ГОСТ 20235.2-74
Группа Н19
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР
МЯСО КРОЛИКОВ
Методы бактериологического анализа
Meat of rabbits. Methods of bacteriological analysis
Дата введения 1975-01-01
Постановлением Государственного комитета стандартов Совета Министров СССР от 2 октября 1974 г. N 2284 срок введения установлен с 01.07.75
ПРОВЕРЕН в 1979 г. Срок действия продлен до 01.07.90*
_______________________________
* Ограничение срока действия снято по протоколу Межгосударственного Совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС N 2, 1993 год). - .
ПЕРЕИЗДАНИЕ. Май, 1981 г.
Настоящий стандарт распространяется на мясо кроликов и устанавливает методы бактериологического анализа, предусматривающие определение аэробов (сальмонелл, бактерий рода Эшериши, стафилококков, стрептококков, листерий, пастерелл) и анаэробов (ботулизм, перфрингренс).
1. МЕТОДЫ ОТБОРА ОБРАЗЦОВ
1.1. Отбор образцов проводят по ГОСТ 20235.0-74.
2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ И ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
2.1. Для проведения анализа применяют:
автоклав электрический по ГОСТ 9586-75;
котлы с паровой рубашкой;
аппарат Коха;
петлю для бактериологического анализа;
баню водяную;
весы лабораторные по ГОСТ 24104-80*;
______________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008. - .
воронки стеклянные по ГОСТ 8613-75;
дистиллятор;
дуршлаг;
колбы стеклянные лабораторные по ГОСТ 10394-72;
кристаллизаторы по ГОСТ 10973-75;
лоток;
лупу по ГОСТ 8309-75;
рН-метр;
микроскоп по ГОСТ 8284-78;
мясорубку бытовую;
ножницы прямые, изогнутые длиной 14 см;
нож;
осветитель ОИ-19;
пинцеты;
прибор для счета колоний;
пластинку с сеткой для счета колоний;
пеналы металлические для пипеток;
поплавки для пробирок и колб длиной 20, 45 и 75 мм и диаметром соответственно 5, 9 и 10 мм;
петледержатели;
проволоку из никелевых сплавов диаметром 0,3-0,5 мм по ГОСТ 492-73*;
______________
* На территории Российской Федерации действует действует ГОСТ 492-2006. - .
плитку электрическую;
пробирки стеклянные бактериологические по ГОСТ 10515-75;
пипетки вместимостью 1, 2, 5 и 10 см
пипетки пастеровские;
скальпель;
стекла предметные по ГОСТ 9284-75;
стекло покровное по ГОСТ 6672-75;
спиртовки стеклянные по ГОСТ 10090-74;
колбы стеклянные по ГОСТ 10394-72;
стаканы стеклянные по ГОСТ 10394-72;
ступки фарфоровые с пестиками;
термостат электрический для выращивания бактерий с автоматическим терморегулятором до температуры 50 °С и с ценой деления 0,2 °С;
флаконы стеклянные вместимостью 100-250 см
холодильник бытовой электрический с температурой в камере 4-6 °С;
холодильники походные (сумки);
цилиндры измерительные вместимостью 10, 100, 500 и 1000 см
часы песочные на 1, 2 и 3 мин по ГОСТ 10576-74;
чашки Петри по ГОСТ 10973-75;
шкаф сушильный лабораторный;
штативы для пробирок;
бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026-76;
вату медицинскую гигроскопическую по ГОСТ 5556-75*;
______________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 5556-81. - .
нитки по ГОСТ 6309-80;
марлю медицинскую по ГОСТ 9412-77*;
______________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 9412-93. - .
ткань для фильтрования;
масло вазелиновое медицинское по ГОСТ 3164-78;
масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739-78;
мел химический осажденный по ГОСТ 8253-79;
песок кварцевый для тонкой керамики по ГОСТ 7031-75;
экстракт дрожжевой;
диализат дрожжевой;
дрожжи прессованные хлебопекарные;
желчь крупного рогатого скота свежую или сухую обезвоженную;
кровь кролика свежую;
молоко обезжиренное;
мясо говяжье по ГОСТ 779-55;
печень говяжью по ГОСТ 19342-73;
аммоний хлористый по ГОСТ 3773-72;
арабинозу;
глюкозу х.ч. по ГОСТ 6038-79;
галактозу;
глицерин по ГОСТ 6259-75;
дульцит;
железо хлористое;
йод кристаллический по ГОСТ 4159-79;
калия гидрат окиси;
калий йодистый по ГОСТ 4232-74;
калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198-75;
калий хлористый по ГОСТ 4234-77;
калий двухромовокислый по ГОСТ 4220-75;
калий фосфорнокислый двузамещенный по ГОСТ 3204-76;
ксилозу;
кислоту серную по ГОСТ 4204-77;
кислоту соляную по ГОСТ 3118-77;
кислоту уксусную по ГОСТ 61-75;
кислоту карболовую;
креатин;
кислоту розоловую;
кальций хлористый кристаллический;
лактозу х.ч.;
малонат;
магний сернокислый;
маннит по ГОСТ 8321-74;
магний хлористый кристаллический по ГОСТ 4209-77;
мальтозу;
мочевину по ГОСТ 6691-77;
масло вазелиновое по ГОСТ 3164-78;
натрий-аммоний фосфорнокислый;
натрий серноватистокислый СТ СЭВ 223-75;
натрий фосфорнокислый двузамещенный безводный по ГОСТ 11773-76;
натрия гидрат окиси по ГОСТ 4328-77;
натрий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 245-76;
натрий кислый селенистокислый;
натрий лимоннокислый;
натрий двууглекислый по ГОСТ 4201-79;
натрий хлористый по ГОСТ 4233-77;
парадиметиламидобензолальдегид;
рамнозу;
сахарозу по ГОСТ 5833-75;
салицин;
соль закиси железа и аммония двойную сернокислую по ГОСТ 4208-72;
соль натриевую дезоксирибонуклеиновой кислоты;
углерод по ГОСТ 4-75;
свинец уксуснокислый по ГОСТ 1027-67 (СТ СЭВ 263-76);
спирт амиловый чистый;
спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67*;
_______________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 51652-2000. - .
хинозол;
фенилаланин;
эфир серный;
индикатор Андреде;
бромтимоловый синий;
бриллиантовый зеленый;
генциан фиолетовый;
кристаллвиолет;
метиловый красный по ГОСТ 5853-51;
метиловый синий;
феноловый красный по ГОСТ 4599-73;
фенолфталеин по ГОСТ 5850-72;
фуксин основной;
воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72;
воду питьевую по ГОСТ 2874-73;
азур-эозин по Романовскому;
эозин;
агар висмут-сульфитный;
агар микробиологический по ГОСТ 17206-71;
бактоагар Плоскирева сухой;
синьку Леффлера;
пептон сухой для бактериологических целей по ГОСТ 13805-76;
пептон импортный чешской фирмы "Спофа" или венгерской фирмы "Рихтер";
кровь кролика свежую;
плазму цитратную кроличью сухую;
среду Гисса сухую с индикатором ВР;
среду Левина сухую;
сыворотки поливалентные и монорецепторные О и Н - агглютинирующие;
сыворотки антиботулинические;
среду Эндо сухую.
3. ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ
3.1. Подготовка и стерилизация посуды и материалов
3.1.1. Вся посуда для бактериологического анализа перед стерилизацией должна быть тщательно вымыта и высушена.
3.1.2. Пробирки должны быть закрыты ватными пробками и завернуты в бумагу; горлышки колб и флаконов закрывают ватной пробкой, а сверху - бумажным колпачком, который обвязывают ниткой.
3.1.3. Пробки для пробирок и колб готовят из ваты, обвертывают слоем марли и завязывают ниткой на свободном конце.
3.1.4. Чашки Петри укладывают в металлические пеналы или завертывают в бумагу. Между крышками и дном чашек, предназначенных для разливки среды Эндо, можно положить кружки фильтровальной бумаги диаметром на 1-2 см больше диаметра чашки.
3.1.5. В конце пипетки, который берется в рот, вкладывают кусочек ваты. Пипетки помещают в металлические пеналы по 6-10 шт. в каждый или завертывают в бумагу.
3.1.6. Подготовленную посуду стерилизуют сухим паром в течение 1 ч в сушильном шкафу при температуре 160±5 °С.
При отсутствии сушильного шкафа посуду стерилизуют в течение 30 мин в автоклаве при температуре 126±2 °С.
3.1.7. Стерильную посуду вынимают из сушильного шкафа после его охлаждения до температуры ниже 60 °С и хранят в плотно закрытых шкафах или ящиках лабораторных столов.
3.2. Приготовление питательных сред, реактивов, красок
3.2.1. Приготовление мясной воды
Говяжье или конское мясо освобождают от костей, жира и сухожилий, измельчают на мясорубке и заливают холодной водой из расчета 1000 см
Затем жидкость и весь сок из вареного мяса отжимают через ткань, доливают кипяченой водой до первоначального объема, разливают в чистую посуду (колбы, бутыли) и стерилизуют 20 мин в автоклаве при температуре 120 °С.
3.2.2. Приготовление мясо-пептонного бульона
К 1000 мл мясной воды, приготовленной по п.3.2.1, добавляют 10 г сухого пептона и 0,5 г хлористого натрия, кипятят в течение 30 мин, после чего доводят уровень воды до первоначального объема. Затем фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,0-7,2 насыщенным раствором двууглекислого натрия или 10%-ным раствором гидрата окиси натрия, 15-20 мин стерилизуют при температуре 120 °С. Если после стерилизации в мясо-пептонном бульоне выпадает осадок, его фильтруют вторично и снова стерилизуют. Вторичную стерилизацию для предотвращения выпадения осадка проводят при более низкой температуре.
3.2.3. Приготовление физиологического раствора
В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 8,5 г химически чистого хлористого натрия. Раствор доводят до кипения, охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы или пробирки и стерилизуют 20 мин в автоклаве при температуре 120 °С.
3.2.4. Приготовление мясо-пептонного агара
К 1000 мл мясо-пептонного бульона, приготовленного по п.3.2.2, перед стерилизацией добавляют 20 г агара и кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения.
Мясо-пептонный агар, охлажденный до температуры 50-55 °С, осветляют яичным белком (из расчета один белок на 1000 см
3.2.5. Приготовление питательного агара
К 100 см
3.2.6. Приготовление среды Левина
К 100 мл расплавленного мясо-пептонного агара с рН 7,0-7,4, приготовленного по п.3.2.4, добавляют 2 см
3.2.7. Приготовление среды Мюллера
Для приготовления среды Мюллера вначале готовят растворы серноватистокислого натрия и Люголя.
В мерный цилиндр с 50 г серноватистокислого натрия добавляют до 100 см
Для приготовления раствора Люголя в 100 см
Для приготовления среды Мюллера в стерильную колбу помещают 4,5 г х.ч. мела и стерилизуют сухим жаром, наливают 90 см
3.2.8. Приготовление среды Кауфмана
К 100 мл стерильной среды Мюллера, приготовленной по п.3.2.7, добавляют 1 см
3.2.9. Приготовление селенитовой среды
Среду готовят из двух основных растворов - А и Б.
Раствор А состоит из 5 г пептона чешской фирмы "Спофа" или венгерской фирмы "Рихтер", 7 г безводного двузамещенного фосфорнокислого натрия, 3 г однозамещенного фосфорнокислого натрия, 4 г х.ч. лактозы, 100 см
Раствор Б состоит из 10%-ного раствора кислого селенистокислого натрия, приготовленного на стерильной воде. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.
При изменении серии любого из входящих в среду компонентов (пептона, кислого селенистокислого натрия, фосфатов) производят предварительную подтитровку, для чего экспериментально определяют точную пропорцию фосфорнокислого двузамещенного безводного натрия и фосфорнокислого однозамещенного натрия, которая с используемыми образцами пептона и селенистокислого натрия дает рН не выше 6,9-7,1, что регулируется изменением соотношения фосфатов.
Для приготовления селенитовой среды к 50 см
3.2.10. Приготовление хлористомагниевой среды "М" (модифицированной)
Среду готовят из трех основных растворов А, В и С.
Для приготовления раствора А в 90 см
Для приготовления раствора В в 9 см
Раствор С состоит из 0,09 см
Для приготовления хлористомагниевой среды "М" (модифицированной) растворы А, В и С смешивают и стерилизуют 30 мин при температуре 112,5 °С.
Концентрированную среду готовят, удваивая содержание всех компонентов, кроме дистиллированной воды.
При отсутствии дрожжевого диализата допускается применять дрожжевой экстракт.
3.2.11. Приготовление дрожжевого экстракта
В 2000 мл дистиллированной воды растворяют 1000 г прессованных хлебопекарных дрожжей. Полученную суспензию стерилизуют 30 мин текучим паром, затем отстаивают в холодильнике при температуре 4-6 °С в течение пяти-шести суток.
Жидкость над осадком декантируют, приливают 2,5 см
3.2.12. Приготовление среды Эндо
К 100 мл холодной дистиллированной воды прибавляют 5 г порошка сухой среды Эндо, тщательно размешивают, нагревают при помешивании до полного расплавления агара, кипятят на слабом огне 3-5 мин, не допуская пригорания. Горячую среду фильтруют через рыхлый ватный, предварительно смоченный дистиллированной водой и отжатый фильтр и вновь доводят до кипения.
После остывания среду разливают в стерильные чашки Петри слоем 4-5 мм и после застывания подсушивают в термостате. Чашки со средой, во избежание ее покраснения, нельзя оставлять на солнечном свету. Среду готовят непосредственно перед анализом.
3.2.13. Приготовление среды Плоскирева
В 100 см
3.2.14. Приготовление висмут-сульфитного агара
В 100 см
После остывания среду разливают в стерильные чашки Петри слоем 4-5 мм, предварительно взболтав для равномерного распределения остатка. Чашки Петри оставляют открытыми на 40 мин для остывания и подсушивания.
3.2.15. Приготовление среды Гисса
К 100 мл дистиллированной воды прибавляют 1 г пептона, 0,5 г хлористого натрия и нагревают до растворения, затем фильтруют до тех пор, пока раствор не станет совершенно прозрачным. Устанавливают рН 7,0, прибавляют 0,5 г углерода и 1 см
Среду разливают по 5 см
Для приготовления индикатора Андреде к 100 см
3.2.16. Приготовление пептонной воды
К 1000 см
3.2.17. Приготовление среды Кристенсена
К 100 см
3.2.18. Приготовление среды Христенсена с мочевиной
К 1000 см
Среду фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 6,8-6,9, разливают в пробирки по 5-6 см
3.2.19. Приготовление среды для реакции с метилротом и Фогес-Проскауэра
В 1000 см
3.2.20. Приготовление индикатора бромтимолблау
В 40 см
3.2.21. Приготовление агара Симмонса
В 1000 см
3.2.22. Приготовление фенилаланинового агара
К 1000 мл дистиллированной воды прибавляют 3 г дрожжевого экстракта, 2-1 г
3.2.23. Приготовление полужидкого агара
К мясо-пептонному бульону, приготовленному по п.3.2.2, добавляют 0,5% агара. Среда должна иметь рН 7,0-7,2. Среду стерилизуют 20 мин при температуре 120 °С.
3.2.24. Приготовление плазмы крови
В пробирку вносят 2 см
3.2.25. Приготовление дефибринированной крови
В колбу со стеклянными бусами сливают 8 см
3.2.26. Приготовление среды с безоксирибонуклеиновой кислотой
В стерильный растопленный 2%-ный мясо-пептонный агар, приготовленный по п.3.2.4 или по п.3.2.5, добавляют натриевую соль дезоксирибонуклеиновой кислоты из расчета 2 г на 1 см
3.2.27. Приготовление кровяного агара
К 100 мл расплавленного стерильного мясо-пептонного агара, приготовленного по п.3.2.4 и охлажденного до температуры 45 °С, стерильно прибавляют 5-10 см
3.2.28. Приготовление среды Китт-Тароцци
500 г говяжьей печени режут на куски массой по 30-40 г, заливают водой и кипятят в течение 15-20 мин. Воду сливают, куски печени разрезают на кусочки массой 1,5-3,0 г, заливают водой, подщелоченной двууглекислым натрием до рН 7,2-7,4, и кипятят в течение 10-15 мин, не допуская бурного кипения. Общее количество добавленной воды 1000 см
Кусочки печени раскладывают во флаконы, заливают водой и стерилизуют 20 мин при температуре 120 °С.
Для приготовления среды Китт-Тароцци пробирки заполняют на 1,0-1,5 см кусочками печени, заливают мясо-пептонным бульоном, приготовленным по п.3.2.2, с добавлением 1 г глюкозы. Высота слоя бульона 6-7 см в обычных пробирках, 9-10 см - в высоких. На поверхность среды в пробирке перед стерилизацией наслаивают 0,5-1 см
3.2.29. Приготовление среды Вильсона-Блера
На дистиллированной воде готовят 20%-ный раствор серноватистокислого натрия и 8%-ный раствор хлористого железа. Оба раствора кипятят.
100 см
3.2.30. Приготовление кровяного агара Цейсслера
К 100 см
3.2.31. Приготовление молока по Тукаеву
К 1%-ной пептонной воде прибавляют 5-6 см
3.2.32. Приготовление среды "Лакмусовое молоко"
Обезжиренное молоко стерилизуют в течение 15-20 мин при температуре 112 °С. Не допускается к применению стерилизованное молоко коричневого цвета и с карамелизованным сахаром.
Перед употреблением к 200 см
Смесь асептически разливают по пробиркам высоким столбиком, кипятят на водяной бане в течение 15-20 мин и охлаждают. Среду готовят перед проведением анализов.
Для приготовления солянокислого цистеина 1 г цистеина растворяют в 0,25 см
3.2.33. Приготовление лакмусовой настойки
К 10 см
3.2.34. Приготовление реактива Эрлиха
В 50 см
3.2.35. Приготовление реактива Ковача
В 75 см
3.2.36. Приготовление реактива для определения сероводорода
В 100 см
3.2.37. Приготовление реактива для реакции с метилротом
В 300 см
3.2.38. Приготовление реактива для реакции Фогес-Проскауэра
В 500 см
3.2.39. Приготовление насыщенного спиртового раствора метиленовой сини
В 100 см
3.2.40. Приготовление спирто-водного раствора метиленовой сини
К 30 см
3.2.41. Приготовление метиленовой сини (Леффлера)
К 100 см
3.2.42. Приготовление фуксин-насыщенного спиртового раствора
8-9 г основного фуксина высыпают во флакон, заливают 100 см
Насыщенный раствор хранят во флаконах из темного стекла.
Из насыщенного спиртового раствора готовят фуксин-спиртоводный раствор. Для этого к 1 см
3.2.43. Приготовление фуксина Циля-Карболового
1 г основного кристаллического фуксина Циля растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты и 0,5 см
Перед работой к одной части карболового фуксина Циля прибавляют девять частей дистиллированной воды.
3.2.44. Приготовление кристаллвиолета и генциан фиолетового для окраски по Граму
В 100 см
Краску наливают в лоток. Фильтровальную бумагу нарезают полосками шириной 2,0-2,5 см и длиной 30-50 см. Полоску погружают на несколько секунд в краску так, чтобы она окрасилась с обеих сторон. Окрашенные полоски вынимают пинцетом, дают краске стечь и подвешивают на шпагате для высушивания. Бумагу сушат на воздухе при температуре 18-23 °С. Высушенные полоски бумаги разрезают на кусочки размером 2х2 см и хранят в банке из темного стекла.
3.2.45. Приготовление раствора Люголя
В 10 см
3.3. Приготовление препаратов
3.3.1. Поверхность паренхиматозных органов тазобедренных мышц и пораженных участков мяса кролика стерилизуют, прикладывая раскаленный шпатель или обжигая тампоном, смоченным в спирте. Затем вырезают стерильными ножницами кусочки размером 1,5х1,0х1,5 или 2,0х1,5х2,5 см и прикладывают поверхностями срезов к предметному стеклу по три отпечатка на двух предметных стеклах. Препараты высушивают на воздухе, фиксируют, окрашивают по Граму, Романовскому-Гимза и метиленовой синькой (в зависимости от характера патологических изменений и предполагаемого диагноза). Мазки микроскопируют.
3.3.2. Приготовление мазков из культуры
3.3.2.1. Метод раздавленной капли
На середину предметного стекла наносят петлей для бактериологических испытаний или пипеткой каплю анализируемой культуры, осторожно покрывают ее покровным стеклом, чтобы под ним не образовалось пузырьков воздуха и жидкость не выступала за края покровного стекла.
3.3.2.2. Для приготовления мазков требуются чистые обезжиренные предметные стекла (капли воды на поверхности чистого сухого стекла должны расплываться, а не принимать шаровидную форму). Чтобы приготовить мазок из культуры с плотной средой, на предметное стекло наносят небольшую каплю стерильного физиологического раствора или водопроводной воды, затем при соблюдении асептики открывают пробирку или чашку Петри и, захватив немного материала прокаленной и остуженной бактериологической петлей, размешивают его в этой капле. Полученную взвесь растирают на площади 1 см
Приготовленный препарат высушивают на воздухе. Если высушиваемые препараты содержат патогенный материал, их накрывают стеклянным колпаком. После приготовления мазка петлю прожигают на пламени горелки, а пипетку опускают в сосуд с дезинфицирующим раствором. Для фиксации мазок трижды медленно проводят через пламя спиртовой или газовой горелки. При излишнем нагревании сильно изменяется структура клеток и мазок плохо окрашивается, при недостаточной фиксации мазок можно смыть при последующей обработке. Фиксацию можно проводить, погружая мазки в фиксирующие жидкости - на 5 мин в метиловый спирт, на 15-20 мин в этиловый 96° спирт, на 5 мин в ацетон, на 10-15 мин в смесь равных объемов абсолютного спирта и эфира по Никифорову. После фиксации препарат высушивают на воздухе.
3.3.3. Окраска препаратов
3.3.3.1. Окраска мазков по Граму
При окраске по Граму на фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги и наливают карболовый генциан фиолетового на 2 мин, после чего снимают бумажку, сливают краску и, промывая водой, наливают на мазок раствор Люголя (мазок чернеет). Через 1 мин его сливают и наливают этиловый спирт на 0,5-1 мин, причем препарат нужно покачивать и менять спирт. Затем мазок промывают водой и дополнительно окрашивают разведенным фуксином в течение 1-2 мин. Краску сливают, промывают водой, обсушивают фильтровальной бумагой.
Окраску по Граму можно применять в видоизменении Синева, согласно которому вместо карболового генциан фиолетового применяют раствор следующего состава: 1 г кристаллвиолета, 100 см
Для окрашивания мазков на фиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной спиртовым раствором кристаллвиолета, и наносят несколько капель воды, которая полностью впитывается бумагой, последняя плотно прилегает к стеклу. Выдерживают 2 мин, затем бумажку удаляют пинцетом и дальнейшую окраску производят по Граму.
3.3.3.2. Окраска спор
Мазок, приготовленный по п.3.3.2, окрашивают при нагревании 1-2 мин карболовым фуксином Циля, до появления паров, промывают водой и обесцвечивают погружением в 2%-ный раствор азотной кислоты в спирте или 1 %-ный водный раствор серной кислоты.
Обесцвечивать нужно так, чтобы на препарате не было видно следов красителя. Затем промывают водой и докрашивают водным раствором метиленового синего. Споры окрашиваются в красный цвет.
3.3.3.3. Окраска капсул методом Михина
Фиксированный мазок окрашивают в течение 2-3 мин синькой Леффлера при подогревании (до появления паров), после чего краску быстро смывают водой и мазок высушивают между листками фильтровальной бумаги. Бактерии окрашиваются в темно-синий цвет, капсулы - в светло-розовый.
3.3.3.4. Окраска капсул методом Романовского-Гимза
Краску Романовского-Гимза фабричного изготовления перед окрашиванием мазков растворяют из расчета одна капля краски на 1 см
4. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
4.1. Определение аэробов
4.1.1. Наряду с бактериоскопией мазков-отпечатков проводят посев паренхиматозных органов, пораженных мышц кусочками размером 1,5х1,0х1,5 или 2,0х1,5х2,5 см путем контакта их с поверхностью элективных сред (Эндо, Плоскирева, Левина, висмут-сульфитный агар), а на мясо-пептонный агар путем посева взвеси материала на его поверхность. Для приготовления взвеси из глубины пораженных мышц и органов берут пробу массой 1-3 г, тщательно растирают в ступке с небольшим количеством стерильного песка, добавляют стерильный физиологический раствор или стерильную воду для разведения материала 1:10. Затем стерильной пипеткой берут 0,2-1 см
4.1.2. Одновременно с посевами на твердые среды проводят посевы материала на среды обогащения. Анализ проводят по следующей методике. При соблюдении асептики из образца вырезают пробы массой по 25 г (две из мышц и две из паренхиматозных органов), помещают их отдельно в стерильные ступки. Пробы хорошо измельчают и вносят в 225 см
В зависимости от результатов бактериоскопии и характера роста на твердых питательных средах в дальнейшем проводят анализ проб из образцов на основании определенных при этом отдельных видов микробов.
4.1.3. Определение сальмонелл
4.1.3.1. Сущность метода заключается в определении сальмонелл на элективных средах и установлении биохимических и серологических свойств сальмонелл.
Биохимические свойства сальмонелл определяют на средах, содержащих углеводы и многоатомные спирты. Под действием ферментов, выделяемых микробами, одни среды остаются неизменными и их цвет не меняется, в то время как другие углеводы и многоатомные спирты расщепляются, образуя кислые продукты, которые изменяют цвет индикатора и соответственно цвет среды.
Некоторые сальмонеллы продуцируют и выделяют протеолитические ферменты, которые расщепляют белки до продуктов глубокого распада - индола и сероводорода.
Серологические свойства определяют в реакции агглютинации с агглютинирующими сыворотками. Поливалентную агглютинирующую сыворотку применяют для дифференциации культур рода Salmonella от других возбудителей кишечных инфекций.
На средах с лактозой (Эндо, Левина, Плоскирева) колонии сальмонелл бесцветные, на висмут-сульфитном агаре - черные с металлическим блеском, на месте снятой колонии остается черный след. Черное окрашивание среды зависит от восстановления солей бактериями.
4.1.3.2. Проведение анализа
Если наблюдается обильный рост однородных колоний (чистая культура), то эту культуру используют для анализа. В случае сомнений в чистоте культуры проводят ее пересев на скошенный мясо-пептонный агар. Посевы помещают на 24 ч в термостат с температурой 37 °С.
При обнаружении характерных колоний на сальмонеллы из небольшой части колонии делают мазок, окрашивают по Граму и определяют подвижность в раздавленной капле. Бактерии сальмонелл представляют собой неспорообразующие маленькие палочки с закругленными концами, по Граму окрашиваются отрицательно. Бактерии из рода сальмонелл подвижны, но из них галлинарум и пуллорум неподвижны.
Для изучения биохимических свойств проводят посев на короткий пестрый ряд, состоящий из сред Гисса с лактозой, глюкозой, сахарозой и маннитом.
Часть подозрительной колонии снимают бактериологической петлей и размешивают в 0,5-1 см
Бактерии сальмонеллезной группы расщепляют глюкозу с образованием кислоты и газа, а маннит - с образованием кислоты. Вследствие образования кислоты меняется цвет среды.
Для определения индола и сероводорода посев производят в пептонную воду. Подозрительную на сальмонеллу колонию растирают в 0,5-1 л физиологического раствора. Полученную взвесь засеивают пастеровской пипеткой на указанную среду и помещают на 24 ч в термостат с температурой 37 °С.
Для определения индола в пробирку с суточной культурой осторожно по стенке добавляют 5-10 капель реактива Эрлиха. При наличии индола не позднее чем через 5 мин в пограничном слое образуется ярко-красное кольцо, при отсутствии - кольцо остается светло-желтого цвета. Сальмонеллы индола не образуют.
Для определения индолообразования пользуются также реактивом Ковача. К 24-часовой культуре добавляют 0,2-0,3 см
Для определения сероводорода в пробирку с анализируемой культурой под пробки помещают полоски фильтровальной бумаги, смоченные уксуснокислым свинцом и высушенные. Полоски фильтровальной бумаги не должны соприкасаться с питательной средой. Посевы выдерживают в термостате одни-трое суток при температуре 37 °С. Если культура выделяет сероводород, то бумажка, смоченная раствором уксуснокислого свинца, чернеет от образующегося сернистого свинца. Сальмонеллы выделяют сероводород.
Для полной биохимической типизации бактерий сальмонелл проводят посев на расширенный пестрый ряд (табл.1).
Таблица 1
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
| Образо- | |||
Груп- | Тип | Лак- | Глюкоза | Ман- | Саха- | Маль- | Адо- | Дуль- | Ара- | Кси- | Рам- | Моче- | Ино- | ин- | серо- | |
В | Sal. abortus (equi) | - | + | +- | + | - | + | - | -+ | + | + | + | - | - | - | + |
Sal. abortus ovis | - | + | + | + | - | + | - | - | - | - | ||||||
Sal. typhi murium (Breslau) | - | + | + | + | - | + | - | + | + | - | - | |||||
Sal. paratyphi В | - | + | - | + | - | + | - | + | + | + | + | - | - | - | + | |
Sal. abortus bovis | - | + | + | + | - | + | - | + | + | + | -+ | - | - | - | + | |
Sal. heidelberg | - | + | + | + | - | + | - | + | + | + | + | - | + | - | + | |
С | Sal. cholerae suis | - | + | + | + | - | + | - | - | + | + | - | - | - | - | |
Sal. cholerae suis var | - | + | + | + | - | + | - | - | + | - | - | - | - | + | ||
С | Sal. newport | - | + | + | + | - | + | - | + | + | + | - | - | - | - | + |
Sal. bonariensis | - | + | + | + | - | + | - | - | - | - | + | |||||
Д | Sal. enteritidis | - | + | + | + | - | + | - | + | + | + | + | - | + | - | + |
Sal. gallinarum | - | + | + | + | - | + | - | + | + | + | + | - | + | + | + | |
Sal. pullorum | - | + | + | + | - | + | - | - | + | + | + | - | + | - | + | |
E | Sal. anatum | - | + | +- | + | - | + | - | + | + | + | + | - | - | - | + |
Sal. london | - | + | + | + | - | + | - | + | + | + | + | - | + | - | + |
Условные обозначения:
"-" - отрицательный результат;
"-+" - отрицательный, иногда положительный результат;
"+" - положительный результат;
"+-" - положительный, редкие типы отрицательные;
"
"
При наличии в препаратах палочек, характерных для сальмонелл и других грамотрицательных бактерий, культуру анализируют в реакции агглютинации на предметном стекле с поливалентной О-сывороткой.
Поливалентную агглютинирующую сыворотку применяют для дифференциаций культур рода Salmonella от других возбудителей кишечных инфекций, а монорецептурные О- и Н-сыворотки - для идентификации сальмонеллезных культур.
Предварительно культуры испытывают в реакции агглютинации на предметном стекле с поливалентной сывороткой.
Отрицательная реакция с поливалентной сывороткой означает, что испытуемая культура не принадлежит к роду Salmonella пяти основных групп (В, С
Положительная агглютинация анализируемой культуры дает основание отнести ее к роду Salmonella одной из пяти основных групп (В, C
Таблица 2
Группы | Тип | О-антигены (соматические) | Н-антигены (жгутиковые) | |
I фазы | II фазы | |||
В | Sal. abortus (equi) | 4 | - | enx |
Sal. abortus ovis | 4 | с | 1,6 | |
Sal. typhi murium (Breslau) | 4,5 | 1,2 | ||
Sal. paratyphi В | 4,5 | 1,2 | ||
Sal. abortus bovis | 4 | enx | ||
Sal. heidelberg | 4,5 | 1,2 | ||
С | Sal. cholerae suis | 7 | с | 1,5 |
Sal. cholerae suis | 7 | - | 1,5 | |
С | Sal. newport | 8 | 1,2 | |
Sal. bonariensis | 8 | enx | ||
Д | Sal. enteritidis | 9 | - | |
Sal. gallinarum | 9 | - | - | |
Sal. pullorum | 9 | - | - | |
E | Sal. anatum | 3,10 | 1,6 | |
Sal. london | 3,10 | 1,6 |
Идентификацию сальмонеллезных культур проводят в следующем порядке. Сначала культуру испытывают в реакции агглютинации с одной из О-сывороток, которую выбирают для кролика. При отрицательной реакции с первоначально взятой О-сывороткой культуру испытывают в реакции агглютинации с остальными четырьмя групповыми О-сыворотками и на основании положительной реакции агглютинации относят культуру к одной из групп.
Культуру анализируют в реакции агглютинации с Н-сыворотками I и II фазы. В выборе сывороток для реакции исходят из антигенной структуры сальмонелл той группы, к которой отнесена определенная культура с учетом животного, от которого она выделена.
На основании положительной реакции агглютинации с определенными О- и Н-сыворотками анализируемую культуру относят к одному из серотипов.
Для проведения реакции агглютинации на предметное стекло наносят каплю неразведенной поливалентной О-сыворотки. Платиновой петлей берут анализируемую 20-часовую культуру, выращенную на мясо-пептонном агаре, приготовленном по п.3.2.4 или п.3.2.5. Для агглютинации с поливалентной и О-сыворотками с верхней части агара, а для агглютинации с Н-сыворотками - из нижней части пробирки вблизи конденсационной воды.
Культуру тщательно растирают на стекле у границы капли сыворотки с последующим смешиванием со всей каплей.
В положительных случаях О-агглютинация наступает медленно, а агглютинат имеет вид плотных с трудом разбиваемых комочков и зернышек. Н-агглютинация наступает быстрее и агглютинат имеет вид крупных рыхлых легко разбивающихся хлопьев.
Агглютинат в реакции с поливалентной сывороткой имеет смешанный характер (хлопья, зернышки, комочки).
При отрицательной реакции культура после тщательного смешивания с каплей сыворотки распределяется в ней в виде гомогенной взвеси.
Реакцию агглютинации проводят при хорошем освещении с использованием лупы.
4.1.3.3. Обработка результатов
Обнаружение подвижных (кроме Sal. gallinarum, Sal. pullorum), грамотрицательных, не разлагающих лактозу и сахарозу, разлагающих глюкозу и маннит, выделяющих сероводород, не образующих индола, обладающих положительной агглютинацией с поливалентной монорецепторным О- и Н-агглютинирующими сыворотками бактерий указывает на бактерии рода Salmonella.
4.1.4. Определение бактерий рода Эшерихи
4.1.4.1. Сущность метода заключается в способности бактерий рода Эшерихи на средах с лактозой (Эндо, Левина, Плоскирева) разлагать лактозу с образованием кислоты, вызывающей окрашивание колоний в зависимости от индикатора среды и дальнейшей дифференциации бактерий по их биохимическим свойствам от других сходных микроорганизмов. Но есть отдельные бактерии рода Эшерихи, которые обладают способностью разлагать лактозу, вследствие чего цвет среды не меняется.
На среде Эндо колонии бактерий рода Эшерихи могут быть красными с металлическим блеском или без блеска, розовыми с красным центром или белыми; на среде Плоскирева - кирпично-красными с глянцевой поверхностью; на среде Левина - темно-фиолетовыми блестящими.
4.1.4.2. Проведение анализа
Из колоний, характерных для бактерий рода Эшерихи, готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Бактерии рода Эшерихи - маленькие палочки с закругленными концами, по Граму окрашиваются отрицательно.
Для определения подвижности культуры и ее сохранения проводят посев в столбик 0,5%-ного полужидкого агара.
Для более четкого проявления особенности роста прокол среды делают у стенки пробирки и помещают на 24 ч в термостат с температурой 37 °С.
Бактерии рода Эшерихи обладают активной подвижностью, вследствие чего в столбике полужидкого агара отмечается выраженное равномерное помутнение полужидкого агара.
Неподвижные формы микробов растут только по ходу прокола среды.
При наличии колоний, характерных для бактерий рода Эшерихи, их дифференцируют от других микроорганизмов Euterobactoriaceae по биохимическим свойствам, указанным в табл.3.
Таблица 3
Дифференцирующие тесты | ТРИБЫ | ||||
Esherichieas | Edwardsielleae | Salmonelleae | Klebsielleae | Proteeae | |
Образование сероводорода | - | + | + | - | +- |
Расщепление мочевины | - | - | - | ± | +- |
Образование индола | +- | + | - | - | +- |
Реакция с метилротом | + | + | + | - | + |
Реакция по Фогес-Проскауэра | - | - | - | + | - |
Использование цитратов | - | - | + | + | ± |
Дезаминирование фенилаланина | - | - | - | - | + |
Условные обозначения:
"+" - положительная реакция;
"-" - отрицательная реакция;
"+-" - реакция положительная, реже отрицательная;
"±" - положительная реакция, может быть отрицательной.
Для определения сероводорода анализируемую культуру засевают уколом в столбик среды Кристенсена и помещают на 24-48 ч в термостат с температурой 37 °С.
Бактерии рода Эшерихи сероводорода не образуют и среда не меняет цвет.
Микроорганизмы, образующие сероводород, окрашивают среду в черный цвет.
Для установления способности бактерий рода Эшерихи расщеплять мочевину производят посев культуры в среду с мочевиной (среда Христенсена) и выдерживают 24 ч в термостате при температуре 37 °С. Бактерии рода Эшерихи не расщепляют мочевину и цвет среды не меняется. При наличии бактерий, расщепляющих мочевину, реакция среды становится резко щелочной и среда приобретает малиновый цвет.
Индол определяют с реактивом Ковача по п.3.2.35. Бактерии рода Эшерихи чаще образуют индол.
Для определения интенсивности кислотообразования и способности рода Эшерихи продуцировать ацетилметилкарбинол (реакция Фогес-Проскауэра) проводят посев анализируемой культуры в две пробирки со средой, приготовленной по п.3.2.19, и помещают на 24-96 ч в термостат с температурой 37 °С. Затем в одну пробирку прибавляют пять-шесть капель раствора метиленового красного.
При сильном кислотообразовании среда становится ярко-красной, при слабом - красно-оранжевой. При отрицательной реакции среда становится желтой.
Бактерии рода Эшерихи разлагают глюкозу с образованием кислоты.
Для определения ацетилметилкарбинола ставят реакцию Фогес-Проскауэра. К трех-, четырехсуточной культуре прибавляют 0,5 см
В результате образования ацетилметилкарбинола на глюкозе цвет среды из слабо-розового переходит в красный; отсутствие изменений в цвете среды рассматривают как отрицательный результат. Бактерии рода Эшерихи не образуют ацетилметилкарбинола.
Для определения способности бактерий рода Эшерихи использовать цитраты культуру засевают на скошенный агар Симмонса, посевы выдерживают 24 ч в термостате с температурой 37 °С.
Кишечная палочка не растет на среде и не меняет ее цвета, а цитратассимиллирующие микробы растут хорошо, подщелачивают среду, тем самым вызывая ее окрашивание в синий цвет.
Для определения способности бактерий дезаминировать фенилаланин производят обильный посев культуры в пробирки со скошенным фенилаланиновым агаром и выдерживают 4-24 ч в термостате с температурой 37 °С, после чего на косяки с культурой добавляют по четыре-пять капель 0,5 см
4.1.4.3. Обработка результатов
Обнаружение подвижных грамотрицательных палочек, дающих сильное кислотообразование, образующих индол, не расщепляющих мочевину, не дезаминирующих фенилаланин, не использующих цитраты, не образующих сероводород и ацетилметилкарбенол указывает на бактерии рода Эшерихи.
4.1.5. Определение бактерий листерий и пастерелл
4.1.5.1. Сущность метода заключается в выделении бактерий листерий и пастерелл, дифференциации их по культурно-морфологическим, биохимическим свойствам и биологической пробе.
4.1.5.2. Проведение анализа
Для проведения анализа из пораженных мышц готовят препараты-отпечатки по п.3.3.1, окрашивают по Граму и Романовскому-Гимза и микроскопируют.
Одновременно производят посев с анализируемых мышц на мясо-пептонный агар, приготовленный по п.3.2.4, и на мясо-пептонный бульон с добавлением к нему 2 г глюкозы. Посевы выдерживают в течение 24 ч в термостате при температуре 37 °С, после чего производят учет роста колоний.
Из колоний, характерных для листерий и пастерелл, готовят мазки, окрашивают их по Граму, Романовскому-Гимза и микроскопируют. Характеристика возбудителей по культурально-морфологическим свойствам приведена в табл.4.
Таблица 4
Наименования показателей | Характеристика возбудителей | |
листереллеза | пастереллеза | |
Морфология в препаратах-отпечатках из материала | Мелкие, часто полиморфные палочки, расположенные одиночно, в виде римской цифры V или частокола | Мелкие палочки с закругленными концами, биополярно окрашивающиеся |
Рост на мясо-пептонном агаре | Вначале, как и рожистые колонии, через 3-4 суток помутнение колоний | Такие же, как и рожистые колонии |
Окраска по Граму | Положительная | Отрицательная |
Подвижность | Подвижные | Неподвижные |
Морфология в мазках из культуры | Короткие, прямые, овоидные палочки, иногда почти кокки, располагаются одиночно или кучками | Биполярность отсутствует |
Рост на мясо-пептонном бульоне | Равномерное помутнение среды, при встряхивании получаются муаровые волны | Равномерное помутнение, затем просветление с образованием слизистого осадка, при встряхивании поднимающегося в виде косички |
Для получения чистой культуры производят посев на скошенный мясо-пептонный агар. Посевы выдерживают в течение 24 ч в термостате при температуре 37 °С, после чего проверяют культуру на чистоту путем микроскопии.
Для определения образования индола и сероводорода производят посев на пептонную воду, а для определения биохимических свойств производят посев на желатин и молоко.
Сероводород и индол определяют по п.4.1.3.2.
Для определения каталазной пробы в пробирку с культурой на мясо-пептонном бульоне, выдержанной в течение 12-24 ч в термостате при температуре 37 °С, добавляют 1 см
При наличии каталазы жидкость вспенивается.
Для того чтобы выделить бактерии листерий производят глазную пробу: в конъюнктивальный мешок морской свинки вводят одну-две капли смыва физиологическим раствором суточной культуры с мясо-пептонного агара и тщательно втирают в слизистую оболочку глаза морской свинки. Через 24 ч появляется отек века, гиперимия, слезотечение, через 36-72 ч веки опухают и из глаза выделяется гнойный эксудат.
Материалом для подкожного заражения лабораторных животных (кроликов, белых мышей) является 0,2-0,5 см
Дифференциация листерий и пастерелл по биохимическим свойствам представлена в табл.5.
Таблица 5
Наименование показателей | Листерии | Пастереллы |
Разжижение желатина | - | - |
Свертывание молока | - | - |
Образование сероводорода | - | + |
Образование индола | О | + |
Реакция на каталазу | + | О |
Действие на морских свинок | + | О |
Условные обозначения:
"+" - положительный результат;
"-" - отрицательный результат;
"О" - анализы не проводятся.
4.1.5.3. Обработка результатов
Обнаружение в препаратах-отпечатках мелких палочек, расположенных одиночно в виде римской цифры V или в виде частокола, грамположительных подвижных, а в мазках из культуры - коротких овоидных палочек, не образующих сероводород и при заражении ими морских свинок в конъюнктивидный мешочек глаза вызывающих опухоль глаза и выделение гнойного эксудата указывает на возбудителя листериоза.
Обнаружение в препаратах-отпечатках коротких палочек с закругленными концами и хорошо выраженной биополярностью, а в мазках из культуры - неспорообразующих палочек, грамотрицательных, неподвижных и не имеющих биополярности, гибель лабораторных животных через 24-48 ч после заражения культурами указывает на возбудителя пастереллеза.
4.1.6. Определение стафилококков
4.1.6.1 Сущность метода заключается в выделении стафилококков, установлении их патогенности в реакции коагулирования крови кролика и определении дезоксирибонуклеазной активности.
4.1.6.2. Проведение анализа
Для проведения анализа из пораженных мышц готовят препараты, производят посев на мясо-пептонный агар по п.4.1.1.
Из колоний, характерных для стафилококков, готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Стафилококки по Граму окрашиваются положительно, имеют шарообразную форму, располагаются группами различной величины, напоминающие гроздья винограда, иногда поодиночке. После микроскопирования делают пересев на скошенный мясо-пептонный агар и помещают на 18-24 ч в термостат с температурой 37 °С, после чего культуру определяют на патогенность в реакции плазмокоагуляции. Плазму крови кролика, приготовленную по п.3.2.24, разливают в две стерильные пробирки, в одну из них вносят петлю стафилококковой культуры, другая пробирка служит для контроля. Внесенную культуру тщательно размешивают, после чего обе пробирки выдерживают 2-10 ч в термостате при температуре 37 °С. Если в указанное время коагуляции не произошло, то пробирки оставляют на 18 ч при комнатной температуре. Если через 18 ч плазма не свернулась, то анализируемую культуру стафилококков относят к коагулазоотрицательной.
При получении положительной реакции плазмокоагуляции считают, что в посевах обнаружен патогенный стафилококк.
Для определения дезоксирибонуклеазной активности стафилококков производят посев на среду, приготовленную по п.3.2.26, и выдерживают 18-20 ч в термостате при температуре 37 °С, после чего прибавляют 5 см
Положительной реакцией считают образование прозрачной зоны вокруг колонии, содержащей продукты расщепления ДНК, которые не осаждаются соляной кислотой.
4.1.6.3. Обработка результатов
Обнаружение грамположительных, расположенных гроздями или поодиночке кокков, способных коагулировать плазму крови кролика и выделять ДНК-азу указывает на патогенные стафилококки.
4.1.7. Определение стрептококков
4.1.7.1. Сущность метода заключается в определении характерных колоний на кровяном агаре.
4.1.7.2. Проведение анализа
Для проведения анализа производят посев на мясо-пептонный агар, приготовленный по п.3.2.4. На мясо-пептонном агаре стрептококки образуют мелкие круглые плоские прозрачные, а затем мутнеющие колонии. Из колоний делают мазки и окрашивают по Граму. Стрептококки располагаются в мазках цепочкой длиной всего 2-3 кокка, иногда 5-8 кокков, окрашиваются положительно. Для получения чистой культуры делают пересев на сахарный бульон. Посевы помещают на 24 ч в термостат с температурой 37 °С.
Стрептококки на бульоне дают придонный рост, бульон остается прозрачным.
Через 24 ч производят пересев культуры с бульона на чашки Петри с кровяным агаром, приготовленным по п.3.2.27. Посевы выдерживают 18-24 ч в термостате при температуре 37 °С.
По характеру роста на кровяном агаре стрептококки делятся на гемолитические, дающие вокруг колоний зону гемолиза; зеленяющие, образующие колонии зеленого цвета без резкого гемолиза; не изменяющие кровяного агара.
4.1.7.3. Обработка результатов
Обнаружение грамположительных расположенных цепочками кокков, вызывающих гемолиз на кровяном агаре, указывает на патогенные стрептококки в мясе кролика.
4.2. Определение анаэробов
4.2.1. Определение Cl. perfringens
4.2.1.1. Сущность метода заключается в специфическом росте Cl. perfringens в лакмусовом молоке с цистеином и на среде Вильсон-Блера, на кровяном агаре, а также определении подвижности. Cl. perfringens развивается при температуре 47 °С и образует в лакмусовом молоке губчатый красновато-синеватый сгусток.
На среде Вильсон-Блера отмечается сильное газообразование и помутнение среды за счет восстановления сернистокислого натрия в сульфат натрия, который взаимодействует с хлористым железом и образует черный осадок сернистого железа.
4.2.1.2. Проведение анализа
Для определения Cl. perfringens готовят препараты-отпечатки по п.3.3.1, окрашивают по Граму и метиленовым синим и микроскопируют.
В препаратах обнаруживают короткие толстые палочки с закругленными концами, грамположительные. При окраске метиленовым синим обнаруживают наличие капсул. Одновременно из материала готовят взвесь по п.4.1.1 и производят посев в две пробирки со средой Китт-Тароцци. Полученную взвесь в количестве 2-3 см
Подвижность клеток определяют микроскопированием в раздавленной капле. Клетки Cl. perfringens неподвижны.
При обнаружении в среде Китт-Тароцци характерных для Cl. perfringens палочек производят посев в лакмусовое молоко с цистеином, среду Вильсон-Блера и на кровяной агар. Посевы помещают на 18-24 ч в термостат с температурой 47 °С.
Посев на среду Вильсон-Блера производят следующим образом. Среду расплавляют и охлаждают до температуры 45 °С. Посев производят пастеровской пипеткой вглубь так, чтобы не попали пузырьки воздуха.
Посевы на чашках Петри с глюкозо-кровяным агаром (по Цейсслеру) выдерживают в анаэростате при температуре 37 °С.
При отсутствии анаэростатов можно использовать чашечный метод или метод Виньяля-Вейона.
При использовании чашечного метода в среду, приготовленную по Цейсслеру, вносят 0,25-0,5 см
При использовании метода Виньяля-Вейона засеянный материал набирают в стеклянную трубку (пастеровские пипетки длиной 20 см и диаметром 0,75 см), один конец которой закрыт ватой, а другой оттянут. Среду набирают не более чем на
По истечении срока термостатирования учитывают результат роста:
в пробирках с лакмусовым молоком Cl. perfringens бурно ферментирует молоко с образованием губчатого сгустка красновато-сиреневого цвета в верхней части пробирки, при этом сыворотка становится прозрачной;
на среде Вильсон-Блера через 18 ч отмечается образование в глубине агара черных колоний, разрывающих среду вследствие газообразования;
на кровяном агаре образуются круглые; влажные серовато-оливковые или зеленые с зоной гемолиза колонии.
4.2.1.3. Обработка результатов
Обнаружение неподвижных грамположительных палочек, вызывающих бурную ферментацию молока с образованием губчатого сгустка красновато-сиреневого цвета, черных колоний на среде Вильсон-Блера, серовато-оливковых или зеленых колоний с зоной гемолиза указывает на Cl. perfringens в мясе кролика.
4.2.2. В случае отсутствия Cl. perfringens анализ продолжают для выявления чистых культур анаэробов и их дифференциации по признакам, указанным в табл.5.
Таблица 6
Название микробов | Морфология микробов | Подвиж- | Расположение спор и их форма | Форма колоний | Характер роста на молоке | |
в столбике агара | на кровяном агаре | |||||
Cl. perfingens | Толстая, грубая, иногда короткая палочка, в организме человека и животного образует капсулы | - | Спорообра- | Дискообразные, чечевице- | Круглые, влажные, серовато- | Образует буроватого цвета сгустки с отслоением сыворотки |
Cl. oedematiens | Толстая, длинная палочка с закругленными концами; иногда образует цепочки | + | Овальной формы, расположены субтерминально | Пушистые колонии с уплотненным центром и тонкими пушинками по периферии | Шероховатые, выпуклые, по периферии зона гемолиза | Молоко свертывается медленно, нехарактерно |
Cl. Septicum | Тонкая, с закругленными концами, часто образует длинные нити | + | Центральное или субтерми- | Хлопьевидные, с древовидно разветвля- | В виде извитых нитей и завитков с зоной гемолиза | Свертывается медленно и нехарактерно |
Cl. histolyticum | Мелкая, с закругленными концами | + | Субтерми- | Мелкие, плотные, ветвистые, темно-желтого цвета | Мелкие, гладкие, напоми- | Быстрая пептонизация без заметного свертывания |
Cl. tetani | Тонкая, мелкая с закругленными концами | + | Терминальное, круглой формы (форма барабанных палочек) | Имеет сходство с комочками ваты | Нежный налет в виде пере- плетающихся нитей | - |
Условные обозначения: "+" - подвижные; "-" - неподвижные.
4.2.3. Определение Cl. botulinum
4.2.3.1. Сущность метода заключается в выделении Cl. botulinum и определении специфического действия ботулинических токсинов при постановке реакции нейтрализации противоботулинической сывороткой на лабораторных животных (мышах).
4.2.3.2. Проведение анализа Cl. botulinum
Для определения Cl. botulinum готовят препараты-отпечатки по п.3.3.1 и окрашивают по Граму и метиленовым синим, после чего микроскопируют.
Обнаружение в препаратах-отпечатках грамположительных толстых палочек с закругленными концами, палочек со спорами, имеющих вид пламени свечи или теннисной ракетки, указывает на возможность Cl. botulinum.
Взвесь готовят по п.4.1.1 и делают посев в две пробирки со средой Китт-Тароцци. Среду предварительно кипятят в течение 20 мин. Взвесь вносят в каждую пробирку по 2-3 см
Рост Cl. botulinum характеризуется газообразованием и помутнением среды.
Для приготовления мазков пастеровской пипеткой берут культуру со дна пробирки. Мазки окрашивают по Граму и микроскопируют.
Возбудитель ботулизма имеет вид палочек с закругленными концами различной длины и ширины (в зависимости от типа), часто коротких цепочек. Клетки со спорой имеют вид ракетки, отделившиеся споры - овальные. Клетки в молодом возрасте грамположительные. При старении культуры (четырех и более суток) появляются грамотрицательные палочки.
Для проведения биологической пробы при определении ботулинического токсина анализируемый материал растирают в ступке со стерильным физиологическим раствором 1:4 и оставляют при комнатной температуре на 1-2 ч, после чего центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15-20 мин. Полученную надосадочную жидкость можно хранить в холодильнике при температуре 4±2 °С и испытывать по мере необходимости. Пробы ставят на мышах.
Анализ на ботулинический токсин в мясе проводят следующим образом. Вначале ставят реакцию нейтрализации со смесью противоботулинических сывороток. Смешивают разные объемы моновалентных сывороток типа А, В, С, Е, F и 0,6 см
Наблюдение за животными ведут на протяжении 2, 4, 6, 24 ч в течение четырех суток.
При наличии ботулинического токсина две контрольные мыши (которым вводился несмешанный с сывороткой центрифугат) болеют, а иногда погибают, у мышей, которым вводился смешанный с сыворотками центрифугат, признаков заболевания ботулизмом не наблюдается.
В случае гибели контрольных и опытных мышей реакцию нейтрализации повторяют с экстрактом мяса, разведенным в 5, 10, 20 раз, что дает возможность избавиться от веществ, вызывающих нехарактерную гибель мышей.
Если в центрифугате обнаружен ботулинический токсин, то для определения типа токсина ставят развернутую реакцию нейтрализации с моновалентными типоспецифическими антитоксическими диагностическими сыворотками.
Для этого в шесть пробирок разливают по 2,4 см
Типовую принадлежность определяют по типам сывороток, нейтрализующих ток
син.
4.2.3.3. Обработка результатов
Обнаружение палочек, типичных по морфологии для Cl. botulinum и ботулинического токсина, указывает на заражение мяса кролика возбудителем ботулизма.
Электронный текст документа
и сверен по:
Мясо кроликов. Методы анализа: Сб. ГОСТов.
ГОСТ 20235.0-74-ГОСТ 20235.2-74. -
М.: Издательство стандартов, 1986