ГОСТ 34735-2021 Методы испытаний по воздействию химической продукции на организм человека. Методы испытаний с применением реконструированного рогового эпителия человека (RhCE) для определения химической продукции, не требующей классификации опасности как вызывающей раздражение или серьезное повреждение глаз

        ГОСТ 34735-2021

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЙ ПО ВОЗДЕЙСТВИЮ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ НА ОРГАНИЗМ ЧЕЛОВЕКА

Методы испытаний с применением реконструированного рогового эпителия человека (RhCE) для определения химической продукции, не требующей классификации опасности как вызывающей раздражение или серьезное повреждение глаз

Methods for studying the effects of chemicals on the human body. Reconstructed human corneal epithelium (RhCE) test methods to determine chemicals not requiring hazard classification as irritating or serious eye damage

МКС 71.040.10

13.020.01

Дата введения 2024-05-01

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены".

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Республиканским унитарным предприятием "Белорусский государственный институт метрологии" (БелГИМ) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии документа, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протоколом от 30 июня 2021 г. N 141-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 16 ноября 2023 г. N 1408-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34735-2021 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 мая 2024 г.

5 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному документу OECD 492:2019* "Руководство по тестированию химической продукции. Метод испытания с применением реконструированного рогового эпителия человека (RhCE) для определения химической продукции, не требующей классификации и маркировки как вызывающей раздражение или серьезное повреждение глаз" ("Guidelines for the testing of chemicals. Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage", MOD) путем изменения его структуры для приведения в соответствие с правилами, установленными в ГОСТ 1.5 (подразделы 4.2 и 4.3).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного документа для увязки с наименованиями, принятыми в существующем комплексе межгосударственных стандартов.

Международный документ разработан Международной организацией экономического сотрудничества и развития (OECD).

Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой указанного международного документа приведено в дополнительном приложении ДА

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.

В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"

Введение

Под серьезным повреждением глаз, в соответствии с Согласованной на глобальном уровне системой классификации и маркировки химической продукции Организации Объединенных Наций (СГС ООН) [1] понимают такие повреждения глазных тканей либо такое обусловленное физическими причинами существенное ухудшение зрения после воздействия на глаза исследуемой химической продукции, которые не могут быть полностью обратимы. Напротив, раздражение глаз, также описанное в рамках СГС ООН, обозначает изменения, происходящие в глазах после воздействия на них исследуемой химической продукции, которые являются полностью обратимыми. Исследуемую химическую продукцию, вызывающую серьезные повреждения глаз, необходимо относить к классу опасности 1, а вызывающую раздражение глаз - к классу опасности 2 в соответствии с классификацией СГС ООН. Исследуемая химическая продукция, которая не была классифицирована как способная вызывать раздражение или серьезное повреждение глаз, рассматривается как не отвечающая условиям для отнесения ее к классу опасности 1 или 2 (подклассы опасности 2A или 2B) согласно СГС ООН, т.е. как продукция, для которой класс опасности согласно СГС ООН отсутствует.

Оценивание проявлений серьезного повреждения/раздражения глаз обычно предполагает использование для этой цели лабораторных животных (Руководство OECD по проведению испытаний (OECD 405); впервые принято в 1981 г., пересмотрено в 1987, 2002 и 2017 гг.) [2]. Выбор наиболее подходящего метода исследований, а также реализация положений настоящего стандарта должны осуществляться с учетом требований Руководящего документа по интегрированным подходам к исследованиям и оценке (Integrated Approaches on Testing and Assessment - IATA) серьезного повреждения и раздражения глаз [3].

Общепризнанно, что в обозримом будущем не следует ожидать появления одного единственного метода in vitro, который мог бы полностью заменить метод in vivo Дрейза [2], [18], позволяющий спрогнозировать весь диапазон серьезного повреждения/раздражения глаз, вызываемого химической продукцией различных классов. Тем не менее выверенное сочетание нескольких альтернативных методов испытаний, реализуемое в рамках единых (многоуровневых) стратегий исследования, основанных на "восходящем"/"нисходящем" подходе, вполне может оказаться способным заменить собой вышеупомянутый метод Дрейза [19]. Предполагается, что применение "восходящего" подхода уместно для случаев, когда, исходя из уже имеющейся информации, способность исследуемой химической продукции вызывать раздражение глаз, предположительно, в недостаточной степени выражена для присвоения ей конкретного класса опасности, в то время как к "нисходящему" подходу следует прибегать в ситуациях, когда ее воздействие, по всей вероятности, должно приводить к серьезному повреждению глаз.

1 Область применения

1.1 Настоящий стандарт устанавливает методы испытаний in vitro для определения химической продукции (веществ и смесей), не требующей классификации и маркировки как вызывающей раздражение или серьезное повреждение глаз в соответствии с требованиями СГС ООН [1]. Данные методы предусматривают использование так называемого реконструированного эпителия роговицы человеческого глаза (reconstructed human cornea-like epithelium - RhCE), достоверно имитирующего гистологические, морфологические, биохимические и физиологические характеристики эпителия роговицы глаза человека. Для определения химической продукции, способной вызывать серьезные повреждения глаз, существенные для конечных показателей здоровья человека, или не требующей такой классификации, могут применяться также четыре альтернативных валидированных метода испытаний in vitro, признанные научно обоснованными и изложенные в [4], [5], [6] и [7].

2 Термины, определения и сокращения

В настоящем стандарте применены следующие термины и сокращения с соответствующими определениями:

2.1 валидированный метод испытаний (validated test method): Метод испытаний, для которого завершены валидационные исследования с целью определения его релевантности (включая точность) и надежности для конкретной цели. Важно отметить, что валидированный метод не обязательно обеспечивает достаточную результативность с точки зрения его точности и надежности для признания его пригодным для конкретной цели [24].

2.2 вещество (substance): Химические элементы и их соединения, представленные в естественном состоянии или полученные при выполнении производственного процесса, включая любые добавки, необходимые для сохранения стабильности продукта, а также любые примеси, наличие которых обусловлено применяемым процессом, но исключая любые растворители, удаление которых не сказывается на стабильности вещества или на его составе [1].

2.3 ВЭЖХ (HPLC - High Performance Liquid Chromatography): Высокоэффективная жидкостная хроматография.

2.4 воспроизводимость (reproducibility): Согласованность результатов, получаемых при неоднократных испытаниях одной и той же химической продукции при применении одного и того же протокола (см. термин "надежность") [24].

2.5 восходящий подход (Bottom-Up Approach): Поэтапный подход, применяемый при исследовании химической продукции, предположительно не требующей классификации и маркировки как вызывающей раздражение или серьезное повреждение глаз, при котором в первую очередь определяется химическая продукция, не требующая классификации (отрицательный отклик), для выделения ее из числа прочей химической продукции (положительный отклик) [3].

2.6 доля ложноположительных заключений (false positive rate): Доля всей химической продукции, дающей отрицательный отклик, которая ошибочно идентифицирована как дающая положительный отклик. Это один из показателей результативности метода.

2.7 доля ложноотрицательных заключений (false negative rate): Доля всей химической продукции, дающей положительный отклик, которая ошибочно была идентифицирована как дающая отрицательный отклик. Это один из показателей результативности метода.

2.8 жизнеспособность тканей (tissue viability): Показатель, определяющий суммарную активность клеточной популяции в реконструированной ткани как ее способность восстанавливать краситель МТТ, который в зависимости от измеряемого конечного показателя и применяемого протокола испытаний коррелирует с общим числом и/или выживаемостью клеток.

2.9 замещающие испытания (replacement test): Испытания, которые предназначены для замены регулярно проводимых испытаний и одобрены для целей выявления опасностей и/или оценки рисков, обеспечивают доказанный аналогичный или более высокий уровень защиты здоровья человека, животных или охраны окружающей среды по сравнению с принятыми методами испытаний независимо от условий проведения испытаний и выбора исследуемой химической продукции [24].

2.10 избыточная доза (infinite dose): Количество исследуемой химической продукции, наносимой на модель ткани RhCE, превышающее количество, требуемое для полного и равномерного покрытия поверхности эпителия.

2.11 испытание (test): Отдельное испытание исследуемой химической продукции, проводимое по меньшей мере на двух параллельно обрабатываемых образцах ткани, как установлено соответствующими СОП.

2.12 исследуемая химическая продукция (test chemical): Химическая продукция (вещества или смеси), которая подвергается испытаниям.

2.13 класс опасности 1 согласно Согласованной на глобальном уровне системе классификации и маркировки химической продукции Организации Объединенных Наций; класс опасности 1 согласно СГС ООН (UN GHS Category 1): См. термины "серьезные повреждения глаз" и/или "необратимые последствия для глаз".

2.14 класс опасности 2 согласно Согласованной на глобальном уровне системе классификации и маркировки химической продукции Организации Объединенных Наций; класс опасности 2 согласно СГС ООН (UN GHS Category 2): См. термины "раздражение глаз" и/или "обратимые последствия для глаз".

2.15 класс опасности согласно Согласованной на глобальном уровне системе классификации и маркировки химической продукции Организации Объединенных Наций отсутствует; класс опасности согласно СГС ООН отсутствует (UN GHS No Category): Химическая продукция, не удовлетворяющая критериям классификации для химической продукции класса опасности 1 или 2 (подклассы опасности 2A или 2B) согласно СГС ООН. Синоним термина "не требует классификации".

2.17 многоуровневая стратегия исследования (tiered testing strategy): Стратегия, предусматривающая поэтапное проведение исследования, при котором вся существующая информация об исследуемой химической продукции анализируется в определенном порядке, с рассмотрением на каждом уровне совокупности имеющихся свидетельств с целью определения достаточности доступной информации для принятия решения о классификации по степени опасности, перед переходом на следующий уровень. Если способность исследуемой химической продукции вызывать раздражение может быть подтверждена на основе существующей информации, дальнейшее исследование не требуется [24].

2.18 МТТ (МТТ): 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид; тиазолил синий тетразолия бромид (CAS N 298-93-1).

2.19 надежность (reliability): Показатель того, что метод испытаний может быть реализован с получением воспроизводимых результатов в рамках одной или различных лабораторий в течение продолжительного времени при применении одного и того же протокола. Он оценивается путем вычисления внутри- и межлабораторной воспроизводимости и внутрилабораторной повторяемости. [24]

2.20 необратимые последствия для глаз (irreversible effects on the eye): См. "серьезные повреждения глаз".

2.21 не требует классификации (Not Classified): Химическая продукция, которая не подлежит классификации как вызывающая раздражение (класс опасности 2, подклассы опасности 2A или 2B согласно СГС ООН) или серьезное повреждение глаз (класс опасности 1 согласно СГС ООН). Синоним термина "класс опасности согласно СГС ООН отсутствует".

2.22 нисходящий подход (Top-Down Approach): Поэтапный подход, применяемый для исследования химической продукции, предположительно вызывающей серьезное повреждение глаз, при котором в первую очередь определяется химическая продукция, способная быть причиной серьезного повреждения глаз (положительный отклик), для выделения ее из числа прочей химической продукции (отрицательный отклик). [3]

2.23 обратимые последствия для глаз (reversible effects on the eye): См. термин "раздражение глаз".

2.24 однокомпонентное вещество (мono-constituent substance): Вещество, характеризуемое количественным составом, в котором одна основная структурная составляющая содержится в количестве не менее чем 80% (по массе).

2.25 ОП (OD - optical density): Оптическая плотность.

2.26 опасность (hazard): Изначально присущее свойство конкретной химической продукции или ситуации, заключающееся в их потенциальной способности вызывать деструктивные последствия в случаях, когда организм, система или субпопуляция подвергаются их воздействию.

2.27 отрицательная контрольная проба (negative control): Проба, включающая в себя все составляющие исследуемой системы и обрабатываемая с использованием вещества, заведомо не способного давать положительный отклик в данной системе. Данная проба используется параллельно с пробами, содержащими исследуемую химическую продукцию, а также другими контрольными пробами и служит для определения 100%-ного уровня жизнеспособности ткани.

2.28 оценивание по совокупности имеющихся свидетельств (weight-of-evidence): Процесс рассмотрения преимуществ и недостатков различной имеющейся информации при подготовке и обосновании заключения о потенциальной опасности исследуемой химической продукции.

2.29 положительная контрольная проба (positive control): Проба, содержащая все компоненты исследуемой системы и обрабатываемая с использованием вещества, заведомо дающего положительный отклик. Чтобы обеспечить возможность учитывать изменчивость во времени отклика, получаемого для данной пробы, этот положительный отклик не должен быть слишком завышенным.

2.30 раздражение глаз (eye irritation): Изменения, происходящие в глазах после воздействия на их поверхность исследуемой химической продукцией, которые являются полностью обратимыми по истечении 21 дня с момента такого воздействия. Синоним терминов "обратимые последствия для глаз" или "класс опасности 2 согласно СГС ООН" [1].

2.31 релевантность (relevance): Характеристика соответствия метода испытаний результату, полученному при исследованиях, а также его обоснованности и пригодности для определенных целей применения. Данная характеристика указывает пределы, в которых метод испытаний позволяет правильно измерить или спрогнозировать исследуемый биологический эффект. Релевантность включает рассмотрение точности (соответствия) метода испытаний [22].

2.32 роговица (cornea): Прозрачная часть передней оболочки глазного яблока, закрывающая радужную оболочку и зрачок и пропускающая лучи света внутрь глаза.

2.33 Согласованная на глобальном уровне система классификации и маркировки химической продукции Организации Объединенных Наций; СГС (GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (UN))): Система, предусматривающая классификацию химической продукции (веществ и смесей) в зависимости от характерных видов и уровней физической опасности, опасности для здоровья человека или опасности для окружающей среды, с применением соответствующих средств информирования, таких как пиктограммы, сигнальные слова, краткая характеристика опасности, меры по предупреждению опасности и паспорта безопасности, чтобы обеспечить информацией о ее негативном воздействии с целью защиты людей (в том числе сотрудников, работников, перевозчиков, потребителей и представителей аварийных служб) и окружающей среды [1].

2.34 серия испытаний (run): Испытания одной химической продукции или более параллельно с отрицательной и положительной контрольными пробами.

2.35 серьезные повреждения глаз (serious eye damage): Развитие повреждений глазных тканей либо обусловленное физическими причинами существенное ухудшение зрения после воздействия на поверхность глаза испытуемой химической продукцией, которые не являются полностью обратимыми по истечении 21 дня с момента такого воздействия. Синоним терминов "необратимые последствия для глаз" или "класс опасности 1 согласно СГС ООН" [1].

2.36 смесь (mixture): Смесь или раствор, состоящие из двух или более веществ, в которых они не вступают в реакцию друг с другом [1].

2.37 согласованность (concordance): См. точность "точность".

2.38 специфичность (specificity): Доля всей дающей отрицательный результат/неактивной химической продукции, которая была правильно классифицирована при применении соответствующего метода испытаний. Этот показатель является мерой точности для метода испытаний, позволяющего получать однозначные результаты, и служит важной отправной точкой при оценке релевантности такого метода [24].

2.39 стандартные операционные процедуры; СОП (Standard Operating Procedures - SOP): Выполняемые в рамках протокола процедуры, письменно оформленные и подробно описывающие, каким образом должна быть организована повседневная деятельность в определенной области и каким должен быть порядок выполнения операций в лаборатории при проведении конкретных видов исследований. Их наличие предусмотрено надлежащей лабораторной практикой.

2.40 стандарты результативности (performance standards): Стандарты, основанные на применении валидированного метода испытаний, который признан научно обоснованным, и обеспечивающие основу для сравнительной оценки других предлагаемых методов испытаний, подобных ему с механистической и функциональной точки зрения. Стандарты устанавливают: (1) важнейшие составляющие метода испытаний; (2) минимальный перечень эталонных химических веществ, отобранных из числа веществ, которые применялись для подтверждения пригодности валидированного метода испытаний, а также (3) сопоставимые уровни надежности и точности по результатам использования валидированного метода испытаний, которые предлагаемый метод испытаний должен демонстрировать при его оценке с использованием этого минимального перечня эталонных химических веществ [24].

2.41 СО (SD - Standard Deviation): Стандартное отклонение.

2.42 тетразолиевый краситель; ТК (tetrazolium dye (TD)): Соли тетразолия MTT, WST-8 и WST-1.

2.43 точность (accuracy): Близость результата испытаний, полученного с применением соответствующего метода испытаний, к принятому эталонному значению величины. Точность является показателем результативности метода и одним из аспектов релевантности. Данный термин часто применяется как взаимозаменяемый термину "согласованность" (concordance) для указания доли корректных результатов, полученных с применением соответствующего метода испытаний [24].

2.44 УВЭЖХ (UPLC): Ультравысокоэффективная жидкостная хроматография.

2.45 формазановый краситель; ФК (Formazan dye (FD)): Пигментообразующий продукт восстановления MTT, WST-8 или WST-1.

2.46 химическая продукция (chemical): Вещество или смесь веществ.

2.47 чувствительность (sensitivity): Доля всей дающей положительный результат/активной химической продукции, которая была правильно классифицирована при применении соответствующего метода испытаний. Этот показатель является мерой точности для методов испытаний, позволяющих получать однозначные результаты, и служит важной отправной точкой при оценке релевантности таких методов [24].

2.48 эталонная химическая продукция (benchmark chemical): Химическая продукция, используемая как эталон для сравнения с испытуемой химической продукцией. Эталонная химическая продукция должна (1) происходить из стабильного и надежного источника (источников); обладать следующими свойствами: (2) структурным и функциональным сходством с классом исследуемой продукции; (3) хорошо изученными физико-химическими характеристиками; (4) наличием подтверждающих данных об известных воздействиях, а также (5) известным уровнем активности в диапазоне ожидаемого отклика.

2.49 CV (Coefficient of Variation): Коэффициент вариации.

2.50 Dev (Deviation): Отклонение.

2.52 EIT (Eye Irritation Test): Испытание на раздражение глаз.

2.54 EURL ECVAM (European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing): Референтная лаборатория по валидации альтернативных методов Европейского союза.

2.55 HCWST (NSWST): Неспецифическое восстановление WST-8 или WST-1.

2.57 HCMTT (NSMTT): Неспецифическое восстановление МТТ.

2.60 LLOQ (Lower Limit of Quantification): Нижний предел количественного определения.

2.61 LogP: Логарифм коэффициента распределения октанол - вода.

2.62 RhCE (Reconstructed human Cornea-like Epithelium): Реконструированный эпителий роговицы человеческого глаза.

2.63 ULOQ (Upper Limit of Quantification): Верхний предел количественного определения.

2.64 UVCB (substances of Unknown or Variable Composition, complex reaction products or Biological materials): Вещества неизвестного или переменного состава, продукты комплексных реакций или вещества биологического происхождения.

2.65 VRM (Validated Reference Method): Валидированный референтный метод.

2.68 WST: Водорастворимая соль тетразолия.

2.69 WST-1: Водорастворимая соль тетразолия-1 [4-[3-(4-йодофенил)-2-(4-нитрофенил)-2Н-5-тетразолио]-1,3-бензол-дисульфонат (CAS N 150849-52-8).

2.70 WST-8: Водорастворимая соль тетразолия-8 [2-(2-метокси-4-нитрофенил)-3-(4-нитрофенил)-5-(2,4-дисульфофенил)-2H-тетразолий, мононатриевая соль (CAS N 193149-74-5).

3 Исходные положения

3.3 Методы настоящего стандарта применимы для испытаний веществ и смесей, которые являются жидкостями, твердыми, полутвердыми и воскоподобными продуктами. Жидкости могут иметь водную или неводную основу; твердые вещества могут быть растворимыми или нерастворимыми в воде. Твердые вещества по возможности перед испытанием должны быть измельчены до тонкого порошкообразного состояния; никакой другой предварительной обработки пробы не требуется. Работы по валидации методов настоящего стандарта для газов и аэрозолей не проводились. Это означает, что, невзирая на теоретическую осуществимость испытаний газов и аэрозолей с применением технологий на основе RhCE, настоящим стандартом такая возможность не предусмотрена. Перед испытанием смесей веществ, сложной для испытаний химической продукции (например, нестабильной) или такой химической продукции, которая не может быть с уверенностью отнесена к области применения настоящего стандарта, в каждом случае следует уточнять, являются ли результаты такого исследования научно обоснованными. Изучение данного вопроса не требуется, если необходимость испытаний соответствующей смеси веществ установлена действующими требованиями.

3.4 Исследуемая химическая продукция, которая поглощает свет в том же спектральном диапазоне, что и формазановый краситель (ФК) в естественном состоянии или после обработки, а также исследуемая химическая продукция, которая способна непосредственно восстанавливать витальный краситель ТК (до ФК), может препятствовать правильному определению жизнеспособности тканей и требует дополнительного использования контрольных проб для внесения соответствующих поправок в результаты. Вид контрольных проб может различаться в зависимости от характера помех, создаваемых исследуемой химической продукцией, и от применяемой в каждом случае методики количественного определения ФК (подробнее см. 7.2.7.2-7.2.7.8).

3.8 Метод LabCyte CORNEA-MODEL EIT может применяться для идентификации химической продукции, не требующей классификации как вызывающей раздражение или серьезное повреждение глаз в рамках системы СГС ООН [1]. В соответствии с данными, полученными при проведении последующего валидационного исследования [14], метод LabCyte CORNEA-MODEL EIT удовлетворяет критериям воспроизводимости и воспроизводимой способности, предусмотренным стандартами результативности для методов настоящего стандарта [23]. Кроме того, следует отметить, что базой данных, включающей результаты испытаний химической продукции 139 наименований, располагает разработчик модели ткани.

3.11 Недостатком методов настоящего стандарта является то, что они не позволяют разделять химическую продукцию, оказывающую раздражающее воздействие (обратимые последствия для глаз), т.е. продукцию класса опасности 2, и химическую продукцию, вызывающую серьезные повреждения (необратимые последствия для глаз), т.е. продукцию класса опасности 1, а также продукцию с сильным (подкласс опасности 2A) и слабым (подкласс опасности 2B) раздражающим воздействием на глаза, как это предусмотрено СГС ООН [1]. В подобных случаях требуется проведение дальнейших испытаний с соблюдением требований Руководящего документа по интегрированным подходам к исследованиям и оценке серьезного повреждения и раздражения глаз [3].

3.12 Термин "исследуемая химическая продукция" в настоящем стандарте применяется для обозначения объекта испытания и не связан с возможностью применения метода RhCE для испытаний тех или иных веществ и/или их смесей.

4 Сущность метода испытаний

4.2 Химически вызванное серьезное повреждение/раздражение глаз, основными признаками которого in vivo обычно являются помутнение роговицы, воспаление радужной оболочки, покраснение и/или отек конъюнктивы, представляет собой результат цепочки событий, начинающейся с проникновения химической продукции через роговицу и/или конъюнктиву и заканчивающейся разрушением клеток. В повреждении клеток могут быть задействованы различные механизмы, в том числе: лизис клеточной мембраны (например, поверхностно-активными веществами, органическими растворителями); коагуляция макромолекул, в частности белков (например, поверхностно-активными веществами, органическими растворителями, щелочами и кислотами); омыление жиров (например, щелочами); а также алкилирование или иного рода ковалентное взаимодействие с макромолекулами (например, при участии отбеливающих средств, пероксидов и алкиляторов) [19], [36], [37]. В то же время доказано, что именно цитотоксический аспект имеет чрезвычайно большое, если не решающее значение для определения общей способности химической продукции вызывать серьезное повреждение/раздражение глаз, вне зависимости от того, какими конкретно физико-химическими процессами была спровоцирована подобная реакция [38], [39]. Более того, потенциальная способность вызывать серьезное повреждение/раздражение глаз в целом определяется размером первичных повреждений [36], коррелирующих с количеством погибших клеток [38], а также с масштабом дальнейших реакций и вероятных последствий воздействия [40], [41]. Таким образом, если химическая продукция, способная вызывать самое легкое раздражение, как правило, воздействует лишь на поверхностный слой эпителия роговицы, то от химической продукции со слабой и средней раздражающей способностью страдают главным образом эпителий и поверхность стромы, а химическая продукция с сильной раздражающей способностью разрушает эпителий, глубоко строму и в отдельных случаях эндотелий роговицы [39], [42]. В основе определения жизнеспособности ткани модели RhCE после воздействия нанесенной на ее поверхность химической продукции с целью идентификации химической продукции, которая не требует классификации как вызывающая серьезное повреждение/раздражение глаз (класс опасности согласно СГС ООН отсутствует), лежит предположение, что всякая химическая продукция, при воздействии которой развивается серьезное повреждение или раздражение глаз, вызывает цитотоксические реакции в эпителии роговицы и/или в конъюнктиве.

5 Подтверждение квалификации

5.1 До того как приступить к регулярному применению методов испытаний с использованием RhCE для целей технического регулирования, лаборатории должны подтвердить свою техническую компетентность, правильно классифицировав химическую продукцию, перечисленную в таблице 1. Данная продукция была выбрана из химической продукции, которая использовалась при валидационных исследованиях методов VRM1 и VRM2 [9], [11], [12]. Выбор был обусловлен тем, что данная химическая продукция:

- представляет различные агрегатные состояния;

- представляет весь диапазон ответных реакций in vivo при серьезном повреждении/раздражении глаз на основе достоверных результатов испытаний на глазу кролика [2], [16] и системы классификации СГС ООН (т.е. класс опасности 1, подклассы опасности 2A, 2B или класс опасности отсутствует) [1];

- обеспечивает различные основания для классификации при испытаниях in vivo [34], [43];

- относится к классам химической продукции, которая использовалась при валидационных исследованиях [9], [11], [12];

- представляет весь спектр органических функциональных групп [9], [11], [12];

- обладает хорошо изученной химической структурой [9], [11], [12];

- имеет выраженную собственную окраску и/или способна непосредственно восстанавливать ТК;

- обеспечивает получение воспроизводимых результатов при применении методов с использованием RhCE при проведении их валидации;

- должным образом была идентифицирована при применении методов с использованием RhCE на этапе валидационных исследований;

- охватывает весь диапазон ответных реакций in vitro на основе достоверных данных, полученных при применении методов с использованием RhCE (жизнеспособность от 0% до 100%);

- является доступной для коммерческого приобретения;

- не требует неоправданных затрат на закупку и/или последующую утилизацию.

В случае когда лаборатория не располагает каким-либо веществом, приведенным в перечне, или оно не может быть использовано в силу каких-либо иных уважительных причин, вместо него допускается использовать другое вещество, удовлетворяющее критериям, приведенным выше, например, из числа химических веществ, на примере которых проводилась валидация VRM. Для таких отступлений от общего правила должны быть убедительные обоснования.

5.2 Рекомендуется, чтобы в рамках проверки квалификации пользователи самостоятельно контролировали барьерные свойства тканей после их получения в соответствии с указаниями разработчика данной модели тканей RhCE (см. 7.1, 7.2.2 и 7.2.5). Это особенно важно в том случае, если транспортирование тканей осуществляется на большие расстояния и/или занимает много времени. После успешного внедрения в практику соответствующего метода испытаний, а также приобретения и подтверждения достаточной квалификации для его применения систематическое проведение таких проверок не требуется. Тем не менее, если метод исследования применяется на постоянной основе, проверки рекомендуется продолжать и с регулярной периодичностью оценивать барьерные характеристики используемых тканей.

6 Методика испытаний

Таблица 1 - Перечень рекомендованных веществ для проверки квалификации

7 Составляющие методов испытаний с использованием RhCE

7.1 Общие параметры моделей

7.2 Функциональные параметры модели

7.2.1 Жизнеспособность

Таблица 2 - Диапазоны приемлемости значений ОП отрицательных контрольных проб (для пользователей метода испытаний)

7.2.2 Барьерные функции

7.2.3 Морфология

При гистологическом исследовании любой модели ткани RhCE должно подтверждаться наличие в ней структуры, аналогичной структуре эпителия роговицы человеческого глаза (в том числе не менее трех слоев жизнеспособных эпителиальных клеток и некератинизированного эпителия). Для трех методов испытаний наличие у моделей тканей соответствующей морфологии подтверждается непосредственно разработчиком/поставщиком, следовательно, у пользователя, применяющего эти методы, отсутствует необходимость в самостоятельном подтверждении ее соответствия для каждой новой партии.

7.2.4 Воспроизводимость

Результаты испытаний положительных и отрицательных контрольных проб, полученные с применением соответствующего метода, должны обладать долговременной воспроизводимостью.

7.2.5 Контроль качества (КК)

Таблица 3 - Контроль качества. Критерии приемки партий

7.2.6 Нанесение исследуемой химической продукции и контрольных веществ

7.2.7 Определение жизнеспособности тканей

7.2.7.6 Важно иметь в виду, что помехи, обусловленные неспецифическим восстановлением ТК и неспецифическим окрашиванием, могут приводить к повышению значений ОП пробы (при измерениях поглощения), а помехи, обусловленные неспецифическим восстановлением ТК, - к увеличению площади пика ФК пробы (при применении методов ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии) до уровней, выходящих за пределы линейного диапазона спектрофотометрического оборудования. По этой причине при использовании моделей RhCE для каждой лаборатории важной задачей является определение линейного диапазона ОП/площади пика применяемого для испытаний спектрофотометрического оборудования с помощью MTT-формазана (CAS N 57360-69-7), доступного для приобретения, например, у компании Sigma-Aldrich (кат.N M2003), WST-8-формазана (CAS N 193149-76-7), доступного для приобретения, например, у компании Dojindo Molecular Technologies, или WST-1-формазана (CAS N 150849-53-9), доступного для приобретения, например, у компании Toronto Research Chemicals (кат. N 1718750).

7.2.7.8 Методы ВЭЖХ/УВЭЖХ могут использоваться для количественного определения ФК при испытаниях любых видов химической продукции (окрашенной, неокрашенной, восстанавливающей и не восстанавливающей ТК) [10], [48]. Существует большое разнообразие ВЭЖХ/УВЭЖХ спектрофотометрических систем, в связи с чем аналитические условия, обеспечиваемые системами, которые находятся в распоряжении у конкретных пользователей, едва ли могут быть во всех случаях полностью идентичными. С учетом данного обстоятельства до начала использования выбранной системы для целей количественного определения ТК в пробах необходимо убедиться в ее соответствии критериям приемлемости, установленным для стандартного набора квалификационных параметров, основанным на положениях руководства по валидации биоаналитических методов в промышленности, которое было разработано американским Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов [48], [49] Данные ключевые параметры и действующие для них критерии приемлемости приведены в приложении Д. Если спектрофотометрическая система ВЭЖХ/УВЭЖХ обеспечивает соблюдение критериев согласно приложению Д, она признается пригодной для выполнения количественных определений ФК в аналитических условиях, предусмотренных настоящим стандартом.

7.2.8 Критерии приемлемости

7.2.9 Интерпретация результатов и модель построения прогнозов

7.2.9.1 Значения ОП/площади пиков, полученные для параллельно обрабатываемых образцов тканей каждой исследуемой химической продукцией, должны использоваться для вычисления среднего арифметического значения жизнеспособности в процентах (среднего арифметического для испытуемых образцов тканей) по отношению к результату, полученному для отрицательной контрольной пробы и принятому равным 100%. Предельные значения жизнеспособности тканей (в процентах) для идентификации химической продукции, не требующей классификации как вызывающей раздражение или серьезное повреждение глаз (класс опасности согласно СГС ООН отсутствует), приведены в таблице 4. Интерпретацию полученных результатов следует осуществлять следующим образом:

- исследуемую химическую продукцию признают не требующей классификации и маркировки в рамках СГС ООН (класс опасности отсутствует), если среднее арифметическое значение жизнеспособности тканей (в процентах) после воздействия и последующего инкубирования больше (>) установленного предельного значения жизнеспособности (в процентах), приведенного в таблице 4. В этом случае проведение дальнейших испытаний с применением других методов не требуется;

Таблица 4 - Модели построения прогнозов в соответствии с классификацией СГС ООН

Эталонная химическая продукция может быть использована для оценивания потенциальной способности неизвестной исследуемой химической продукции вызывать серьезное повреждение/раздражение глаз или для оценивания относительной офтальмологической токсичности классифицируемой химической продукции в пределах заданного диапазона положительного отклика.

8 Данные и отчеты об испытаниях

8.1 Данные

8.2 Отчет об испытаниях

Отчет об испытаниях должен включать в себя следующую информацию:

Исследуемая химическая продукция:

Однокомпонентное вещество:

- идентификационные данные химической продукции, а именно название (ия) по IUPAC или CAS, регистрационный номер (номера) CAS, коды SMILES или InChl, структурную формулу и/или другие отличительные признаки;

- сведения об агрегатном состоянии, летучести, показателе pH, значении LogP, молекулярной массе, классе химических веществ, а также по возможности других значимых физико-химических характеристиках;

- сведения о степени чистоты, характеристика примесей, если подготовка такой характеристики возможна и практически целесообразна, и т.п.;

- способ обработки перед началом испытаний, если такая обработка проводилась (например, подогрев, измельчение);

- сведения об условиях хранения и стабильности вещества, если таковые имеются.

Многокомпонентное вещество, UVCB и смеси:

- как можно более полное описание вещества, например все доступные сведения о химических обозначениях (см. выше), степени чистоты, о количественных долях и соответствующих физико-химических характеристиках (см. выше) его составляющих;

- сведения об агрегатном состоянии, а также по возможности других значимых физико-химических характеристиках;

- сведения о степени чистоты, характеристика примесей, если подготовка такой характеристики возможна и практически целесообразна, и т.п.;

- способ обработки перед началом испытаний, если такая обработка проводилась (например, подогрев, измельчение);

- сведения об условиях хранения и стабильности, если таковые имеются.

Вещества для положительной и отрицательной контрольных проб:

- идентификационные данные, а именно название (я) по IUPAC или CAS, регистрационный номер (номера) CAS, коды SMILES или InChI, структурную формулу и/или другие отличительные признаки;

- сведения об агрегатном состоянии, летучести, молекулярной массе, классе химических веществ, а также по возможности других значимых физико-химических характеристиках;

- сведения о степени чистоты, характеристика примесей, если подготовка такой характеристики возможна и практически целесообразна, и т.п.;

- способ обработки перед началом испытаний, если такая обработка проводилась (например, подогрев, измельчение);

- сведения об условиях хранения и стабильности вещества, если таковые имеются;

- обоснование выбора вещества отрицательной контрольной пробы, отличного от рекомендованных в приложении А, при необходимости;

- обоснование выбора вещества положительной контрольной пробы, отличного от рекомендованных в приложении А, при необходимости;

- ссылки на результаты прошлых испытаний отрицательных и положительных контрольных проб, подтверждающие пригодность критериев приемлемости, использованных для серий испытаний.

Информация о лице/организации, осуществлявших финансирование, и лаборатории, проводившей испытания:

- наименование/имя и адрес организации/лица, осуществлявших финансирование, лаборатории, где проводились испытания, а также имя руководителя исследования.

Использованная модель ткани RhCE и применявшийся протокол исследования (с соответствующим обоснованием выбора, при необходимости).

Условия испытаний в соответствии с применяемым методом:

- сведения об использованной модели ткани RhCE, включая номер партии;

- сведения о длине волны и полосе пропускания (при необходимости), использованных для количественного определения ФК, и линейном диапазоне средства измерений (например, спектрофотометра);

- описание метода, используемого для количественного определения ФК;

- описание спектрофотометрической системы ВЭЖХ/УВЭЖХ, если такая система использовалась.

Полный объем сопроводительной информации о конкретной используемой модели тканей RhCE, включая сведения о ее характеристиках. Эта информация, в частности, должна включать данные, касающиеся:

- контроля качества с точки зрения жизнеспособности (поставщиком);

- контроля жизнеспособности в условиях, предусмотренных методом испытаний (пользователем);

- контроля качества с точки зрения эффективности барьерных функций ткани (для положительных и отрицательных контрольных проб);

- морфологии ткани (если таковые имеется);

- других видов контроля качества (КК) модели ткани RhCE (если таковые имеются);

- ссылки на данные прошлых наблюдений за характеристиками модели ткани RhCE. Эта информация должна включать, но не ограничиваться сведениями, касающимися приемлемости результатов КК со ссылкой на накопленные данные соответствующей партии ткани;

- сведения о наличии у испытательной лаборатории достаточной квалификации до начала регулярного применения соответствующего метода испытаний, подтвержденной с использованием химических веществ согласно рекомендованному списку для проверки квалификации.

Критерии приемлемости результатов испытаний:

- средние значения, полученные для положительных и отрицательных контрольных проб, и диапазоны приемлемости, основанные на данных прошлых наблюдений;

- допустимая вариабельность характеристик образцов ткани, на которые наносились положительные и отрицательные контрольные пробы;

- допустимая вариабельность характеристик образцов ткани, на которые наносилась исследуемая химическая продукция.

Порядок испытаний:

- подробное описание применяемой методики испытаний;

- используемая дозу исследуемой химической продукции и контрольных веществ;

- длительность и температура воздействия химической продукцией, ополаскивания погружением и периодов инкубирования образцов (при необходимости);

- описание любых изменений методики испытаний;

- результаты контроля для исследуемой химической продукции, способной непосредственно восстанавливать ТК и/или имеющей мешающую окраску (при необходимости);

Результаты:

- представление в табличной форме данных для каждой исследуемой химической продукции и контрольных веществ в каждой серии испытаний (в том числе для повторных испытаний, если проводились) и для всех параллельно испытанных образцов, включая значения ОП или площади пиков ФК, значения жизнеспособности ткани (в процентах), среднее арифметическое значение жизнеспособности ткани (в процентах), разность значений жизнеспособности параллельно обрабатываемых образцов ткани или CO, а также окончательное прогнозное заключение;

- результаты, полученные для исследуемой химической продукции и контрольных веществ с точки зрения их соответствия критериям приемлемости для испытания и серии испытаний;

- описание прочих явлений, наблюдавшихся в ходе испытаний, например, окрашивание тканей при испытаниях химической продукции, имеющей собственную окраску.

Рассмотрение результатов.

Выводы.

Приложение A

(обязательное)

Основные параметры методов испытаний с использованием RhCE, валидированных для определения химической продукции, не требующей классификации и маркировки как вызывающей раздражение или серьезное повреждение глаз

Таблица A.1 - Основные параметры валидированных методов испытаний с использованием RhCE

Приложение B

(обязательное)

Блок-схема для наглядного представления процесса выявления веществ, способных непосредственно восстанавливать MTT и/или обладающих мешающей окраской, и дальнейших операций с ними согласно СОП для VRM1

Приложение C

(обязательное)

Блок-схема для наглядного представления процесса выявления веществ, способных непосредственно восстанавливать MTT и/или обладающих мешающей окраской, и дальнейших операций согласно СОП для VRM2

Приложение D

(обязательное)

Блок-схема для наглядного представления процесса выявления веществ, способных непосредственно восстанавливать WST и/или обладающих мешающей окраской, и дальнейших операций с ними согласно СОП ДЛЯ LABCYTE CORNEA-MODEL24 EIT

Приложение E

(обязательное)

Ключевые параметры и критерии приемлемости для признания спектрофотометрической системы ВЭЖХ/УВЭЖХ пригодной для количественного определения MTT-формазана, экстрагируемого из моделей тканей RhCE

Таблица E.1 - Параметры и критерии приемлемости для признания спектрофотометрической системы ВЭЖХ/УВЭЖХ пригодной для количественного определения MTT-формазана

Приложение ДА

(справочное)

Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой международного документа

Таблица ДА.1

Библиография