ГОСТ 20264.4-89
Группа С09
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТНЫЕ
Методы определения амилолитической активности
Enzyme preparations.
Methods for the determination of amylase activity
МКС 07.100.30
65.120
ОКСТУ 9291
Дата введения 1990-07-01
ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ
1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Министерством медицинской и микробиологической промышленности СССР
2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 24.03.89 N 677
Изменение N 1 принято Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол N 12 от 21.11.97)
За принятие изменения проголосовали:
Наименование государства | Наименование национального органа стандартизации |
Азербайджанская Республика | Азгосстандарт |
Республика Армения | Армгосстандарт |
Республика Белоруссия | Госстандарт Белоруссии |
Грузия | Грузстандарт |
Киргизская Республика | Киргизстандарт |
Республика Молдова | Молдовастандарт |
Российская Федерация | Госстандарт России |
Республика Таджикистан | Таджикгосстандарт |
Туркменистан | Главная государственная инспекция Туркменистана |
Республика Узбекистан | Узгосстандарт |
Украина | Госстандарт Украины |
3. ВЗАМЕН ГОСТ 20264.4-74
4. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
Обозначение НТД, на который дана ссылка | Номер раздела, пункта |
ГОСТ 61-75 | 3.2, 4.2 |
ГОСТ 199-78 | 3.2, 4.2 |
ГОСТ 1770-74 | 2.2 |
ГОСТ 3118-77 | 2.2, 4.2 |
ГОСТ 4159-79 | 2.2, 4.2 |
ГОСТ 4172-76 | 2.2, 4.2 |
ГОСТ 4174-77 | 3а.2 |
ГОСТ 4198-75 | 2.2, 3.2, 4.2 |
ГОСТ 4204-77 | 4.2 |
ГОСТ 4207-75 | 3.2 |
ГОСТ 4220-75 | 4.2 |
ГОСТ 4232-74 | 2.2, 4.2 |
ГОСТ 4328-77 | 4.2 |
ГОСТ 4919.2-77 | 2.2 |
ГОСТ 5962-67 | 3.2 |
ГОСТ 6038-79 | 3.2 |
ГОСТ 6709-72 | 2.2, 3.2, 4.2 |
ГОСТ 10163-76 | 2.2, 3.2, 4.2 |
ГОСТ 10521-78 | 3.2 |
ГОСТ 12026-76 | 2.2 |
ГОСТ 18300-87 | 3.2 |
ГОСТ 20264.0-74 | 1 |
ГОСТ 24104-88 | 2.2 |
ГОСТ 24363-80 | 3.2, 4.2 |
ГОСТ 25336-82 | 2.2 |
ГОСТ 27068-86 | 4.2 |
ГОСТ 28498-90 | 2.2 |
ГОСТ 29169-91 | 3а.2 |
ГОСТ 29227-91 | 2.2 |
ГОСТ 29251-91 | 2.2 |
5. Ограничение срока действия снято по протоколу N 4-93 Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 4-94)
6. ИЗДАНИЕ с Изменением N 1, утвержденным в октябре 1997 г. (ИУС 4-94)*
________________
* Вероятно, ошибка оригинала. Следует читать: ИУС 8-98. - .
Настоящий стандарт распространяется на ферментные препараты и устанавливает методы определения активности амилолитического комплекса ферментных препаратов микробного происхождения.
1. МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ
Методы отбора проб - по ГОСТ 20264.0.
2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИЛОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ (АС)
2.1. Метод основан на гидролизе крахмала ферментами амилолитического комплекса до декстринов различной молекулярной массы.
Амилолитическая активность характеризует способность амилолитических ферментов катализировать гидролиз крахмала до декстринов различной молекулярной массы и выражается числом единиц указанных ферментов в 1 г препарата.
За единицу амилолитической активности (
2.2. Аппаратура, материалы, реактивы
Весы лабораторные общего назначения не ниже 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104*.
________________
* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001.
Колориметр фотоэлектрический лабораторный (фотоэлектроколориметр) по НТД обеспечивающий измерения в интервалах длин волн 434-450 нм и 630-670 нм с погрешностью ±1% абс. (по коэффициенту пропускания) или 0,01
Прибор для измерения рН среды в диапазоне 0-14 с погрешностью измерения ±0,1 рН.
Термостат или ультратермостат, обеспечивающий температуру нагрева (30,0±0,2) °С.
Баня водяная.
Мешалка магнитная.
Термометры по ГОСТ 28498 диапазоном измерения 0-100 °С и ценой деления шкалы не более 0,1 °С.
Холодильник бытовой.
Стаканчики для взвешивания по ГОСТ 25336.
Стаканы вместимостью от 100 до 2000 см
Колбы типа Кн вместимостью от 100 до 2000 см
Колбы мерные наливные 1-го или 2-го исполнения вместимостью 100, 200, 250 и 1000 см
Воронки типа В по ГОСТ 25336.
Пипетки 1-1-2-0,5; 1-1-2-1; 1-2-2-5; 1-2-2-10; 1-2-2-25 по ГОСТ 29227.
Пробирки П1-21-200 или П1-16-150, или П2-19-180, или П2-16-150(180) по ГОСТ 25336.
Бюретка 1-1-2-25 по ГОСТ 29251.
Эксикатор по ГОСТ 25336.
Секундомер по НТД.
Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.
Крахмал растворимый по ГОСТ 10163.
Ацетатный буферный раствор с рН 4,7, приготовленный по ГОСТ 4919.2.
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный по ГОСТ 4172, раствор молярной концентрации
Калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198, раствор молярной концентрации
Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор молярной концентрации вещества эквивалента 0,1 моль/дм
Йод по ГОСТ 4159.
Калий йодистый по ГОСТ 4232.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Примечан
ия:
1. Все реактивы должны быть квалификации ч., х.ч. или ч.д.а.
2. Допускается использование импортной посуды и приборов с метрологическими характеристиками и реактивов с квалификацией не ниже отечественных.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
2.3. Подготовка к анализу
2.3.1. Приготовление раствора крахмала с массовой долей 1% (субстрата)
(1,00±0,01) г крахмала, взятого с учетом влажности, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см
Раствор крахмала готовят в день проведения анализа.
2.3.2. Приготовление фосфатного буферного раствора с рН 5,6 и рН 6,0
Смешивают растворы фосфорнокислого натрия и фосфорнокислого калия молярной концентрации
Величину рН проверяют на приборе. В случае отклонения рН буфера от требуемого, соответствующими растворами доводят его до нормы.
2.3.3. Приготовление основного раствора йода
0,50 г йода и 5,00 г йодистого калия растворяют в бюксе с притертой крышкой в небольшом количестве воды.
Содержимое перемешивают на магнитной мешалке при плотно закрытой крышке бюксы.
Раствор после полного растворения йода переносят в мерную колбу с притертой крышкой вместимостью 200 см
Основной раствор йода хранят в течение 1 мес в склянке из темного стекла с притертой пробкой.
2.3.4. Приготовление рабочего раствора йода
2 см
Оптическая плотность рабочего раствора йода должна быть равна 0,220 (±0,01).
В случае отклонения ее от этого значения добавляют в раствор несколько капель соляной кислоты или основного раствора йода.
2.3.5. Приготовление основного раствора очищенных ферментных препаратов
0,1000-1,0000 г исследуемого препарата (в зависимости от предполагаемой активности) растворяют в небольшом количестве воды, при необходимости тщательно растирая стеклянной палочкой, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см
2.3.6. Приготовление рабочего раствора очищенных ферментных препаратов
Рабочий раствор готовят в соответствии с табл.1 из основного раствора (для навески 0,1000 г), разбавляя его дистиллированной водой так, чтобы в 5 см
Таблица 1
Амилолитическая активность ( | Масса препарата в 5 см | Объем основного раствора, необходимый для вторичного разбавления, см | Общий объем разбавленного раствора, см |
От 20 до 80 включ. | 5,0 | 50,0 | 50,0 |
" 80 " 150 " | 2,0 | 20,0 | 50,0 |
" 150 " 300 " | 1,0 | 10,0 | 50,0 |
" 300 " 700 " | 0,5 | 5,0 | 50,0 |
" 700 " 1200 " | 0,25 | 10,0 | 200,0 |
" 1200 " 2500 " | 0,125 | 5,0 | 200,0 |
" 2500 " 5000 " | 0,05 | 2,0 | 200,0 |
Св. 5000 | 0,025 | 1,0 | 200,0 |
Примечание. Для анализа берут две параллельные навески препарата и из каждой делают одно разведение, которое анализируют не менее трех раз.
Рабочий раствор ферментного препарата готовят непосредственно перед определением.
2.3.7. Приготовление основного раствора из воздушно-сухой культуры гриба
5,00 г исследуемой воздушно-сухой культуры гриба, предварительно растертой в ступке, переносят в коническую колбу вместимостью 250 см
Фильтрат хранят в течение суток при температуре от 2 до 6 °С.
2.3.8. Приготовление рабочего раствора из воздушно-сухой культуры гриба
Рабочий раствор готовят из основного раствора, разбавляя его дистиллированной водой, в соответствии с табл.2.
Таблица 2
Амилолитическая активность ( | Масса культуры гриба в 5 см | Объем основного раствора, необходимый для вторичного разбавления, см | Общий объем разбавленного раствора, см |
От 5 до 15 включ. | 37,5 | 15 | 100 |
" 15 " 50 " | 10,0 | 4 | 100 |
" 50 " 100 " | 2,5 | 1 | 100 |
" 100 " 150 " | 1,25 | 1 | 200 |
" 150 " 300 " | 0,625 | 0,5 | 200 |
2.3.9. Приготовление основного раствора из культуральной жидкости бактериального происхождения
В мерную колбу вместимостью 100 см
2.3.10. Приготовление рабочего раствора из культуральной жидкости
Рабочий раствор готовят из основного раствора, разбавляя его дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 100 см
Таблица 3
Амилолитическая активность ( | Объем культуральной жидкости в 5 см | Объем основного раствора, необходимый для вторичного разбавления, см |
От 10 до 25 включ. | 0,01 | 20,0 |
" 25 " 50 " | 0,005 | 10,0 |
" 50 " 75 " | 0,003-0,0035 | 6,0-7,0 |
" 75 " 100 " | 0,0025 | 5,0 |
" 100 " 125 " | 0,0020 | 4,0 |
" 125 " 150 " | 0,0015 | 3,0 |
Св. 150 | 0,00125 | 2,5 |
Примечание. При анализе культур бактериального происхождения с предполагаемой активностью 50-150 ед/см
2.4. Проведение анализа
Берут две пробирки, наливают в каждую по 10 см
Затем из каждой пробирки поочередно отбирают по 0,5 см
Полученные растворы приобретают следующую окраску:
контрольный раствор - синий цвет, опытный - фиолетовый различной интенсивности в зависимости от количества непрогидролизованного крахмала.
Через 5-10 мин после смешивания определяют оптическую плотность растворов фотоэлектрическим колориметром в диапазоне длин волн 630-670 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм.
Контрольным раствором при колориметрировании является дистиллированная вода.
2.5. Обработка результатов
Массу прогидролизованного крахмала (
где
0,1 - масса крахмала, взятая для анализа, г.
Если масса прогидролизованного крахмала меньше 0,02 г или больше 0,06 г, то анализ повторяют, подбирая другое разведение.
Амилолитическую активность (
Амилолитическую активность (
где
5,885; 0,001671; 7,264; 0,03766 - коэффициенты расчетного уравнения, полученные при математической обработке экспериментальных данных зависимости массы прогидролизованного крахмала от массы фермента, взятого для анализа в пересчете на 1 ч действия фермента.
За окончательный результат анализа принимают среднеарифметическое значение результатов определения активностей, полученных при анализе двух параллельных навесок препарата, относительное допускаемое расхождение между которыми не должно превышать 5%. Результат округляют до первого десятичного знака.
Предел возможных значений относительной погрешности измерений при доверительной вероятности
3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛЮКОАМИЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ (ГлС)
ГЛЮКОЗООКСИДАЗНЫМ МЕТОДОМ (АРБИТРАЖНЫЙ МЕТОД)
3.1. Метод основан на определении глюкозы, образующейся при гидролизе растворимого крахмала ферментом глюкоамилазы.
Глюкоамилазная активность (
За единицу глюкоамилазной активности принята способность фермента катализировать гидролиз растворимого крахмала при определенных условиях температуры и рН, высвобождая за 1 мин 1 мкмоль глюкозы.
3.2. Аппаратура, материалы, реактивы
Аппаратура и материалы - по п.2.2 со следующими дополнениями.
Колориметр фотоэлектрический лабораторный (фотоэлектроколориметр) по НД, обеспечивающий измерения в интервале длин волн 390-415 нм с погрешностью ±1% абс. (по коэффициенту пропускания) или 0,01
Калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198, раствор молярной концентрации 1 моль/дм
Калий железистосинеродистый по ГОСТ 4207.
Глюкоза по ГОСТ 6038.
Натрий уксуснокислый по ГОСТ 199.
Кислота уксусная по ГОСТ 61.
Крахмал растворимый по ГОСТ 10163.
Кислота бензойная по ГОСТ 10521.
Калия гидроокись по ГОСТ 24363, раствор молярной концентрации 1 моль/дм
Кальций хлористый.
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962* или спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300.
________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 51652-2000.
Глюкозооксидаза с ферментативной активностью 100000 ед/г.
Пероксидаза.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Примечание. Все реактивы должны быть квалификации ч.; х.ч. или ч.д.а.
3.3. Подготовка к анализу
3.3.1. Приготовление раствора крахмала с массовой долей 1% (субстрата) - по п.2.3.1.
3.3.2. Приготовление фосфатного буферного раствора с рН 7,5 молярной концентрации 1 моль/дм
Смешивают равные объемы растворов фосфорнокислого однозамещенного калия и гидроокиси калия молярной концентрации 1 моль/дм
Величину рН проверяют на приборе. В случае отклонения рН от требуемого составляющими растворами доводят его до нормы.
3.3.3. Приготовление раствора железистосинеродистого калия с массовой долей 1% (раствора А)
0,05 г железистосинеродистого калия количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см
Раствор готовят непосредственно перед определением.
3.3.4. Приготовление раствора глюкозооксидазы (раствора Б)
5,00 (6,00) мг глюкозооксидазы растворяют фосфатным буферным раствором с рН 7,5 в мерной колбе вместимостью 50 см
Если активность глюкозооксидазы отличается от требуемой (100000 ед/г), то навеску берут с таким расчетом, чтобы в 50 см
3.3.5. Приготовление рабочего раствора С
Рабочий раствор С готовят смешиванием равных объемов растворов А и Б.
Полученный раствор хранят в темной склянке в холодильнике в течение 2-3 сут.
3.3.6. Приготовление насыщенной бензойной кислоты
2,70 г бензойной кислоты количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см
3.3.7. Приготовление стандартных растворов глюкозы
Для приготовления стандартных растворов глюкозы пользуются перекристаллизованной из спирта безводной глюкозой, которую хранят в эксикаторе над хлористым кальцием.
100,00 мг глюкозы растворяют в 100 см
Этими растворами пользуются для построения градуировочного графика.
3.3.8. Приготовление основного и рабочего растворов очищенных ферментных препаратов
Основной раствор очищенных ферментных препаратов готовят по п.2.3.5.
Рабочий раствор готовят из основного раствора, разбавляя его дистиллированной водой в зависимости от предполагаемой активности препарата.
3.3.9. Приготовление основного и рабочего растворов из воздушно-сухой культуры гриба
1,00-5,00 г исследуемой воздушно-сухой культуры гриба (в зависимости от активности), предварительно растертой в ступке, переносят в коническую колбу вместимостью 250 см
Основной раствор хранят в течение суток при температуре от 2 °С до 6 °С.
Рабочий раствор готовят из основного, разбавляя его дистиллированной водой в зависимости от предполагаемой активности.
3.3.10. Приготовление рабочего раствора из культуральной жидкости
Отфильтрованную культуральную жидкость разбавляют дистиллированной водой в 1000 и более раз в зависимости от предполагаемой активности.
3.3.11. Построение градуировочного графика
В пробирки приливают по 1 см
По полученным значениям строится градуировочный график, имеющий линейную зависимость.
Рабочая зона градуировочного графика лежит в области 50-150 мкг.
Оптическая плотность раствора должна быть близка к значениям 0,1±0,01; 0,2±0,01; 0,3±0,01.
Если оптическая плотность отличается от этих значений, то навеску глюкозооксидазы увеличивают.
3.4. Проведение анализа
Берут две параллельные навески анализируемого продукта и из каждой делают не менее двух разведений. Каждое разведение исследуемого раствора анализируют не менее двух раз.
В пробирку наливают 10 см
Затем 1 см
Одновременно готовят контрольную пробу. Для этого 5 см
Все последующие операции с контрольными пробами проводят так же, как и с опытными.
Кроме указанной контрольной пробы на инактивированный фермент ставят контрольную пробу на рабочий раствор С. Для этого к 3 см
Интенсивность окраски определяют на фотоэлектроколориметре в диапазоне длин волн 390-415 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм.
Если контрольные пробы на инактивированный фермент имеют заметную окраску, то необходимо исследуемый раствор проколориметрировать, взяв в качестве раствора сравнения рабочий раствор.
Значение оптической плотности должно лежать в пределах, соответствующих массе глюкозы от 50 до 150 мкг.
3.5. Обработка результатов
Глюкоамилазную активность (
где
10 - время гидролиза, мин;
180 - молекулярная масса глюкозы, г/мкмоль.
Примечание. Глюкоамилазную активность в ед/см
За окончательный результат анализа принимают среднеарифметическое значение результатов определения активностей, полученных при анализе двух параллельных навесок препарата, относительное допускаемое расхождение между которыми не должно превышать 5%. Результат округляют до первого десятичного знака.
Предел возможных значений относительной погрешности измерений глюкоамилазной активности при доверительной вероятности
3а. Определение глюкоамилазной активности (ГлСп) поляриметрическим методом
3а.1. Метод основан на определении глюкозы, образующейся при гидролизе мальтозы ферментом глюкоамилазой.
Глюкоамилазная активность характеризует способность ферментного препарата катализировать гидролиз мальтозы с образованием глюкозы и выражается числом единиц активности в грамме (или см
За единицу активности глюкоамилазы принимается способность фермента катализировать при определенных значениях температуры и рН гидролиз 1 мкмоль мальтозы до глюкозы за 1 мин.
3а.2. Аппаратура, материалы, реактивы
Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г, не ниже 2-го класса точности.
Сахариметр универсальный СУ-3, СУ-4, автоматический СП или автоматические поляриметры А1-ЕПО или А1-ЕПЛ.
Прибор для измерения рН среды в диапазоне 0-14 с погрешностью измерения ±0,1 рН.
Термостат или ультратермостат, обеспечивающий температуру нагрева (50±0,2) °С.
Термометры по ГОСТ 28498 диапазоном измерения 0-100 °С и ценой деления шкалы не более 0,1 °С.
Баня водяная.
Стаканчики для взвешивания по ГОСТ 25336.
Колбы типа Кн вместимостью от 100 до 1000 см
Колбы мерные наливные 1-го или 2-го исполнения вместимостью 100, 200, 250 и 1000 см
Воронки типа В по ГОСТ 25336.
Пипетки типа 2; 1-го и 2-го исполнения вместимостью от 1 до 25 см
Пробирки П1-21-200, или П1-16-150, или П2-19-180, или П2-16-150 по ГОСТ 25336.
Секундомер по НД.
Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.
Мальтоза перекристаллизованная для бактериологических целей по НД.
Раствор буферный ацетатный с рН 4,7, приготовленный по ГОСТ 4919.2.
Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор молярной концентрации 5 моль/дм
Цинк сернокислый 7-водный по ГОСТ 4174.
Калий железистосинеродистый 3-водный по ГОСТ 4207.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Примечания:
1. Все реактивы должны быть квалификации ч., х.ч. или ч.д.а.
2. Допускается использование импортной посуды и приборов с метрологическими характеристиками и реактивов с квалификацией не ниже отечественных.
3а.3. Подготовка к анализу
3а.3.1. Приготовление раствора мальтозы массовой долей 2% (субстрат)
20,00 г перекристаллизованной мальтозы, взятой с учетом влаги, растворяют в мерной колбе вместимостью 1000 см
Хранят раствор при температуре 4-6 °С в течение 30 дней. Если при хранении раствор мальтозы помутнеет, пользоваться им не следует.
3а.3.2. Приготовление раствора железистосинеродистого калия массовой долей 15%
17,65 г калия железистосинеродистого количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см
3а.3.3. Приготовление раствора сернокислого цинка массовой долей 30%
42,85 г сернокислого цинка количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см
3а.3.4. Приготовление раствора соляной кислоты концентрации 5 моль/дм
430 см
3а.3.5. Приготовление растворов ферментных препаратов
3а.3.5.1. Приготовление основного и рабочего растворов очищенных ферментных препаратов
Основной раствор из очищенных ферментных препаратов готовят в соответствии с 2.3.5.
Рабочий раствор готовят из основного, разбавляя его дистиллированной водой в зависимости от предполагаемой активности.
3а.3.5.2. Приготовление основного и рабочего растворов из воздушно-сухой культуры гриба
Основной раствор из воздушно-сухой культуры гриба готовят в соответствии с 2.3.7.
Рабочий раствор готовят из основного, разбавляя его дистиллированной водой в зависимости от предполагаемой активности.
3а.3.5.3. Приготовление раствора из культуральной жидкости
Культуральную жидкость фильтруют через бумажный фильтр (или двойной полотняный мешок), возвращая первые порции обратно, добиваясь получения прозрачного раствора.
От 5 до 20 см
3а.3.5.4. Приготовление раствора из ультраконцентрата
5 см
_________________
* Текст соответствует оригиналу. - .
Все исследуемые растворы глюкоамилазы, приготовленные по 3а.3.5, должны обеспечивать разность угла вращения плоскости поляризации (
Если эта разность ниже 0,5° или выше 2,5°, то основной раствор разбавляют в ту или другую сторону.
3а.4. Проведение анализа
Берут две параллельные навески анализируемого продукта и из каждой делают не менее двух разведений. Каждое разведение исследуемого раствора анализируют не менее двух раз.
В две пробирки наливают по 25 см
Одновременно готовят контрольную пробу. Для этого к 25 см
Если опытные и контрольные растворы получились мутными, их осветляют. Для этого приливают по 1 см
Содержимое пробирок перемешивают и фильтруют. На сахариметре или автоматическом поляриметре измеряют угол вращения плоскости поляризации опытного и контрольного растворов, используя поляриметрическую трубку (кювету) длиной 200 мм. При использовании автоматического поляриметра показания прибора умножают на коэффициент перевода круговых градусов в градусы нормальной сахарной шкалы, равный 2,8885. Величина
3а.5. Обработка результатов
Глюкоамилазную активность
где
0,00243 - массовая концентрация глюкозы, соответствующая 1 °S, г/см
31 - объем инкубационной смеси, см
10
15 - время гидролиза, мин;
2 - коэффициент, учитывающий образование из мальтозы двух молекул глюкозы;
180 - молярная масса глюкозы, мкг/мкмоль.
В случае применения осветления конечный результат, вычисленный по формуле (4а), умножают на коэффициент, учитывающий изменение объема инкубационной смеси на 2 см
За окончательный результат анализа принимают среднеарифметическое значение результатов определения активностей, полученных при анализе двух параллельных навесок. Результат округляют до второго десятичного знака. Расхождение между каждым измерением и среднеарифметическим значением не должно превышать 5% среднего значения при доверительной вероятности
Перевод единиц активности, полученных поляриметрическим методом, в единицы стандартного глюкозооксидазного метода осуществляется в соответствии с приложением А.
Разд.3а. (Введен дополнительно, Изм. N 1).
4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСАХАРИВАЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ (ОС)
4.1. Метод основан на гидролизе растворимого крахмала в пределах 25% глюкозидных связей исследуемым ферментом с последующим йодометрическим определением количества образовавшихся сахаров.
Осахаривающая активность характеризует способность амилолитических ферментов катализировать осахаривание крахмала до мальтозы или мальтозы в смеси с глюкозой.
За единицу осахаривающей активности принята способность фермента катализировать за 1 мин при определенных значениях температуры и рН расщепление 1 мкмоля гликозидных связей до восстанавливающих сахаров. Активность выражается в ед/г препарата.
4.2. Аппаратура, материалы, реактивы
Аппаратура и материалы - по п.2.2.
Крахмал растворимый по ГОСТ 10163.
Натрий уксуснокислый 3-водный по ГОСТ 199, раствор молярной концентрации вещества эквивалента 1 моль/дм
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный по ГОСТ 4172, раствор молярной концентрации
Калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198, раствор молярной концентрации
Калий двухромовокислый по ГОСТ 4220.
Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор молярной концентрации 1 моль/дм
Кислота уксусная по ГОСТ 61, раствор молярной концентрации вещества эквивалента 1 моль/дм
Калий йодистый по ГОСТ 4232.
Калия гидроокись по ГОСТ 24363 или натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор молярной концентрации вещества эквивалента 0,1 моль/дм
Натрий серноватистокислый (натрия тиосульфат) по ГОСТ 27068 или фиксанал.
Кислота серная по ГОСТ 4204 (плотность
Йод по ГОСТ 4159.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Примечание. Все реактивы должны быть марки ч.; х.ч. или ч.д.а.
4.3. Подготовка к анализу
4.3.1. Приготовление раствора крахмала с массовой долей 1% (субстрата) - по п.2.3.1.
4.3.2. Приготовление раствора йода молярной концентрации 0,1 моль/дм
25,00 г йодистого калия растворяют в мерной колбе вместимостью 1000 см
4.3.3. Приготовление раствора серноватистокислого натрия (гипосульфита) молярной концентрации 0,1 моль/дм
25,00 г гипосульфита растворяют в мерной колбе вместимостью 1000 см
Приготовленный раствор хранят в склянке из темного стекла с сифоном и бюреткой с хлоркальциевой трубкой, заполненной натронной известью.
Титр устанавливают по двухромовокислому калию после выдерживания раствора гипосульфита в течение 15 сут.
4.3.4. Приготовление раствора серной кислоты 1:4
К четырем объемам дистиллированной воды приливают один объем серной кислоты.
4.3.5. Приготовление основного раствора очищенных ферментных препаратов - по п.2.3.5.
4.3.6. Приготовление основного раствора из воздушно-сухой культуры гриба
5,00 г исследуемой воздушно-сухой культуры гриба, предварительно растертой в ступке, переносят в коническую колбу вместимостью 250 см
Через 1 ч раствор фильтруют и фильтрат используют для анализа.
Фильтрат хранят в течение суток при температуре от 2 до 6 °С.
4.4. Проведение анализа
4.4.1. Берут две параллельные навески исследуемого продукта и из каждой делают не менее двух разведений. Каждое разведение анализируют не менее двух раз.
4.4.2. Определение осахаривающей активности в очищенных препаратах и культуре гриба, полученных из Asp. oryzae
В коническую колбу вместимостью 50 см
Через 10 мин после добавления ферментного раствора действие фермента приостанавливают добавлением 2 см
Колбу закрывают и оставляют на 15 мин в защищенном от света месте. Через 15 мин в раствор добавляют 2 см
Одновременно ставят контрольный опыт с теми же количествами всех реагентов, только ферментный раствор вводят после добавления 2 см
Разность между результатами титрования контрольного и опытного растворов должна составлять 0,5-6 см
аствора.
4.4.3. Определение осахаривающей активности в очищенных препаратах и в культуре гриба, полученный из Asp. awamori
Все операции по определению осахаривающей активности проводят по п.4.4.2 со следующим дополнением:
для прекращения ферментативной реакции добавляют 5 см
4.4.4. Определение осахаривающей активности в очищенных препаратах и в культуре из Вас. subtilis
Все операции по определению осахаривающей активности проводят по п.4.4.2 со следующими дополнениями:
в качестве субстрата берут раствор крахмала, приготовленного на буферном растворе с рН 6,0;
после введения 20 см
при пересчете найденных значений скорости реакции на начальную скорость (в пределах 4-25% гидролиза гликозидных связей крахмала) следует пользоваться градуировочным графиком, построенном на основании экспериментальных данных.
4.5. Обработка результатов
4.5.1. Осахаривающую активность (
где
Эквивалентную массу вещества, в зависимости от разности титрования контрольного и опытного растворов (
Таблица 3
( | |
0,1 | 5,0 |
0,2 | 10,0 |
0,3 | 15,0 |
0,4 | 20,2 |
0,5 | 25,5 |
0,6 | 30,8 |
0,7 | 36,2 |
0,8 | 41,6 |
0,9 | 47,0 |
1,0 | 52,6 |
1,1 | 58,2 |
1,2 | 63,9 |
1,3 | 69,7 |
1,4 | 75,5 |
1,5 | 81,5 |
1,6 | 87,6 |
1,7 | 93,6 |
1,8 | 99,8 |
1,9 | 106,1 |
2,0 | 112,5 |
2,1 | 118,9 |
2,2 | 125,5 |
2,3 | 132,1 |
2,4 | 138,9 |
2,5 | 145,8 |
2,6 | 152,8 |
2,7 | 159,9 |
2,8 | 167,1 |
2,9 | 174,5 |
3,0 | 181,9 |
3,1 | 189,5 |
3,2 | 197,2 |
3,3 | 205,1 |
3,4 | 213,1 |
3,5 | 221,3 |
3,6 | 229,6 |
3,7 | 238,1 |
3,8 | 246,8 |
3,9 | 255,6 |
4,0 | 264,6 |
4,1 | 273,8 |
4,2 | 283,2 |
4,3 | 292,8 |
4,4 | 302,7 |
4,5 | 312,8 |
4,6 | 323,1 |
4,7 | 333,6 |
4,8 | 344,4 |
4,9 | 355,5 |
5,0 | 366,9 |
5,1 | 378,6 |
5,2 | 390,6 |
5,3 | 402,9 |
5,4 | 415,6 |
5,5 | 428,8 |
5,6 | 442,3 |
5,7 | 456,2 |
5,8 | 470,6 |
5,9 | 485,0 |
6,0 | 501,2 |
4.5.2. Осахаривающую активность (
где
50 - коэффициент пересчета на мкмоль гликозидных связей;
4.5.3. Осахаривающую активность (
где
Эквивалентную массу вещества в зависимости от разности титрования контрольного и опытного растворов
Таблица 4
0,9 | 45,0 |
1,0 | 52,1 |
1,1 | 58,7 |
1,2 | 63,3 |
1,3 | 67,8 |
1,4 | 74,7 |
1,5 | 81,4 |
1,6 | 85,9 |
1,7 | 92,7 |
1,8 | 99,6 |
1,9 | 108,5 |
2,0 | 113,1 |
2,1 | 119,9 |
2,2 | 128,8 |
2,3 | 138,0 |
2,4 | 150,3 |
2,5 | 158,3 |
2,6 | 169,7 |
2,7 | 180,9 |
2,8 | 192,3 |
2,9 | 209,9 |
3,0 | 226,1 |
3,1 | 250,6 |
3,2 | 278,2 |
3,3 | 312,1 |
3,4 | 366,2 |
3,5 | 452,3 |
3,6 | 517,9 |
3,7 | 585,7 |
3,8 | 662,7 |
3,9 | 740,3 |
4,0 | 811,9 |
4,1 | 891,6 |
4,2 | 968,1 |
4.5.4. За окончательный результат анализа принимают среднеарифметическое значение результатов определения активностей, полученных при анализе двух параллельных навесок препарата, относительное допускаемое расхождение между которыми не должно превышать 5%.
Результат округляют до первого десятичного знака.
Предел возможных значений относительной погрешности измерений при доверительной вероятности
ПРИЛОЖЕНИЕ А
Справочное
ПЕРЕВОД ЕДИНИЦ АКТИВНОСТИ В ЕДИНИЦЫ ГЛЮКОЗООКСИДАЗНОГО МЕТОДА
Для перевода единиц активности, полученных поляриметрическим методом, в единицы глюкозооксидазного метода используется переводной коэффициент
1. Для препаратов, полученных при культивировании гриба Asp. awamori, выращенного глубинным способом,
При изменении условий культивирования продуцента глюкоамилазы значение коэффициента следует уточнять. Для контрольных заводских условий уточнение коэффициента проводят путем сравнительного определения активности глюкоамилазы глюкозооксидазным и поляриметрическим методами.
Работу проводят на пяти пробах, полученных при разных ферментациях.
Переводной коэффициент
где
ПРИЛОЖЕНИЕ. (Введено дополнительно, Изм. N 1).
Электронный текст документа
и сверен по:
Препараты ферментные. Сб. ГОСТов. -
М.: ИПК Издательство стандартов, 2005