allgosts.ru67. ПРОИЗВОДСТВО ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ67.050. Общие методы проверки и анализа пищевых продуктов

ГОСТ 33634-2015 Продукты пищевые, продовольственное сырье. Иммуноферментный метод определения остаточного содержания антибиотиков фторхинолонового ряда

Обозначение:
ГОСТ 33634-2015
Наименование:
Продукты пищевые, продовольственное сырье. Иммуноферментный метод определения остаточного содержания антибиотиков фторхинолонового ряда
Статус:
Действует
Дата введения:
01/01/2017
Дата отмены:
-
Заменен на:
-
Код ОКС:
67.050, 67.100, 67.120

Текст ГОСТ 33634-2015 Продукты пищевые, продовольственное сырье. Иммуноферментный метод определения остаточного содержания антибиотиков фторхинолонового ряда



МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

ГОСТ

33634—

2015


МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ, ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЕ СЫРЬЕ

Иммуноферментный метод определения остаточного содержания антибиотиков фторхинолонового ряда

Издание официальное

Москва

Стенда ртмнформ 2016


Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0—92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2—2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки. принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)

2    ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстан-

Дарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 октября 2015 г. No 81 -П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны

Код страны

Сокращенное наименование национального ортана

по МК (ИСО 3166) 004-97

по МК (ИСО 3166)004- 97

по стандартизации

Армения

AM

Минэкономики Республики Армения

Киргизия

KG

Кыргызстакдарт

Россия

RU

Росстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 18 января 2016 г. N» в-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33634—2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2017 г.

5 8ВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется е ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты». а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уве-домлениеи тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — неофициальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ.2016

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

Содержание

in

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ, ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЕ СЫРЬЕ

Иммунофермонтный метод определения остаточного содержания антибиотиков

фторхиколонового ряда

Food products, food raw materials. Immunoenzymatlc method for determination of fluoroquinolones residual content

Дата введения — 2017—01—01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на мясо, мясо птицы, яйца, яичный меланж, яичный лоро» шок. молоко и устанавливает иммуноферментный метод определения остаточного содержания антибиотиков фторхинолонового ряда (энрофлоксацина. ципрофлоксацина. норфлоксацина и офлоксацина) в диапазоне измерений от 5 до 1280 мкг/кг.

2    Нормативные ссылки

8 настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.1.004—91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007—76 Система стандартов безопасности труда, вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019—791 * Система стандартов безопасности труда. Электробеэопасность. Общие тре-бования и номенклатура видов защиты

ГОСТ OIML R 76*1—2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 245—76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-еодный. Технические условия

ГОСТ 334—73 Бумага масштабно-координатная. Технические условия

ГОСТ 1770—74 (ИСО 1042—83, ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2652—78 Реактивы. Калия бихромат технический. Технические условия

ГОСТ 4172—76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый деузамещенный 12-водный. Технические условия

ГОСТ4204—77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4233—77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328—77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ ИСО 5725-6—20032* Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть6. Использование значений точности на практике

1}В Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019—2009 «Системе стандартов безопасности труда. Электробеэопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».

2>6 Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6—2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике».

Издание официальное

ГОСТ 6552—80 Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия

ГОСТ 6709—72 вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 7269—79 Мясо. Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести

ГОСТ 12026—76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 25336—82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809—86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

ГОСТ 31467—2012 Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы отбора проб и подготовка их к испытаниям

Применение — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателе «Национальные стандарты», составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании нестоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется а части, не затрагивающей зту ссылку

3    Термины, определения и сокращения

3.1    В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1.1    тест-система: Набор (комплект) специально подобранных реагентов (реактивов) и составных частей, предназначенный для определения одного или нескольких конкретных веществ.

3.1.2    вспомогательный раствор: Раствор, приготовляемый заблаговременно и необходимый для приготовления других типов растворов.

3.1.3    рабочий раствор: Раствор одного или нескольких реактивов, приготовляемый непосредственно перед использованием и необходимый для выполнения процедуры анализа.

3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:

ИФА — иммуноферментный анализ;

ОП — оптическая плотность;

АГ — антиген;

АТ — антитела;

ФК — ферментный конъюгат;

П — относительное поглощение.

4    Сущность метода

4.1    Иммуноферментный метод основан на измерении содержания фторхинолонов в растворах экстрактов исследуемых проб с помощью непрямого твердофазного конкурентного ИФА.

4.2    Непрямой твердофазный конкурентный ИФА основан неспособности антибиотикоефторхино-лонового ряда взаимодействовать со специфичными АТ. полученными к энрофпоксацину, в условиях конкуренции с белковым конъюгатом энрофлоксацина, нанесенным на поверхность лунок планшета, — твердофазным АГ.

4.3    Связавшиеся с твердой фазой АТ взаимодействуют с вторичными антиеидовыми АТ. меченными лероксидазой хрена, которые выявляют путем измерения интенсивности окрашивания продукта реакции окисления 3.3\5,5'-тетраметилбвнзидина (раствор No 11. см. приложение А) перекисью водорода.

Аналитический сигнал (регистрируемое значение ОП), характеризующий степень взаимодействия АТ с АГ. обратно пропорционален массовой концентрации фторхинолонов в исследуемом растворе.

5    Метрологические характеристики

5.1 Установленный в настоящем стандарте метод обеспечивает определение содержания антибиотиков фторхинолоноеого ряда с расширенной неопределенностью результатов аналитических измерений при коэффициенте охвата к = 2. указанной в таблице 1.

Таблица 1 — Метрологические характеристики

Содержание фторхинолонов

Диапазон измерений содержания. М(Г/ДМ3 (ни/ кг»

Значение относительной расширенной

неопределенности U. при коэффициенте охвата к » 2. Р-0.В5. %

Показатель повторяемости (относительное средиекеэдратичес-кое отклонение повторяемости) О', %

Показатель воспроизводимости (относительное стандартное отклонение воспроизводимости) Лд. %

Предел повторяемости г. % (при Р - 0.95. л > 2)

в мясе, мясе птицы, яйцвх. яичном порошке, яичном меланже, молоке

5—1230

75

13

35

36


5.2 Специфичность АТ. применяемых для определения содержания фторхинолонов, выраженная в коэффициентах перекрестного реагирования, представлена в таблице 2.

Таблица 2 — Специфичность АТ. применяемых для определения массовой концентрации фторхинолонов

Фторхи ПОЛОН

Коэффициент перекрестного реагирования. %

Энрофлоксацин

100

Ципрофлоксацин

100

Норфлохсвцин

60

Офлоксацин

20

б Требования безопасности и условия выполнения измерений

6.1    При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.

6.2    Помещения, в которых проводится анализ и подготовка проб, должны быть оборудованы при* точно-вытяжной вентиляцией, и соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и электробезопасности по ГОСТ 12.1.019.

6.3    К выполнению измерений допускаются лица, владеющие техникой ИФА и изучившие инструк* цию по применению тест системы и инструкции по эксплуатации используемых приборов.

6.4    При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

•    температура окружающего воздуха............................от 20 *С до 30 *С;

• атмосферное давление....................................от 84 до 106 кПа;

•    напряжение в питающей электросети............................от 200 до 240 В;

•    частота переменного тока....................................от49до51 Гц;

• относительная влажность воздуха.............................от 40 % до 80 %.


7 Средства измерений, аппаратура, материалы, посуда и реактивы

7.1 При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, аппаратуру, матери* алы и посуду:

•    весы неавтоматического действия высокого класса точности по ГОСТ OIML R 76*1 с наибольшим пределом взвешивания не более 150 г и пределом допускаемой абсолютной погрешности 10.05 г:

•    весы микроаналитические с наибольшим пределом взвешивания 52 г. с пределом допускаемой абсолютной погрешности не более 10,01 мг;

•    калькулятор любого типа с логарифмической функцией:

•    pH-метр любой марки, позволяющий проводить измерения едиапазомеотЗдо 10 ед. pH с погрешностью 10.05 ед. pH;

•    фотометр вертикального типа фотометрирования с диапазоном измерений ОП от 0 до 3 в комплекте с интерференционными светофильтрами для длин волн 450 и 620 нм;

•    измельчитель-гомогенизатор лабораторный;

•    морозильную камеру любого типа, обеспечивающую среднюю температуру в холодильной камере не выше минус 20 вС;

-    роторный испаритель любого типа или устройство для испарения экстрактов, термостатируемый нагревательный модуль с системой отдувки растворителей инертным газом;

•    термостат любого типа, поддерживающий температуру (37 ± 1) *С:

•    холодильник бытовой с цифровым контроллером температуры и рабочим диапазоном температур отОвСдо8вС;

-    центрифугу сбакет-роторомиадаптером для пробирок вместимостью 15 см3, частотой вращения не менее 4000 об/мин;

•    шейкер еортексиого типа, с вставкой для одной пробирки и диапазоном скорости от 150 до 2500 об/мин;

•    шейкер переворачивающий вертикального вращения 360е в одной плоскости с адаптером для пробирок и диапазоном скорости от 20 до 100 об/мин;

-    шкафсушильный любого типа,обеспечивающий поддержание температуры не менее (95 ±5)*С;

-    бумагу масштабно-координатную по ГОСТ 334. марки Н-1;

-    бумагу фильтровальную по Г ОСТ 12026:

-    колбы 1-10(100.1000>-2 по ГОСТ 1770;

-    колбу типа Кн-1 -50-24/29 ТС по ГОСТ 25336;

•    пипетки многоканальные переменной вместимости 0,03—0.3 см3, с допустимой относительной погрешностью дозирования по метанолу и ацетонитрилу не более ±1,0 %;

•    пипетки одноканальные переменной вместимости 20—100 мм3.200—1000 мм3.500—5000 мм3 с допустимой относительной погрешностью дозирования по метанолу и ацетонитрилу не более ±1 %;

-    пробирки полипропиленовые вместимостью 15 см3 с завинчивающимися крышками;

•    пробирки типа П-1-10-0.1 ХС по ГОСТ 25336;

-    пробирки типа «Эппендорф» вместимостью 1,5 см3;

•    цилиндры 1{2.3}-100(250)-1 по ГОСТ 1770.

7.2 При выполнении измерений применяют следующие реактивы:

•    ацетонитрил для хроматографии.о.с.ч.. смассовой долей основноговещества не менее 99.9%;

-    воду дистиллированную по ГОСТ 6709;

•    гексан с содержанием основного вещества не менее 96 %. х. ч.;

-    дихлорметан длягазовой хроматографии смассовойдолейосновноговеществанвменее99.9%;

-    калия бихромат по ГОСТ 2652;

•    кислоту ортофосфорную поГОСТ 6552. концентрированную, х. ч.;

-    кислоту серную по ГОСТ 4204, концентрированную:

•    натрия гидроксид по ГОСТ 4328. х. ч.;

-    натрия гидрофосфат безводный, х.ч., поГОСТ 4172:

-    натрия дигидрофосфат 2-водный. ч. д. а., по ГОСТ 245;

•    натрий хлористый по ГОСТ4233. х. ч.;

•    тест-систему для непрямого твердофазного конкурентного ИФА. укомплектованную в соответствии с приложением А.

8 Подготовка к выполнению измерений

8.1    Подготовка оборудования

8.1.1    При подготовке к проведению измерений лабораторную стеклянную посуду моют смесью водного раствора бихромата калия с концентрированной серной кислотой, многократно промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу.

8.1.2    Подготовку и проверку фотометра. pH-метра проводят в соответствии с руководствами по эксплуатации приборов.

8.2    Приготовление растворов

8.2.1 Приготовление раствора фосфорной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм3

В мерную колбу вместимостью ЮС см3 вносят 50 см3 дистиллированной воды и осторожно приливают 12 см3 концентрированной фосфорной кислоты, доводят объем раствора дистиллированной водой до метки, закрывают пробкой и тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора в вытяжном шкафу при комнатной температуре — не более 1 мес.

8.2.2    Приготовление фосфатного буферного раствора молярной концентрацией

0,067 моль/дм3 и pH 7,2

6 мерную колбу вместимостью 1000 см* вносят 7,67 г безводного гидрофосфата натрия. 2,02 г 2-водного дигидрофосфата натрия и 8.7 г хлорида натрия, растворяют в 500 смэ дистиллированной воды. Измеряют pH. устанавливают его значение до 7.2 ± 0.2, осторожно по каплям прибавляя раствор фосфорной кислоты (см. 8.2.1) и постоянно перемешивая. Затем объем в колбе доводят до метки дис* тиллированной водой.

Срок хранения раствора при температуре 4 *С — не более 1 мес.

8.2.3    Приготовление раствора гидроксида натрия молярной концентрацией 0,1 моль/дм3

8 мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,4 г гидроксида натрия, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, перемешивают и доводят до метки дистиллированной водой.

Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 1 мес.

8.2.4    Приготовление рабочего буферного раствора

8 мерную колбу вместимостью 10см3 приливают до метки раствор Ne 10(см. приложение А), добавляют 28 мм3 раствора Ne 13 (см. приложение А), перемешивают и закрывают притертой пробкой.

Используют свежеприготовленный раствор.

8.2.5    Приготовление смеси ацетонитрила и раствора гидроксида натрия молярной

концентрацией 0,1 моль/дм3

8 мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 90 см3 ацетонитрила и доводят до метки раствором гидроксида натрия (см. 8.2.3). Колбу закрывают пробкой и тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора при комнатной температуре в вытяжном шкафу — 2 сут.

8.2.6    Приготовление рабочих градуировочных растворов К0

Для приготовления рабочего разведения градуировочных растворов Kq—К5 в пробирки типа «Эппендорф». маркированные Kq. К,. Kj. К3. К4 и К5. вносят по 0.27 см3 рабочего буферного раствора (см.8.2.4)илоО,ОЗсм3 реактивов № 3—№ 8{см. приложение А), соответственно маркировке. Перемешивают. в результате получают растворы со следующими концентрациями энрофлоксацина: К0—0мкг/см3;К, — 0.5мкг/см32 — 2,0 мкг/см3; К3 —8.0мкг/см34 — Зг.Омкг/см3;^ — 128.0 мкг/см3.

Используют свежеприготовленные растворы.

Концентрированные градуировочные растворы после вскрытия флаконов хранят при температуре от 2 *С до 8 *С в течение всего срока годности набора.

8.2.7    Приготовление рабочего раствора буфера для промывки

8 колбу вместимостью 50 см3 вносят 47.5 см3 дистиллированной воды, добавляют 2,5 см3 реактива № 2 (см. приложение А), перемешивают.

Срок хранения раствора при температуре от 2 *Сдо8*Снв более — 1 мес.

8.2.8    Приготовление рабочего раствора ферментного конъюгата

В стеклянную пробирку вносят 2.25 см3 реактива № 10 (см. приложение А) и 0.25 см3 реактива No 9 (см. приложение А), перемешивают.

Используют свежеприготовленный раствор.

8.3 Отбор проб

8.3.1    Отбор проб мяса и мясных продуктов — по ГОСТ 7269.

8.3.2    Отбор проб мяса птицы — по ГОСТ 31467.

8.3.3    Отбор проб молока — по ГОСТ 26809.

8.3.4    Отбор проб яиц. яичного меланжа и яичноголорошка проводят по нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.

8.3.5    Срок хранения отобранных проб при температуре от 2 вС до 8 вС—2 сут. При отсутствии возможности исследования проб в течение двух суток они должны быть заморожены при температуре минус 20 “С со сроком хранения не более двух месяцев.

8.4 Подготовка проб

8.4.1 Подготовка проб мяса, мяса птицы, яиц, яичного меланжа, яичного порошка

Яйцаотделяют от скорлупы и перемешивают на гомогенизаторе. Яичный меланж, яичный порошок тщательно перемешивают.

Мышечную ткань предварительно очищают от жира, грубой соединительной ткани и измельчают на гомогенизаторе. Далее обработку пробы проводят в соответствии с рисунком 1.

S

2.00 г гомогенизированной пробы помещают в полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см3. Вносят в см3 смеси ацетонитриле и раствора натрия гидроксида (см. 8.2.5), перемешивают в течение 2 мин на шейкере вортексного типа, после чего перемешивают на переворачивающем шейкере в течение 10 мин


Центрифугируют при 4000 об/мин в течение 10 мин при температуре 15 'С

_i_

3 см9 надосадочной жидкости переносят в новую полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см9, добавляют 3.0 см9 фосфатного буферного растворе (см. 8.2.2} и 6 см9 дихлорметанв. Перемешивают на

переворачивающем шейкере в течение 10 мин

I


Центрифугируют при 4000 об/мин в течение 10 мин при температуре 15 *С

I

V

Удаляют верхний водный слой и промежуточную фазу. Переносят 3 см9 нижнего органического слоя в новую полипропиленовую пробирку вместимостью 1S см9 и упаривают досуха а токе азота в системе упаривания при

температуре 50 *С


К сухому остатку добавляют 0.3 см9 раствора Nb 3 (см. приложение А) и тщательно перемешивают на шейкере

вортексного типа до полного растворения


Полученный экстракт обезжиривают. Для этого приливают 0.3 см3 гексана и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 10 мин при температуре 15 *С. Удаляют верхний гексановый слой. Процедуру обезжиривания

повторяют еще раз

_I_

8 пробирку типа «Эппендорф* отбирают 0,03 см9 обезжиренного экстракта, добавляют 0.27 см3 рабочего буферного раствора (см. 8.2.4), перемешивают и используют для проведении ИФА в соответствии с

разделом 9


Рисунок 1 — Обработка испытуемых проб

8.4.2 Подготовка проб молока

Отобранную пробу молока перед анализом тщательно перемешивают.

В полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см3 вносят 2 см3 пробы. 8 см3 смеси ацетонитрила и раствора натрия гидроксида (см. 8.2.5). гомогенизируют в течение 2 мин. после чего перемешивают на шейкере зортексноготилаетечение 10 мин. Далее процедуру экстракции и обезжиривания пробы проводят согласно рисунку 1.

9 Проведение иммуноферментного анализа

9.1    Общие положения

9.1.1    При проведении испытаний следует использовать реагенты и компоненты, входящие в один и тот же набор (тест-систему). Разбавление или замена реагентов из набора (тест-системы) другой серии не допускается.

9.1.2    Наборы (тест-системы) следует хранить при температуре от 2 *С до 8 *С в пределах срока хранения.

9.1.3    Окрашивание раствора субстрата Ne 11 (см. приложение А) является признаком его порчи и делает невозможным его применение для анализа.

9.2 Подготовка тест-системы к проведению анализа

9.2.1    Перед использованием тест-систему вынимают из холодильника и выдерживают при комнатной температуре не менее 30 мин, после чего аккуратно встряхивают каждый флакон. Реактив № 2 (см. приложение А) необходимо прогреть всушильном шкафу при температуре 37 *С до полного растворения кристаллов солей и тщательно перемешать.

9.2.2    После использования, реагенты тест-системы сразу помещают в холодильник.

9.2.3    На всех стадиях необходимо избегать воздействия прямого солнечного света.

9.2.4    Для каждого реактива и раствора используют отдельные съемные наконечники автоматических пипеток. Внесение растворов в лунки проводят осторожно, не касаясь наконечниками их дна и стенок.

9.2.5    Каждый исследуемый рабочий раствор экстрактов испытуемых проб анализируют в двух повторностях.

Примечание — Далее приведены расходы реактивов на два стрипвЧ что достаточно для анализа двух исследуемых проб. Для другого числа проб количество используемых стрипов и смешиваемых объемов реагентов изменяют в соответствии с количеством исследуемых проб.

9.3 Проведение испытания

9.3.1    Из планшета извлекают необходимое число стрипов. Неиспользованные стрипы хранят в закрытом фольгированном полиэтиленовом пакете с эип-локом при температуре от 2е,Сдо8*Св течение срока годности тест-системы.

9.3.2    8 лунки планшета вносят по 0.05 см3 рабочих градуировочных растворов (8.2.6)и по 0.05 смрастворов экстрактов испытуемых проб.

Каждый раствор вносят в двойной повторности (лунки-дубли).

Внесение растворов проводят согласно приложению Б.

Далее в каждую лунку вносят по 0.05 см3 раствора № 1 (см. приложение А). Стрипы заклеивают пленкой или закрывают крышкой, инкубируют в термостате при температуре 37 ®С в течение 1 ч. после чего содержимое лунок сливают.

9.3.3    В лунки планшета вносят по 0.2 см3 раствора буфера для промывки (см. 8.2.7). оставляют на 1—2 мин и сливают. Процедуру промывки повторяют еще три раза. Остатки жидкости интенсивно стряхивают на чистую фильтровальную бумагу.

9.3.4    В лунки планшета вносят по 0.1 см3 раствора ферментного конъюгата (см. 8.2.8). заклеивают пленкой или закрывают крышкой, инкубируют в термостате при температуре 37 *С 1 ч и отмывают, как указано в 9.3.3.

9.3.5    В лунки планшета вносят ло0,1 см3 раствора № 11 (см. приложение А) и инкубируют при комнатной температуре в темноте в течение 15 мин. Добавляют 0.1 см3 раствора N«12 (см. приложение А) и аккуратно перемешивают легким постукиванием по ребру планшета. Помещают планшет в вертикальный фотометр и измеряют значения ОП при длине волны 450 нм.

Запись результатов проводят согласно приложению В.

10 Обработка результатов измерения

10.1 По показателям ОП в лунках-дублях находят среднеарифметические значения. Разность значений ОП для них в процентах от среднего не должна превышать 10.

Связывание АТ (или относительное поглощение) П. %. рассчитывают по формуле

П =


ОП

ОП


П


100.


(1)


к


где ОПп — среднее значение ОП. измеренной в лунках с градуировочными растворами энрофлоксаци-на К,— К5 (см. 8.2.6) или рабочими растворами экстрактов испытуемых проб;

ОП, — среднее значение ОП. измеренной в лунках с градуировочным раствором Kg (см. 8.2.6).

По значениям процентов связывания, вычисленным для градуировочных растворов исоответству-ющим известным значениям массовой концентрации энрофлоксацика (мкг/дм3), строят градуировочный график в полулогарифмической системе координат.

10.2 Для построения градуировочного графика ислольэуют масштабно-координатную бумагу. На ось абсцисс наносят значения логарифмов концентраций энрофлоксацина в рабочих разведениях градуировочных растворов (см. 8.2.6). По оси ординат откладывают значения процентов связывания, рассчитанные для массовых концентраций по формуле (1), и строят градуировочный график с использованием линейной зависимости.

10.3    С помощью градуировочного графика по значению процента связывания, полученного для рабочих растворов экстрактов испытуемых проб, находят логарифм массовой концентрации фторхино-лонов. С помощью калькулятора вычисляют его обратное значение (антилогарифм), соответствующее массовой концентрации определяемого фторхинолона в растворе экстракта. После чего рассчитывают содержание фторхинолонов в пробе С. мкг/дм3 (мкг/кг). по формуле

С-с-К.    (2)

где с—массовая концентрация фторхинолонов в рабочем растворе экстракта испытуемой пробы, определяемая по градуировочному графику, мкг/дм3;

К— коэффициент пересчета мкг/дм3 в рабочем растворе экстракта испытуемой пробы в мкг/дм3 (мкг/кг),

учитывающий как разведение, так и степень извлечения фторхинолонов и равный 10.

Результаты измерений массовой концентрации (содержания) фторхинолонов С. мкг/дм3 (мкг/кг). округляют до целого числа.

За окончательный результат принимают среднеарифметическое двух измерений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости

|С, —С2| £ 0.01 • Сср • г,    (3)

где С, и С2 — результаты определений содержания фторхинолонов. полученные в условиях повторяемости. мкг/кг.

Сср — среднеарифметическое результатов двухопределенийсодержания фторхинолоноввлро-бе. мкг/кг;

г — предел повторяемости. %, (см. таблицу 1).

10.4    Допускается использование программного обеспечения, позволяющего определять содержание фторхинолонов в пробе по средним значениям ОП. измеренным в лунках сградуировочными растворами и рабочими растворами экстрактов испытуемых проб.

11 Контроль точности результатов измерения

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (сходимости) и воспроизводимости, проводят с учетом требований ГОСТ ИСО 5725-6 (раздел 5).

Относительное расхождение между результатами, полученными в разных лабораториях, не должно превышать относительного стандартного отклонения воспроизводимости (см. таблицу 1).

Комплектация тест-системы «Фторхинолоны ИФА»

В комплектацию тест-системы входят:

Планшет 96-луночный полистироловый стрилоеанный для иммунологических исследований, сенсибилизированный антигеном;

Пакет полиэтиленовый фольгированный с эил-локом.

Пленка полиэтиленовая самоклеющаяся для заклеивания планшетов.

Растворы:

N9 1 — АТ — антитела к энрофлоксвцину;

N» 2 — раствор фосфатного буфера для промывки с добавлением теина-20 (20-кратный концентрат). pH (7.0—7.4);

N9 3 — буфер для экстракции;

N9 4 — Kj.N# 5 — К2. № 6 — K^.N# 7 — К4. N9 8 — К5 — градуировочные растворы с известным содержанием (мкг/дм3) энрофлоксацина;

N9 9 — ФК — конъюгат антител против IgG (Н ♦ L) кролике с пероксидазой хрена (10-кратный концентрат);

N9 10— реакционный буферный рвствор с добавлением твина-20 и бычьего сывороточного альбумина. pH 7.0—7.4. стерильный;

N9 11 — раствор субстрата на основе 3.3'. б.б'-твтраметилбензидинв с добавлением перекиси водорода;

N9 12 — стоп-реагент, раствор серной кислоты молярной концентрацией 0.S моль/дм3;

N913 — натрия ацетат, рвствор молярной концентрацией 1.5 моль/дм3.

Схема заполнения лунок планшета

Внесение реагентов следует проводить согласно следующей схеме:

1

2

3

4

5

6

7

а

9

10

11

12

А

Ко

Ко

№ 3

N9 3

N9 11

N9 11

N9 19

N9 19

№ 27

N9 27

N9 35

N9 35

в

К.

Ki

№ 4

N94

N9 12

N9 12

N9 20

N9 20

N9 28

N9 28

N9 36

N9 36

С

к,

К*

N9 5

N9 5

N9 13

N9 13

N9 21

N9 21

N9 29

N9 29

N9 37

N9 37

О

к,

К»

N9 6

N96

N9 14

N9 14

N9 22

N9 22

N9 30

N9 30

N9 38

N9 38

Е

к*

К«

N9 7

N9 7

N9 15

N9 15

N9 23

N9 23

N9 31

N9 31

N9 39

N9 39

F

Ко

К-,

N9 8

N98

N9 16

N9 16

N9 24

N9 24

N9 32

N9 32

N9 40

N9 40

G

N9 1

N9 1

N9 9

N9 9

№ 17

№ 17

N9 25

N9 25

N9 33

N9 33

№ 41

N9 41

Н

N9 2

N? 2

N9 10

N9 10

N9 18

N9 18

N9 26

N9 26

N9 34

N9 34

Ш 42

N9 42

Таблица для записи результатов измерения

Таблица 8.1

Маркировке варианта

Значение ОП

22а.-«о.% on.

I дС

Содержание фторхииолона

по лункам

среднее

в мстракте с. ыкг/ди}

а исследуемой пробе С. миг/дм* {мкг/кг)

К0

К,

К,

ка

К*

Кв

№ 1

№ ...

№42

УДК 637.5:615.28:006.354    МКС 67.050

67.100

67.120

Ключевые слова: пищевые продукты, продовольственное сырье, иммуноферментный метод, остаточное содержание, фторхинопоны, антибиотики фторхинолоиового ряда, экрофлоксацин. ципрофлокса-цик, норфлоксацин, офлоксацин, прецизионность метода, тест-система, антиген, антитела, оптическая плотность, ферментный конъюгат

Редактор К.в. Оудхо Технический редактор в.Ю. Фотиево Корректор И.А Королеве Компьютерная верстка А.Н. Золотаревой

Сдано а набор 18.02.2015. Подписано а печать 17.03.2013. Формат    Гарнитура Ариап.

Усп леч. л. 1.86 Уч.-изд. п. 1.40. Тираж 35 о». Эак. 773.

Издано и отпечатано во ФГУП яСТАНДАРТИНФОРМ». >23995 Москва. Гранатный пер.. А. www.90slinfo.1u    

Стрип — полоске из восьми лунок.

Зип-лок — замок, обеспечивающий герметизацию пакета

Данный комплект реагентов является рекомендуемым и приведен для удобства пользователей настоящего стандарта.