allgosts.ru67. ПРОИЗВОДСТВО ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ67.050. Общие методы проверки и анализа пищевых продуктов

ГОСТ 33615-2015 Продукты пищевые, продовольственное сырье. Иммуноферментный метод определения остаточного содержания метаболита фуразолидона

Обозначение:
ГОСТ 33615-2015
Наименование:
Продукты пищевые, продовольственное сырье. Иммуноферментный метод определения остаточного содержания метаболита фуразолидона
Статус:
Действует
Дата введения:
01/01/2017
Дата отмены:
-
Заменен на:
-
Код ОКС:
67.050, 67.100, 67.120

Текст ГОСТ 33615-2015 Продукты пищевые, продовольственное сырье. Иммуноферментный метод определения остаточного содержания метаболита фуразолидона



МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

ГОСТ

33615-

2015


МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ, ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЕ СЫРЬЕ

Иммуноферментный метод определения остаточного содержания метаболита фуразолидона

Издание официальное

Москва

Стенда ртинформ 2016


Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стан» дартизации установлены ГОСТ 1.0—92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2—2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «всероссийский государственный Центо качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)

2    ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстан-

Дарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 октября 2015 г. N» 81 -П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны

Коя страны

Сокращенное маиыеиоеакие национального органа

по МК <ИСО 3166) 004-97

по МК <ИСО Э1вв) 004 -97

по стандартизации

Армения

AM

Минэкономики Республики Армения

Киргизия

КО

Кыргызстандврт

Россия

RU

Россгвидарт

4    Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 18 января 2016 г. № 4-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33615—2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2017 г.

5    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется е ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты». а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соотеетстеующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уве-домление и тексты размещаются такжееинформационнойсистемеобщегопользоеания — неофициальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ. 2016

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

Содержание

in

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ. ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЕ СЫРЬЕ

Иммуноферментный метод определения остаточного содержания метаболита фуразолидона

Pood products, food raw materials.

Immunoenzymatlc method for determination of furazolidone metabolite

Дета введения — 2017—01—01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на мясо, мясо птицы, яйца, яичный порошок, яичный меланж, молоко, рыбу, мед и устанавливает иммуноферментный метод определения остаточного содержания метаболита фуразолидона (З-амино-2-оксаэолидинона) в диапазоне измерений от 0,7 до 62.5 мкг/кг. для сухого молока — от 7 до 625 мкг/кг.

2    Нормативные ссылки

8 настоящем стандарте ислользоеаны нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.1.004—91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007—76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019— 79м Система стандартов безопасности труда. Электробеэопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ OIML R 76*1—2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 334—73 Бумага масштабно-координатная. Технические условия

ГОСТ 1770—74 (ИСО 1042—83. ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2652—78 Калия бихромат технический. Технические условия

ГОСТ 3118—77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 4204—77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4328—77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ ИСО 5725-6—200321 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

В Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019—2009 «Системе стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».

21 В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6—2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике».

Издание официальное

ГОСТ 6709—72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 7269—79 Мясо. Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести

ГОСТ 12026—76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 19792—2001° Меднатуральный.Техническивусловия

ГОСТ 25336—62 Посуда иоборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809—86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка пробканализу

ГОСТ 31339—2006 Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 31467—2012 Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы отбора проб и подготовка их к испытаниям

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылоч-ныхстандартовпо указателю «Национальные стандарты».составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным а текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей зту ссылку.

3    Термины, определения и сокращения

3.1    В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1.1    тест-система: Набор (комплект) специально подобранных реагентов (реактивов) и составных частей, предназначенный для определения одного или нескольких конкретных веществ.

3.1.2    вспомогательный раствор: Раствор, приготовляемый заблаговременно и необходимый для приготовления других типов растворов.

3.1.3    рабочий раствор: Раствор одного или нескольких реактивов, приготовляемый непосредственно перед использованием и необходимый для выполнения процедуры анализа.

3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:

АО2 — З-амино-2-оксаэолидинон (метаболит фуразолидона);

АГ — антиген;

АТ — антитела;

ИФА — иммуноферментный анализ;

ОП —оптическая плотность;

П — относительное поглощение;

ТМБ — 3.3',5.5,-тетраметилбензидин;

ФК — ферментный конъюгат.

4    Сущность метода

4.1    Иммуноферментный метод основан на измерении массовой концентрации AOZ в растворах экстрактов исследуемых пробе помощью прямого твердофазного конкурентного ИФА.

4.2    Прямой твердофазный конкурентный ИФА основан на способности маркерного метаболита AOZ и ФК в условиях конкуренции взаимодействовать со специфичными АТ, нанесенными на поверхность лунок планшета.

4.3    Связавшийся с AT AOZ. меченный пероксидаэой хрена, выявляют путем измерения интенсивности окрашивания продукта реакции окисления 3.3'.5,S'-тетра метил бенэидина (раствор № 5, см. приложение А) перекисью водорода.

Аналитический сигнал (регистрируемое значение ОП). характеризующий степень взаимодействия АТ с АГ. обратно пропорционален массовой концентрации AOZ в растворе.

11 8 Российской Федерации действует ГОСТ Р 54644—2011 «Мед натуральный. Технические условия».

5 Метрологические характеристики

5.1 Установленный в настоящем стандарте метод обеспечивает выполнение измерений массовой концентрации (содержания) AOZ с расширенной неопределенностью результатов аналитических измерений при коэффициенте охвата к- 2. указанной в таблице 1.

Таблица 1 — Метрологические характеристики методе

А02

(3.амино-2-оксазолидинои)

Диапазон

измерений

содержания.

«IKf/ДМ <ШГ/КГ)

Значение относительной расширенной неопределенности U. при коэффициенте охеата А ■ 2.

Р - 0.96. %

Показатель

повторяемости

(относительное

среднеквадратичное

отклонение

повторяемости)

в,.%

Показатель воспроизводим ости (относительное стандартное отклонение еосп рои зео д и мос т и)

Предел

повторяемости г. %

(при Р > 0.95. л >2)

В мясе, мясе пти-цы, яйцах, яичном порошке, яичном меланже. рыбе, молоке, меде

От 0.7 до 2.0 аключ.

50

16

24

44

Се. 2.0 до 62.5 аключ.

30

9

14

25

В сухом молоке

От 7 до 20 аключ.

50

16

24

44

Се. 20 до 625 аключ.

30

9

14

25

6 Требования безопасности и условия выполнения измерений

6.1    При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.

6.2    Помещения, в которых проводится анализ и подготовка проб, должны быть оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией, и соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004иэлвктробвэоласносги по ГОСТ 12.1.019.

6.3    К выполнению измерений допускаются лица, владеющие техникой ИФА и изучившие инструкции по применению тест-систем и инструкции по эксплуатации используемых приборов.

6.4    При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- температура окружающего воздуха...................от 20 *С до 30 °С;

•    атмосферное давление...........................от 84 до 106 кЛа;

• напряжение в питающей электросети..................от 200 до 240 В:

• частота переменного тока.........................от 49 до 51 Гц;

• относительная влажность воздуха....................от 40 % до 80 %.


7 Средства измерений, аппаратура, материалы, посуда и реактивы

7.1 При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, аппаратуру, материалы и посуду:

•    весы неавтоматического действия высокого класса точности по ГОСТ OIML R 76-1 с наибольшим пределом взвешивания не более 150 г и пределом допускаемой абсолютной погрешности j.0.05 г:

•    весы микроаналитические с наибольшим пределом взвешивания 52 г, с пределом допускаемой абсолютной погрешности не более iO,G1 мг;

•    pH-метр любой марки, позволяющий проводить измерения в диапазоне от 3 до 10 ед. pH с погрешностьюл.0,05 ед. pH:

•    фотометр вертикального типа фотометрирования с диапазоном измерений ОП от 0 до 3 в комплекте с интерференционными светофильтрами для длин волн 450 и 620 нм;

•    баню водяную с терморегулятором, позволяющим поддерживать температуру от 40 °С до 100 *С. с отклонением от заданной температуры 15 *С;

•    измельчитель-гомогенизатор лабораторный:

•    калькулятор любого типа с логарифмической функцией:

•    микроцентрифугу любого типа счастотой вращения 7000 об/мин:

•    морозильную камеру любого типа, обеспечивающую среднюю температуру в холодильной камере не выше минус 20 *С.

•    роторный испаритель любого типа или устройство для испарения экстрактов, с термостати-руемым нагревательным модулем с системой отдуеки растворителей инертным газом:

•    термостат любого типа, поддерживающий температуру (3711) ®С;

•    холодильник бытовой с цифровым контроллером температуры и рабочим диапазоном темпе* ратур от 0 *С до 8 ®С;

•    центрифугу с бакет-ротором и адаптером для пробирок вместимостью 15 см3, частотой вращения не менее 4000 об/мин:

•    шейкер переворачивающий вертикального вращения 360е в одной плоскости с адаптером для пробирок и диапазоном скорости от 20 до 100 об/мин;

•    шейкер вортексного типа, с вставкой для одной пробирки и диапазоном скорости от 150 до 2500 об/мин;

•    шкаф сушильный любого типа, обеспечивающий поддержание температуры не менее (95 ± 5) *С;

•    бумагу индикаторную универсальную. pH 0—12;

•    бумагу масштабно-координатную по ГОСТ 334. марки Н*1:

•    бумагу фильтровальную лабораторную по ГОСТ 12026;

•    колбы 1*100 (1000)*2 по ГОСТ 1770;

•    колбы конические Кн*1*25(50>*24/29ТС по ГОСТ 25336;

•    пипетки многоканальные переменной вместимости 0,03—0,3 см3, с допустимой относительной погрешностью дозирования по метанолу и ацетонитрилу не более ±1,0 %;

•    пипетки одноканальные переменной вместимости 0.005—0.05; 0.1—1.0; 0.5—5.0 см3 с допустимой относительной погрешностью дозирования по карбинолу и ацетонитрилу не более ±1 %;

-    пробирки стеклянные типа П-1*10*0,1 ХС по ГОСТ 25336;

•    пробирки стеклянные типа «Фалькон» вместимостью 50 см3 с завинчивающимися крышками;

-    пробирки типа «Эппендорф» вместимостью 1,5 см3:

-    цилиндры 1(2,3>*10(250.500)-1 поГОСТ 1770.

7.2 При выполнении измерений применяют следующие реактивы:

-    воду дистиллированную по ГОСТ 6709;

•    калия бихромат по ГОСТ 2652;

-    кислоту серную по ГОСТ 4204, концентрированную;

-    кислоту соляную по ГОСТ 3116, концентрированную, плотностью 1.19 г/см3, х. ч.;

•    метанол с содержанием основного вещества не менее 99 %, х. ч.;

•    натрия гидроокись по ГОСТ 4328. х.ч..

-    натрия фосфат додекагидрат с содержанием основного вещества не менее 98 %;

•    н-гексан ссодержанием основного вещества не менее 98 %, х. ч.;

•    тест-систему для прямого твердофазного конкурентного ИФА в комплектации (приложение А), которая предназначена для определения AOZ;

-    этилацетат с содержанием основного вещества не менее 98 %. х. ч.

8 Подготовка к выполнению измерений

8.1    Подготовка оборудования

8.1.1    При подготовке к проведению измерений лабораторную стеклянную посуду моют смесью водного раствора бихромата калия с концентрированной серной кислотой, многократно промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу.

8.1.2    Подготовку и проверку фотометра и pH-метра проводят в соответствии с руководством по эксплуатации приборов.

8.2    Приготовление растворов

8.2.1 Приготовление раствора фосфата натрия с молярной концентрацией 0,3 моль/дм3

В мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 11.4 г натрия фосфата додекагидрата. растворяют в 500 см3 дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки водой.

Срок хранения раствора при температуре от 2 *С до 8 °С — не более 1 мес.

8.2.2    Приготовление раствора соляной кислоты с молярной концентрацией 1 моль/дм3

8 мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 8.5 см3 концентрированной соляной кислоты, доводят объем раствора дистиллированной водой до метки, закрывают пробкой и тщательно лере* мешивают.

Срок хранения раствора в вытяжном шкафу при комнатной температуре — не более 1 мес.

8.2.3    Приготовление раствора гидроокиси натрия молярной концентрацией 0,1 моль/дм3

6 мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0.4 г гидроокиси натрия, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, перемешивают и доводят до метки дистиллированной водой.

Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 1 мес.

8.2.4    Приготовление рабочих градуировочных растворов AOZ К,—К,

8.2.4.1    Приготовление исходного раствора Kq

6 пробирку типа «Эппендорф» вносят 0.9 см3 дистиллированной воды. добаеляют0.1 см3 реактива № 1 (см. приложение А), перемешивают на шейкере в течение 30 с.

8.2.4.2    Приготовление рабочих градуировочных растворов AOZ К,—К*

Рабочие градуировочные растворы К,—К5 готовят в стеклянных пробирках типа «Фальконя согласно таблице 2.

Таблица 2 — Приготовление рабочих градуировочных растворов К«—К»

Название и массовая конивнтрация приготовляемого раствора AOZ

вносимый объем, см3

дистиллированной

орды

исходного раствора К9

рабочего раствора К4

рабочего раствора К4

рабочею раствора К3

К>(62.5мкг/ды3)

0.9

0.1

К, (12.5 мкг/дм3)

0.8

0.2

К, (2.5 мкг/дм3)

0.8

0.2

К» (0.5 мкг/дм3)

0.8

0.2

К, (0 ыкг/дм5)

1.0

Пробирки закрывают крышками и перемешивают на шейкере в течение 20 с.

Используют свежеприготовленные растворы.

8.2.5    Приготовление рабочего раствора буфера для промывки

6 колбу вместимостью 50 см3 вносят 28 см3 дистиллированной воды, добавляют 1.47 см3 реактива N? 3 (см. приложение А), перемешивают.

Срок хранения раствора при температуре от 2 *С до 8 °С — не более 1 мес.

8.2.6    Приготовление рабочего раствора реакционного буфера

В стеклянную пробирку вносят 10 см3 реактива № 4 (см. приложение А) и 0.0065 см3 реактива № 7 (см. приложение А), перемешивают на шейкере в течение 30 с.

Срок хранения раствора при температуре от 2 *С до 8 *С — не более 1 сут.

8.2.7    Приготовление 20 % раствора метанола в рабочем растворе реакционного буфера

6 колбу вместимостью 25 см3 вносят 8 см3 рабочего раствора реакционного буфера (см. 8.2.6). добавляют 2 см3 метанола, перемешивают.

Срок хранения раствора при температуре от 2 *С до 8 *С — не более 1 сут.

8.2.8    Приготовление рабочего раствора ферментного конъюгата

В стеклянную пробирку вносят 2.25 см3 реактива N9 4 (см. приложение А) и 0,25 см3 реактива N9 2 (см. приложение А), перемешивают на шейкере в течение 10 с.

Используют свежеприготовленный раствор.

8.3 Отбор проб

8.3.1    Отбор проб мяса — по ГОСТ 7269.

8.3.2    Отбор проб мяса птицы — по ГОСТ 31467.

8.3.3    Отбор проб молока — по ГОСТ 26809.

8.3.4    Отбор проб яиц, яичного меланжа и яичного порошка — по нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.

8.3.5    Отбоо проб рыбы — лоГОСТ31339.

8.3.6    Отбор проб меда — по ГОСТ 19792.

8.3.7 Срок хранения отобранных проб при температуре от 2 ®С до 8 *С — 2 сут. При отсутствии возможности исследования проб в течение двух суток они должны быть заморожены при температуре минус 20 *С со сроком хранения не более 2 мес.

8.4 Подготовка проб

8.4.1    Мышечную ткань предварительно очищают от жира, грубой соединительной ткани и измельчают на гомогенизаторе.

8.4.2    Яйца отделяют от скорлупы и перемешивают на гомогенизаторе. Меланж, яичный порошок тщательно перемешивают.

8.4.3    При подготовке питьевого молока проводят его обезжиривание с помощью центрифугирования в течение 15 мин при 4000 об/мин. верхний слой удаляют.

При подготовке сухого молока 1 г пробы перемешивают с 10 см3 дистиллированной воды до полного растворения. Далее проводят обезжиривание, какописано выше.

8.4.4    1.00 г гомогенизированной пробы или 1 см3 обезжиренного молока помещают в стеклянные пробирки типа «Фалькон». Затем обоабатывают испытуемые пробы и градуировочные растворы, приготовленные по 8.2.4.2. как указано на рисунке 1.

8 каждую пробирку вносят по S см3 дистиллированной воды. 0.S см3 растворе соляной кислоты (см. 8.2.2) и 0.1 см3 реактива Nb б (см. приложение А) и перемешивают на переворачивающем шейкере в течение 10 мин

I

выдерживают на водяной бане при температуре 50 *С в течение 3 ч или в термостате при температуре 37 *С

в течение 16ч

1

Пробирки охлаждают при комнатной температуре, добавляют 1.4 см3 раствора фосфата натрия (см. 8.2.1)

и тщательно перемешивают на шейкере в течение 30 с

1

Используя индикаторную бумагу, измеряют pH и доводят его значение до (7.0 х 0.1) раствором соляной кислоты (см. 8.2.2) или раствором гидроокиси натрия (см. 6.2.3). перемешивают на шейкере 20 с и оставляют для

уравновешивания в течение б мин

I

Добавляют 12 см3 этилвцетатв и перемешивают на переворачивающем шейкере в течение 10 мин

1

Центрифугируют при 2000 об/мин в течение 15 мин при температуре (23 х 5) “С

1

Переносят 6 см3верхнего органического слоя в стеклянную пробирку и упаривают досуха в токе азота в системе упаривания при температуре 4S *С. Допускается хранить полученный сухой экстракт, при отсутствии возможности непосредственной дальнейшей обработки, при температуре от 2 *С до 8 *С в течение 24 ч

или при температуре минус 20 'С 7 сут

I

К сухому экстракту добавляют 1 см3 раствора метанола (см 6.2.7) и тщательно перемешивают на шейкере

до полного растворения

1

Полученный раствор переносят в пробирку типа «Элпекдорф». добавляют 0.S см3 н-гексвна и перемешивают на шейкере в течение 30 с. Центрифугируют при 7000 об/мин в течение 10 мин при температуре (23 х 5} ‘С. Удаляют верхний гексановый слой. Процедуру обезжиривания повторяют еще раз

I

После удаления гексанового слоя нижний слой используют для проведения ИФА в соответствии с разделом в

Рисунок 1 — Обработка испытуемых проб и градуировочных растворов

9    Проведение иммуноферментного анализа

9.1    Общие положения

9.1.1    При проведении испытаний следует использовать реагенты и компоненты, входящие водим и тот же набор (тест-систему). Разбавление или замена реагентов из набора (тест-системы) другой серии не допускается.

9.1.2    Наборы (тест-системы) следует хранить лри температуре от 2 *С до 8 вС в пределах срока хранения.

9.1.3    Окрашивание раствора субстрата № 5 (см. приложение А) является признаком его порчи и делает невозможным его применение для анализа.

9.2 Подготовка тест-системы к проведению анализа

9.2.1    Перед использованием тест-систему вынимают из холодильника и выдерживают при комнатной температуре не менее 30 мин, после чего аккуратно встряхивают каждый флакон. Реактив № 3 (см. приложение А) необходимо прогреть в термостате при температуре 37 °С до полного растворения кристаллов солей и тщательно лере мешать.

9.2.2    После использования реагенты тест-системы сразу убирают в холодильник.

9.2.3    На всех стадиях необходимо избегать воздействия прямого солнечного света.

9.2.4    Для каждого реактива и раствора используют отдельные съемные наконечники пипеток переменкой вместимости. Внесение растворов в лунки проводят осторожно, не касаясь наконечниками их дна и стенок.

9.2.5    Каждый исследуемый раствор экстрактов испытуемых проб (см. 8.4) и градуировочных растворов (см. 8.2.4.2) анализируют в двух повторностях.

Примечание — Далее приведены расходы реактивов не два стрмлеЧ что достаточно для анализа трех исследуемых проб. Для другого числа проб количество используемых стрипов и смешиваемых объемов реагентов изменяют в соответствии с количеством исследуемых проб.

9.3 Проведение анализа

9.3.1    Из планшета извлекают необходимое число стрипов. Неиспользованные стрипы хранят в закрытом фольгированном полиэтиленовом пакете с эип-локом ' при температуре от 2 °С до 8 *С в течение всего срока годности тест-системы.

9.3.2    в лунки планшета вносят по 0,05 см3 экстрактов рабочих градуировочных растворов К,—Кь (см. 8.2.4.2) и растворов испытуемых проб.

Каждый раствор вносят в двойной повторности (лунки-дубли).

Внесение растворов проводят согласно приложению Б.

Далее в каждую лунку вносят по 0,05 см3 рабочего раствора ферментного конъюгата (см. 8.2.8). Стрипы заклеивают пленкой или закрывают крышкой, инкубируют в термостате при температуре от 2 *С до 8 °С в течение 1 ч. после чего содержимое лунок сливают.

9.3.3    В лунки планшета вносят по 0.2 см3 раствора буфера для промывки (см. 8.2.5). оставляют на 1—2 мин и сливают. Процедуру промывки повторяют еще три раза. Остатки жидкости интенсивно стряхивают на чистую фильтровальную бумагу.

9.3.4    В лунки планшета вносят по 0.1 см3 раствора № 5 (см. приложение А) и инкубируют в термостате при температуре 37 *С в течение 10 мин. Добавляют по 0.1 см3 раствора N9 6 (см. приложение А), аккуратно перемешивают легким постукиванием по ребру планшета. Помещают планшет в вертикальный фотометр и измеряют значения ОП при длине волны 450 нм.

10    Обработка результатов измерения

10.1 По показателям ОП в лунках-дублях находят среднеарифметические значения. Разность значений ОП для них в процентах от среднего не должна превышать 10.

Связывание АТ (или относительное поглощение П. %. рассчитывают по формуле

n=£Ik.ioo.    С)

ОП,

где ОП„ — среднее значение ОП. измеренной в лунках с экстрактами градуировочных растворов Kj—Kj (см. 6.2.4} и с растворами экстрактов испытуемых проб;

ОПк — среднее значение ОП. измеренной влункахс нулевым стандартом (экстрактом градуировочного раствора К, (см. 6.2.4);

Поэначениям процентов связывания, вычисленным для градуиро вочныхрастворовссоответстеу-ющими известными значениями массовой концентрации AOZ, мкг/дм3. строят градуировочный график в полулогарифмической системе координат.

10.2    Для построения градуировочного графика используют масштабно-координатную бумагу. На ось абсцисс наносят значения логарифмов концентраций AOZ в градуировочных растворах К2—К(см. 8.2.4.2). По оси ординат откладывают значения процентов связывания, рассчитанные для массовых концентраций по формуле (1). Градуировочный график строят с использованием линейной зависимости.

10.3    С помощью градуировочного графика по значению процента связывания, полученного для растворов экстрактов испытуемых проб, находят логарифмы массовой концентрации в них AOZ. С помощью калькулятора вычисляют его обратное значение (антилогарифм), соответствующее массовой концентрации AOZ в растворе экстракта.

10.4    Массовую концентрацию (содержание) AOZ в испытуемой пробе С. мкг/дм3 (мкг/кг). рассчитывают по формуле

С-с-К,    <2)

где с — массовая концентрация AOZ в рабочем растворе экстракта испытуемой пробы, определяемая по градуировочному графику, мкг/дм3;

К — коэффициент пересчета мкг/дм3 в мкг/кг в экстракте испытуемой пробы, учитывающий ее разведение; для сухого молска равен 10. для остальных проб — единице.

Образец записи результатов измерений приведен в приложении В.

За окончательный результат принимают среднеарифметическое двух измерений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости

|Ci — Сг| £0.01 • С<р • Гоги-    (3)

где С, иС2 — результаты определений массовой концентрации (содержания) AOZ. полученные в условиях повторяемости, мкг/дм3 (мкг/кг);

Сср — среднеарифметическое результатов двух определений массовой концентрации AOZ в испытуемой пробе, мкг/дм3 (мкг/кг);

'on. — предел повторяемости <%). приведенный в таблице 1.

Результаты измерений массовой концентрации (содержания) AOZ. мкг/дм3 (мкг/кг). округляют до первого знака после запятой.

10.5 Допускается использование программного обеспечения, позволяющего определять массовую концентрацию (содержание) AOZ в испытуемой пробе по средним значениям ОП. измеренным в лунках с экстрактами градуировочных растворов и испытуемых проб.

С помощью компьютерной системы обработки данных строят градуировочную зависимость оптической плотности раствораот массовой концентрации АОгиаппроксимируют линейной функцией.

Градуировочная зависимость считается приемлемой, если рассчитанное программным обеспечением значение коэффициента корреляции г*20.96.

За результат измерений принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости

2 |С,-С,|Ю0„.    (4>

<с, - сг)

где С,, С2 — результаты параллельных определений массовой концентрации AOZ. мкг/дм3;

г — значение предела повторяемости для разных диапазонов измерения (см. таблицу 1).

в

Результат определений массовой концентрации (содержаний) AOZ в анализируемой пробе представляют в виде

С ± 0.01 U.    (5)

где С — массовая концентраций (содержание) AOZ в испытуемой пробе, мкг/дм3 (мкг/кг):

U — значение относительной расширенной неопределенности при коэффициенте охвата к- 2. % (см. таблицу 1).

11 Контроль точности результатов измерения

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (сходи* мости) и воспроизводимости, проводят с учетом требований ГОСТ ИСО 5725*6 (раздел 5).

Приложение А (рекомендуемое)

Комплектация тест-системы1' «Фуразолидон — ИФА»

В комплектацию тест-системы входят:

Планшет 96-лукочный полистироловый стрипоеанный для иммунологических исследований, с иммобилизованными антителами.

Пакет полиэтиленовый фольгироввнный с зип-локом:

Пленка полиэтиленовая свмоклеящаясядля заклеивания планшетов.

Растворы:

Ns 1 — AOZ — раствор с известным содержанием AOZ (6.25 мкг/см3);

Ns 2 — ФК — конъюгат AOZ с перохсидазой хрена;

М» 3 — раствор фосфатного буфера для промывки (20-кратный концентрат). pH (7,0—7.4);

Ns 4 — реакционный буферный раствор с добавлением бычьего сывороточного альбумина. pH (7.0—7.4). стерильный:

Ns 5 — раствор субстрата на основе З.Э',5.5-ТМБ сдобавлением перекиси водорода;

М» 6 — стол-реагент — раствор серной кислоты молярной концентрации 0.5 моль/дм-3;

Ns 7 — раствор натрия ацетата молярной концентрации 3.0 моль/дм3;

Ns 8 — раствор 2-нитробенэальдегидв в ДМСО с молярной концентрацией 0.01 мольфм3.

11 Данный комплект реагентов является рекомендуемым и приведен для удобства пользователей настоящего стандарта.

Приложение Б (рекомендуемое)

Схема заполнения лунок планшета

Внесение реагентов следует проводить согласно следующей схеме.

1

2

3

4

5

6

7

a

9

10

11

12

А

К.

Ki

Ns 4

Ns 4

Ns 12

Ns 12

Ns 20

Ns 20

Ns 28

Ns 28

Ns 36

Ns 36

В

к?

К,

Ns 5

Ns 5

Ns 13

Ns 13

Ns 21

Ns 21

Ns 29

Ns 29

Ns 37

Ns 37

С

к,

Кг

Ns 6

Ns 6

Ns 14

Ns 14

Ns 22

Ns 22

Ns 30

Ns 30

Ns 38

Ns 38

0

К,

к.

Ns 7

Ns 7

Ns 15

Ns 15

Ns 23

Ns 23

Ns 31

Ns 31

Ns 39

Ns 39

Е

к*

к„

Ns 8

Ns 8

Ns 16

Ns 16

Ns 24

Ns 24

Ns 32

Ns 32

Ns 40

Ns 40

F

Ns 1

Ns 1

Ns 9

Ns 9

Ns 17

Ns 17

Ns 25

Ns 25

Ns 33

Ns 33

Ns 41

Ns 41

0

Ns 2

№2

Ns 10

Ns 10

Ns 18

Ns 18

Ns 26

Ns 26

Ns 34

Ns 34

№ 42

Ns 42

Н

Ns 3

№3

Ns 11

N9 11

Ns 19

Ns 19

Ns 27

Ns 27

Ns 35

Ns 35

NS 43

Ns 43

Приложение В {рекомендуемое)

Таблица для записи результатов измерения

Таблица 8.1

Маркировка

оериантэ

Значение ОП

2^ 100. S ОП,

1 |д|С

Массовая концентрация (содержание) А02

по лункам

среднее

в экстракте «, ыкт/дн9

в исследуемой пробе С. MKf/дм(мкг/кт)

к<

0

к,

х,

0.3

0.5

Xj

0.4

2.5

К,

1.1

12.5

X,

хь

1.8

62.5

х>

№ 1

№ 1

Ne ...

№ ...

№ 42

№ 42

№ 43

№ 43

УДК 664:615.28:006.354    МКС 67.050

67.100

67.120

Ключевые слова: продукты пищевые, продовольственное сырье, метаболит фуразолидона. остаточное содержание, иммуноферментный метод, прецизионность метода, тест-система, антиген, антитела, оптическая плотность, ферментный конъюгат

Редактор К.В.Дудяо Технический редактор ВЮ. Фотиеяа Корректор М.8. Бучиая Компьютерная верстка И.А. Наяайкшюй

Сдано в набор 19.02 2016. Подписано в печать 26.03.20t6. Формат 60>84j£. Гарнитура Ариал. Уел. печ. п. 1,86. Уч.-ияд. п. 1.40. Тираж 3S эм Зак. 857.

Иядано и отпечатано во ФГУП «СТАНДАР ТИН ФОРМ». 123995 Москва. Гранатный лер.. 4. wovw.goslinfo.tu    

Стрип — полоска из восьми лунок.

> Зип-лок — замок, обеспечивающий герметизацию пакета.