ГОСТ 20264.3-81
Группа С09
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТНЫЕ
Методы определения активности пектолитического комплекса
Enzyme preparations.
Methods for determination of pectolytic complex activity
МКС 07.100.30
65.120
ОКСТУ 9291
Дата введения 1982-07-01
Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 15 апреля 1981 г. N 1973 дата введения установлена 01.07.82
Ограничение срока действия снято по протоколу N 2-92 Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 2-93)
ВЗАМЕН ГОСТ 20264.3-74
ИЗДАНИЕ с Изменением N 1, утвержденным в январе 1987 г. (ИУС 4-87).
Настоящий стандарт распространяется на ферментные препараты микробного происхождения и устанавливает методы определения активности пектолитического комплекса.
1. МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ
1.1. Отбор проб - по ГОСТ 20264.0-74.
1.2. Все весовые определения проводятся на лабораторных весах общего назначения по ГОСТ 24104-88* 1 и 2-го классов точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г. Допускается применение других весов с аналогичными техническими и метрологическими характеристиками.
________________
* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001.
(Введен дополнительно, Изм. N 1).
2. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕКТОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ (ПкС)
(интерферометрический метод)
2.1. Сущность метода
Метод основан на определении пектолитических ферментов при каталитическом расщеплении пектина.
За единицу пектолитической активности должно быть принято количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 г пектина до продуктов, не осаждаемых сернокислым цинком при проведении гидролиза в строго определенных условиях: температура 30 °С, время гидролиза 1 ч, величина рН реакционной среды 4,0; соотношение фермент-субстрат в реакционной среде, обеспечивающее гидролиз 30%-ного пектина, взятого на реакцию.
Пектолитическую активность выражают числом указанных единиц в 1 г испытуемого препарата.
Количество продуктов гидролиза пектина, не осаждаемых сернокислым цинком, определяют на интерферометре.
2.2. Аппаратура, материалы, реактивы
Интерферометр типа ИТР-2 или ЛИР-2.
Мешалка любой марки.
Прибор для определения рН среды в интервале от 1 до 14 с погрешностью измерения не более 0,05 рН.
Ультратермостат типа ТС-16А с пределом измерений 40 °С и погрешностью 1% или другой ультратермостат с аналогичными характеристиками.
Термометры 0-150 °С по ГОСТ 28498-90 с ценой деления 1 °С.
Пробирки стеклянные диаметром 15-18 мм по ГОСТ 25336-82.
Стаканчики для взвешивания вместимостью 25-30 см
Колбы мерные 2-50, 500-2 (наливные) по ГОСТ 1770-74.
Стаканы и колбы стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336-82 вместимостью 250, 300, 500 см
Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026-76.
Фильтры обеззоленные. Синяя лента.
Пектин свекловичный со степенью метоксилирования не менее 35% и содержанием основного вещества не менее 70%.
Сахароза по ГОСТ 5833-75, раствор с массовой долей сахарозы 0,25%.
Цинк сернокислый по ГОСТ 4174-77, раствор с массовой долей сернокислого цинка 15%.
Аммиак водный по ГОСТ 3760-79.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.
Примечание. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
2.3. Подготовка к анализу
2.3.1. Приготовление основного ферментного раствора из очищенных порошкообразных препаратов
0,1000 г (или 1,0000 г) исследуемого препарата взвешивают с погрешностью не более 0,0001 г в стаканчике вместимостью 25-30 см
Таблица 1
Количество ед. активности в 1 г препарата (ед. | Количество раствора, которое необходимо для вторичного разбавления, см | Объем, до которого необходимо разбавить взятое количество раствора, см | Количество препарата, содержащееся в 10 мл ферментного раствора, взятое на анализ, г |
2-5 | Без разведения | Без разведения | 0,02 |
5-10 | 20 | 50 | 0,008 |
10-20 | 10 | 50 | 0,004 |
20-40 | 5 | 50 | 0,002 |
40-100 | 2,5 | 50 | 0,001 |
100-200 | 2,5 | 100 | 0,0005 |
200-500 | 2,5 | 250 | 0,0002 |
2.3.2. Приготовление основного ферментного раствора из поверхностной культуры гриба
1,00 г измельченной воздушно-сухой культуры гриба взвешивают с погрешностью не более 0,01 г, переносят в стакан вместимостью 250 см
Таблица 2
Количество условных единиц активности в 1 г культуры | Количество фильтрата вытяжки, взятое для разбавления, см | Количество культуры, содержащееся в 10 см |
0,4-1,0 | - | 0,1 |
1,0-2,5 | 20 | 0,04 |
2,5-5,0 | 10 | 0,02 |
5,0-10 | 5 | 0,01 |
Свыше 10 | 2,5 | 0,005 |
2.3.3. Приготовление раствора с массовой долей пектина 1% (субстрат)
Навеску пектина, взятую с таким расчетом, чтобы в 250 см
Раствор пектина готовят не менее чем за 4 ч до проведения анализа.
Раствор пектина можно использовать в течение 2-3 сут при условии хранения в холодильнике.
2.3.4. Проверка интерферометра
Интерферометр проверяют раствором сахарозы. В правую секцию кюветы интерферометра с длиной грани 4 см наливают дистиллированную воду, в левую - приготовленный раствор сахарозы.
Поправочный коэффициент (
где 780 - показание прибора;
2.4. Проведение анализа
Для анализа берут несколько пробирок диаметром 2 см и высотой 18 см по количеству исследуемых проб. В каждую пробирку наливают по 20 см
По истечении этого времени в пробирки с реакционной смесью добавляют по 2 см
Содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают путем встряхивания не менее 10 раз и фильтруют через фильтр.
Если фильтрат будет мутным, то его необходимо заново профильтровать через тот же фильтр до получения прозрачного раствора. Полученный раствор является исследуемым.
Одновременно готовят контрольный раствор. Для этого в пробирку наливают 2 см
Измерение проводят на интерферометре. Для этого исследуемый раствор наливают в левое отделение кюветы интерферометра с длиной грани 4 см, а контрольный раствор в правое отделение и измеряют величину смещения интерференционных полос, возникающую вследствие различия показателей преломления контрольного и исследуемого растворов. Отсчет ведут по шкале барабана прибора.
Для обеспечения точности анализа необходимо разведение ферментных препаратов подбирать таким образом, чтобы получать показания прибора от 400 до 1250
.
2.5. Обработка результатов
Пектолитическую активность (
где
0,06425, 19,62 и 1000 - постоянные коэффициенты, полученные при математической обработке экспериментальных данных по изучению зависимости между количеством образующихся продуктов гидролиза пектина в условиях метода и количеством единиц активности фермента, взятого на анализ;
За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение активностей, полученных при анализе двух навесок. Из каждой навески делают не менее трех разведений. Допускаемое расхождение между значениями активностей не должно превышать 5%.
Результат округляют до первого десятичного знака.
Предел возможных значений погрешности измерений пектолитической активности при доверительной вероятности
2.3.1-2.5. (Измененная редакция, Изм. N 1).
3. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭКЗОПОЛИГАЛАКТУРОНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ (экзо-ПгС)
ПО УВЕЛИЧЕНИЮ КОЛИЧЕСТВА ВОССТАНАВЛИВАЮЩИХ АЛЬДЕГИДНЫХ ГРУПП
3.1. Сущность метода
Метод основан на учете количества прогидролизированных связей по увеличению конечных альдегидных групп.
За единицу экзополигалактуроназной активности принято количество фермента, которое в условиях определения при 30 °С катализирует гидролиз 1 мкэкв. гликозидных связей в молекуле пектовой кислоты за 1 мин.
Экзополигалактуроназная активность выражается числом указанных единиц в 1 г препарата (или 1 см
3.2. Аппаратура, материалы, реактивы
Шкаф сушильный вакуумный любой марки.
Ультратермостат типа ТС-16А с пределом измерений 40 °С и погрешностью 1% или другой ультратермостат с аналогичными характеристиками.
Прибор для определения рН среды в интервале от 1 до 14 с погрешностью измерения не более 0,05 рН.
Воронка Бюхнера.
Стаканы и колбы стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336-82 вместимостью 100, 500, 1000 см
Термометры 0-150 °С по ГОСТ 28498-90 с ценой деления 1 °С.
Бюретки любого исполнения, 2-го класса точности вместимостью 25 см
Пипетки 2-1-10 и 2-1-25 по ГОСТ 29227-91.
Бязь по ГОСТ 29298-92*.
_________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 29298-2005. - .
Марля медицинская по ГОСТ 9412-93.
Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026-76.
Сито из проволочной сетки N 025 по ГОСТ 6613-86.
Кислота пектовая.
Спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300-87.
Натрий серноватистокислый по ГОСТ 27068-86.
Пектин свекловичный со степенью метоксилирования не менее 35% и содержанием основного вещества не менее 70%.
Крахмал растворимый по ГОСТ 10163-76, раствор с массовой долей крахмала 1%.
Натрий углекислый по ГОСТ 83-79, раствор молярной концентрации 1 моль/дм
Йод по ГОСТ 4159-79, раствор молярной концентрации 0,1 моль/дм
Кислота серная по ГОСТ 4204-77, раствор молярной концентрации 2 моль/дм
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77.
Кислота соляная по ГОСТ 3118-77, раствор молярной концентрации 0,5 моль/дм
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.
Примечание. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
3.3. Подготовка к анализу
3.3.1. Приготовление пектовой кислоты (субстрат)
30,00 г свекловичного пектина, взвешенного с погрешностью не более 0,01 г, заливают 600 см
Для омыления раствор оставляют на 1 ч в холодильнике. Затем осаждают пектовую кислоту прибавлением примерно 900 см
Полученную кислоту сушат на воздухе, затем в вакуумном сушильном шкафу при комнатной температуре.
Порошок отсеивают через сито с ячейками 0,25 мм (остаток на сите отбрасывают). Влажность продукта обычно 10-15%
.
3.3.2. Приготовление раствора с массовой долей пектовой кислоты 1%
Навеску пектовой кислоты, взятую с таким расчетом, чтобы в 100 см
Полученный раствор пектовой кислоты количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см
(Измененная редакция, Изм. N 1).
3.3.3. Приготовление основного раствора ферментного препарата - по пп.2.3.1, 2.3.2 непосредственно перед применением.
3.4. Проведение анализа
3.4.1. 10 см
Через 10 мин в колбу вводят по 5 см
По истечении этого времени в эти же колбы добавляют по 1,8 см
3.4.2. Для проведения анализа ферментных препаратов, величина активности которых неизвестна, необходимо взять 50 см
3.4.3. Растворы тщательно перемешивают, закрывают стеклянными пробками и оставляют стоять 20 мин в защищенном от света месте. Затем вводят 2 см
Одновременно ставят контрольный опыт с таким же количеством всех реагентов, только ферментный раствор вводят после добавления углекислого натрия непосредственно перед добавлением раствора йода.
Разность при титровании между контролем и опытом должна быть от 0,5 до 2,5 см
3.5. Обработка результатов
Экзополигалактуроназную активность (
где 51,3 - число микроэквивалентов альдегидных групп, соответствующих 1 см
Для обеспечения точности анализа необходимо разведение ферментных препаратов подбирать таким образом, чтобы гидролиз пектовой кислоты не превышал 20%.
Гидролиз пектовой кислоты (
где
9,03 - количество пектовой кислоты, соответствующее 1 см
100 - коэффициент перевода в проценты.
За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение активностей, полученных при анализе двух навесок. Из каждой навески делают не менее трех разведений. Допускаемое расхождение между значениями активностей не должно превышать 5%.
Результат округляют до первого десятичного знака.
Предел возможных значений погрешности измерений экзополигалактуроназной активности при доверительной вероятности
3.4.1-3.5. (Измененная редакция, Изм. N 1).
Разд.4. (Исключен, Изм. N 1).
5. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕКТИНЭСТЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ (ПэС)
5.1. Сущность метода
Метод основан на гидролизе раствора пектина исследуемым ферментным препаратом с последующим определением освободившихся в результате гидролиза карбоксильных групп.
Пектинэстеразная активность характеризует способность фермента катализировать гидролиз сложноэфирных связей в молекуле пектина с образованием метилового спирта и свободных карбоксильных групп.
За единицу активности пектинэстеразы принято количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 мкэкв сложноэфирных связей в молекуле пектина за 1 мин при 30 °С.
Пектинэстеразную активность (
Определяемая величина пектинэстеразной активности находится в непосредственной зависимости от степени этерификации пектина.
Сравнимые результаты при работе с различными субстратами можно получить только при пересчете полученных данных на субстрат со 100%-ной степенью метоксилирования.
5.2. Аппаратура, материалы, реактивы
Прибор для определения рН среды в интервале от 1 до 14 с погрешностью измерения не более 0,05 рН.
Мешалка любой марки.
Ультратермостат типа ТС-16А с пределом измерений 40 °С и погрешностью 1% или другой ультратермостат с аналогичными характеристиками.
Воронка Бюхнера.
Стаканчики для взвешивания вместимостью 25-30 см
Стаканы и колбы стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336-82 вместимостью 50, 200, 250, 300 см
Колбы мерные 2-50, 100-2 (наливные) по ГОСТ 1770-74.
Пипетка 2-1-10, 20, 100 по ГОСТ 29227-91.
Микробюретка.
Марля медицинская по ГОСТ 9412-93.
Баня водяная.
Вата медицинская по ГОСТ 5556-81.
Пектин свекловичный со степенью метоксилирования не менее 80% и содержанием пектина не менее 70%.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, раствор молярной концентрации 0,1 моль/дм
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.
Примечание. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
5.3. Подготовка к анализу
5.3.1. Приготовление раствора с массовой долей пектина 1% (субстрат)
Навеску пектина, взятую с таким расчетом, чтобы в 100 см
На следующий день раствор нагревают до 20 °С, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см
5.3.2. Приготовление основного раствора ферментного препарата из очищенных порошкообразных препаратов
0,5000 г исследуемого ферментного препарата взвешивают на аналитических весах с погрешностью не более 0,0001 г, тщательно растирают стеклянной палочкой в небольшом количестве дистиллированной воды, затем количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см
5.3.3. Приготовление основного раствора ферментного препарата из поверхностной культуры гриба
5,00 г измельченной культуры гриба, взвешенной с погрешностью не более 0,01 г, помещают в колбу вместимостью 200-300 см
5.3.1-5.3.3. (Измененная редакция, Изм. N 1).
5.3.4. Приготовление инактивированного ферментного раствора
Для инактивации фермента, применяемого в контрольном опыте, берут 25 см
5.4. Проведение анализа
В стаканы вместимостью по 50 см
Общий объем реакционной смеси всегда равен 30 см
Через час после введения фермента пробу вынимают из термостата и быстро титруют из микробюретки раствором гидроокиси натрия до рН 7,5, используя для этой цели потенциометр. Разность между контролем и опытом при титровании должна быть от 0,5 до 1,5.
5.5. Обработка результатов
Пектинэстеразную активность (
где
100 - число микроэквивалентов прогидролизованных сложноэфирных связей, соответствующее 1 см
100 - степень этерификации пектина, на которой ведется расчет.
За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение активностей, полученных при анализе двух навесок. Из каждой навески делают не менее трех разведений. Допускаемое расхождение между значениями активностей не должно превышать 5%.
Результат округляют до первого десятичного знака.
Предел возможных значений погрешности измерений пектинэстеразной активности при доверительной вероятности
ПРИЛОЖЕНИЕ
Обязательное
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕКТИНА
(кальцийпектатный метод)
1. Сущность метода
Метод основан на получении соли пектана кальция в виде осадка.
2. Аппаратура, материалы, реактивы
Шкаф сушильный любой марки, обеспечивающий нагрев до 105 °С.
Мешалка любой марки.
Эксикатор по ГОСТ 25336-82.
Колбы мерные 1-100-2 или 2-100-2 (наливные) по ГОСТ 1770-74.
Пипетка 2-1-20 по ГОСТ 29227-91.
Цилиндр любого исполнения вместимостью 100 см
Стаканчики для взвешивания любого типа вместимостью 25-30 см
Фильтры обеззоленные. Синяя лента.
Пектин свекловичный со степенью метоксилирования не менее 30% и содержанием основного вещества не менее 70%.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, раствор молярной концентрации 0,1 моль/дм
Кислота уксусная по ГОСТ 61-75, раствор молярной концентрации 0,1 моль/дм
Кальций хлористый по ГОСТ 4161-77, раствор молярной концентрации 1 моль/дм
Серебро азотнокислое по ГОСТ 1277-75, раствор с массовой долей серебра 1%.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.
Примечание. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
3. Проведение анализа
0,150 г исследуемого свекловичного пектина, взвешенного на аналитических весах с погрешностью не более 0,002 г, растворяют в небольшом объеме дистиллированной воды при постоянном перемешивании на мешалке, затем количественно переносят в колбу вместимостью 100 см
Затем берут 20 см
После этого раствор кипятят 5 мин и фильтруют через обеззоленный фильтр, высушенный до постоянной массы. Осадок пектата кальция промывают горячей дистиллированной водой до исчезновения ионов хлора (реакция с раствором азотнокислого серебра).
После промывки осадок с фильтра помещают в бюксу и высушивают при 105 °С до постоянной массы.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
4. Обработка результатов
Количество пектина (
где
По разности масс между фильтром и осадком и фильтром без осадка определяют содержание пектата кальция.
Массовую долю пектина (
где
0,92 - пересчетный коэффициент, учитывающий содержание кальция в осадке;
100 - переводной коэффициент для выражения результатов, %.
За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение пектина, полученное при анализе трех навесок пектина, допускаемое расхождение между ними не должно превышать 5%.
Результат округляют до второго десятичного знака.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
Электронный текст документа
и сверен по:
Препараты ферментные. Сб. ГОСТов. -
М.: ИПК Издательство стандартов, 2005