ГОСТ Р 71328-2024 Качество воды. Санитарно-вирусологические методы исследования воды

        ГОСТ Р 71328-2024

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КАЧЕСТВО ВОДЫ

Санитарно-вирусологические методы исследования воды

Water quality. Sanitary-virological methods of water research

ОКС 7.100.20

Дата введения 2024-05-01

Предисловие

1 РАЗРАБОТАН Российской ассоциацией водоснабжения и водоотведения совместно с Техническим комитетом по стандартизации ТК 343 "Качество воды", Федеральным государственным бюджетным учреждением "Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью" Федерального медико-биологического агентства "Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды им.А.Н.Сысина" (ФГБУ "ЦСП" ФМБА России), Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи (ФГБУ "НИЦЭМ им.Н.Ф.Гамалеи") Минздрава России, Федеральным бюджетным учреждением науки "Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН РостовНИИМП Роспотребнадзора)

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 343 "Качество воды"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 4 апреля 2024 г. № 414-ст

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Правила применения настоящего стандарта установлены в статье 26 Федерального закона от 29 июня 2015 г. № 162-ФЗ "О стандартизации в Российской Федерации". Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе "Национальные стандарты", а официальный текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.rst.gov.ru)

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на питьевую воду централизованного и нецентрализованного, в том числе горячего, хозяйственно-бытового водоснабжения, упакованную питьевую воду, включая природную минеральную воду, воду поверхностных пресноводных и морских водоемов, подземных источников водоснабжения, технического водоснабжения, воды бассейнов и аквапарков (кроме бассейнов, используемых в бальнеологических целях), сточную воду.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 25151 Водоснабжение. Термины и определения

ГОСТ 27065 Качество вод. Термины и определения

ГОСТ 30813 Вода и водоподготовка. Термины и определения

ГОСТ 31942-2012 (ISO 19458:2006) Вода. Отбор проб для микробиологического анализа

ГОСТ Р 58144 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ Р 59053 Охрана и рациональное использование вод. Термины и определения

ГОСТ Р 70152 Качество воды. Методы внутреннего лабораторного контроля

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ Р 59053, ГОСТ 25151, ГОСТ 27065 и ГОСТ 30813.

4 Сокращения

В настоящем стандарте применены следующие сокращения:

БОЕ - бляшкообразующая единица;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

КРС - крупный рогатый скот;

МЕ - международная единица;

ос. ч. - особо чистый;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

УМ - ультрафильтрационная мембрана;

ч.д.а. - чистый для анализа;

ЦПЭ - цитопатогенный эффект;

ЦПА - цитопатогенный агент.

5 Общелабораторное оборудование, расходные материалы, реактивы, питательные среды

Реактивы, расходные материалы и питательные среды указаны в соответствующих разделах.

Необходимые реактивы или их аналоги могут быть приобретены в готовом виде или приготовлены из составляющих веществ в соответствии с методиками по классификации не ниже ч.д.а.

Допускается использование реактивов более высокой квалификации, а также материалов, оборудования, питательных сред, тест-систем с аналогичными или усовершенствованными характеристиками, чем у нижеуказанных.

5.1 Общелабораторное оборудование и расходные материалы:

стерилизатор суховоздушный;

шкаф вытяжной;

бокс микробиологической безопасности (класс II);

весы с разрешающей способностью не более 1% для обеспечения максимальной допустимой погрешности 5% по массе.

Примеры

1 Для взвешивания 10 г весы должны обеспечить считывание до 0,1 г.

2 Для взвешивания 1 г весы должны обеспечить считывание до 0,01 г.

pH-метр, обеспечивающий измерение водородного показателя pH с допускаемой точностью ±0,1;

термометр ртутный с диапазоном измерения от 0°C до плюс 200°C, с ценой деления шкалы 1°C или логгер;

термометр ртутный с диапазоном измерения от 0°C до плюс 50°C, с ценой деления шкалы 0,5°C или логгер;

термометр спиртовой, позволяющий измерять температуру в диапазоне от 0°C до плюс 50°C, с ценой деления шкалы 1°C (для измерения температуры в холодильниках) или логгеры;

дистиллятор или иное устройство, обеспечивающие получение воды, соответствующей требованиям ГОСТ Р 58144;

холодильники с температурой в камере плюс (6±2)°C;

камера морозильная с температурой в камере минус 20°C;

камера морозильная с температурой в камере минус 70°C;

мешалка магнитная;

дозаторы автоматические различных объемов одноканальные и многоканальные;

горелки газовые или спиртовки;

груши, фингеры или дозаторы автоматические для серологических пипеток;

УФ-облучатели открытого и (или) закрытого типов;

насадки стерилизующие с фильтрами 0,22 и 0,45 мкм для селективной деконтаминации элюатов;

колбы плоскодонные конические разной вместимости мерные;

штативы для пробирок;

штатив химический с держателями и зажимами;

емкость для дезинфицирующего раствора;

наконечники одноразовые для автоматических дозаторов с аэрозольным барьером и без разных объемов;

флаконы пенициллиновые;

пробки силиконовые разных размеров;

корнцанг;

вата;

марля;

пакеты стерилизационные;

стаканы мерные;

шпагат;

фольга алюминиевая.

6 Общие требования

6.1 Требования к квалификации исследователей

К выполнению всех технологических операций (отбор проб, транспортирование, хранение, подготовка проб, исследование и обработка результатов) допускаются лица с высшим или средним специальным образованием либо с иным образованием, прошедшие соответствующую специальную подготовку (обучение) по безопасности работы с микроорганизмами III-IV группы патогенности и по методам проведения санитарно-вирусологических исследований, имеющие навыки работы в области микробиологических или вирусологических исследований.

6.2 Внутренний контроль качества вирусологических исследований

Комплекс выполняемых лабораторией мероприятий и процедур, направленных на обеспечение стандартизации и контроля при проведении вирусологических исследований, изложен в ГОСТ Р 70152 и действующей методической документации [1], [2].

7 Подготовка к исследованию

7.1 Требования к емкостям для отбора проб

Емкости должны быть оснащены плотно закрывающимися пробками (силиконовыми, резиновыми или из других материалов) и защитным колпачком (из алюминиевой фольги, плотной бумаги) или завинчивающимися крышками. Многоразовая посуда, в том числе пробки, должна выдерживать паровую или суховоздушную стерилизацию.

Стерильные емкости открывают непосредственно перед процедурой отбора проб, удаляя пробку вместе со стерильным колпачком. Во время отбора не допускается соприкосновение пробки и краев емкости с посторонними объектами окружающей среды (поверхностями и гранями). Перед проведением процедуры отбора проб ополаскивание посуды не допускается.

При заполнении емкостей должно оставаться пространство между пробкой и поверхностью воды, чтобы пробка не смачивалась при транспортировании.

После наполнения емкость закрывают стерильной пробкой, обеспечивающей герметичность и не намокающей при транспортировании, и стерильным колпачком или герметично завинчивают крышку.

Вместимость бутыли для отбора проб должна соответствовать объему воды, необходимому для определения всех требуемых вирусологических показателей. Не допускаются отбор и доставка одной пробы для вирусологического исследования в нескольких стерильных емкостях.

При автоклавировании завинчивающиеся крышки не закручивают до конца для того, чтобы обеспечить замещение воздуха в бутыли паром во время повышения температуры. После стерилизации бутыли плотно закрывают завинчивающимися крышками.

Стерилизацию (обеззараживание) многоразовой посуды, которая не выдерживает автоклавирование, осуществляют химическим способом - средствами, разрешенными к применению согласно инструкции производителя.

7.2 Общие требования к подготовке лабораторной посуды для исследования

Лабораторная посуда, применяемая для вирусологических исследований, может быть одноразового и многоразового использования, должна обеспечивать удобство при применении, гарантировать стерильность и эпидемическую безопасность при работе по ГОСТ 31942-2012 (5.3).

Пипетки непосредственно после применения в работе погружают полностью в емкость с рабочим раствором дезинфицирующего средства. Через 30-60 мин экспозиции в дезинфицирующем средстве пипетки одноразового использования подвергают обеззараживанию; пипетки многоразового использования тщательно промывают вначале проточной водопроводной водой, затем дистиллированной водой, после чего высушивают и подвергают обеззараживанию.

После окончания вирусологического исследования использованную лабораторную посуду обеззараживают в автоклаве в соответствии с требованиями [3].

После обеззараживания лабораторную посуду одноразового использования утилизируют в соответствии с требованиями [3].

После обеззараживания лабораторную посуду многоразового использования обезжиривают (например, посредством дихромата калия), тщательно ополаскивают водопроводной водой, моют с применением соответствующих средств, не содержащих фосфаты, многократно промывают проточной водопроводной водой, а затем дистиллированной водой и высушивают.

После высушивания вирусологическую посуду многоразового использования укладывают в металлические пеналы или заворачивают в бумагу. Бумага, применяемая для обертывания лабораторной посуды, не должна разрушаться при стерилизации (например, самоклеящиеся пакеты из крафт-бумаги для паровой, воздушной, пароформальдегидной, этиленоксидной и радиационной стерилизации).

Стерилизацию лабораторной посуды сухим жаром проводят в суховоздушном шкафу одним из следующих способов:

- при температуре плюс (180±3)°C - в течение 1 ч с момента достижения указанной температуры;

- при температуре плюс (160±5)°C - в течение 2,5 ч с момента достижения указанной температуры.

Материалы и лабораторную посуду, разрушающиеся при температуре от 160°C до 180°C (резина и т.п.), следует стерилизовать в паровом стерилизаторе при температуре (126±2)°C в течение 60 мин.

После окончания стерилизации лабораторную посуду маркируют с указанием даты стерилизации.

Срок хранения стерильной лабораторной посуды, укупоренной в бумагу или металлические пеналы, составляет не более 30 дней.

7.3 Инактивация дезинфектантов

При отборе проб воды, подвергнутой обеззараживанию химическими реагентами, необходимо проводить нейтрализацию дезинфектанта.

8 Отбор, транспортирование, хранение проб

8.1 Отбор проб

Отбор проб питьевой воды проводят в стерильные емкости одноразового или многоразового использования, а также специализированные емкости с сорбентом (ловушечные устройства).

Отбор проб проводят специалисты после прохождения инструктажа по технике безопасности и технике выполнения отбора проб конкретных типов вод.

8.1.1 Отбор проб воды централизованного и нецентрализованного питьевого водоснабжения

Отбор проб водопроводной воды для проведения микробиологических и паразитологических исследований из одной точки выполняют в следующем порядке: вначале для санитарно-паразитологического исследования, затем кран дезинфицируют и осуществляют отбор для санитарно-бактериологического анализа и в конце для санитарно-вирусологического исследования.

8.1.2 Отбор проб воды из поверхностных и подземных водоемов и морской воды

Отбор проб поверхностных вод следует проводить с использованием различных плавучих средств, с мостов, помостов и т.п. в тех местах, где глубина водоемов не менее 0,5 м. В случае отбора проб не из рекреационных вод отбор выполняют в потоке воды, осуществлять отбор проб с берега недопустимо.

При отборе проб с движущихся плавучих средств пробы вод следует проводить с подветренного борта; при отборе проб со стоящего на якоре плавучего средства пробы вод - с носа плавучего средства.

При мониторинге водных объектов отбор проб проводят в середине водотока с использованием плавучих средств (корабля, лодки, судна и т.п.) или с моста.

Отбор проб с использованием пакетов из флизелиновой ткани с макропористым стеклом проводят следующим образом: пакет с сорбентом опускают в воду в поток воды на глубину, не превышающую 5-10 см, закрепляют с помощью лески за неподвижный предмет и оставляют на промежуток от 3 до 7 сут. По истечении времени экспозиции пакет вынимают, помещают в отдельный полиэтиленовый мешок или стерильный флакон.

8.1.3 Отбор проб воды плавательных бассейнов и воды аквапарков

8.1.4 Отбор проб хозяйственно-бытовых сточных вод

Отбор проб с использованием пакетов из флизелиновой ткани с макропористым стеклом проводят следующим образом: пакет с сорбентом опускают в воду, в поток воды на глубину, не превышающую 5-10 см, закрепляют с помощью лески за неподвижный предмет и оставляют на 2-3 сут. По истечении времени экспозиции пакет вынимают, помещают в отдельный полиэтиленовый мешок или стерильный флакон.

8.1.5 Отбор проб очищенных сточных вод

Пробы сточных вод отбирают с помощью стерильного батометра или другими устройствами либо непосредственно в стерильную одноразовую посуду.

При отборе одним батометром или другим устройством нескольких проб их каждый раз обеззараживают фламбированием перед отбором новой пробы.

8.2 Маркировка, хранение и транспортирование проб для санитарно-вирусологического исследования

Отобранную пробу маркируют в соответствии с актом отбора пробы, с указанием места, даты, времени забора, времени экспозиции специализированной емкости с сорбентом, фамилии специалиста, отбирающего пробу, и другой информации, влияющей на последующие исследования (температура, погодные условия и т.д.).

Доставку проб воды осуществляют в сумках-холодильниках, контейнерах-холодильниках при температуре плюс (6±2)°C. В холодный период года контейнеры снабжают термоизолирующими прокладками, обеспечивающими предохранение проб от промерзания и повреждения.

Время транспортирования проб до их предварительной обработки (концентрирования) и вирусологического исследования не должно превышать 6 ч. Если пробу не представляется возможным охладить при транспортировании, анализ выполняют не позднее, чем через 2 ч от момента отбора проб. В случае превышения времени доставки пробы на санитарно-вирусологический анализ не принимают. Доставленные в лабораторию пробы регистрируют в рабочем журнале.

Допускается предварительное концентрирование отобранных проб воды на месте с использованием мобильных установок. Доставку проб воды осуществляют в сумках-, контейнерах-холодильниках при температуре плюс (6±2)°C в течение 1 сут, при температуре минус (20±1)°C - в течение 1 нед.

В лаборатории до этапа обработки (концентрирования) отобранные пробы хранят в холодильнике при температуре плюс (6±2)°C не более суток.

9 Концентрирование проб воды

В связи с низкой концентрацией вирусных агентов в воде санитарно-вирусологические исследования воды на предмет наличия возбудителей инфекций вирусной природы состоят из двух этапов:

а) концентрирование вирусов из отобранных объемов проб воды;

б) выделение и последующая идентификация вирусов из элюата после этапа концентрирования.

Все работы, связанные с концентрированием и выделением вирусов, проводят с соблюдением правил эпидемической безопасности в соответствии с действующим санитарным законодательством.

Допускается концентрирование вирусов другими способами, например картриджной фильтрацией на стекловолокне или концентрированием с использованием подкисленного 5%-ного молока, при условии, что доказанная эффективность метода не ниже, чем у методов, указанных в настоящем стандарте.

9.1 Концентрирование вирусов с использованием ионообменных смол

Метод рекомендуется для концентрирования вирусов из питьевой воды нецентрализованного и централизованного, в том числе горячего водоснабжения, воды технического водоснабжения, упакованной питьевой воды, включая природную минеральную воду, воды поверхностных пресных и морских водоемов, рекреационных вод, воды подземных источников водоснабжения, природной и сточной вод, вод бассейнов и аквапарков.

9.1.1 Аппаратура, материалы, реактивы, питательные среды и средства измерений

Для проведения метода рекомендуются приборы, оборудование и расходные материалы, указанные в разделе 5, а также следующие:

центрифуга лабораторная, минимум 2000 об/мин;

шланги стерильные гибкие, разной длины;

ткань флизелиновая;

колонки (бюретки) диаметром от 12 до 15 мм и длиной более 200 мм для загрузки сорбента;

шланги резиновые для колонок разных диаметров;

штатив для колонок (бюреток);

зажимы винтовые для шлангов;

0,5 М фосфатный буфер с pH 8,2;

калий фосфорнокислый однозамещенный, ч.д.а.;

натрий фосфорнокислый двузамещенный, ч.д.а.;

хлорид натрия;

кислота соляная;

10%-ный раствор гидроксида натрия;

смола анионоактивная (анионит АВ-17-8; АВ-17-8-чс; АВ-17-ИК) или аналог;

вода дистиллированная стерильная;

спирт этиловый ректификационный 96%;

перекись водорода 33%;

хлороформ.

9.1.2 Приготовление суспензии анионоактивной смолы

9.1.3 Приготовление 0,5 M фосфатного буфера с pH 8,2

9.1.4 Концентрирование вирусов из проб воды с использованием анионоактивной смолы

Для осуществления концентрирования к нижнему концу стерильной бюретки (колонки) присоединяют стерильный резиновый шланг с завинчивающимся зажимом, после чего ее строго вертикально устанавливают в штативе. На дно колонки помещают небольшой слой стекловаты или флизелина для удержания смолы.

В колонку вносят суспензию смолы, удаляя через нижний резиновый шланг избыток воды. При заполнении колонки следует избегать образования пузырьков воздуха в столбике смолы. Высота столбика смолы в колонке должна быть от 10 до 12 см.

Перед концентрированием исследуемую пробу воды доводят до значений рН 5,5-6,0 путем добавления концентрированной соляной кислоты или 10%-ного раствора гидроксида натрия.

Емкость с пробой воды располагают выше колонок, в нее опускают стерильный резиновый шланг со стеклянной трубкой на конце. Другой конец шланга должен быть оснащен резиновой пробкой подходящего для колонок размера со вставленной в нее стеклянной трубкой для прохождения воды.

Допускается применение готовых наборов, предназначенных для концентрирования вирусов с использованием ионообменных смол, с аналогичными характеристиками, разрешенных к применению для этих целей в установленном действующим законодательством порядке.

9.1.5 Элюция сконцентрированных вирусных частиц

9.1.6 Антибактериальная обработка элюатов

а) Антибактериальная обработка элюатов с помощью хлороформа

Запрещается использовать пластиковые флаконы и пипетки для антибактериальной обработки с помощью хлороформа.

б) Антибактериальная обработка элюатов с помощью фильтрующих насадок

9.1.7 Хранение элюата

Стерильные элюаты делят на две равные порции и хранят до проведения испытания при температуре плюс (4±2)°C не более 24 ч.

При температуре минус 20°C стерильные элюаты можно хранить в течение одного года. При необходимости многократного исследования элюат дополнительно делят на несколько порций для того, чтобы избежать повторного замораживания.

9.2 Двухэтапное концентрирование вирусов (сорбция на ионообменной смоле и осаждение с помощью сульфата аммония)

Метод рекомендуется для концентрирования вирусов из питьевой воды нецентрализованного и централизованного, в том числе горячего, водоснабжения, воды технического водоснабжения, упакованной питьевой воды, включая природную минеральную воду, воды поверхностных пресных и морских водоемов, рекреационных вод, воды подземных источников водоснабжения, природной и сточной вод, вод бассейнов и аквапарков.

9.2.1 Аппаратура, материалы, реактивы, питательные среды и средства измерений

Для проведения метода рекомендуются приборы, оборудование и расходные материалы, указанные в разделе 5, а также следующие:

центрифуга лабораторная со скоростью 2000 и 6000 об/мин;

шланги стерильные гибкие;

ткань флизелиновая;

колонки (бюретки) стеклянные для титрометрии диаметром от 36 до 38 мм и длиной от 250 до 300 мм;

шланги резиновые для колонок и компрессора разных диаметров;

буфер глициновый с pH 11,5;

кислота аминоуксусная;

гидроксид натрия;

насыщенный раствор сульфата аммония;

сульфат аммония;

вода дистиллированная;

хлорид натрия;

кислота соляная;

смола ионообменная - аниониты АВ-17-8, АВ-17-8-чс, АВ-17-ИК;

хлороформ;

раствор физиологический;

спирт этиловый ректификационный 96%;

перекись водорода 33%.

9.2.2 Приготовление суспензии ионообменной смолы

9.2.3 Приготовление глицинового буфера с pH 11,5

9.2.4 Приготовление насыщенного раствора сульфата аммония

9.2.5 Концентрирование вирусов из проб воды

Метод осуществляется в два этапа.

Этап I. Концентрирование и элюция вирусов из проб воды при помощи сорбции на ионообменной смоле

Стеклянные бюретки (колонки) устанавливают в штативе. В бюретки (колонки) поэтапно загружают ионообменную смолу, затем гидроксид алюминия. Высота столбика смолы должна составлять не менее 30-40 мм, навеска гидроксида алюминия - от 8 до 10 г.

Этап II. Вторичное концентрирование - осаждение с помощью сульфата аммония

При необходимости концентрат делят на две части, одну из которых исследуют на наличие вирусной ДНК или РНК методом ПЦР, другую - подвергают антибактериальной обработке и используют для заражения тканевых культур.

9.2.6 Антибактериальная обработка элюатов

а) Антибактериальная обработка элюатов с помощью хлороформа

Запрещается использовать пластиковые флаконы и пипетки для антибактериальной обработки с помощью хлороформа.

б) Антибактериальная обработка элюатов с помощью фильтрующих насадок

9.2.7 Хранение элюата

Стерильные элюаты делят на две равные порции и хранят до испытания при температуре плюс (4±2)°C не более 24 ч.

При температуре минус 20°C стерильные элюаты можно хранить в течение одного года. При необходимости многократного исследования элюат дополнительно делят на несколько порций для того, чтобы избежать повторного замораживания.

9.3 Концентрирование вирусов на проточном мембранном фильтрующем модуле с тангенциально-радиальным движением жидкости, с использованием позитивно заряженных микрофильтрационных полиамидных мембран в режиме микрофильтрации

Метод рекомендуется для концентрирования вирусов из питьевой воды нецентрализованного и централизованного, в том числе горячего, водоснабжения, воды технического водоснабжения, упакованной питьевой воды, включая природную минеральную воду, воды поверхностных пресных и морских водоемов, рекреационных вод, воды подземных источников водоснабжения, вод бассейнов и аквапарков.

9.3.1 Аппаратура, материалы, реактивы, питательные среды и средства измерений

Для проведения метода рекомендуются приборы, оборудование и расходные материалы, указанные в разделе 5, а также следующие:

центрифуга лабораторная со скоростью минимум 2000 об/мин;

центрифуга лабораторная рефрижераторная минимум с 6000 g и 10000 g и температурой плюс 4°C;

модуль проточный, мембранный, фильтрующий (фильтродержатель), с тангенциально-радиальным движением жидкости МФМ-0142 или аналог;

шланги стерильные гибкие, разной длины, с переходниками;

насос, обеспечивающий давление не выше 3 бар;

насадки шприцевые (штуцеры) для фильтрующего модуля;

мембрана позитивно заряженная микропористая капроновая с диаметром пор 0,2 мкм;

шланги резиновые для компрессора с металлической оплеткой разных диаметров;

пинцет анатомический;

насадка шприцевая с ультрафильтрационной мембраной;

раствор 3%-ный бифэкстракта на трисбуфере с pH 9,1-9,5;

трис (гидроксиметил) аминометан;

экстракт мясной (бифэкстракт);

гидроксид натрия;

вода дистиллированная;

спирт этиловый ректификационный 96%;

магний хлористый кристаллический, ч.д.а.;

хлороформ;

перекись водорода 33%;

кислота соляная;

натрий хлористый;

ПЭГ 6000.

9.3.2 Приготовление 3%-ного раствора бифэкстракта на трисбуфере с рН 9,1-9,5

Рабочее разведение трисбуфера получают добавлением девяти частей стерильной дистиллированной воды к одной части концентрированного раствора.

9.3.3 Подготовка мембранных фильтров

Фильтрующие мембраны должны быть подготовлены к анализу в соответствии с указаниями организации-изготовителя (листовка-аннотация, сопровождающая фильтры).

9.3.4 Подготовка фильтровального аппарата

Для фильтрования исследуемой воды используют фильтрующую установку с тангенциально-радиальным движением жидкости, например типа МФМ-0142, или аналоги, которые состоят из фильтродержателя, перистальтического насоса и емкости объемом 10 л и более для исследуемой воды.

Перед фильтрацией фильтродержатель протирают ватным тампоном, смоченным спиртом, ректификованным 70%, и обжигают. После охлаждения в ложу нижней тарелки фильтродержателя помещают стерильным пинцетом подготовленный мембранный фильтр и смачивают стерильной дистиллированной водой. При этом необходимо не допускать образования воздушных пузырей под мембраной. Затем фильтр прижимают обручем и верхней тарелкой фильтродержателя и закрепляют зажимами, равномерно завинчивая со всех сторон. К фильтровальной установке присоединяют шланги с помощью штуцеров: входящий, подающий исследуемую воду, и отводящий.

9.3.5 Концентрирование вирусов из проб воды

Перед концентрированием исследуемую пробу воды доводят до значения pH 5,5-6,0 путем добавления концентрированной соляной кислоты или 10%-ным раствором гидроксида натрия.

После окончания фильтрации насос отключают, сбрасывают давление из фильтровальной емкости, а входящий и отходящий шланги отсоединяют от фильтродержателя.

9.3.6 Элюция сконцентрированных вирусных частиц

9.3.7 Вторичное концентрирование элюата

а) С использованием ПЭГ 6000

б) С использованием метода ультрафильтрации

9.3.8 Антибактериальная обработка элюатов

а) Антибактериальная обработка элюатов с помощью хлороформа

Запрещается использовать пластиковые флаконы и пипетки для антибактериальной обработки с помощью хлороформа.

б) Антибактериальная обработка элюатов с помощью фильтрующих насадок

9.3.9 Хранение элюата

Стерильные элюаты делят на две равные порции и хранят до проведения испытания при температуре плюс (4±2)°C не более 24 ч.

При температуре минус 20°C стерильные элюаты можно хранить в течение одного года. При необходимости многократного исследования элюат дополнительно делят на несколько порций для того, чтобы избежать повторного замораживания.

9.3.10 Обеззараживание и контроль стерильности фильтровального модуля

Для оценки стерильности фильтровальной установки и ее готовности для концентрирования каждой новой пробы воды проводят посев 10 мл полученного смыва дистиллированной водой шлангов и фильтродержателя в трех повторностях на предмет наличия фага MS2. В случае обнаружения фагов MS2 в смыве результат концентрирования вирусов из последующей пробы воды считают недействительным.

9.4 Концентрирование вирусов с использованием двухфазного разделения

9.4.1 Аппаратура, материалы, реактивы, питательные среды и средства измерений

Для проведения метода рекомендуются приборы, оборудование и расходные материалы, указанные в разделе 5, а также следующие:

шланги стерильные гибкие, разной длины, с переходниками для закрепления к водопроводам;

колба Эрленмейера;

чашки Петри диаметром 142 мм;

шланги резиновые для колонок и компрессора разных диаметров;

декстран Т-40;

гидроксид натрия;

ПЭГ 6000;

вода дистиллированная;

хлорид натрия;

хлороформ;

пенициллин G или аналог;

стрептомицин;

спирт этиловый ректификационный 96%.

9.4.2 Приготовление 22%-ного декстрана (по весу)

9.4.3 Приготовление 29%-ного ПЭГ 6000 (по весу)

9.4.4 Концентрирование вирусов из проб воды

Доводят pH надосадочной жидкости до нейтрального уровня (7,0-7,5) 1 N раствором NaOH и измеряют конечный объем надосадочной жидкости.

Для каждой пробы подготавливают стерильную коническую делительную воронку и закрепляют ее в штативе. Смазывают скользящие поверхности кранов, но так, чтобы не закрыть в них отверстие. Проверяют плотность кранов небольшим количеством воды.

Смесь надосадочной жидкости, декстрана, ПЭГ 6000 и NaCI переливают в воронку и оставляют на 12-18 ч при температуре плюс 4°C.

9.4.5 Хранение элюата

Стерильные элюаты делят на две равные порции и хранят до проведения испытания при температуре плюс (4±2)°C не более 24 ч.

При температуре минус 20°C стерильные элюаты можно хранить в течение одного года. При необходимости многократного исследования элюат дополнительно делят на несколько порций для того, чтобы избежать повторного замораживания.

9.5 Концентрирование вирусов с использованием набора для сбора и концентрирования вирусов из питьевой воды с помощью ловушечного устройства

Метод рекомендуется для концентрирования вирусов из питьевой воды централизованного, в том числе горячего, водоснабжения и из воды технического водоснабжения.

9.5.1 Аппаратура, материалы, реактивы, питательные среды и средства измерений

Для проведения метода рекомендуются приборы, оборудование и расходные материалы, указанные в разделе 5, а также следующие:

центрифуга лабораторная со скоростью минимум 2000 об/мин;

центрифуга лабораторная рефрижераторная при ускорении минимум 6000 g и 10000 g и с температурой плюс 4°C;

ультрацентрифуга со скоростью минимум 50000 об/мин;

набор для сбора и концентрирования вирусов из питьевой воды в системе централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения с помощью ловушечного устройства;

чашки Петри диаметром 142 мм;

пинцет анатомический;

ножницы;

вода дистиллированная;

перекись водорода 33%;

раствор сахарозы от 10% до 20%;

буфер фосфатно-солевой твинсодержащий (pH 7,2);

ПЭГ 6000;

хлороформ;

спирт этиловый ректификационный 96%.

9.5.2 Подготовка ловушечного устройства к отбору проб

Перед использованием в ловушечное устройство вставляют ловушку, после чего его заворачивают в бумагу для стерилизации и стерилизуют сухим жаром при температуре 80°C в течение 45 мин.

9.5.3 Элюция сконцентрированных вирусных частиц

Отбор проб проводят в соответствии с 8.1.1.

Использованный адсорбент заливают 3%-ным раствором перекиси водорода для обеззараживания на 12 ч.

С целью увеличения эффективности обнаружения вирусов в элюатах проб воды при исследовании методом ПЦР проводят дополнительное вторичное концентрирование элюатов с помощью ультрацентрифугирования либо обрабатывают элюаты ПЭГ 6000.

9.5.4 Вторичное концентрирование элюата

а) Ультрацентрифугирование элюата

б) Обработка элюата ПЭГ 6000

9.5.5 Антибактериальная обработка элюатов

а) Антибактериальная обработка элюатов с помощью хлороформа

Запрещается использовать пластиковые флаконы и пипетки для антибактериальной обработки с помощью хлороформа.

б) Антибактериальная обработка элюатов с помощью фильтрующих насадок

9.5.6 Хранение элюата

Стерильные элюаты делят на две равные порции и хранят до проведения испытания при температуре плюс (4±2)°C не более 24 ч.

При температуре минус 20°C стерильные элюаты можно хранить в течение одного года. При необходимости многократного исследования элюат дополнительно делят на несколько порций для того, чтобы избежать повторного замораживания.

9.6 Концентрирование вирусов с использованием сернокислого алюминия

Метод рекомендуется для концентрирования вирусов из питьевой воды нецентрализованного и централизованного, в том числе горячего, водоснабжения, из воды технического водоснабжения, упакованной питьевой воды, включая природную минеральную воду, из воды поверхностных пресных и морских водоемов, рекреационных вод, воды подземных источников водоснабжения, из природной и сточной воды, вод бассейнов и аквапарков.

9.6.1 Аппаратура, материалы, реактивы, питательные среды и средства измерений

Для проведения метода рекомендуются приборы, оборудование и расходные материалы, указанные в разделе 5, а также следующие:

центрифуга лабораторная со скоростью 2000 об/мин;

устройство для перемешивания воды (шейкер орбитальный, блендер, миксер);

денситометр или стандарт мутности оптический на 10 ед.;

баня водяная;

алюминий сернокислый;

гидроокись натрия;

кислота соляная;

калий фосфорнокислый однозамещенный, ч.д.а.;

натрий фосфорнокислый двузамещенный, ч.д.а.;

хлороформ;

раствор Хенкса;

спирт этиловый ректификационный 96%.

9.6.2 Концентрирование вирусов из проб воды

В качестве элюентов кроме раствора Хенкса может быть использован 0,5 М раствор фосфатного буфера со значением pH 8,2.

9.6.3 Антибактериальная обработка элюатов

а) Антибактериальная обработка элюатов с помощью хлороформа

Запрещается использовать пластиковые флаконы и пипетки для антибактериальной обработки с помощью хлороформа.

б) Антибактериальная обработка элюатов с помощью фильтрующих насадок

9.6.4 Хранение элюата

Стерильные элюаты делят на две равные порции и хранят до проведения испытания при температуре плюс (4±2)°C не более 24 ч.

При температуре минус 20°C стерильные элюаты можно хранить в течение одного года. При необходимости многократного исследования элюат дополнительно делят на несколько порций для того, чтобы избежать повторного замораживания.

9.7 Концентрирование вирусов с использованием макропористого стекла

Метод рекомендуется для концентрирования вирусов из хозяйственно-бытовых сточных вод, а также из поверхностных пресных и морских водоемов в местах выпуска хозяйственно-бытовых сточных вод.

9.7.1 Аппаратура, материалы, реактивы, питательные среды и средства измерений

Для проведения метода рекомендуются приборы, оборудование и расходные материалы, указанные в разделе 5, а также следующие:

центрифуга лабораторная со скоростью 2000 об/мин;

ткань флизелиновая;

колонки (бюретки) для загрузки сорбента;

экстракт мясной (бифэкстракт);

жидкость силиконовая;

вода дистиллированная;

натрий хлористый;

кислота соляная;

перекись водорода 33%;

спирт этиловый ректификационный 96%;

хлороформ.

9.7.2 Приготовление раствора 0,05 М трис-HCL со значением pH 9,1

Раствор автоклавируют 15 мин при давлении 1 бар.

Рабочие разведения получают добавлением девяти частей стерильной дистиллированной воды к одной части концентрированного раствора.

9.7.3 Приготовление раствора 0,05 М трис-HCL со значением pH 9,1 с добавлением 0,5 М NaCI

Растворы автоклавируют 15 мин при давлении 1 бар.

Рабочие разведения получают добавлением девяти частей стерильной дистиллированной воды к одной части концентрированного раствора.

9.7.4 Приготовление раствора 3%-ного мясного экстракта (бифэкстракта) на 0,05 М трис-HCL со значением pH 9,1

Раствор автоклавируют 15 мин при давлении 1 бар.

Рабочие разведения получают добавлением девяти частей стерильной дистиллированной воды к одной части концентрированного раствора.

9.7.5 Подготовка макропористого стекла

Один объем макропористого стекла заливают в колбе одним объемом смеси (в соотношении 1:1) 3%-ного раствора перекиси водорода и 6 М раствора HCL и кипятят в вытяжном шкафу в течение 1 ч (без пробки), соблюдая меры безопасности. Отмывают большим количеством дистиллированной воды до нейтрального значения pH. Высушивают при температуре плюс 100°C.

9.7.6 Подготовка колонок с целью предотвращения адсорбции вирусов

Силиконовую жидкость используют для предварительной обработки колонок с целью предотвращения адсорбции вирусов. Для этого смачивают внутреннюю поверхность колонок жидкостью, сливают ее и выдерживают колонки 1 ч при температуре плюс 100°C.

Силиконовую жидкость используют многократно.

На дно колонки помещают небольшой слой стекловаты или флизелиновой ткани для удержания сорбента.

9.7.7 Обработка проб

Отбор проб с использованием пакетов из флизелиновой ткани с макропористым стеклом для поверхностных источников проводят в соответствии с 8.1.2 и 8.1.4.

В качестве элюирующих растворов используют:

а) 0,05 М трис-HCL pH 9,1;

б) 0,05 М трис-HCL с pH 9,1 с добавлением 0,5 М NaCI;

в) 3%-ный раствор мясного экстракта (бифэкстракта) на 0,05 М трис-HCL со значением pH 9,1.

9.7.8 Антибактериальная обработка элюатов

а) Антибактериальная обработка элюатов с помощью хлороформа

Запрещается использовать пластиковые флаконы и пипетки для антибактериальной обработки с помощью хлороформа.

б) Антибактериальная обработка элюатов с помощью фильтрующих насадок

9.7.9 Хранение элюата

Стерильные элюаты делят на две равные порции и хранят до проведения испытания при температуре плюс (4±2)°C не более 24 ч.

При температуре минус 20°C стерильные элюаты можно хранить в течение одного года. При необходимости многократного исследования элюат дополнительно делят на несколько порций для того, чтобы избежать повторного замораживания.

10 Идентификация вирусов в воде

10.1 Общие сведения об идентификации энтеровирусов в культурах клеток

Для проведения исследований полученных элюатов на наличие энтеровирусов используют различные культуры клеток, первично-трипсинизированные, диплоидные или перевиваемые, обладающие восприимчивостью ко всем или к большинству из известных цитопатогенных энтеровирусов. Перевиваемые культуры клеток RD, Нер-2 (Cincinnati), BGM, Vera, Hela, BS-C-1, L20B наиболее пригодны для проведения лабораторных исследований и позволяют выделять достаточно широкий спектр энтеровирусов, которые могут присутствовать в водных объектах окружающей среды.

Культуры перевиваемых клеточных штаммов обладают различной чувствительностью к отдельным энтеровирусам и имеют более узкий спектр восприимчивости, чем первичные или диплоидные культуры. Поэтому при выделении энтеровирусов наибольший эффект достигается при использовании нескольких перевиваемых линий. Чувствительность культур клеток к различным энтеровирусам представлена в таблице 1.

10.1.1 Культуры клеток для проведения лабораторного исследования следует получать из аттестованного источника, например из лаборатории, обладающей банком клеток. Культура клеток должна сопровождаться паспортом, в котором должны быть представлены следующие сведения:

а) наименование клеточной культуры, коллекционный шифр;

б) происхождение клеточной культуры;

в) количество клеток в емкости;

г) номер пассажа и дата закладки клеток на хранение;

д) условия, режим хранения и жизнеспособность клеток после размораживания;

е) ростовые свойства (способ культивирования, питательная среда, посевная концентрация, метод снятия клеток, кратность рассева, температура культивирования, частота пассирования);

ж) подлинность (морфология, кариологическая характеристика, молекулярно-генетические методы исследования);

и) стерильность;

к) присутствие посторонних вирусов, в том числе эндогенных;

л) туморогенность;

м) онкогенность;

н) количество рекомендованных пассажей;

п) чувствительность к штаммам вируса.

Таблица 1 - Чувствительность культур клеток к различным энтеровирусам

10.1.2 Культуры клеток для проведения лабораторного исследования следует получать из аттестованного источника, например из лаборатории, обладающей банком клеток. Культура клеток должна сопровождаться паспортом, в котором должны быть представлены следующие сведения:

а) наименование клеточной культуры, коллекционный шифр;

б) происхождение клеточной культуры;

в) количество клеток в емкости;

г) номер пассажа и дата закладки клеток на хранение;

д) условия, режим хранения и жизнеспособность клеток после размораживания;

е) ростовые свойства (способ культивирования, питательная среда, посевная концентрация, метод снятия клеток, кратность рассева, температура культивирования, частота пассирования);

ж) подлинность (морфология, кариологическая характеристика, молекулярно-генетические методы исследования);

и) стерильность;

к) присутствие посторонних вирусов, в том числе эндогенных;

л) туморогенность;

м) онкогенность;

н) количество рекомендованных пассажей;

п) чувствительность к штаммам вируса.

10.1.3 В качестве контрольных (эталонных) референс-штаммов используют тест-штаммы из официально признанных коллекций микроорганизмов, имеющих паспорт и хранящихся в соответствии с действующими санитарными правилами таким образом, чтобы возможность мутаций и контаминации культур была минимальной. В паспорте референс-штамма вируса должны содержаться следующие сведения:

а) наименование ведомства, учреждения, подразделения (отдела, отделения, лаборатории), откуда получен референс-штамм;

б) инвентарный номер штамма в коллекции организации;

в) наименование штамма в латинской транскрипции;

г) особое обозначение штамма, присвоенное коллекцией;

д) концентрация штамма;

е) дата выделения (год, месяц, число);

ж) объект выделения;

и) место выделения;

к) кем выделен;

л) кем подтвержден;

м) характеристика штамма [в т.ч. патогенность, данные о первичной структуре генома и (или) отдельных генов (ссылки на базы данных или другие источники, где хранится информация о последовательностях];

н) перечень клеточных культур, чувствительных к данному штамму.

Перевиваемые линии клеток, как нормальные, так и опухолеродные, поддерживают путем последовательных пассажей.

Все этапы работы с культурой клеток требуют соблюдения стерильных условий: выполнения всех процедур в ламинарном шкафу в пламени горелки, использования стерильных инструментов, посуды, питательных сред и т.д.

10.2 Аппаратура, материалы, реактивы, питательные среды и средства измерений

Для проведения идентификации рекомендуются приборы, оборудование и расходные материалы, указанные в разделе 5, а также следующие:

центрифуга лабораторная со скоростью минимум 1000 об/мин;

анализатор иммуноферментный;

лупа;

оборудование для подсчета культуральных клеток;

пинцет анатомический;

вода дистиллированная стерильная;

спирт этиловый ректификационный 96%;

перекись водорода 33%;

раствор Версена;

раствор Хенкса;

раствор трипсина 0,25%;

среда 199 на растворе Хенкса;

среда "Игла MEM", значение pH 7,2 с двойным набором аминокислот;

L-глютамин;

сыворотка КРС;

сыворотка стерильная эмбриональная КРС;

соль бензилпенициллина натриевая;

стрептомицина сульфат;

линии клеток перевиваемые;

раствор Эрла 10-кратный;

нейтральный красный в соотношении 1:1000;

агар "Дифко" бактериологический 1,5%.

10.3 Приготовление агарового покрытия для культуры клеток (по Уоллис и Мелник)

10.4 Подготовка клеточных линий

10.4.1 Классическая процедура перевивания клеточной линии

Клетки однослойной культуры диспергируют раствором Версена. Для этого удаляют из флакона ростовую среду, на которой клетки выращены, промывают клеточный слой раствором Версена два раза. Версен добавляют так, чтобы все участки клеточного слоя были покрыты жидкостью. Культуру инкубируют при температуре плюс (36±1)°C в течение 15-20 мин.

Встряхивают флакон, тем самым снимают клетки со стекла, пипетируют клеточную взвесь, добиваясь получения однородной суспензии.

Через четыре-пять дней культивирования клеток в термостате при температуре (36±1)°C на стекле образуется сливной слой клеток.

10.4.2 Упрощенная процедура перевивания клеточной линии

Через 2-4 сут культивирования клеток при температуре (36±1)°C проводят смену ростовой среды на поддерживающую. В качестве среды для поддержания роста клеток используют:

- среду с 0,5%-ным раствором гидролизата лактальбумина на растворе Эрла, pH 7,6;

- среду 199 на растворе Эрла;

- среду "Игла MEM" с глютамином (L-глютамин в замороженном состоянии хранят в отдельной расфасовке и добавляют непосредственно перед работой).

Через 4-5 сут культивирования клеток в термостате при температуре (36±1)°C на стекле образуется сплошной монослой клеток.

10.5 Проведение качественного исследования на культуре клеток

10.5.1 Первичное заражение

Предварительно флаконы со свежеобразованным монослоем клеток микроскопируют для того, чтобы убедиться в здоровом состоянии клеток.

В качестве контроля исходной культуры клеток обязательно оставляют по одному незараженному флакону каждой культуры.

Флаконы инкубируют в термостате при температуре плюс (36±1)°C. Ежедневно в течение не более 10 дней культуры проверяют на наличие ЦПЭ. Все признаки ЦПЭ, токсичности, контаминации посторонними микроорганизмами регистрируют в лабораторном журнале. При появлении ЦПЭ (при охвате изменениями 75% клеточного монослоя) прекращают инкубацию флаконов и сохраняют культуральную жидкость при температуре минус 20°C для следующего пассажа на той же культуре клеток.

10.5.2 Пассирование культур после первичного заражения

Содержимое каждого флакона с культурой клеток пассируют индивидуально, флаконы не допускается объединять и (или) сливать.

Если при первичном заражении не наблюдали ЦПЭ, то делают так называемый "слепой" пассаж. Культуры, в которых не проявлялся ЦПЭ, инкубируют и наблюдают в течение не менее 14 дней. При отсутствии ЦПЭ на протяжении этого срока культуры отбрасывают как негативные. При надлежащем состоянии культуры клеток первичное заражение и один пассаж вместе составляют период наблюдения 14 дней. В ряде случаев (например, при выделении агента с низкой цитопатогенной активностью или при наличии в пробе вируса в небольшом количестве) необходимо сделать последующие пассажи. При этом следует помнить о том, что каждый последующий пассаж увеличивает риск перекрестной контаминации.

Пассирование проводят следующим образом: отобранные флаконы с культурой клеток после первичного заражения или предыдущего пассажа подвергают тройному циклу "заморозки-разморозки" (примерно минус 20°C для заморозки и примерно плюс 36°C для разморозки) для разрушения оставшихся после культивирования клеток. Затем осуществляют заражение новых флаконов с чистой культурой полученных суспензий в соответствии с 10.5.1.

10.5.3 Метод адсорбции исследуемого материала на клеточном монослое

При использовании этого метода из посуды для выращивания монослоя клеток удаляют ростовую среду, вносят исследуемую пробу и инкубируют флакон при температуре плюс (36±1)°C в течение 1 ч. Таким образом, создают наиболее подходящие условия для адсорбции вируса клетками, если он присутствует в пробе. После истечения срока инкубации в каждую единицу посуды для выращивания монослоя клеток вносят необходимое количество поддерживающей среды. Применение этого метода может способствовать выявлению вируса при его незначительных количествах в исследуемом материале, а также ускорять проявление ЦПЭ по крайней мере на 1 сут. При использовании этого метода в результате дополнительных открываний крышек во много раз возрастает вероятность контаминации (перекрестной вирусной или бактериальной). Ввиду высокого риска контаминации этот метод не следует использовать для пассирования или инокуляции изолятов вирусов.

10.5.4 Идентификация цитопатических агентов в реакции нейтрализации

После инкубации в течение 1 ч при температуре плюс (36±1)°C проводят заражение культуры клеток смесью вируса и сыворотки во флаконах, пробирках или планшетах. Опыт ежедневно просматривают под микроскопом в течение не менее трех дней. Иммунная сыворотка, которая предотвращает развитие ЦПЭ, указывает тип вируса.

При постановке реакции нейтрализации необходимо соблюдать несколько наиболее значимых положений.

Для идентификации ЦПА неизменно используют ту культуру клеток, на которой они были выделены. Если ЦПА выделен в нескольких культурах клеток, то следует провести идентификацию каждого штамма. Это связано с тем, что в пробах воды могут содержаться различные энтеровирусы, а чувствительность клеточных культур к разным энтеровирусам различная.

Реакцию нейтрализации проводят в культуральных планшетах с плоским дном (микрометод). Микрометод позволяет экономить все компоненты, необходимые для проведения опыта, однако при недостаточном опыте возникает опасность перекрестной лабораторной контаминации.

10.5.5 Идентификация цитопатических агентов методом ПЦР/ОТ-ПЦР

Отобранные флаконы с культурой клеток после первичного заражения или проведенного пассажа подвергают тройному циклу "заморозки-разморозки" (примерно минус 20°C для заморозки и примерно 36°C для разморозки) для разрушения оставшихся после культивирования клеток. Использованную суспензию исследуют для идентификации ЦПА методом ПЦР/ОТ-ПЦР.

Необходимое оборудование, расходные материалы и реактивы используют в соответствии с инструкцией к применяемому зарегистрированному коммерческому набору, предназначенному для выделения искомой вирусной ДНК или РНК, к набору для проведения обратной транскрипции, а также ПЦР тест-систем, зарегистрированных в России.

Экстракцию (выделение), обратную транскрипцию, амплификацию, идентификацию и хранение вирусных ДНК и РНК проводят в соответствии с инструкцией к применяемому зарегистрированному коммерческому набору.

10.5.6 Нежелательные явления при выделении вирусов из проб воды различного происхождения

Если при первичном заражении в культуре клеток развивается быстрая (в течение одного - двух дней после внесения исследуемого субстрата) дегенерация клеток, то, вероятнее, это связано с неспецифической токсичностью пробы. Такие культуры нужно заморозить при температуре минус 20°C, оттаять и выполнить пассаж. Если признаки токсичности обнаружатся вновь, то следует возвратиться к исходной пробе, развести ее в питательной среде в соотношении 1:10 и повторить заражение.

Бактериальная контаминация, которая проявляется в виде помутнения среды, приводит к гибели клеток и делает выявление вирусного ЦПЭ затруднительным или невозможным. В этом случае следует возвратиться к исходной пробе, подвергнуть антибактериальной обработке и повторить процедуры заражения.

Особое внимание следует уделять предупреждению перекрестной вирусной контаминации во время процедур заражения и пассирования. Не допускается сливать среду через край флакона или пробирки, в которые вносилась исследуемая проба, даже если ЦПЭ отсутствует. Удаление среды проводят пипеткой, которую меняют после каждой процедуры. При заражении с помощью автоматических дозаторов используют только наконечники с фильтрами. Следует избегать процедур, при которых образуются аэрозоли (например, энергичное пипетирование). По возможности не рекомендуется использование посуды с силиконовыми пробками, которые помещаются внутрь горлышка флакона или пробирки, целесообразно применять посуду с внешней резьбой на горлышке, которая закрывается завинчивающимися крышками.

10.6 Проведение количественного исследования на культуре клеток

10.6.1 Метод конечного разведения для определения количества вирусов в вируссодержащем материале на культуре клеток

Для получения данных о количестве цитопатогенных энтеровирусов в материале чаще всего используют метод конечного разведения, основанный на цитопатогенном действии вирусных частиц на культуру клеток.

а) Расчет титра вируса методом пробитов

Таблица 2 - Пример полученных результатов титрования

б) Расчет титра вируса по методу Рида и Менча

Метод основан на логической предпосылке, что тканевая культура или животное, погибшие при их заражении каким-либо разведением вируса, погибнут и при заражении любым более низким разведением.

где N - номер разведения, ниже которого гибель культуры в тест-объектах более 50%;

A - процент гибели при разведении, непосредственно ниже искомой 50%-ной дозы;

B - процент гибели при разведении непосредственно выше искомой 50%-ной дозы.

Проводят расчет:

10.6.2 Метод бляшек для определения количества определяемого вируса в вируссодержащем материале на культуре клеток

а) Проведение метода

б) Расчет титра вируса в БОЕ

При определении титра вируса для повышения точности в расчетах используют результаты, получаемые в двух разведениях:

1) в разведении, при котором появилось оптимальное для подсчета количество бляшек;

2) последующего за ним разведения, при котором появились единичные бляшки.

По данным титрования проводят расчет титра определяемого вируса.

в) Определение среднеарифметического числа бляшек во флаконах

Среднеарифметическое количество X бляшек во флаконах, зараженных вируссодержащей жидкостью каждого из указанных разведений, определяют по формуле

где X - среднеарифметическое количество бляшек во флаконах, зараженных материалом из того разведения, при котором появились единичные бляшки;

n - количество зараженных флаконов данного разведения.

г) Определение среднеквадратического отклонения

Среднеквадратическое отклонение S определяют по формуле:

n - количество зараженных флаконов данного разведения.

Например:

д) Определение значения весов и ошибки титрования

По данным таблиц А.1-А.5 определяют значение весов W. Для проведения всех последующих вычислений подбирают таблицу в зависимости от n, т.е. от количества флаконов, которые использованы для заражения одним разведением.

е) Определение ошибки титрования

Пример - В данном примере значение ошибки титрования m=0,54.

ж) Определение средневзвешенного титра определяемых вирусов

Средневзвешенный титр вируса Z определяют по формуле

Пример - В данном примере проводят следующий расчет:

и) Условия, необходимые для учета результатов титрования определяемых вирусов

Результаты титрования не учитывают, если нарушены следующие условия:

- отношение количества бляшек в двух соседних разведениях должно быть равно 10;

- отношение размаха выборки (максимальное число бляшек на флаконе минус минимальное количество бляшек на флаконе среди параллельных флаконов одного разведения) к среднему числу бляшек на флаконе должно быть менее 3.

10.7 Выявление искомой вирусной ДНК и РНК из проб воды

Необходимое оборудование, расходные материалы и реактивы используют в соответствии с инструкцией к применяемому зарегистрированному коммерческому набору, предназначенному для выделения искомой вирусной ДНК или РНК, а также ПЦР тест-систем, зарегистрированных в России.

Идентификация искомых вирусов методом ПЦР по определению ДНК и РНК из проб вод, обработанных ультрафиолетовым облучением, проводят только в качестве скрининга с последующим определением инфекционности выделенных вирусов на культуре клеток.

Экстракцию (выделение), обратную транскрипцию, амплификацию, идентификацию и хранение вирусной ДНК и РНК проводят в соответствии с инструкцией к применяемому зарегистрированному коммерческому набору, предназначенному для выделения искомой вирусной ДНК или РНК, к набору для выполнения обратной транскрипции, а также ПЦР тест-систем, зарегистрированных в России.

10.8 Электронно-микроскопическое изучение элюатов и других проб при вирусологическом анализе воды

Метод прямой просвечивающей электронной микроскопии можно отнести к экспресс-методам, поскольку при наличии электронного микроскопа весь анализ, включая приготовление сеток электронно-микроскопических, занимает от 10 до 20 мин. Многие вирусы имеют уникальный внешний вид, поэтому данный метод позволяет незамедлительно идентифицировать обнаруженные вирионы до семейства и даже до родов по вирусной классификации, что выгодно отличает его от других методов.

10.8.1 Аппаратура, материалы, реактивы, питательные среды и средства измерений

Для проведения метода рекомендованы приборы, оборудование и расходные материалы, указанные в разделе 5, а также:

микроскоп электронный;

материал, не смачивающийся водой (например, фторопласт);

сетка медная электронно-микроскопическая (150 меш);

бумага фильтровальная;

вода дистиллированная;

раствор, контрастный для электронов (например, 1%-ный раствор уранилацетата или 2%-5%-ный раствор солей свинца).

10.8.2 Приготовление электронно-микроскопических сеток

10.8.2.1 На ленту из несмачивающегося водой материала (например, фторопласта) наносят одну каплю элюата или другой суспензии, предположительно содержащей вирусы.

10.8.2.2 Сверху на каплю элюата или суспензии осторожно накладывают электронно-микроскопическую медную сетку (150 меш) пленкой подложкой вниз на 10 мин.

10.8.2.3 Сетку аккуратно переносят для промывки в одну каплю дистиллированной воды на 5 с, после чего воду удаляют промакиванием кусочком фильтровальной бумаги.

10.8.2.4 Сетку переносят в каплю какого-либо контрастного для электронов раствора, например 1%-ного раствора уранилацетата или 5%-ного раствора солей свинца на 30 с.

10.8.2.5 После удаления контрастера фильтровальной бумагой препарат готов для исследования под электронным микроскопом.

Приложение А

(обязательное)

Расчет титра вируса

В таблицах А.1-А.8 приведен расчет титра вируса.

Библиография