ГОСТ 10444.8-88
Группа Н09
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ
Метод определения Bacillus cereus
Food products. Method for determination of Bacillus cereus
МКС 07.100.30
ОКСТУ 9109
Дата введения 1990-01-01
ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ
1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Государственным агропромышленным комитетом СССР
2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 25.08.88 N 3021
3. В стандарт введен международный стандарт ИСО 7932 (1987)
4. ВЗАМЕН ГОСТ 10444.10-75
5. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
Обозначение НТД, | Номер пункта |
ГОСТ 3640-94 | 2.1 |
ГОСТ 6672-75 | 2.1 |
ГОСТ 8756.18-70 | 1.2 |
ГОСТ 9284-75 | 2.1 |
ГОСТ 10444.1-84 | 1.2; 2.1; 3.2.3; 3.2.4; 3.2.5; 3.2.8; 3.2.9; 4.2.4; 4.2.5 |
ГОСТ 10444.7-86 | 3.1.10 |
ГОСТ 24104-88 | 2.1 |
ГОСТ 24363-80 | 2.1 |
ГОСТ 26668-85 | 1.1 |
ГОСТ 26669-85 | 1.2 |
ГОСТ 26670-91 | 4.1.2; 5.4 |
ГОСТ 26809-86 | 1.1 |
ГОСТ 30425-97 | 4.2.1 |
6. Ограничение срока действия снято по протоколу N 4-93 Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 4-94)
7. ПЕРЕИЗДАНИЕ. Апрель 2010 г.
Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод определения Bacillus cereus, в том числе близких к нему видов В. anthracis, В. thuringiensis, В. cereus var. mycoides.
Метод основан на выделении В. cereus из колоний, полученных при поверхностном посеве продукта, его разведения или культуральной жидкости на селективные среды. Принадлежность выделенных колоний к В. cereus определяют по морфологическим и биохимическим свойствам. В зависимости от требований нормативного документа подсчитывают количество или учитывают присутствие (отсутствие) В. cereus в исследуемом продукте.
Метод предназначен для:
установления соответствия микробиологических показателей качества пищевого продукта требованиям нормативного документа;
исследования продукта по санитарно-эпидемиологическим показаниям;
анализа микрофлоры посевов (культуральной жидкости), в которых обнаружены мезофильные факультативно-анаэробные микроорганизмы, при необходимости подтверждения присутствия в посевах В. cereus.
1. ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ
1.1. Отбор проб пищевых продуктов по ГОСТ 26668, ГОСТ 26809.
1.2. Подготовка проб пищевых продуктов к анализу - по ГОСТ 26669.
Консервы проверяют на герметичность по ГОСТ 8756.18.
Полные консервы, нормальные по внешнему виду, перед испытанием термостатируют при 30-37 °С в таре вместимостью до 1 дм
Пищевые продукты, в которых нормируется допустимое количество В. cereus, термостатированию не подлежат.
Масса (объем) навески, предназначенной для приготовления гомогената продукта или исходного разведения, - не менее (10,0±0,1) г (см
Исходные разведения продуктов, с массовой долей NaCl более 5%, готовят с использованием пептонной воды; исходные разведения мясных, молочных продуктов и молока готовят с использованием физиологического раствора. Для приготовления последующих десятикратных разведений используют пептонно-солевой раствор. Пептонную воду и пептонно-солевой раствор готовят по ГОСТ 26669, физиологический раствор - по ГОСТ 10444.1.
Из пробы пищевого продукта, в котором нормируется количество В. cereus, или его исходного разведения готовят ряд разведений в соответствии с допустимым количеством В. cereus, указанном в нормативно-технической документации на конкретный вид пищевого продукта. Культуральную жидкость разводят так, чтобы получить при высеве раздельные колонии.
2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ
2.1. Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1, а также аппаратуру, материалы и реактивы, указанные ниже:
весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104*, с наибольшим пределом взвешивания до 200 г и поверочной ценой деления не более 2 мг (для взвешивания реактивов);
_________________
* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001. На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008.
весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104*, с наибольшим пределом взвешивания до 200 г и поверочной ценой деления не более 20 мг (для взвешивания продукта);
_________________
* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001. На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008.
микроскоп световой биологический с приспособлением для фазовоконтрастного микроскопирования;
стекла предметные по ГОСТ 9284;
стекла покровные по ГОСТ 6672;
петлю бактериологическую;
термостат с диапазоном рабочих температур от 28 до 55 °С, позволяющий поддерживать заданную температуру с погрешностью ±1 °С;
шпатели стеклянные;
калия гидроокись по ГОСТ 24363;
креатин;
полимиксин В сульфат во флаконах по 25 мг (250000 ЕД) и по 50 мг (500000 ЕД);
полимиксин М сульфат во флаконах по 500000 ЕД;
кислоту 5-амино-2-нафтален сульфоновую;
кислоту сульфаниловую;
феноловый красный, индикатор;
цинк - порошок по ГОСТ 3640.
3. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ
3.1. Приготовление растворов
3.1.1. Раствор массовой концентрацией гидроокиси калия 400 г/дм
Применяют для постановки реакции на образование ацетилметилкарбинола.
3.1.2. Раствор массовой концентрации гидроокиси натрия 4 г/дм
Применяют для приготовления раствора индикатора фенолового красного.
3.1.3. Раствор полимиксин В сульфата или полимиксин М сульфата: непосредственно перед использованием во флакон со стерильным полимиксин сульфатом 250000 ЕД (для инъекций) внести 2,5 см
Применяют для приготовления селективных сред.
3.1.4. Раствор 5-амино-2-нафтален сульфоновой кислоты: 0,1 г 5-амино-2-нафтален сульфоновой кислоты переносят, смывая раствором уксусной кислоты с объемной долей уксусной кислоты 15%, в мерную посуду вместимостью 100 см
Раствор фильтруют через бумажный фильтр и хранят при температуре (4±2) °С в хорошо закупоренных сосудах из темного стекла не более 3 мес.
Применяют для приготовления индикатора при определении нитратредуцирующих свойств.
3.1.5. Раствор массовой концентрации сульфаниловой кислоты 4 г/дм
Объем доводят до метки тем же раствором уксусной кислоты. Раствор фильтруют через бумажный фильтр и хранят при температуре (4±2) °С в хорошо закупоренных сосудах из темного стекла не более 2 мес.
Применяют для приготовления индикатора при определении нитратредуцирующих свойств.
3.1.6. Раствор массовой концентрации сульфаниловой кислоты 8 г/дм
Применяют в качестве индикатора при определении нитратредуцирующих свойств.
3.1.7. Раствор массовой концентрации 1-нафтола 5 г/дм
Применяют в качестве индикатора при определении нитратредуцирующих свойств.
3.1.8. Растворы с объемной долей уксусной кислоты 15 и 30%: 15 или 30 см
Применяют для приготовления индикатора при определении нитратредуцирующих свойств.
3.1.9. Раствор индикатора фенолового красного: 1,25 г фенолового красного растирают в ступке с 40 см
Применяют для приготовления агара желточного с полимиксин В или полимиксин М сульфатом.
3.1.10. Эмульсию яично-желточную готовят по ГОСТ 10444.7.
3.2. Приготовление питательных сред
3.2.1. Селективный агар для выделения и идентификации, выпускаемый Дагестанским НИИ питательных сред.
Состав среды на 1 дм
ферментативный гидролизат кормовых дрожжей | 12,0 |
1,0 | |
натрий хлористый | 3,0 |
натрий лимоннокислый трехзамещенный | 5,0 |
литий сернокислый | 5,0 |
маннит | 5,0 |
бромтимоловый синий | 0,04 |
агар микробиологический | 10,0. |
4,0 г сухого порошка готовой среды размешать в колбе со 100 см
Применяют в качестве селективной среды.
3.2.2. Лецитин-агар для выделения В. cereus из консервированных продуктов, выпускаемый Дагестанским НИИ питательных сред.
Состав среды на 1 дм
ферментативный гидролизат кормовых дрожжей | 15,0 |
1,0 | |
натрий хлористый | 3,0 |
бромтимоловый синий | 0,04 |
агар микробиологический | 10,0. |
2,8 г сухого порошка готовой среды размешать в колбе в 100 см
Охлажденную до 45-50 °С среду разлить в чашки Петри. После застывания агара чашки подсушить в термостате 40-60 мин. Цвет готовой среды - салатный, рН среды после стерилизации 7,4±0,2.
Применяют в качестве селективной среды для выделения В. cereus из консервированных продуктов.
3.2.3. Агар желточный с хлористым натрием, полимиксин В или полимиксин М сульфатом и 2, 3, 5-трифенилтетразолиум хлоридом.
К 1 дм
Перед употреблением к 1 дм
Применяют в качестве селективной среды.
3.2.4. Агар желточный с маннитом, полимиксин В или полимиксин М сульфатом и феноловым красным.
К 1 дм
Перед употреблением к 1 дм
Применяют в качестве селективной среды.
3.2.5. Агар мясо-пептонный готовят по ГОСТ 10444.1.
Применяют для морфологической и биохимической идентификации.
3.2.6. Среда с индикатором бромкрезоловым пурпуровым и глюкозой, выпускаемая Дагестанским НИИ питательных сред.
Состав среды на 1 дм
сухой питательный агар | 7,3 |
глюкоза | 3,65 |
натрий фосфорнокислый двузамещенный | 0,38 |
натрий хлористый | 3,65 |
бромкрезоловый пурпуровый | 0,02. |
15,0 г сухого порошка готовой среды растворяют в колбе в 1 дм
Применяют для определения анаэробной ферментации глюкозы.
3.2.7. Среда с индикатором бромкрезоловым пурпуровым и маннитом, выпускаемая Дагестанским НИИ питательных сред.
Состав среды на 1 дм
сухой питательный агар | 7,3 |
маннит | 3,65 |
натрий фосфорнокислый двузамещенный | 0,38 |
натрий хлористый | 3,65 |
бромкрезоловый пурпуровый | 0,02. |
15,0 г сухого порошка готовой среды растворяют в колбе в 1 дм
Применяют для определения биохимических свойств.
3.2.8. Пептонную среду с глюкозой готовят по ГОСТ 10444.1.
Применяют для определения способности В. cereus образовывать ацетилметилкарбинол.
3.2.9. Нитратная среда
К 1 дм
Среду хранят при температуре 0-5 °С не более 1 мес.
Применяют для определения нитратредуцирующих свойств.
4. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ
4.1. Выделение характерных колоний
4.1.1. Для проведения испытания отбирают объем 0,1-0,2 см
Допускается для получения раздельных колоний проводить посев культуральной жидкости петлей на поверхность питательной среды.
4.1.2. Подготовленную пробу продукта, его разведения или разведения культуральной жидкости высевают поверхностным методом по ГОСТ 26670 параллельно в две чашки Петри с предварительно подсушенной селективной средой, указанной в пп.3.2.1-3.2.3 или 3.2.4.
4.1.3. Посевы на чашках Петри термостатируют при (30±1) °С в течение 24-48 ч. Через 24 ч посевы просматривают и выбирают чашки Петри, на которых выросло от 15 до 150 колоний, характерных для В. cereus. Характеристика колоний В. cereus на селективных питательных средах приведена в приложении.
Через 48 ч уточняют число обнаруженных колоний. Корректировку подсчета количества В. cereus проводят после изучения морфологических и биохимических особенностей микроорганизмов из колоний, характерных для В. cereus.
4.2. Подтверждение принадлежности характерных колоний к В. cereus.
4.2.1. Для подтверждения принадлежности подсчитанных колоний к колониям, образуемым В. cereus, микроорганизмы из пяти колоний пересевают на скошенный мясо-пептонный агар и термостатируют 18-24 ч при (30±1) °С.
На скошенном мясо-пептонном агаре В. cereus образует сплошной налет белого цвета, иногда с мучнистой поверхностью. Со скошенного мясо-пептонного агара готовят препараты, окрашивают по Граму по ГОСТ 30425, а также определяют подвижность клеток при микроскопировании методом висячей капли.
В мазках, приготовленных со скошенного агара, В. cereus имеет вид крупных грамположительных палочек размером 1,0-1,2x3,0-5,0 мкм со слегка закругленными концами, лежащих в виде цепочек или штакетообразных скоплений, реже отдельно друг от друга. В. cereus образует субтерминальные или центральные споры. В висячей капле клетки подвижны, однако могут встречаться штаммы со слабо выраженной подвижностью.
4.2.2. Для доказательства анаэробной ферментации глюкозы культуры со скошенного агара, указанного в п.4.2.1, высевают уколом в питательную среду с индикатором бромкрезоловым пурпуровым и глюкозой (см. п.3.2.6). Посевы инкубируют при температуре (30±1) °С в течение 24 ч. В. cereus растет, окрашивая среду в желтый или желто-коричневый цвет по всей длине укола.
4.2.3. Для определения способности В. cereus ферментировать маннит культуры со скошенного агара (см. п.4.2.1) пересевают на питательную среду с индикатором бромкрезоловым пурпуровым и маннитом (см. п.3.2.7). Посевы термостатируют при (30±1) °С в течение 24 ч.
При развитии В. cereus на среде с маннитом цвет среды не изменяется.
4.2.4. Для постановки реакции на образование ацетилметилкарбинола культуры со скошенного агара (см. п.4.2.1) пересевают на пептонную среду с глюкозой с рН 7,0. Посевы термостатируют при (30±1) °С в течение 24 ч. В чистую пробирку отбирают 1 см
После добавления каждого раствора содержимое пробирки тщательно встряхивают, а затем оставляют на 1 ч при комнатной температуре.
В. cereus образует ацетилметилкарбинол, поэтому окраска среды меняется в розовый цвет.
При отрицательной реакции культуральную жидкость термостатируют дополнительно 24 ч, после чего делают окончательное заключение.
4.2.5. При постановке реакции на подтверждение редукции В. cereus нитратов предварительно убеждаются в том, что сама среда не содержит нитритов. Для этого в две контрольные пробирки со средой добавляют по 0,2-0,5 см
Допускается использование йодокрахмального реактива по ГОСТ 10444.1 для контроля отсутствия нитритов в питательной среде.
Для подтверждения редукции нитратов проводят посевы в пробирки с нитратной средой. Посевы термостатируют при температуре (30±1) °С в течение 24 ч, затем добавляют 0,2-0,5 см
Если в течение 15 мин не происходит покраснения, добавляют в посев немного порошкообразного цинка и выдерживают еще 10 мин. Если после добавления цинка среда краснеет, то редукция нитратов, вследствие отсутствия В. cereus, не произошла и тест считают отрицательным. Если после добавления цинка среда не краснеет, то делают вывод о том, что редукция нитратов, вследствие присутствия В. cereus, произошла.
Допускается вместо смеси равных объемов растворов, указанных в пп.3.1.4, 3.1.5, использовать растворы, указанные в пп.3.1.6, 3.1.7.
В этом случае эти растворы добавляют из расчета по две капли каждого раствора к 3 см
5. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ
5.1. Результаты испытания продукта оценивают по каждой пробе отдельно.
5.2. Если при изучении культуральных, морфологических и биохимических свойств микроорганизмов, выделенных из колоний, обнаружены подвижные, грамположительные, нитратредуцирующие, спорообразующие палочки, способные образовывать ацетилметилкарбинол, ферментировать в анаэробных условиях глюкозу и не способные ферментировать маннит, то дают заключение о том, что обнаруженные микроорганизмы относятся к В. cereus.
5.3. При необходимости подсчета В. cereus, если в 80% случаев, т.е. не менее чем в четырех из пяти колоний, подтвержден рост В. cereus, то считают, что все характерные колонии, выросшие в чашке, принадлежат к В. cereus.
В остальных случаях количество В. cereus определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для изучения морфологических и биохимических свойств.
5.4. Результаты испытаний пересчитывают на 1 г или 1 см
ПРИЛОЖЕНИЕ
Справочное
ХАРАКТЕРИСТИКА КОЛОНИЙ В. CEREUS НА СЕЛЕКТИВНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ
Название питательной среды | Характеристика колоний |
1. Селективный агар для выделения и идентификации | Колонии диаметром 1,5-2,0 мм, окруженные зонами преципитата синего цвета диаметром 4-5 мм. В первые часы роста колонии округлые, выпуклые; затем края колоний становятся изрезанными. |
2. Желточный агар с хлористым натрием, полимиксин В или полимиксин М сульфатом и 2, 3, 5-трифенилтетразолиум хлоридом | Колонии круглые, блестящие, красные, диаметром около 2-3 мм с зоной белого преципитата диаметром около 4-5 мм. |
3. Желточный агар с маннитом, полимиксин В или полимиксин М сульфатом и феноловым красным | Колонии розовые (вследствие отсутствия способности ферментировать маннит), крупные, шероховатые, сухие, окруженные зоной бело-розового преципитата. |
Если в чашках содержится много микроорганизмов, ферментирующих маннит до кислоты, то характерный розовый цвет колоний В. cereus может побледнеть или исчезнуть, в этом случае эти колонии следует учитывать. | |
4. Лецитин-агар для выделения В.cereus из консервированных продуктов | Колонии, аналогичные колониям, указанным в п.1. |
Электронный текст документа
и сверен по:
Продукты пищевые, консервы.
Методы микробиологического анализа:
Сб. ГОСТов. - , 2010