так называемых установленных подходов (Defined Approach - DA), т.е. подходов, стандартизированных как с точки зрения набора используемых источников информации, так и с точки зрения порядка формирования прогнозного заключения [21], которые также могут быть востребованы при выполнении работ в рамках IATA.

3.1.5 Методы исследований DPRA и ADRA, описанные в 3.2 и 3.3, обеспечивают возможность классификации химической продукции, способной (класс опасности 1 согласно СГС ООН) и не способной вызывать сенсибилизацию кожи. При условии, что это не противоречит требованиям действующего законодательства, положительные результаты, полученные с помощью этих методов, могут сами по себе рассматриваться как достаточное основание для отнесения химической продукции к классу опасности 1. В то же время указанные методы не подлежат самостоятельному применению для целей классификации сенсибилизирующей химической продукции в соответствии с подклассами опасности 1A и 1B [22], как предусмотрено СГС ООН [1] для нужд официальных органов, контролирующих эти два необязательных подкласса опасности, а также не могут применяться для целей прогнозирования способности исследуемой химической продукции вызывать сенсибилизацию кожи в процессе принятия решений по оценке необходимых мер безопасности при обращении с этой продукцией.

3.1.6 В свою очередь, метод kDPRA, описанный в 3.4, позволяет достоверно квалифицировать химическую продукцию, способную вызвать сенсибилизацию кожи и подлежащую отнесению к подклассу опасности 1A согласно СГС ООН, и химическую продукцию, не подлежащую отнесению к данному подклассу опасности (т.е. вне подкласса опасности 1A), а именно такую, которая должна классифицироваться как принадлежащая к подклассу опасности 1B или не имеющая класс опасности [1], но при этом не может применяться для целей определения сенсибилизирующей (класс опасности 1) и несенсибилизирующей химической продукции. При условии, что это не противоречит требованиям действующего законодательства, положительные результаты, полученные с помощью метода kDPRA, могут сами по себе рассматриваться как достаточное основание для отнесения химической продукции к подклассу опасности 1А согласно СГС ООН.

3.1.7 Определения соответствующих терминов даны в разделе 2. Разработаны соответствующие стандарты результативности для оценивания предлагаемых идентичных или модифицированных методов исследований для определения сенсибилизации кожи in vitro, в основе которых лежат DPRA и ADRA [23].

3.2 Сенсибилизация кожи in chemico. Прямой анализ реакционной способности в отношении пептидов (DPRA)

3.2.1 Исходные положения, пригодность и ограничения

3.2.1.1 Метод DPRA предназначен для определения исходного молекулярного события АОР для сенсибилизации кожи, а именно реакций с белками, путем количественной оценки реакционной способности исследуемой химической продукции по отношению к модельным синтетическим пептидам, в состав которых входит лизин либо цистеин [27]. В основу метода положен анализ значений показателей деплеции (обеднения) производных цистеина и лизина с целью последующего отнесения исследуемой химической продукции к продукции, способной и не способной вызывать сенсибилизацию кожи [28].

3.2.1.2 Метод DPRA обладает доказанной пригодностью для применения на базе лабораторий, которые уже имеют достаточный опыт проведения аналитических испытаний с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Воспроизводимость прогнозных заключений для данного метода составляет порядка 85% при подготовке их в пределах одной лаборатории и 80% при подготовке заключений различными лабораториями [5]. Результаты, полученные в ходе соответствующего валидационного исследования [29], а также опубликованные данные других исследований [30] в целом указывают, что точность различия сенсибилизирующих (т.е. относящихся к классу опасности 1 согласно СГС ООН) и несенсибилизирующих агентов с помощью метода DPRA составляет 80% (88/109), а специфичность - 77% (37/48) при сравнении их с аналогичными показателями для метода LLNA. Применение метода DPRA с большей вероятностью может приводить к занижению оценки опасности для химической продукции, обладающей низкой или умеренной способностью вызывать сенсибилизацию кожи (т.е. относящейся к подклассу опасности 1В согласно СГС ООН), чем для химической продукции, обладающей высокой способностью вызывать сенсибилизацию кожи (т.е. относящейся к подклассу опасности 1А согласно СГС ООН) [29], [30]. Показатели точности, приведенные выше для DPRA как для самостоятельного метода испытания, являются ориентировочными, поскольку любые результаты, полученные с его помощью, следует рассматривать в сочетании с информацией из других источников в контексте IATA или DA и с учетом 3.1.4 и 3.1.5. При оценке эффективности применения методов определения сенсибилизации кожи, не требующих использования подопытных животных, следует иметь в виду, что применение метода LLNA, а также других методов, которые предполагают проведение испытаний на животных, может не в полной мере раскрывать характер воздействия исследуемой химической продукции на организм целевого биологического вида, представляющего основной интерес для исследователей, т.е. на организм человека. Исходя из имеющихся данных, установлено, что метод DPRA подходит для проведения исследований широкого спектра химической продукции, которая может характеризоваться наличием различных органических функциональных групп, механизмов реакций, различных сенсибилизирующих потенциалов при воздействии на кожу (подтвержденных путем проведения испытаний in vivo), а также различными физико-химическими свойствами [27], [28], [5], [30]. В совокупности эта информация указывает на пригодность DPRA к применению в качестве вспомогательного средства для выявления опасностей, связанных с развитием сенсибилизации кожи.

_______________

3.2.1.4 Метод исследования, описанный в настоящем разделе стандарта, представляет собой метод in chemico, не учитывающий взаимодействие испытываемого вещества с метаболической системой. Он не позволяет определять химическую продукцию, для раскрытия сенсибилизирующего потенциала которой при воздействии на кожу требуется ее предварительная биологическая активация ферментами (т.е. прогаптенами). При этом химическая продукция, которая проявляет свои сенсибилизирующие свойства после абиотической трансформации (т.е. прегаптены), согласно имеющимся свидетельствам в большинстве случаев правильно определяется с помощью данного метода [29], [34], [35]. Таким образом, любые отрицательные результаты, полученные с его применением, следует рассматривать с учетом указанных ограничений и в сочетании с информацией из других источников в контексте соответствующего IATA или DA. Проведение испытаний химической продукции, не образующей ковалентных связей с пептидами, но способствующей их окислению (т.е. димеризации цистеина), может приводить к получению завышенной оценки деплеции (обеднения) пептидов, а следовательно, к выдаче ложноположительных прогнозных заключений и/или отнесению испытуемой химической продукции к более высокому классу по реакционной способности, чем тот, к которому они принадлежат в действительности (см. 3.2.4.5 и 3.2.4.6).

3.2.1.5 Как отмечалось ранее, метод DPRA позволяет различать химическую продукцию, способную и не способную вызывать сенсибилизацию кожи. Также он может быть полезен для оценки сенсибилизирующей способности веществ [31], [36] при условии применения его в рамках комплексных исследовательских подходов, таких как IATA или DA [37]. Требуется проведение дальнейших работ, предпочтительно с использованием данных, полученных на человеке, чтобы определить, как по результатам проведения исследований методом DPRA можно дать оценку сенсибилизирующей способности.

3.2.2 Сущность метода испытания

3.2.2.1 DPRA - это метод испытания in chemico, предназначенный для определения остаточной концентрации цистеин- или лизинсодержащих пептидов после инкубирования их в течение 24 ч с исследуемой химической продукцией при температуре от 22,5°C до 30°C. Синтетические пептиды содержат фенилаланин, что облегчает процесс обнаружения. Относительную концентрацию пептидов измеряют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с градиентным элюированием и УФ-детектированием на длине волны 220 нм. На следующем этапе рассчитывают процентные значения показателей деплеции (обеднения) пептидов для цистеина и лизина с дальнейшей подстановкой их в модель построения прогнозов (см. 3.2.4.5), которая позволяет отнести исследуемую химическую продукцию к одному из четырех классов по реакционной способности, обеспечивающих различие между сенсибилизирующими и несенсибилизирующими веществами.

3.2.2.2 До того как приступить к регулярному применению метода испытаний, описанного в настоящем разделе, лаборатории должны подтвердить свою техническую компетентность, выполнив анализ специально отобранных для этой цели веществ, перечисленных в приложении Б.

3.2.3 Методика испытаний

В основу рассматриваемого метода положен протокол DPRA DB-ALM [32], соответствующий протоколу, ранее принятому для проведения валидационного исследования, в роли координатора которого выступала EURL ECVAM. Этот протокол рекомендован для повсеместного использования при внедрении и применении данного метода в лабораторной практике. Сведения об основных составляющих и процедурах метода DPRA представлены ниже. В случае использования альтернативной конфигурации оборудования для ВЭЖХ должна быть подтверждена эквивалентность ее рабочих характеристик характеристикам оборудования, использовавшегося при проведении валидационного исследования и описанного в протоколе DB-ALM (например, путем выполнения анализа веществ согласно списку для проверки квалификации, приведенному в приложении Б).

3.2.3.1 Приготовление цистеин- или лизинсодержащих пептидов

Исходные растворы цистеина (Ac-RFAACAA-COOH) и лизина (Ac-RFAAKAA-COOH), содержащие синтетические пептиды, степень чистоты которых должна составлять не менее 85%, а предпочтительно - более 90%, должны быть свежеприготовленными непосредственно перед началом инкубирования пептидов с исследуемой химической продукцией. Конечная концентрация цистеин-содержащего пептида должна составлять 0,667 мМ в фосфатном буферном растворе с pH 7,5, а лизинсодержащего пептида - 0,667 мМ в аммонийно-ацетатном буферном растворе с рН 10,2 соответственно. Последовательность выполнения анализа посредством ВЭЖХ должна быть спланирована таким образом, чтобы общее время анализа не превышало 30 часов. Для системы ВЭЖХ, использовавшейся в ходе проведения валидационного исследования, и описанного в настоящем методе исследования в рамках одного цикла ВЭЖХ могут быть параллельно исследованы до 26 аналитических проб (включая пробу исследуемой химической продукции, положительную контрольную пробу и необходимое число контрольных проб растворителя, в зависимости от общего числа различных видов растворителей, задействованных в испытаниях, в количестве трех экземпляров каждая). Для всех параллельно анализируемых проб в одном и том же цикле используют идентичные по составу исходные растворы цистеина и лизина. Рекомендуется проверять каждую партию пептидов на растворимость до начала их использования.

3.2.3.2 Приготовление пробы исследуемой химической продукции

Перед проведением анализа растворимость исследуемой химической продукции в подходящем растворителе контролируют после процедуры солюбилизации, описанной в протоколе DPRA DB-ALM [32]. Испытываемая химическая продукция должна полностью растворяться в этом растворителе. Поскольку в процессе выполнения анализа по методу DPRA исследуемая химическая продукция подвергается инкубированию с цистеин- или лизинсодержащими пептидами в заведомо избыточных количествах, результаты визуального контроля, свидетельствующие об образовании прозрачного раствора, следует считать достаточным подтверждением полного растворения этой продукции (и - в случае если речь идет о многокомпонентном веществе или смеси - всех его компонентов). Подходящими растворителями являются ацетонитрил, вода, смесь ацетонитрила и воды в соотношении 1:1, изопропанол, ацетон или же смесь ацетона и ацетонитрила в соотношении 1:1. Другие растворители могут быть использованы при условии, что растворение в них не оказывает влияния на стабильность пептида, которая контролируется с помощью стандартных контрольных проб C (т.е. проб, состоящих только из пептида, отдельно растворенного в соответствующем растворителе; см. приложение C). Если исследуемая химическая продукция не растворяется ни в одном из вышеуказанных растворителей, для этой цели допускается использовать ДМСО, но только в минимально достаточном количестве. Важно иметь в виду, что ДМСО может привести к димеризации пептидов, усложнить обеспечение соответствия результатов испытаний установленным критериям приемлемости. Если в качестве растворителя выбран ДМСО, сначала следует растворить исследуемую химическую продукцию в 300 мкл ДМСО, разбавляя полученный раствор 2700 мкл ацетонитрила. Если исследуемую продукцию не удается полностью растворить в этой смеси, следует попытаться растворить аналогичное количество исследуемой химической продукции в 1500 мкл ДМСО с разбавлением полученного раствора 1500 мкл ацетонитрила. Предварительно подготовленные навески исследуемой химической продукции помещают в стеклянные флаконы и растворяют непосредственно перед проведением испытаний в соответствующем растворителе в концентрации 100 мМ. Для смесей и многокомпонентных веществ с известным составом общую степень чистоты продукции устанавливают на основе суммы долей ее составляющих (исключая воду), а усредненное значение молекулярной массы рассчитывают исходя из собственных значений молекулярной массы каждой такой составляющей (исключая воду) и доли, которая на нее приходится. Полученные значения степени чистоты и усредненные значения молекулярной массы используют для вычисления значения массы исследуемой химической продукции, необходимой для приготовления раствора с концентрацией 100 мМ. При исследованиях полимеров, для которых невозможно определить преобладающее значение молекулярной массы, за основу для расчетов с целью получения концентрации раствора 100 мМ может быть взята молекулярная масса соответствующего мономера (либо усредненная молекулярная масса различных мономеров, составляющих полимер). В любом случае при проведении испытаний смесей, многокомпонентных веществ или полимеров с известным составом всегда также следует рассматривать возможность выполнения анализа входящих в их состав чистых химических веществ. Для жидкостей чистые химические вещества исследуют в их исходном состоянии, без предварительного разбавления, инкубируя их в соотношении 1:10 и 1:50 с цистеин- и лизинсодержащими пептидами соответственно. При работе с твердой химической продукцией испытуемую продукцию растворяют в максимально достижимой концентрации в том же растворителе, который должен использоваться для приготовления раствора со средним значением концентрации 100 мМ. Затем выполняют анализ продукции в указанном состоянии, без дополнительного разбавления, путем инкубирования в соотношении 1:10 и 1:50 с цистеин- и лизинсодержащими пептидами соответственно. Получение согласующихся результатов (по наличию или отсутствию реакционной способности) для раствора со средней концентрацией 100 мМ и чистой химической продукции позволяет дать уверенное заключение о способности исследуемой продукции вызывать сенсибилизацию кожи.

3.2.3.3 Приготовление положительной контрольной пробы, стандартных контрольных проб и проб для контроля совместного элюирования

3.2.3.4 Инкубирование исследуемой химической продукции с растворами цистеин- или лизинсодержащих пептидов

3.2.3.5 Построение стандартной градуировочной кривой ВЭЖХ

3.2.3.6 Подготовка к выполнению анализа ВЭЖХ и порядок его выполнения

_______________

3.2.3.6.2 Существует вероятность того, что исследуемая химическая продукция может способствовать процессу окисления цистеинсодержащих пептидов. Пик димеризованного цистеинсодержащего пептида обнаруживают при проведении визуального контроля. Все видимые случаи димеризации регистрируют во избежание получения завышенных оценок процентного значения деплеции (обеднения) пептидов, использование которых может привести к выдаче ложноположительных прогнозных заключений и/или отнесению исследуемых веществ к более высокому классу по реакционной способности, чем тот, к которому они принадлежат в действительности (см. 3.2.4.5 и 3.2.4.6).

3.2.3.6.3 К инжектированию первой из проб при анализе методом ВЭЖХ необходимо приступать спустя 22-26 ч после смешивания исследуемой химической продукции с раствором пептидов. Последовательность выполнения анализа должна быть спланирована таким образом, чтобы общее время анализа не превышало 30 ч. При выборе конфигурации системы ВЭЖХ, использовавшейся в ходе проведения валидационного исследования и включенной в описание рассматриваемого метода исследования, в рамках одного цикла ВЭЖХ могут быть параллельно исследованы до 26 аналитических проб (см. 3.2.3.1). Пример последовательности выполнения такого ВЭЖХ-анализа приведен в приложении C.

3.2.4 Данные и протоколы об испытаниях

Интерпретация данных

3.2.4.1 Концентрацию цистеин- или лизинсодержащих пептидов в каждой пробе определяют фотометрическим способом на длине волны 220 нм путем измерения площади соответствующих пиков (площади под кривой (area under the curve - AUC)) с последующим расчетом значения концентрации на основе линейной градуировочной кривой, полученной по результатам анализа стандартных растворов.

3.2.4.2 Процентное значение деплеции (обеднения) пептидов в каждой пробе определяют путем измерения значения площади пика и деления ее на среднюю площадь пика для соответствующих стандартных контрольных проб C (см. приложение B) по формуле, представленной ниже:

Критерии приемлемости

3.2.4.3 Должны быть соблюдены следующие критерии приемлемости:

b) среднее процентное значение деплеции (обеднения) пептидов в трех параллельно обрабатываемых положительных контрольных пробах на основе коричного альдегида должно составлять от 60,8% до 100,0% для цистеинсодержащих пептидов и от 40,2% до 69,0% для лизинсодержащих пептидов (в случае использования для целей положительного контроля других химических веществ для последних должен быть установлен собственный диапазон), а максимальное стандартное отклонение (CO) для параллельно обрабатываемых положительных контрольных проб должно составлять менее 14,9% для процентного значения деплеции (обеднения) цистеина и менее 11,6% для процентного значения деплеции (обеднения) лизина;

c) средняя концентрация пептидов в стандартных контрольных пробах A должна составлять (0,50±0,05) мМ, а коэффициент вариации (CV) площадей пиков пептидов для девяти стандартных контрольных проб B и C в растворе с ацетонитрилом должен быть менее 15,0%.

Если один или несколько указанных критериев не выполняются, весь цикл анализа повторяют.

3.2.4.4 Результаты анализа в отношении конкретной химической продукции считают достоверными при условии выполнения следующих критериев:

a) максимальное значение стандартного отклонения для параллельно обрабатываемых проб этой химической продукции должно составлять менее 14,9% для процентного значения деплеции (обеднения) цистеина и менее 11,6% для процентного значения деплеции (обеднения) лизина;

b) среднее значение концентрации пептидов в трех стандартных контрольных пробах С в соответствующем растворителе должно составлять (0,50±0,05) мМ.

Если один или несколько из этих критериев не выполняются, несоответствующие данные аннулируют и повторяют цикл анализа для этого конкретного химического вещества.

Модель построения прогнозов

3.2.4.5 Средние процентные значения деплеции (обеднения) цистеина и деплеции (обеднения) лизина рассчитывают отдельно для каждой исследуемой химической продукции. При расчете среднего значения отрицательные значения деплеции (обеднения) принимают равными "0". В соответствии с моделью построения прогнозов "цистеин 1:10/лизин 1:50", показанной в таблице 1, для различия между веществами, способными и не способными вызывать сенсибилизацию кожи, в процессе применения IATA или DA используют пороговое среднее значение деплеции (обеднения), равное 6,38%. Использование данной модели построения прогнозов для классификации исследуемой химической продукции в зависимости от ее химической активности (т.е. низкой, умеренной либо высокой реакционной способности) может быть полезным для оценивания размера сенсибилизирующей способности продукции в рамках IATA или DA.

3.2.4.6 Не исключены случаи, когда исследуемая химическая продукция (чистое вещество или одна либо несколько составляющих многокомпонентного вещества или смеси) демонстрирует интенсивное поглощение на длине волны 220 нм и характеризуется тем же временем удерживания, что и соответствующий пептид (т.е. происходит их совместное элюирование). Этого можно избежать путем внесения небольших изменений в настройки системы ВЭЖХ с целью последующего разграничения во времени этапов элюирования исследуемой химической продукции и пептида. Если для решения проблемы совместного элюирования используется альтернативная конфигурация системы ВЭЖХ, эквивалентность ее рабочих характеристик характеристикам, обеспечиваемым валидированной конфигурацией, должна быть подтверждена (например, путем выполнения анализа веществ согласно списку для проверки квалификации, приведенному в приложении А). При совместном элюировании интегрирование пика пептида, а следовательно, и расчет его процентного значения деплеции (обеднения) становятся невозможными. Если совместное элюирование исследуемой химической продукции наблюдается как с цистеин-, так и с лизинсодержащими пептидами или же только с цистеинсодержащими пептидами, то при составлении отчета результаты такого анализа должны быть определены как "недостоверные". Если совместное элюирование наблюдается только с лизинсодержащими пептидами, то может использоваться модель построения прогнозов "цистеин 1:10", приведенная в таблице 2.

3.2.4.7 Возможны случаи, когда время удерживания исследуемой химической продукции и одного из видов пептидов перекрывается лишь частично. В подобной ситуации значения процентной деплеции (обеднения) пептидов могут быть оценены и использованы в модели построения прогнозов "цистеин 1:10/лизин 1:50", однако отнесение исследуемой химической продукции к тому или иному классу реакционной способности не может быть выполнено с максимальной точностью.

3.2.4.8 Результатов однократного анализа методом ВЭЖХ для цистеин- и лизинсодержащих пептидов должно быть достаточно для оценки характеристик исследуемой химической продукции, если эти результаты обеспечивают его однозначную классификацию. При получении результатов, близких к пороговому значению, используемому для деления их на положительные и отрицательные (т.е. когда среднее процентное значение деплеции (обеднения) находится в диапазоне от 3% до 10% для прогнозирования в соответствии с моделью "цистеин 1:10/лизин 1:50" либо в диапазоне от 9% до 17% для прогнозирования в соответствии с моделью "цистеин 1:10"), рекомендуется проводить дополнительные исследования. В частности, если в соответствующую область диапазона попадают отрицательные результаты (от 3% до 6,38% для модели "цистеин 1:10/лизин 1:50" или от 9% до 13,89% для модели "цистеин 1:10"), может быть принято решение о проведении второго цикла испытаний, а также третьего - в случае расхождения результатов между двумя предыдущими.

Протокол испытаний

3.2.4.9 Протокол испытаний должен включать в себя следующую информацию:

Исследуемое химическое вещество и контрольные пробы (положительная контрольная проба и проба растворителя/вещества-носителя)

Однокомпонентное вещество (исследуемое вещество или вещество контрольной пробы):

- химическое наименование, а именно название (названия) по IUPAC или CAS, регистрационный номер (номера) CAS, коды SMILES или InChl, структурная формула и/или другие отличительные признаки;

- физико-химические свойства, такие как агрегатное состояние, внешний вид, растворимость в воде, молекулярная масса, а также другие дополнительные физико-химические свойства;

- степень чистоты, химическую характеристику примесей с учетом целесообразности и возможности практической реализации;

- способ обработки перед началом испытаний, если такая обработка проводилась (например, подогрев, измельчение);

- значение (значения) концентрации вещества при проведении испытаний;

- условия хранения и сведения о стабильности вещества, если таковые имеются.

Многокомпонентное вещество, вещество с неопределенным или переменным составом (UVCB) и смеси веществ:

- полное описание вещества, например химическое обозначение (см. выше), степень чистоты, количественные характеристики и соответствующие физико-химические характеристики (см. выше) его составляющих;

- внешний вид, растворимость в воде, а также другие физико-химические характеристики;

- значение молекулярной массы или - для смесей веществ/полимеров с известным составом - усредненной молекулярной массы либо иные сведения, важные для целей исследования;

- способ обработки перед началом испытаний, если такая обработка проводилась (например, подогрев, измельчение);

- значение (значения) концентрации вещества при испытаниях;

- условия хранения и сведения о стабильности вещества, если таковые имеются.

Дополнительные сведения о положительной контрольной пробе:

- ссылки на результаты ранее проводимых испытаний положительных контрольных проб, если таковые проводились, подтверждающие подходящий характер критериев приемлемости, использованных для циклов испытаний.

Дополнительные сведения о пробе растворителя/вещества-носителя:

- описание используемого растворителя/вещества-носителя и пропорции их составляющих, если таковые имеются;

- обоснование выбора растворителя для каждого исследуемого химического вещества;

- для ацетонитрила - результаты испытаний на способность оказывать влияние на стабильность пептидов.

Пептиды:

- сведения о поставщике, партии, степени чистоты.

Настройки оборудования для проведения анализа методом ВЭЖХ и условия выполнения анализа

- тип оборудования ВЭЖХ, описание колонок ВЭЖХ и защитных колонок, детектора, автоматического пробоотборника;

- параметры выполнения анализа ВЭЖХ, такие как температура колонки, объем впрыска, расход газа-носителя и градиент.

Пригодность аналитической системы

- площадь пика пептидов на длине волны 220 нм для каждого стандартного раствора и параллельно обрабатываемой стандартной контрольной пробы A;

- значение концентрации пептидов в каждой параллельно обрабатываемой стандартной контрольной пробе A;

- среднее значение концентрации пептидов (мМ) в трех стандартных контрольных пробах A, значения CO и CV;

- концентрацию пептидов в стандартных контрольных пробах A и C.

Порядок выполнения анализа

Для стандартных контрольных проб:

- площадь пика пептидов на длине волны 220 нм для каждой параллельно обрабатываемой пробы B и C;

- среднее значение площади пика пептидов на длине волны 220 нм для девяти стандартных контрольных проб B и C в ацетонитриле, значения CO и CV (для обеспечения стабильности стандартных контрольных проб в процессе выполнения анализа);

- среднее значение площади пика пептидов на длине волны 220 нм с каждым используемым растворителем для трех соответствующих стандартных контрольных проб C (для расчета процентного значения деплеции (обеднения) пептидов);

- значение концентрации пептидов (мМ) с каждым используемым растворителем для трех соответствующих стандартных контрольных проб C;

- среднее значение концентрации пептидов (мМ) с каждым используемым растворителем для трех соответствующих стандартных контрольных проб C, значения CO и CV.

Для положительной контрольной пробы:

- площадь пика пептидов на длине волны 220 нм для каждой параллельно обрабатываемой пробы;

- процентное значение деплеции (обеднения) пептидов в каждой параллельно обрабатываемой пробе;

- среднее процентное значение деплеции (обеднения) пептидов в трех параллельно обрабатываемых пробах, значения CO и CV.

Для каждого исследуемого химического вещества:

- сведения о появлении осадка в реакционной смеси по истечении времени инкубирования, если таковой имеется; а также о том, был ли образовавшийся осадок растворен повторно или удален путем обработки в центрифуге;

- сведения о наличии совместного элюирования;

- прочие наблюдения, важные для результатов исследования, если таковые имеются;

- площадь пика пептидов на длине волны 220 нм для каждой параллельно обрабатываемой пробы;

- процентное значение деплеции (обеднения) пептидов в каждой параллельно обрабатываемой пробе;

- среднее процентное значение деплеции (обеднения) пептидов в трех параллельно обрабатываемых пробах, значения CO и CV;

- средние процентные значения деплеции (обеднения) цистеина и лизина;

- используемую модель построения прогнозов и прогнозное заключение по методу DPRA.

Проверка квалификации

- отметку о том, что испытательная лаборатория смогла подтвердить свою компетентность в использовании данного метода исследования до начала его регулярного применения путем проведения испытаний специально отобранных для этого химических веществ.

Оценка результатов

- описание любых незапланированных изменений, внесенных в методику испытаний;

- анализ результатов, полученных с применением метода исследования DPRA, с учетом соответствия их значений диапазонам, указанным в 3.2.4.8.

Выводы

3.3 Сенсибилизация кожи in chemico. Анализ реакционной способности в отношении производных аминокислот (ADRA)

3.3.1 Исходные положения, пригодность и ограничения

3.3.1.1 Метод ADRA предназначен для определения исходного молекулярного события АОР для сенсибилизации кожи, а именно реакций с белками, путем количественной оценки реакционной способности исследуемой химической продукции по отношению к модельным синтетическим производным аминоксилот, в состав которых входит лизин либо цистеин [6], [38], [39]. В основу метода положен анализ значений показателей деплеции (обеднения) производных цистеина и лизина с целью последующего отнесения исследуемой химической продукции к способной и не способной вызывать сенсибилизацию кожи [6], [38], [39].

3.3.1.2 Метод ADRA обладает доказанной пригодностью для применения на базе лабораторий, которые уже имеют достаточный опыт проведения аналитических испытаний с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Воспроизводимость прогнозных заключений по методу ADRA в пределах одной лаборатории составила 100% (10/10), 100% (7/7), 90% (9/10) и 100% (10/10) для четырех участвующих лабораторий. Общая воспроизводимость при подготовке заключений различными лабораториями для 40 наименований химической продукции, рассчитанная на основе результатов трех участвующих лабораторий, составила 91,9% [39]. Для 40 наименований исследуемой химической продукции, подвергнутой анализу при проведении валидационного исследования в четырех лабораториях, в совокупности уровень точности составил 86,9% (139/160), чувствительности - 81,5% (88/108), а специфичности - 98,1% (51/52) [40], [9]. Результаты валидационного исследования [40], [9] наряду с результатами других опубликованных исследований [39] свидетельствуют о том, что метод ADRA позволяет определять вещества, способные и не способные вызывать сенсибилизацию, с точностью 79% (98/124) (124 соединения, подпадающие под область применимости ADRA), чувствительностью 74% (65/88) и специфичностью на уровне 92% (33/36) по сравнению с результатами аналогичных исследований по методу LLNA [41]. При этом для 73 соединений, входящих в область применимости метода, точность прогнозирования развития кожной сенсибилизации у человека составляет 86% (63/73), чувствительность - 85% (44/52), а специфичность - 90% (19/21) [41]. Показатели точности, приведенные выше для ADRA как для самостоятельного метода испытания, являются ориентированными, поскольку результаты, полученные с его помощью, рекомендуется рассматривать в сочетании с информацией из других источников в контексте IATA и с учетом положений 3.1.4 и 3.1.5. При подготовке оценки эффективности применения методов определения сенсибилизации кожи, не требующих использования подопытных животных, следует иметь в виду, что применение метода LLNA, а также других методов, которые предполагают проведение испытаний на животных, может не в полной мере раскрывать характер воздействия исследуемого вещества на организм целевого биологического вида, представляющего основной интерес для исследователей, т.е. на организм человека. Исходя из имеющихся данных, установлено, что область применения метода ADRA включает в себя широкий спектр химических веществ, которые могут характеризоваться наличием разнообразных органических функциональных групп, различными механизмами развития реакций, различным сенсибилизирующим потенциалом при воздействии на кожу (подтвержденным путем проведения испытаний in vivo), а также различными физико-химическими свойствами [6], [38], [39], [40]. По итогам независимой экспертной оценки результатов исследования с целью валидации метода ADRA был сделан вывод о возможности применения данного метода в рамках интегрированной стратегии испытаний для прогнозирования опасности сенсибилизации кожи [41], [10].

3.3.1.3 Под "исследуемой химической продукцией" для целей настоящего стандарта понимается продукция, подвергаемая испытаниям; использование данного термина не связано с возможностью применения метода ADRA для исследования тех или иных чистых веществ и/или их смесей (см. краткое описание известных ограничений для применения метода ADRA в приложении D). Данный метод неприменим для исследований соединений металлов, реакции которых с белками, как известно, протекают в соответствии с механизмами, отличными от ковалентного связывания. Метод исследования, описанный в настоящем разделе стандарта, представляет собой метод in chemico, не учитывающий взаимодействие исследуемой химической продукции с метаболической системой. Данный метод не позволяет определять химическую продукцию, для раскрытия сенсибилизирующего потенциала которой при воздействии на кожу требуется ее предварительная биологическая активация ферментами (т.е. прогаптенами). По имеющейся информации, химическая продукция, которая проявляет свои сенсибилизирующие свойства после абиотической трансформации (т.е. прегаптены), в некоторых случаях правильно определяется при помощи данного метода [6], [38], [39], [40]. Таким образом, любые отрицательные результаты, полученные с его применением, следует рассматривать с учетом указанных ограничений и в сочетании с информацией из других источников в контексте соответствующего IATA. Если присутствие исследуемой химической продукции способствует окислению реактива N-(2-(1-нафтил)ацетил)-L-цистеина (NAC) (т.е. димеризации цистеина), это может приводить к потенциальному завышению оценки деплеции (обеднения) NAC и, соответственно, к выдаче ложноположительных прогнозных заключений (см. 3.3.4.6 и 3.3.4.7). Использование средств ВЭЖХ обеспечивает возможность обнаружения и количественного определения любых вновь образующихся димеров NAC и, таким образом, позволяет подтвердить или исключить вероятность того, что деплеция (обеднение) реактива NAC была вызвана его димеризацией при окислении, а не явилась результатом реакции с исследуемым веществом (веществами) и последующего ковалентного связывания.

3.3.1.4 Метод ADRA может применяться для исследования химической продукции, характеризующейся низкими показателями растворимости [42]. Исследуемая химическая продукция должна обладать растворимостью в соответствующем растворителе при конечном значении концентрации, соответствующем 1 мМ (см. 3.3.3.4). Если исследуемая химическая продукция не может быть полностью растворена при указанном значении концентрации, это не исключает возможности проведения исследования с более низкими значениями концентрации. В подобных случаях положительный результат исследования может использоваться как доказательство способности исследуемой химической продукции вызывать сенсибилизацию кожи, тогда как получение отрицательного результата, напротив, не позволяет с уверенностью судить об отсутствии у вещества сенсибилизирующих свойств.

3.3.1.5 Известно, что многие органические соединения могут поглощать УФ-излучение в диапазоне 220 нм. В случае совместного элюирования применяемого нуклеофильного реактива и исследуемой химической продукции это может явиться причиной вынесения ложноотрицательного прогнозного заключения о сенсибилизирующих свойствах такой продукции. Это возможно при выполнении анализа по методу DPRA, в соответствии с которым количественное определение пептидсодержащих нуклеофильных реактивов должно выполняться на длине волны 220 нм. Метод ADRA, напротив, требует использовать для количественного определения нуклеофильных реактивов длину волны 281 нм. Перечень веществ, поглощающих ультрафиолетовое излучение на этом участке спектра, обычно ограничивается веществами с конъюгированными двойными связями, что существенно снижает возможность совместного элюирования [43].

3.3.1.6 Текущую модель построения прогнозов нельзя использовать при выполнении анализа сложных смесей веществ неизвестного состава, а также веществ неизвестного или переменного состава, продуктов комплексных реакций или биологических материалов (веществ UVCB) ввиду необходимости соблюдения определенного молярного отношения между исследуемым химическим веществом и используемыми нуклеофильными реактивами. Количество доступной информации о возможности применения метода ADRA для анализа смесей веществ в настоящее время ограничено [44], [45]. Необходимо разработать новый протокол для проведения исследований многокомпонентных веществ и смесей в соответствии с такими методами, как ADRA, которые используют ВЭЖХ-анализ для количественной оценки деплеции (обеднения) нуклеофильных реагентов [44], [45]. Таким образом, несмотря на то что в рамках настоящего стандарта не представляется возможным однозначно указать методы, рекомендуемые для оценивания свойств многокомпонентных веществ и смесей, способ получения оценки, описанный в 3.3.3.5, в настоящее время может рассматриваться как наиболее подходящий для выполнения анализа таких многокомпонентных веществ или смесей с известным составом [44]. Следует учитывать, что возможность его применения для этих целей не была изучена в процессе валидации метода. Перед исследованием смесей, химической продукции, определение которых затруднено (например, нестабильных), или химической продукции, которая относится к области применения настоящего стандарта, следует оценить значимость результатов такого исследования с научной точки зрения.

3.3.1.7 Метод ADRA может применяться для различия химической продукции, способной и не способной вызывать сенсибилизацию кожи. Требуется проведение дальнейших работ, предпочтительно с использованием данных, полученных на человеке, чтобы определить, как по результатам проведения исследований методом ADRA можно дать оценку сенсибилизирующей способности [41].

3.3.2 Сущность метода испытания

3.3.2.2 До того как приступить к регулярному применению метода испытаний, лаборатории должны подтвердить свою техническую компетентность путем исследования 10 веществ специально отобранной химической продукции, перечисленных в приложении E.

3.3.3 Методика испытаний

В основу метода ADRA положен специализированный протокол [46], соответствующий протоколу, ранее принятому для проведения соответствующего валидационного исследования, в роли координатора которого выступал JaCVAM, и рекомендованный для повсеместного использования при внедрении рассматриваемого метода в лабораторной практике. Сведения об основных составляющих и процедурах метода ADRA представлены ниже. Перед использованием альтернативной конфигурации оборудования для ВЭЖХ должна быть подтверждена эквивалентность ее рабочих характеристик характеристикам оборудования, использовавшегося при проведении валидационного исследования и описанного в действующем протоколе, предпочтительным образом путем выполнения анализа веществ согласно списку для проверки квалификации, приведенному в приложении E.

Качество реактивов NAC и NAL

3.3.3.1 Необходимые нуклеофильные реактивы можно приобрести в виде набора ADRA Kit для испытаний на сенсибилизацию кожи, производимого компанией FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, N по каталогу 296-80901. Использование NAC/NAL в качестве реактива для определения сенсибилизации запатентовано Fujifilm Corporation только на территории Японии. В других странах получать разрешение для использования NAC/NAL не требуется. В случае использования NAC/NAL других производителей используемые реактивы должны удовлетворять трем критериям качества, перечисленным ниже. С целью исключения контроля качества реактивов и ускорения процесса проведения исследований по методу ADRA необходимо проводить закупку NAC и NAL, специально изготовленных с учетом удовлетворения этих критериев.

Требования к качеству реактивов NAC и NAL:

1) Чистота: Степень чистоты NAC и NAL должна составлять не менее 98%.

2) Стабильность: В целях контроля стабильности используемых реактивов из стандартных растворов NAC и NAL готовят соответствующие стандартные контрольные растворы, не содержащие исследуемую химическую продукцию, и определяют остаточные уровни содержания в них NAC и NAL сразу после приготовления (спустя 0 ч) и после инкубирования в течение 24 ч. Значение остаточных уровней содержания NAC и NAL должно составлять не менее 90% [46]. Значение остаточного уровня NAC рассчитывают как процентную долю от суммы уровня содержания NAC и остаточного уровня содержания димеров NAC.

3) Реакционная способность: Реакционную способность NAC и NAL оценивают при помощи 10 веществ согласно перечню веществ для проверки квалификации, приведенному в приложении E, и контролируют соответствие указанных для них требований.

Приготовление стандартных растворов NAC и NAL

3.3.3.2 Перед использованием каждую партию NAC и NAL проверяют на растворимость. Стандартный раствор NAC готовят в концентрации 2 мМ в 100 мМ фосфатного буфера с pH = 8,0 и добавлением 0,333 мкМ ЭДТА, стандартный раствор NAL - в концентрации 2 мМ в 100 мМ фосфатного буфера с pH = 10,2. Затем эти два стандартных раствора дополнительно разбавляют буферным раствором для получения стандартных растворов с концентрацией 6,667 мкМ. Стандартные растворы NAC и NAL должны быть использованы в кратчайший срок после их приготовления [39]. При необходимости хранения стандартные растворы замораживают и хранят не более 12 месяцев при температуре менее минус 75°C. Конечное значение концентрации раствора NAC должно составлять 5 мкМ в растворе с фосфатным буфером с pH = 8,0, а конечное значение раствора NAL должно составлять 5 мкМ в растворе с фосфатным буфером с pH = 10,2.

Приготовление раствора исследуемой химической продукции

3.3.3.3 Перед проведением анализа растворимость исследуемой химической продукции в подходящем растворителе контролируют в соответствии с процедурой солюбилизации, описанной в протоколе ADRA JaCVAM [46]. Исследуемая химическая продукция должна полностью растворяться в этом растворителе. Поскольку протоколом ADRA предусматривается инкубирование NAC либо NAL с заведомо избыточным количеством исследуемой химической продукции, результат визуального осмотра, свидетельствующий об образовании прозрачного раствора, считается достаточным подтверждением полного растворения этой продукции (всех ее компонентов, если исследуются многокомпонентное вещество или смеси). Подходящим растворителем являются дистиллированная вода, ацетонитрил и ацетон. Если исследуемая химическая продукция не растворяется ни в одном из вышеуказанных растворителей, допускается использовать ДМСО - в минимально достаточном количестве. Важно иметь в виду, что ДМСО может вызвать димеризацию нуклеофильного реактива NAC [47] и усложнить обеспечение соответствия результатов испытаний установленным критериям приемлемости. Если в качестве растворителя выбран ацетонитрил с добавлением ДМСО (5% ДМСО в ацетонитриле), вначале растворяют исследуемую химическую продукцию в ДМСО в концентрации 20 Мм, а затем выполняют 20-кратное разбавление полученного раствора ацетонитрилом, чтобы получить раствор испытуемой химической продукции с концентрацией 1 мМ. Влияние ДМСО на процесс димеризации реактива NAC может быть проконтролировано аналитическим путем, поскольку димеры NAC можно обнаружить методом ВЭЖХ. Предварительно подготовленные навески исследуемой химической продукции помещают в одноразовые полипропиленовые пробирки и непосредственно перед проведением испытаний растворяют в соответствующем растворителе в концентрации 1 мМ.

3.3.3.4 При исследованиях однокомпонентных веществ с неизвестной молекулярной массой значение концентрации раствора для испытаний может быть выбрано равным 0,5 мг/мл вместо 1 мМ [44]. Для полимеров с известными характеристиками используют значение концентрации 1 мМ, устанавливаемое исходя из усредненного значения их молекулярной массы, в порядке, аналогичном применяемому для однокомпонентных веществ.

3.3.3.5 Исследования смесей и многокомпонентных веществ с известным составом проводят следующим образом.

1) Жидкости. При исследованиях жидкостей их рассматривают как неразбавленную смесь. Когда получить реакционный раствор невозможно из-за неполного растворения взятого для испытаний образца, т.е. в растворе заметно присутствие нерастворенного материала, помутнение и/или выпадение осадка, положительный результат эксперимента может использоваться в оценке, а отрицательный результат следует рассматривать как сомнительный и интерпретировать с осторожностью. При получении положительных результатов нельзя полностью исключать их вероятного ложного характера, что также требует определенной осторожности при интерпретации прогнозного заключения.

2) Твердые вещества. Исследуемую химическую продукцию растворяют до максимально возможной концентрации в том же растворителе, который использовался для приготовления раствора вещества со значением концентрации 1 мМ. При дальнейших исследованиях этот раствор с максимально возможной концентрацией рассматривают как неразбавленную смесь. Если получить реакционный раствор с желаемыми свойствами невозможно из-за неполного растворения взятого для испытаний образца, т.е. в растворе наблюдаются нерастворенные остатки твердого вещества, помутнение и/или выпадение осадка, положительный результат исследования может считаться достоверным, а отрицательный результат следует рассматривать как сомнительный и использовать его с надлежащей осторожностью. Однако полученные положительные результаты могут быть ложноположительными, что также требует определенной осторожности при интерпретации прогнозного заключения.

При исследовании многокомпонентных смесей отсутствует возможность индивидуальной оценки сенсибилизирующих свойств каждого компонента смеси, поэтому положительный результат исследований может рассматриваться как доказательство способности исследуемой химической продукции вызывать сенсибилизацию кожи, тогда как отрицательный результат, напротив, не позволяет точно оценить отсутствие у химической продукции сенсибилизирующих свойств.

Приготовление положительной контрольной пробы, стандартных контрольных проб и проб для контроля совместного элюирования

Инкубирование исследуемой химической продукции с растворами NAC и NAL

Подготовка к выполнению анализа ВЭЖХ и порядок его выполнения

3.3.3.11 Воздействие некоторой исследуемой химической продукции потенциально может способствовать окислению NAC. Пик, соответствующий димеризованному NAC, может быть обнаружен при визуальном контроле. Любые видимые признаки димеризации регистрируют во избежание получения завышенной оценки деплеции (обеднения) NAC, использование которой может привести к выдаче ложноположительного прогнозного заключения (см. 3.3.4.5 и 3.3.4.6).

3.3.4 Данные и протоколы испытаний

Интерпретация данных

3.3.4.1 Концентрацию NAC и NAL в каждой пробе определяют фотометрическим способом на длине волны 281 нм путем измерения площади соответствующих пиков (площади под кривой (AUC)) с последующим расчетом значения концентрации на основе линейной градуировочной кривой, полученной по результатам анализа стандартных растворов.

3.3.4.2 Процентное значение деплеции (обеднения) NAC и NAL в каждой пробе определяют путем измерения значения площади пика и деления ее на среднюю площадь пика для соответствующих стандартных контрольных проб C (см. приложение F) по формуле, представленной ниже.

Критерии приемлемости

3.3.4.3 Должны быть соблюдены следующие критерии приемлемости:

b) среднее процентное значение деплеции (обеднения) NAC и NAL и максимальное стандартное отклонение (CO) в трех параллельно обрабатываемых положительных контрольных пробах (на основе фенилацетальдегида или диэтилового эфира сквараиновой кислоты) должны удовлетворять следующим критериям:

- деплеция (обеднение) NAC:

для фенилацетальдегида: от 6% до 30%; для диэтилового эфира сквараиновой кислоты: от 15% до 40%;

- деплеция (обеднение) NAL:

для фенилацетальдегида: от 75% до 100%; для диэтилового эфира сквараиновой кислоты: от 40% до 85%;

- максимальное стандартное отклонение (CO):

для фенилацетальдегида и диэтилового эфира сквараиновой кислоты: менее 10% при определении значения деплеции (обеднения) для NAC и NAL;

c) среднее значение концентрации NAC и NAL в стандартных контрольных пробах A и C должно составлять 3,2-4,4 мкМ, а коэффициент вариации (CV) площадей пиков NAC и NAL для девяти стандартных контрольных проб B и C в растворе с ацетонитрилом должен быть менее 10%.

Если один или несколько из этих критериев не выполняются, несоответствующие данные аннулируют и повторяют весь цикл анализа.

3.3.4.4 Результаты анализа в отношении конкретной исследуемой химической продукции считают достоверными при условии выполнения следующих критериев:

a) максимальное значение стандартного отклонения для процентного значения деплеции (обеднения) NAC и NAL для параллельно обрабатываемых проб этой исследуемой химической продукции должно составлять менее 10%;

b) среднее значение концентрации NAC и NAL в трех стандартных контрольных пробах C в соответствующем растворителе должно составлять 3,2-4,4 мМ. При использовании ацетонитрила с 5%-ным содержанием ДМСО в качестве растворителя допустимый диапазон средних значений концентрации NAC в стандартных контрольных пробах C устанавливается равным 2,8-4,0 мкМ [48].

Если один или несколько из этих критериев не выполняются, несоответствующие данные аннулируют и повторяют цикл анализа.

Модель построения прогнозов

3.3.4.5 Средние процентные значения деплеции (обеднения) NAC и NAL рассчитывают отдельно для каждой исследуемой химической продукции. При расчете среднего значения отрицательные значения деплеции (обеднения) принимаются равными "0". При работе с моделью построения прогнозов "NAC/NAL", показанной в таблице 3, для различия между исследуемой химической продукцией, способной и не способной вызывать сенсибилизацию кожи, в процессе применения IATA или DA в качестве порогового используют среднее значение деплеции (обеднения), равное 4,9%. Порог в размере 4,9% для среднего процентного значения деплеции (обеднения) NAC и NAL был выбран с учетом параметров применяемой двоичной системы классификации таким образом, чтобы он обеспечивал как можно более достоверное предсказание наличия или отсутствия у исследуемой химической продукции сенсибилизирующих свойств.

3.3.4.6 Совместное элюирование происходит, когда исследуемая химическая продукция (вещество либо одна или несколько составляющих многокомпонентного вещества или смеси) демонстрирует интенсивное поглощение на длине волны 281 нм и характеризуется тем же временем удерживания, что и NAC или NAL. Этого можно избежать путем внесения небольших изменений в настройки системы ВЭЖХ с целью последующего разграничения во времени этапов элюирования исследуемого химического вещества и NAC или NAL. Если в ходе решения проблемы совместного элюирования используется альтернативная конфигурация системы ВЭЖХ, эквивалентность ее рабочих характеристик характеристикам, обеспечиваемым валидированной конфигурацией, должна быть подтверждена, желательно путем выполнения анализа веществ согласно списку для проверки квалификации, приведенному в приложении E. При совместном элюировании невозможно интегрировать данные о пиках NAC или NAL и выполнить расчеты процентных значений деплеции (обеднения) NAC или NAL соответственно. Если элюирование исследуемой химической продукции наблюдается как с NAC, так с NAL либо же только с NAC и разграничить во времени этапы их элюирования невозможно, то при составлении отчета результаты такого анализа должны рассматриваться как "недостоверные". Если совместное элюирование наблюдается только с NAL и разграничить во времени этапы элюирования исследуемой химической продукции и NAL невозможно, то может использоваться модель построения прогнозов, использующая только данные для NAC (см. таблицу 4). Пороговое значение 5,6% для процентного значения деплеции (обеднения) NAC было установлено с учетом параметров применяемой двоичной системы классификации таким образом, чтобы обеспечивать как можно более достоверное предсказание наличия или отсутствия у исследуемой химической продукции сенсибилизирующих свойств.

3.3.4.7 Результатов однократного анализа методом ВЭЖХ для сочетания NAC и NAL должно быть достаточно для оценки характеристик исследуемого химического вещества, если эти результаты обеспечивают его однозначную классификацию. При получении значений результатов, близких к пороговому значению, установленному для деления их на положительные и отрицательные результаты (т.е. в ситуации, когда среднее процентное значение деплеции (обеднения) находится в диапазоне от 3% до 10% для модели прогнозирования "NAC/NAL" либо в диапазоне от 4% до 11% для модели, основанной только на данных для NAC), рекомендуется проводить дополнительные исследования. В частности, если в соответствующую область диапазона попадают отрицательные результаты (от 3% до 4,9% для модели "NAC/NAL" или от 5% до 5,6% для модели, основанной только на данных для NAC), может быть принято решение о проведении второго цикла испытаний, а также третьего - в случае расхождения результатов между первыми двумя.

Протокол испытаний

3.3.4.8 Протокол испытаний должен включать в себя следующую информацию:

Исследуемое химическое вещество и контрольные пробы (положительная контрольная проба и проба растворителя/вещества-носителя)

Однокомпонентное вещество (исследуемое вещество или вещество контрольной пробы):

- химическое наименование, а именно название (названия) по IUPAC или CAS, регистрационный номер (номера) CAS, коды SMILES или InChl, структурную формулу и/или другие отличительные признаки;

- физическо-химические свойства, такие как агрегатное состояние, внешний вид, растворимость в воде, молекулярная масса, а также другие дополнительные физико-химические свойства;

- степень чистоты, химическую характеристику примесей, с учетом целесообразности и возможности практической реализации;

- способ обработки перед началом испытаний, если такая обработка проводилась (подогрев, измельчение);

- значение (значения) концентрации вещества при проведении испытаний;

- условия хранения и сведения о стабильности вещества, если таковые имеются.

Многокомпонентное вещество, вещество с неопределенным или переменным составом (UVCB) и смеси веществ:

- полное описание вещества, например химическое обозначение (см. выше), степени чистоты, количественные характеристики и соответствующие физико-химические свойства (см. выше) его составляющих;

- внешний вид, растворимость в воде, а также другие физико-химические свойства;

- значение молекулярной массы (или усредненной молекулярной массы) для смесей веществ или полимеров известного состава либо иные сведения, важные для целей исследования;

- способ обработки перед началом испытаний, если такая обработка проводилась (подогрев, измельчение);

- значение (значения) концентрации при испытаниях;

- условия хранения и сведения о стабильности вещества, если таковые имеются.

Дополнительные сведения о положительной контрольной пробе:

- ссылки на результаты ранее проводимых испытаний положительных контрольных проб, если таковые проводились, подтверждающие подходящий характер критериев приемлемости, использованных для циклов испытаний.

Дополнительные сведения о пробе растворителя/вещества-носителя:

- используемый растворитель и соотношение его компонентов, если применимо;

- обоснование выбора растворителя для каждого исследуемого химического вещества;

- сведения о влиянии ацетонитрила на стабильность NAC и NAL при использовании его в качестве растворителя.

Приготовление растворов NAC и NAL, положительной контрольной пробы и исследуемого химического вещества

- характеристики растворов NAC и NAL (наименование поставщика, номер партии, точная масса NAC и NAL, объем растворителя, добавляемый для получения стандартного раствора);

- характеристики растворов положительной контрольной пробы (точная масса реактива, используемого в качестве положительной пробы, объем растворителя, добавляемый для получения контрольного раствора);

- характеристики растворов исследуемых химических веществ (точная масса исследуемого химического вещества, объем растворителя, добавляемый для получения анализируемого раствора).

Настройки оборудования для проведения анализа методом ВЭЖХ и порядок выполнения анализа

- тип оборудования ВЭЖХ, описание колонок ВЭЖХ и защитных колонок, детектора, автоматического пробоотборника;

- параметры выполнения анализа ВЭЖХ, такие как температура колонки, объем впрыска, расход газа-носителя и градиент.

Пригодность аналитической системы

- площадь пиков NAC и NAL на длине волны 281 нм для каждого стандартного раствора и параллельно обрабатываемой стандартной контрольной пробы A;

- графическое представление линейной градуировочной кривой с указанием значения R2;

- значение концентрации NAC и NAL в каждой параллельно обрабатываемой контрольной пробе A;

- среднее значение концентрации NAC и NAL (мкМ) в трех стандартных контрольных пробах A, значения CO и CV;

- значение концентрации NAC и NAL в стандартных контрольных пробах A и C.

Порядок выполнения анализа

Для стандартных контрольных проб:

- площадь пиков NAC и NAL на длине волны 281 нм для каждой параллельно обрабатываемой стандартной контрольной пробы A;

- среднее значение площади пиков NAC и NAL на длине волны 281 нм для девяти стандартных контрольных проб B и C в ацетонитриле, значения CO и CV (для обеспечения стабильности стандартных контрольных проб в процессе выполнения анализа);

- среднее значение площади пиков NAC и NAL на длине волны 281 нм с каждым используемым растворителем для трех соответствующих контрольных проб C (для расчета процентного значения деплеции (обеднения) NAC и NAL);

- концентрация NAC и NAL (мкМ) с каждым используемым растворителем для трех соответствующих стандартных контрольных проб C;

- среднее значение концентрации пептидов (мкМ) с каждым используемым растворителем для трех соответствующих стандартных контрольных проб C, значения CO и CV.

Для положительных контрольных проб:

- площадь пиков NAC и NAL на длине волны 281 нм для каждой параллельно обрабатываемой пробы;

- процентное значение деплеции (обеднения) NAC и NAL в каждой параллельно обрабатываемой пробе;

- среднее значение процентной деплеции (обеднения) NAC и NAL в трех параллельно обрабатываемых пробах, значения CO и CV.

Для каждой исследуемой химической продукции:

- сведения о появлении осадка в реакционной смеси по истечении времени инкубирования, если таковой наблюдается, а также о том, был ли осадок растворен повторно или удален путем обработки в центрифуге;

- сведения о наличии совместного элюирования;

- прочие наблюдения, важные для результатов исследования, если имеются;

- площадь пиков NAC и NAL на длине волны 281 нм для каждой параллельно обрабатываемой пробы;

- процентное значение деплеции (обеднения) NAC и NAL в каждой параллельно обрабатываемой пробе;

- среднее значение процентной деплеции (обеднения) NAC и NAL в трех параллельно обрабатываемых пробах, значения CO и CV;

- среднее значение для значений процентной деплеции (обеднения) NAC и процентной деплеции (обеднения) NAL;

- используемую модель построения прогнозов и прогнозное заключение по методу ADRA.

Проверка квалификации

- отметку о том, что испытательная лаборатория смогла подтвердить свою компетентность в использовании данного метода исследования до начала его регулярного применения путем проведения испытаний специально отобранной для этого химической продукции.

Оценка результатов

- описание любых незапланированных изменений, внесенных в методику испытаний;

- анализ результатов, полученных с применением метода исследования ADRA, с учетом соответствия их значений диапазонам, указанным в 3.3.4.7.

Выводы

3.4 Сенсибилизация кожи in chemico. Кинетический прямой анализ реакционной способности пептидов (kDPRA)

3.4.1 Исходные положения, пригодность и ограничения

_______________

По итогам проведенной независимой экспертной оценки [67] метод kDPRA признан научно обоснованным и может применяться для отнесения химической продукции к подлежащей и не подлежащей к подклассу опасности 1А (т.е. вне подкласса опасности 1A) согласно СГС ООН [58]. Таким образом, метод kDPRA может рассматриваться (i) в качестве вспомогательного метода исследования, предназначенного для проведения более точной классификации химической продукции, включенной в класс опасности 1 согласно СГС ООН по способности вызывать сенсибилизацию кожи, в соответствии с дополнительно выделяемыми подкатегориями либо (ii) в качестве самостоятельно применяемого метода исследования, позволяющего, при условии получения положительных результатов, непосредственно классифицировать ту или иную химическую продукцию в соответствии с подклассом опасности 1А согласно СГС ООН, если подобная возможность предусмотрена действующим законодательством.

3.4.1.3 Под "исследуемой химической продукцией" для целей настоящего стандарта понимается продукция, которая подвергается испытаниям; использование данного термина не связано с возможностью применения метода kDPRA для исследования веществ и/или смесей. Данный метод неприменим для исследования соединений металлов, реакции которых с белками протекают в соответствии с механизмами, отличными от ковалентного связывания. Метод kDPRA измеряет реакционную способность исследуемой химической продукции только с цистеинсодержащими пептидами, соответственно, продукция проявляет высокую сенсибилизирующую способность с лизином, так как некоторые ацилгалогениды, фенольные эфиры или альдегиды относятся к области применения данного метода. Известно несколько наименований химической продукции подкласса опасности 1А согласно СГС ООН, способной вызывать сенсибилизацию кожи, которая реагирует исключительно с остатками лизина. Использование в рамках многоуровневой стратегии исследования данных испытаний, проводимых по методу DPRA или ADRA, для проверки наличия у исследуемой химической продукции высокой реакционной способности к лизину позволяет уточнить полученный результат во многих подобных случаях. Проведение исследований химической продукции, не образующей ковалентных связей с пептидами, но способствующей их окислению (т.е. димеризации цистеина), потенциально может приводить к получению завышенной оценки деплеции (обеднения) пептидов, а следовательно, к выдаче ложноположительных прогнозных заключений и/или отнесению исследуемой химической продукции к более высокому классу по реакционной способности, чем тот, к которому она принадлежит в действительности. Метод исследования, описанный в 3.4, представляет собой метод in chemico, не учитывающий взаимодействие исследуемой химической продукции с метаболической системой. Он не позволяет точно определить реакционную способность химической продукции, для раскрытия сенсибилизирующего потенциала которой при воздействии на кожу требуется ее предварительная биологическая активация ферментами (т.е. прогаптенами). Однако было установлено, что ограничения в отношении исследования прогаптенов менее выражены для химической продукции, способной оказывать сильное сенсибилизирующее воздействие, по сравнению с той химической продукцией, сенсибилизирующая способность которой невелика [54]. Химические вещества, которые проявляют свои сенсибилизирующие свойства после абиотической трансформации (т.е. прегаптены), правильно определяются с применением методов исследований in chemico [59], [60]. Напротив, оценка сенсибилизирующей способности прегаптенов, подверженных спонтанному быстрому окислению, с использованием метода kDPRA (равно как и любого другого метода исследования сенсибилизации кожи in vitro) может оказаться заниженной из-за присутствия отложенной фазы окисления, снижающей общую скорость реакции. Таким образом, результаты, полученные с применением данного метода испытаний, если они не свидетельствуют об отнесении исследуемой химической продукции к подклассу опасности 1А, следует рассматривать с учетом действующих ограничений (см. также приложение G), а именно:

- для ароматических аминов, катехинов или гидрохинонов может потребоваться получение дополнительных данных, подтверждающих их низкую реакционную способность даже в условиях, способствующих окислению;

- для ацилгалогенидов, фенольных эфиров или альдегидов, избирательно реагирующих с лизиновыми остатками, например, в соответствии с результатами исследований по методу DPRA или ADRA, могут потребоваться дополнительные данные для подтверждения низкой реакционной способности.

3.4.1.4 Исследуемая химическая продукция должна обладать растворимостью в соответствующем растворителе при максимально возможной концентрации, соответствующей 20 мМ.

3.4.1.6 Метод kDPRA основан на использовании данных флуоресцентных измерений, поэтому при подготовке и проведении исследования важно предотвратить такие потенциально нежелательные явления, как автофлуоресценция исследуемого химического вещества, гашение флуоресценции или взаимодействие вещества с соответствующим флуоресцентным реактивом (монобромбиманом). Для этого необходимо провести анализ контрольных проб исследуемого вещества, описанных в 3.4.3.3.3, и оценить зависимость между определяемым уровнем деплеции (обеднения) пептидов и продолжительностью инкубирования. Химические вещества, имеющие в своей структуре первичную сульфгидридную группу (тиолы), не могут быть исследованы методом kDPRA, так кактиоловая группа способна вступать во взаимодействие с монобромбиманом (см. 3.4.2.1), вызывая флуоресценцию. Аналогичные указанным выше ограничения действуют для химических веществ, которые подвержены разложению с выделением свободной сульфгидридной группы в условиях, предусмотренных для выполнения анализа (нейтральная кислотность, водный раствор).

3.4.1.7 Метод исследования kDPRA считается технически применимым для проведения исследований многокомпонентных веществ и смесей веществ с известным составом, хотя возможность его применения для этих веществ не была изучена в процессе валидации метода. В этом случае общая степень чистоты многокомпонентного вещества может быть установлена на основе суммы долей его составляющих (исключая воду), а усредненное значение молекулярной массы - рассчитано исходя из собственных значений молекулярной массы каждой такой составляющей (исключая воду) и доли, которая на нее приходится. Эти значения степени чистоты и усредненные значения молекулярной массы затем могут быть использованы для вычисления значения массы исследуемой химической продукции, необходимого для приготовления раствора с концентрацией 20 мМ. Результаты исследований смесей и многокомпонентных веществ известного состава могут носить нелинейный характер, соответственно, при их оценивании следует руководствоваться положениями, приведенными в 3.4.4.2.2. Что касается смесей и веществ с неопределенным или переменным составом, продуктов комплексных реакций или биологических материалов (т.е. веществ, в совокупности рассматриваемых как UVCB), то оценить их свойства с использованием текущей модели построения прогнозов невозможно из-за необходимости определения молярных соотношений. При изучении целесообразности проведения исследований определенных смесей веществ, трудно поддающейся анализу химической продукции (например, не обладающей достаточной стабильностью) либо химической продукции, не относящейся к области применения, описанной в настоящем стандарте, следует заранее оценить возможность получения научно обоснованных результатов после проведения испытаний. При наличии доказательств, свидетельствующих о непригодности метода для исследований определенных категорий химической продукции, его не следует применять с этими конкретными категориями химической продукции.

3.4.1.8 Метод kDPRA предназначен для установления различия между химической продукцией, способной вызывать сенсибилизацию кожи и подлежащей отнесению к подклассу опасности 1А согласно СГС ООН, и химической продукцией, не подлежащей отнесению к подклассу опасности 1A (т.е. вне подкласса опасности 1A) согласно СГС ООН [54]. Как и для любого метода исследования, основанного на ключевых событиях, эффективность применения метода kDPRA необходимо дополнительно оценить в сочетании с альтернативными методами исследования, такими как DPRA или ADRA, в рамках интегрированных подходов IATA или DA с целью всестороннего анализа причин развития сенсибилизации кожи [54], [61].

3.4.2 Сущность метода испытания

3.4.2.2 До того как приступить к регулярному применению метода испытания, лаборатории должны подтвердить свою техническую компетентность путем исследования девяти специально отобранных химических веществ, перечисленных в приложении И.

3.4.3 Методика испытаний

В основу рассматриваемого метода положен протокол kDPRA DPRA DB-ALM N 217 [62], соответствующий протоколу, ранее принятому для проведения валидационного испытания, в роли координаторов которого выступали заинтересованные предприятия промышленности. Этот протокол рекомендован для повсеместного использования при внедрении и применении данного метода в лабораторной практике. Сведения об основных составляющих и процедурах метода kDPRA представлены ниже.

3.4.3.1 Приготовление растворов цистеинсодержащего пептида

Исходный раствор цистеинсодержащего синтетического пептида (Ac-RFAACAA-COOH) со степенью чистоты не менее 95% должен быть свежеприготовленным перед началом инкубирования пептида с исследуемой химической продукцией. Конечное значение концентрации цистеинсодержащего пептида в фосфатном буферном растворе с значением pH = 7,5 должно составлять 0,667 мМ для исследуемой химической продукции, растворяемой в ацетонитриле, и 1,0 мМ - для исследуемой химической продукции, растворяемой в фосфатном буфере со значением pH = 7,5.

3.4.3.2 Приготовление пробы исследуемой химической продукции

3.4.3.2.1 Перед проведением анализа контролируют растворимость исследуемой химической продукции в подходящем веществе-носителе. В качестве носителя используют химически неактивное, способное смешиваться с водой вещество, обеспечивающее полное растворение исследуемой химической продукции. Растворимость контролируют визуально, при этом достаточным подтверждением полного растворения этой продукции считают образование прозрачного раствора. Наиболее предпочтительным для использования веществом-носителем является ацетонитрил. Если исследуемая химическая продукция не растворяется в ацетонитриле, следует рассмотреть возможность ее растворения в фосфатном буферном растворе со значением pH = 7,5. Целесообразность использования других видов веществ-носителей к настоящему времени еще не проверена экспериментально, однако такое использование не исключается, если доказано, что вещества-носители не оказывают влияния на анализ. Это означает, что все контрольные пробы могут быть приготовлены с использованием того же самого вещества-носителя, а значения скорости реакции, получаемые для положительной контрольной пробы и исследуемой химической продукции согласно списку для проверки квалификации, находятся в пределах диапазонов, указанных в 3.4.4.2.1 и приложении H к нему соответственно. Важно отметить, что использование в качестве вещества-носителя ДМСО может привести к димеризации пептидов.

3.4.3.2.2 Предварительно подготовленные навески исследуемой химической продукции помещают в стеклянные флаконы и растворяют непосредственно перед проведением испытаний в соответствующем веществе-носителе, описанном в 3.4.3.2.1, в концентрации 20 мМ. Разбавление растворов исследуемой химической продукции выполняют последовательно, добиваясь получения значений концентрации 20, 10, 5, 2,5 и 1,25 мМ.

3.4.3.3 Приготовление контрольных проб

3.4.3.3.2 Контрольная проба вещества-носителя (КН), являющаяся одновременно и отрицательной контрольной пробой, включает в себя раствор пептида, приготовленный с использованием буферного раствора и вещества-носителя соответственно, но без добавления к ним исследуемого вещества или материала ПК. Уровень деплеции (обеднения) пептидов в пробах, инкубированных с добавлением исследуемой химической продукции или ПК, рассчитывают относительно соответствующего уровня для КН.

3.4.3.3.3 Анализу подвергают также контрольные пробы исследуемой химической продукции, представляющие собой растворы с определенной концентрацией исследуемой химической продукции в веществе-носителе и буферном растворе, но без добавления пептида. Такие контрольные пробы предназначены для выявления влияния исследуемой химической продукции (автофлуоресценции и гашения флуоресценции) при выполнении флуоресцентных измерений, например для оценки взаимодействия этого вещества с монобромбиманом и для определения соответствующих фоновых показателей.

3.4.3.3.4 Холостая контрольная проба (ХК) используется для выполнения измерений фоновых показателей и включает в себя вещество-носитель и буферный раствор без добавления исследуемой химической продукции, ПК или пептида.

3.4.3.4 Инкубирование исследуемой химической продукции с раствором цистеинсодержащего пептида

3.4.3.5 Измерения интенсивности флуоресценции

По истечении выбранного периода инкубации (времени экспозиции) в лунки аналитических планшетов (по одному на каждое значение времени экспозиции), избегая попадания на них света, быстро добавляют свежеприготовленный раствор МББ (в концентрации 3 мМ) в ацетонитриле. Планшеты снова герметизируют газонепроницаемой адгезивной фольгой и встряхивают при 200 об/мин в течение 5 мин. После этого определяют интенсивность наблюдаемой флуоресценции, используя значения длины волны 390 нм для фильтра возбуждения и 480 нм - для фильтра эмиссии соответственно.

3.4.4 Данные и протоколы испытаний

3.4.4.1 Интерпретация данных

3.4.4.1.1 Для оценки данных рекомендуется использовать таблицу в формате Excel, предлагаемую вместе с протоколом DB-ALM. Подробные указания приведены в протоколе DB-ALM N 217 [62].

3.4.4.1.2 Для каждого периода инкубации (времени экспозиции) t вычисляют значения следующих параметров:

- среднее арифметического и стандартное отклонение интенсивности флуоресценции для 12 холостых контрольных проб (ХК);

- среднее арифметического и стандартное отклонение интенсивности флуоресценции для 12 контрольных проб вещества-носителя (КН);

- скорректированные значения КН путем вычитания из первоначального значения КН среднего значения ХК;

- скорректированные значения исследуемой химической продукции и ПК путем вычитания из значений, полученных для каждого значения концентрации исследуемой химической продукции и ПК, соответствующего значения, полученного для контрольной пробы исследуемой химической продукции.

3.4.4.1.3 С целью определения процентного значения деплеции (обеднения) пептидов для каждого значения концентрации исследуемой химической продукции при каждом значении времени экспозиции выполняют следующий расчет:

3.4.4.1.4 Рассчитывают среднее арифметическое и стандартное отклонение для трех параллельно обрабатываемых проб при каждом значении концентрации исследуемой химической продукции (при каждом значении времени экспозиции). Чтобы узнать, являются ли значения концентрации пептидов, измеренные в трех параллельно обрабатываемых пробах, статистически значимо более низкими по сравнению со значениями концентрации в 12 лунках с КН, используют оценку на основе t-критерия Стьюдента.

3.4.4.1.5 При выполнении испытаний по методу kDPRA значения кинетической константы скорости реакции определяют в порядке, указанном ниже, если (i) деплеция (обеднение) пептида в размере, большем или равном 13,89%, отмечается при самом высоком значении концентрации исследуемой химической продукции (при конечном значении концентрация исследуемой химической продукции 5 мМ) в заданный момент времени и если (ii) значение расхождения статистически отличается от значения, установленного для КН. Основанием для принятого "критерия позитивности" является аналогичный "положительный" критерий оценивания реакционной способности пептидов, который предусмотрен моделью построения прогнозов для метода DPRA, включающий в себя только данные о цистеине и подробно описанный в приложении G. Если этот положительный критерий не выполняется, исследуемая химическая продукция признается неактивной в соответствии с моделью построения прогнозов, представленной в 3.4.4.3.1.

где t - время экспозиции в минутах. Если линейная зависимость не обнаружена (т.е. коэффициент корреляции составляет менее 0,90), дальнейшие действия выполняют в соответствии с рекомендациями, изложенными в 3.4.4.2.2.

3.4.4.2 Критерии приемлемости

3.4.4.2.1 Должны быть соблюдены следующие критерии приемлемости для получения достоверных результатов исследования. Если один или несколько из указанных критериев не выполняются, весь цикл анализа повторяют.

b) КН: Коэффициент вариации, рассчитанный для 12 значений КН на одном и том же планшете, должен составлять менее 12,5% по меньшей мере для пяти из шести значений времени экспозиции.

3.4.4.2.2 Данные, полученные для исследуемой химической продукции, подвергают дополнительной оценке с целью выявления побочных факторов, которые могли бы повлиять на окончательные результаты исследования.

(i) Прекращение реакции: Если существенная деплеция (обеднение) пептидов отмечалась в ранних временных точках, но не происходила в дальнейшем, то это свидетельствует либо о нелинейном течении реакции, присущем данной конкретной исследуемой химической продукции, либо о том, что эксперимент был проведен с отклонениями. В подобных случаях весь цикл анализа повторяют. Если при новых повторениях картина, наблюдавшаяся ранее, сохраняется, то нелинейный кинетический характер реакции считают доказанным и определяют значение константы скорости на основе показателей, полученных на ранних этапах экспозиции.

В таком случае необходимо аналогичным образом повторить выполнение анализа, чтобы определить, является ли эта нелинейность присущей исследуемой химической продукции или это отклонения в ходе исследования. Если нелинейность воспроизводима, то для вычисления окончательного результата применяют представленный выше порядок расчетов, основанный на использовании индивидуальных значений показателя деплеции (обеднения).

(iii) Помехи при измерениях интенсивности флуоресценции, т.е. автофлуоресценция или тушения флуоресценции: Контрольные лунки, содержащие исследуемую химическую продукцию без добавления к ней исследуемого пептида, предназначены для выявления случаев автофлуоресценции исследуемой химической продукции или случаев тушения им искомой флуоресценции. Поскольку результаты скорректированны с учетом уровня автофлуоресценции, зарегистрированного в лунках с контрольной пробой исследуемой химической продукции, компенсация низких значений автофлуоресценции не представляет затруднений, однако при ее высокой интенсивности показатели флуоресценции аддуктов пептида и собственной флуоресценции вещества могут быть не полностью аддитивными по отношению друг к другу, таким образом, простое вычитание значений, соответствующих автофлуоресценции, может приводить к искажению оценки истощения пептида, связанному не с ослабеванием флуоресцентного сигнала, а именно с указанным фактом неаддитивности. Соответственно, рекомендуется проверить, зависит ли наблюдаемая деплеция (обеднение) пептида от времени. Если подобная зависимость не подтверждается и при этом регистрируется автофлуоресценция, то предполагается, что происходит уменьшение концентрации от флуоресценции. Явление тушения флуоресценции также может привести к "кажущейся деплеции (обеднению)" пептида, это происходит в самом начале, в дальнейшем измеряемое значение деплеции (обеднения) не увеличивается со временем. Если выполняются оба указанных условия, то это свидетельствует о том, что видимый уровень деплеции (обеднения) обусловлен тушением флуоресценции. Такие случаи встречаются редко. Если имеющиеся результаты вызывают сомнения, испытания можно повторить, однако если описанный эффект выражен четко, повторение не требуется. В подобной ситуации оценка исследуемой химической продукции не может быть получена с применением метода kDPRA (в силу технических причин), за исключением случаев, когда аналогичные измерения могут быть выполнены с использованием другого флуоресцентного маркера, не вызывающего автофлуоресценцию и не подверженного гашению (см. раздел II приложения 1 к протоколу DB-ALM [62]).

(iv) Все перечисленные выше случаи подробно описаны в протоколе DB-ALM, а в процессе обработки информации с использованием шаблона Excel, предлагаемого вместе с протоколом DB-ALM, для них автоматически генерируются соответствующие предупреждения.

3.4.4.3 Модель построения прогнозов

3.4.4.3.1 Метод kDPRA предусматривает использование данных о кинетической скорости реакции деплеции (обеднения) пептида для различия между исследуемой химической продукцией, способной вызывать сенсибилизацию кожи и подлежащей отнесению к подклассу опасности 1A согласно СГС ООН, и исследуемой химической продукцией, не подлежащей отнесению к подклассу опасности 1A (т.е. вне подкласса опасности 1A) согласно СГС ООН [54]. Любые результаты, полученные с применением данного метода, если они не свидетельствуют о необходимости отнесения исследуемой химической продукции к подклассу опасности 1A, следует рассматривать с учетом ограничений, описанных в 3.4.1.3 и приложении G.

Таблица 5 - Модель построения прогнозов для kDPRA

3.4.4.3.3 Значение кинетической константы скорости может быть дополнительно использовано в рамках реализации комплексных подходов, таких как IATA или DA, для оценивания сенсибилизирующего потенциала исследуемой химической продукции при его воздействии на кожу по непрерывной шкале, как это предусмотрено требованиями оценки рисков [54], [61].

3.4.4.4 Протокол испытаний

Протокол испытаний должен включать в себя следующую информацию:

Исследуемая химическая продукция и контрольные пробы (положительная контрольная проба и проба растворителя/вещества-носителя)

Однокомпонентное вещество (исследуемая химическая продукция или контрольная проба):

- химическое наименование, а именно название (названия) по IUPAC или CAS, регистрационный номер (номера) CAS, коды SMILES или InChl, структурную формулу и/или другие отличительные признаки;

- физико-химические свойства, такие как агрегатное состояние, внешний вид, растворимость в воде, молекулярная масса, а также другие дополнительные физико-химические свойства;

- степень чистоты, химическую характеристику примесей, с учетом целесообразности и возможности практической реализации;

- способ обработки перед началом испытаний, если такая обработка проводилась (подогрев, измельчение);

- значение (значения) концентрации вещества при проведении испытаний;

- сведения об условиях хранения и сведения о стабильности вещества, если таковые имеются.

Дополнительные сведения о положительной контрольной пробе:

- ссылки на результаты предыдущих испытаний положительных контрольных проб, если таковые проводились, подтверждающие подходящий характер критериев приемлемости, использованных для циклов испытаний.

Дополнительные сведения о пробе растворителя/вещества-носителя:

- описание используемого растворителя/вещества-носителя и соотношение его компонентов, если таковые имеются;

- обоснование выбора растворителя, отличного от ацетонитрила, и исследовательная оценка влияния растворителя на стабильность пептида.

Пептид

- сведения о поставщике, партии, степени чистоты.

Флуоресцентный анализ

- сведения об используемом флуориметре (например, модель и тип прибора), включая выбранные настройки длины волны.

Проверка квалификации

- отметку о том, что испытательная лаборатория смогла подтвердить свою компетентность в использовании данного метода исследования до начала его регулярного применения путем проведения испытаний специально отобранной для этого химической продукции.

Оценка результатов

- описание любых незапланированных изменений, внесенных в методику испытаний;

- анализ результатов, полученных с применением метода исследования kDPRA, с учетом соответствия их значений диапазонам, указанным в 3.4.4.3.2;

- прочие наблюдения, важные для результатов исследования, например, сведения о появлении осадка в реакционной смеси по истечении времени инкубирования, если это имело место, и о том, был ли образовавшийся осадок растворен повторно или удален путем обработки в центрифуге.

Выводы

Приложение А

(обязательное)

Известные ограничения, связанные с применением метода кинетического прямого анализа реакционной способности пептидов

В таблице А.1 представлены известные ограничения для метода DPRA.

Таблица А.1 - Ограничения для метода DPRA

Приложение B

(обязательное)

Вещества, рекомендованные к использованию для проверки квалификации. Сенсибилизация кожи in chemico. Прямой анализ реакционной способности в отношении пептидов

До того как приступить к регулярному применению метода DPRA, лаборатории должны подтвердить свою техническую компетентность, подготовив на его основе достоверный прогноз сенсибилизирующей способности для 10 специально отобранных химических веществ, перечисленных в таблице А.1, и правильно определив значения деплеции (обеднения) цистеина и лизина в соответствующем нормированном диапазоне для 8 из 10 таких контрольных веществ для каждого пептида. Вещества согласно приведенному списку для проверки квалификации подобраны таким образом, чтобы охватить весь диапазон возможных реакций при развитии сенсибилизации кожи. Дополнительными критериями отбора послужили доступность этих веществ для коммерческого приобретения, наличие для них как достоверных справочных данных, полученных in vivo, так и достоверных данных, полученных in vitro с использованием метода DPRA, а также положительный опыт их практического использования в ходе соответствующего валидационного исследования, в роли координатора которого выступала EURL ECVAM, для подтверждения успешной реализации рассматриваемого метода лабораториями, принимавшими участие в исследовании.

Таблица B.1 - Список рекомендованных веществ для проверки квалификации при проведении испытаний по методу прямого анализа реакционной способности в отношении пептидов

Приложение С

(обязательное)

Примеры последовательности анализа

В последовательности выполнения анализа должна быть предусмотрена обработка трех комплектов стандартных контрольных проб (т.е. проб, представленных только соответствующими пептидами, растворенными в выбранном растворителе):

- стандартная контрольная проба A. Для проверки пригодности системы ВЭЖХ;

- стандартная контрольная проба B. Исследуется дважды, в начале и в конце анализа, для подтверждения стабильности характеристик стандартных контрольных проб во время выполнения анализа;

- стандартная контрольная проба C. Включается в обработку для подтверждения отсутствия влияния растворителя, служащего для растворения исследуемой химической продукции, на показатели процентной деплеции (обеднения) пептидов.

Приложение D

(обязательное)

Известные ограничения, связанные с применением метода анализа реакционной способности в отношении производных аминокислот

В таблице D.1 представлено краткое описание известных ограничений для метода ADRA.

Таблица D.1 - Известные ограничения для метода ADRA

Приложение E

(обязательное)

Вещества, рекомендованные к использованию для проверки квалификации. Сенсибилизация кожи in chemico. Анализ реакционной способности в отношении производных аминокислот (ADRA)

До того как приступить к регулярному применению метода ADRA, лаборатории должны подтвердить свою техническую компетентность, подготовив на его основе достоверный прогноз сенсибилизирующей способности для 10 специально отобранных веществ, перечисленных в таблице В.1, и правильно определив значения деплеции (обеднения) NAC и NAL в соответствующих нормированных диапазонах для 8 из 10 таких контрольных веществ. Вещества согласно приведенному списку для проверки квалификации подобраны таким образом, чтобы полностью охватить диапазон возможных реакций при развитии кожной сенсибилизации. Дополнительными критериями отбора послужили доступность этих веществ для коммерческого приобретения, наличие для них как достоверных справочных данных, полученных in vivo, так и достоверных данных, полученных с использованием метода ADRA, а также опыт их практического использования в ходе валидационного исследования, в роли координатора которого выступал JaCVAM, для подтверждения успешного применения проверяемого метода.

Таблица E.1 - Список рекомендованных химических веществ для проверки квалификации при проведении исследований по методу ADRA

Приложение F

(обязательное)

Примерная последовательность выполнения анализа методом ВЭЖХ

Исследование каждой пробы при выполнении ВЭЖХ-анализа осуществляют в соответствии с пунктами алгоритма, представленными ниже. Дополнительные сведения о порядке выполнения ВЭЖХ-анализа см. в таблице F.1 с примерами аналитических последовательностей для ВЭЖХ ниже.

1. Приступают к анализу градуировочных стандартных растворов и стандартной контрольной пробы A (N = 3).

2. Поочередное выполнение анализа пробы для контроля совместного элюирования не требуется, если такой анализ предусмотрен после выполнения анализа стандартного раствора и стандартной контрольной пробы A.

3. Анализ контрольной пробы B выполняют трижды (в общей сложности шесть раз): до и после анализа исследуемой пробы, стандартной контрольной пробы C и положительной контрольной пробы.

4. Выполняют анализ растворов стандартной контрольной пробы C, положительной контрольной пробы и исследуемого химического вещества (после выполнения анализа первой группы каждого вида параллельно обрабатываемых проб выполняют анализ второй группы каждого вида параллельно обрабатываемых проб).

Таблица F.1 - Дополнительные сведения о порядке выполнения ВЭЖХ-анализа

В последовательности выполнения анализа должна быть предусмотрена обработка трех комплектов стандартных контрольных проб (т.е. проб, представленных NAC или NAL соответственно, растворенных в выбранном растворителе):

Стандартная контрольная проба A: Контрольная проба для проверки пригодности системы ВЭЖХ. Пробу A используют для контроля значений концентрации NAC и NAL, соответствующих каждой градуировочной кривой, при добавлении ацетонитрила вместо исследуемой химической продукции.

Стандартная контрольная проба B: Контрольная проба для проверки стабильности реакционного раствора при выполнении анализа. Пробу B используют для контроля значений коэффициента изменчивости (CV) для каждой тройки значений площадей пиков NAC/NAL в анализируемом растворе при добавлении ацетонитрила вместо исследуемой химической продукции в начале и в конце анализа.

Стандартная контрольная проба C: Контрольная проба для расчета значения деплеции (обеднения) NAC/NAL для каждого раствора исследуемой химической продукции. Расчет значения деплеции (обеднения) NAC/NAL осуществляют после выполнения измерений на трех контрольных пробах C с добавлением растворителя вместо исследуемой химической продукции. Пробу C приготавливают для всех растворителей, используемых для растворения исследуемой химической продукции.

Приложение G

(обязательное)

Известные ограничения, связанные с применением метода кинетического прямого анализа реакционной способности пептидов

В таблице G.1 представлены известные ограничения для метода kDPRA.

Таблица G.1 - Известные ограничения для метода kDPRA

_______________

Приложение H

(обязательное)

Вещества, рекомендованные к использованию для проверки квалификации. Сенсибилизация кожи in chemico. Кинетический прямой анализ реакционной способности пептидов (kDPRA)

Таблица H.1 - Список рекомендованных веществ для проверки квалификации при проведении исследований по методу кинетического прямого анализа реакционной способности в отношении пептидов

Приложение ДА

(справочное)

Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой международного документа

Таблица ДА.1

Библиография