ГОСТ Р ИСО 20397-2-2023 Биотехнология. Массовое параллельное секвенирование. Часть 2. Оценка качества данных секвенирования

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО

ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ГОСТ Р

ИСО 20397-2—

2023

Биотехнология

МАССОВОЕ ПАРАЛЛЕЛЬНОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ

Часть 2 Оценка качества данных секвенирования (ISO 20397-2:2021, IDT)

Издание официальное

Москва Российский институт стандартизации 2023

Предисловие

• 1 ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Российский институт стандартизации» (ФГБУ «Институт стандартизации») на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 4

• 2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 326 «Биотехнологии»

• 3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 10 августа 2023 г. № 633-ст

• 4 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 20397-2:2021 «Биотехнология. Массовое параллельное секвенирование. Часть 2. Оценка качества данных секвенирования» (ISO 20397-2:2021 «Biotechnology — Massively parallel sequencing — Part 2: Quality evaluation of sequencing data», IDT).

Международный стандарт разработан Техническим комитетом ТК276 «Биотехнология» Международной организации по стандартизации (ИСО)

• 5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

• 6 Некоторые элементы настоящего стандарта могут являться объектами патентных прав

Правила применения настоящего стандарта установлены в статье 26 Федерального закона от 29 июня 2015 г. № 162-ФЗ «О стандартизации в Российской Федерации». Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе «Национальные стандарты», а официальный текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.rst.gov.ru)

© ISO, 2021 © Оформление. ФГБУ «Институт стандартизации», 2023

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

Содержание

• 1 Область применения

• 2 Нормативные ссылки

• 3 Термины и определения

• 4 Исходные данные

• 5 Выравнивание последовательностей и картирование

• 6 Идентификация вариантов

• 7 Валидация

• 8 Документирование

Приложение А (справочное) Показатели качества для конкретных примеров платформ MPS

Приложение В (справочное) Охват и рекомендации по прочтению по приложениям

Приложение С (справочное) Программное обеспечение для выравнивания и сопоставления последовательностей

Библиография

Введение

Массовое параллельное секвенирование (MPS) — это высокопроизводительный аналитический подход к секвенированию нуклеиновых кислот с использованием массово-параллельной архитектуры, которая позволяет исследовать целые геномы, транскриптомы и специфические мишени из нуклеиновых кислот различных организмов за относительно короткое время.

MPS используется во многих областях биологии, позволяя определять и осуществлять высокопроизводительный анализ миллионов и тысяч миллионов нуклеотидных оснований. Биологическая изменчивость полимеров дезоксирибонуклеиновых и рибонуклеиновых кислот живых организмов приводит к трудностям в точном определении их последовательностей. Качество определения последовательности с помощью MPS зависит от многих факторов, в том числе от качества образца, подготовки библиотеки, выбора платформы и качества данных секвенирования.

Анализ данных секвенирования создает значительные сложности в биоинформатике, связанные с хранением данных, временем вычислений и точностью определения вариантов. Одной из основных проблем, возникающих при работе с данными секвенирования, которую в ряде случаев упускают из виду, является мониторинг показателей контроля качества на всех этапах обработки конвейера. Информация о качестве данных необходима для последующего анализа последовательностей. Контроль качества при обработке и анализе данных секвенирования нуклеиновых кислот можно разделить на три этапа: исходные данные, выравнивание и поиск вариантов. В настоящем стандарте приведен список критериев для оценки качества данных секвенирования MPS, а также конкретные рекомендации для различных платформ MPS.

ГОСТ Р ИСО 20397-2—2023

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Биотехнология

МАССОВОЕ ПАРАЛЛЕЛЬНОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ

Часть 2

Оценка качества данных секвенирования

Biotechnology. Massively parallel sequencing. Part 2. Quality evaluation of sequencing data

Дата введения — 2024—03—01

• 1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает общие требования и рекомендации по оценке и контролю качества данных массового параллельного секвенирования (MPS). Он охватывает процедуры генерации исходных данных, выравнивания последовательностей и поиска вариантов.

Настоящий стандарт также содержит общие рекомендации по валидации и документированию данных MPS.

Настоящий стандарт не относится к процессам, связанным со сборкой de novo.

• 2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте нормативные ссылки отсутствуют.

• 3 Термины и определения

• В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями.

ИСО и МЭК ведут терминологические базы данных для использования в области стандартизации по следующим адресам:

• - Электропедия МЭК: доступна по адресу: http://www.electropedia.org/;

• - платформа онлайн-просмотра ИСО: доступна по адресу: http://www.iso.org/obp.

• 3.1 последовательность адаптера; адаптер (adapter sequence, adapter): Синтетический олигонуклеотид известной последовательности, который может быть добавлен к 3' или 5' концам фрагмента нуклеиновой кислоты.

Примечание — Он обеспечивает участок праймера, а также другие необходимые последовательности для секвенирования вставки.

• 3.2 алгоритм (algorithm): Полностью определенная конечная последовательность инструкций, с помощью которой значения выходных переменных могут быть вычислены из значений входных переменных.

[МЭК 60050-351:2013, 351-42-27, изменено — примечания удалены]

• 3.3 распознание нуклеотидов (base calling): Процесс вычисления в массивно-параллельном секвенировании перевода необработанных электрических сигналов в последовательность нуклеотидов.

Примечание — Применение распознавания нуклеотидов и алгоритмов характеризуется точностью считывания и консенсуса.

Издание официальное

• 3.4 биоинформатический конвейер (bioinformatics pipeline): Отдельные программы, сценарии или части программного обеспечения, связанные между собой, в которых необработанные данные или выход одной программы используют в качестве входных данных для следующего этапа обработки данных.

Пример — Результаты работы программы тримминга базового качества могут быть использованы в качестве входных данных для ассемблера de novo.

• 3.5 эффективность захвата (capture efficiency): Процентное содержание всех секвенированных или картированных ридов, которые перекрывают целевые области.

• 3.6 покрытие; глубина покрытия (coverage, coverage depth): Количество раз, когда определенное положение основания считывается в ходе секвенирования.

Примечание — Количество прочтений, покрывающих определенную позицию.

• 3.7 ширина покрытия (coverage breadth): Доля генома в собранном/целевом размере генома в циклах секвенирования.

• 3.8 плотность кластеров (cluster density): Количество кластеров для каждой области сканирования.

Примечание 1 — Плотность кластеров, применяемая к платформам MPS (3.30), требует амплификации.

Примечание 2 — Плотность отдельных кластеров последовательностей, каждый из которых возникает из одной молекулы на некоторых платформах секвенирования.

Примечание 3 — Плотность кластеров, как правило, выражается в тысячах на мм².

• 3.9 секвенирование кольцевых консенсусных последовательностей; CCS (circular consensus sequencing, CCS): Режим секвенирования, при котором размер вставки секвенируется несколько раз в амплификации по типу «катящегося кольца», что обеспечивает высокую точность.

Примечание — В этом режиме допускается использовать несколько проходов от одной и той же молекулы для достижения более высокой точности определения одной молекулы.

• 3.10 диапазон покрытия (coverage range): Диапазон глубины покрытия по всему геному при проведении секвенирования.

• 3.11 вариация числа копий; вариант числа копий; CNV (copy number variation, copy number variant, CNV): Вариант числа копий одного или нескольких участков ДНК или присутствующих в геноме организма.

Примечание — CNVs — это вставки, делеции, инверсии и дупликации, содержащие не менее 1000 оснований в длину.

• 3.12 дезоксирибонуклеиновая кислота; ДНК (deoxyribonucleic acid, DNA): Полимер дезоксирибонуклеотидов, существующий в двухцепочечной (дцДНК) или одноцепочечной (оцДНК) форме.

[ИСО 22174:2005, 3.1.2]

• 3.13 делеция (deletion): Потеря одной (или более) пары нуклеотидных оснований из последовательности нуклеиновой кислоты по сравнению с ее эталонной последовательностью.

• 3.14 уровень дупликации (duplication level): Количество идентичных повторов для каждой последовательности в библиотеке.

Примечание — Уровень дупликации, как правило, отображается в виде графика, показывающего относительное количество последовательностей с разной степенью дупликации.

• 3.15 гуанин-цитозиновый состав; GC-состав (GC content): Процентное содержание гуанина и цитозина в одной или более последовательности(ях) нуклеиновой кислоты.

Примечание — Количество гуанина и цитозина в полинуклеиновой кислоте, как правило, выражается в мольной доле (или процентах) от общего количества азотистых оснований. Общее количество азотистых оснований включает в себя общее количество нуклеотидных оснований ридов в результате одного или нескольких циклов MPS.

• 3.16 ген (gene): Последовательность нуклеотидов в ДНК или РНК, кодирующая РНК либо белковый продукт.

Примечание 1 — Гены признаны основной единицей наследственности.

Примечание 2 — Ген может состоять из несмежных сегментов нуклеиновых кислот, которые перестраиваются в результате этапа ядерного процессинга.

Примечание 3 — Ген может включать или быть частью оперона, который содержит элементы для экспрессии гена.

• 3.17 вставка-делеция (индел) (indel): Вставка(3.18) и/или делеция (3.13) нуклеотидов в геноме ДНК.

Примечание — Инделы имеют длину менее 1000 оснований.

• 3.18 вставка (insertion): Добавление одной или нескольких пар нуклеотидных оснований в последовательность ДНК.

[ISO/TS 20428:2017, 3.19, изменено — «ДНК» заменено «нуклеиновой кислотой»]

• 3.19 секвенирование (sequencing): Определение порядка и содержания нуклеотидных оснований (аденина, гуанина, цитозина, тимина и урацила) в молекуле нуклеиновой кислоты.

Примечание — Последовательность, которая, как правило, описывается с 5-го конца по 3-й.

[ISO/TS 17822-1:2020, 3.19, изменено— «ДНК» исключена из термина; в определении «ДНК» заменено «нуклеиновой кислотой» и добавлен «урацил»]

• 3.20 выравнивание последовательностей (sequence alignment): Расположение последовательностей нуклеиновых кислот в соответствии с областями сходства.

Примечание — Выравнивание последовательностей может не требовать эталонного генома/эталонной целевой области нуклеиновой кислоты, и создание сборки может не быть его целью.

• 3.21 исходные данные (raw data): Первичные данные секвенирования, полученные секвенатором без предварительной фильтрации на основе программного обеспечения для целей анализа.

• 3.22 рибонуклеиновая кислота; РНК (ribonucleic acid; RNA): Полимер рибонуклеотидов, возникающий в двухцепочной или одноцепочной форме.

Примечание — Синтез белков в клетках регулируется генетической информацией, содержащейся в последовательности нуклеотидов в классе РНК, известном как РНК-посредник (мРНК).

• 3.23 рибонуклеотид (ribonucleotide): Нуклеотид, содержащий рибозу в качестве пентозного компонента, образующий основные строительные блоки для РНК.

Примечание — Рибонуклеотиды состоят из аденилата (АМР), гуанилата (GMP), цитидилата (СМР) или уридилата (UMP).

• 3.24 прочтение (рид); прочтенная последовательность (read, sequence read): Нуклеотидная последовательность, генерируемая устройством секвенирования.

Примечание — Прочтение (рид) — это выведенная последовательность пар оснований нуклеиновых кислот (или вероятностей пар оснований), соответствующая всему (или части) одному фрагменту нуклеиновой кислоты. Рид допускается использовать для обозначения последовательностей, полученных в результате экспериментов MPS.

• 3.25 тип прочтения (read type): Категория последовательности, которая зависит от того, как разработан и проведен эксперимент по прочтению последовательности.

Пример — Тип считывания (рида) может быть одноконцевым, парно-концевым, спаренным концевым, непрерывным длинным считыванием, циркулярным консенсусом.

• 3.26 референсная последовательность (reference sequence): Последовательность нуклеиновой кислоты, используемая либо для выравнивания путем картирования ридов последовательности, либо в качестве основы для аннотаций, таких как гены и вариации последовательности.

• 3.27 демультиплексирование (demultiplexing): Вычислительный процесс, обратный процессу мультиплексирования, смешивание двух или более образцов вместе таким образом, чтобы их можно было секвенировать за один цикл на приборе MPS.

Примечание 1 — Образцы, подлежащие объединению, должны иметь штрихкоды/индексы до смешивания.

Примечание 2 — Демультиплексирование — это вычислительный алгоритм, который разделяет пул ридов в соответствии с их исходным образцом на основе штрихкода.

• 3.28 картирование (mapping): Сборка последовательностей нуклеиновых кислот против существующей базовой (эталонной) последовательности, чтобы построить консенсусную последовательность.

• 3.29 спаренные концевые риды (mate pairs, mate pair reads): Парные риды, которые соответствуют концам длинного фрагмента последовательности нуклеиновой кислоты, полученного путем сжатия образца на большие фрагменты (более 2 кб или не менее 2 кб).

• 3.30 массовое параллельное секвенирование; MPS (massively parallel sequencing; MPS): Метод секвенирования, основанный на определении полимеризации инкремента на основе шаблона множества независимых молекул ДНК одновременно.

Примечание — Технология массивно-параллельного секвенирования может обеспечить миллионы или миллиарды коротких прочтений за один цикл.

• 3.31 парно-концевые риды (paired-end reads): Секвенирование ридов обоих концов фрагмента ДНК.

Примечание — При парно-концевом секвенировании прибор секвенирует оба конца коротких вставок, как правило, от 200 до 800 бит/с.

• 3.32 оценка качества секвенирования; показатель качества Q (quality score, Q score, Phred quality score): Мера качества секвенирования данного нуклеотидного основания.

Примечание 1 — Q вычисляют по формуле

Q =-10 Iog10(p), где р — оценочная вероятность того, что основание названо неверно.

Примечание 2 — Оценка качества, равная 20, представляет собой вероятность ошибки 1 к 100, что соответствует точности вызова 99 %.

Примечание 3 — Более высокие баллы качества указывают на меньшую вероятность ошибки. Более низкие показатели качества могут привести к тому, что значительная часть ридов окажется непригодной для использования. Низкие показатели качества могут также указывать на ложноположительные вызовы вариантов, что приводит к неточным выводам.

• 3.33 цикл (запуск) (run): Единый технологический цикл секвенсора от момента инициирования до получения исходных данных.

• 3.34 аннотация секвенированной последовательности (sequence annotation): Процесс добавления пояснения, комментария или ссылки на конкретные особенности в последовательности ДНК, РНК или белка с описательной информацией о структуре или функции.

Примечание — Процесс аннотации секвенированной последовательности можно рассматривать как присвоение метаданных последовательности.

• 3.35 одноконцевой рид (одноконцевое прочтение) (single-end read): Эквивалентное прочтение, получаемое при прочтении фрагмента ДНК с одного конца до другого.

• 3.36 однонуклеотидный вариант; SNV (single nucleotide variant, SNV): Изменение в одном нуклеотиде молекулы нуклеиновой кислоты.

• 3.37 структурная вариация; SV (structural variation, SV): Фрагмент ДНК размером примерно 1000 оснований или больше, который может включать инверсии и сбалансированные транслокации или геномный дисбаланс.

Примечание — Общие типы структурных вариантов включают в себя варианты числа копий (делеции, вставки, амплификации, дупликации), делеции с нейтральным числом копий (потеря гетерозиготности), инверсии, сегментные дупликации и транслокации (сбалансированные или несбалансированные).

• 3.38 субчтение (subread): Доля прочтения, находящаяся между адаптерами шпильки.

• 3.39 тримминг исходных прочтений (trimming of raw reads): Процедура, направленная на удаление низкокачественных частей или загрязнений последовательности с сохранением самой длинной высококачественной части чтения MPS.

• 3.40 вариации (variation): Отличия одного или нескольких оснований нуклеиновой кислоты в последовательности по отношению к ожидаемому(ым) основанию(ям).

• 3.41 идентификация вариантов (коллинг) (variant calling): Логическое заключение о том, что в определенной позиции нуклеотид исследуемой ДНК отличается от нуклеотида референсной последовательности.

• 3.42 волновод с нулевым режимом; ZMW (zero mode waveguide, ZMW): Оптический волновод, который направляет световую энергию в объем, который по всем измерениям мал по сравнению с длиной волны света.

Примечание — Полимераза закрепляется на дне этой ZMW, и включение нуклеотидов измеряется по увеличению флуоресценции во время связывания с последующим уменьшением после включения.

• 4 Исходные данные

• 4.1 Общие положения

Каждому нуклеотиду в последовательности необходимо присвоить числовое значение (основная оценка качества), которое соотносится с предполагаемой точностью процесса распознавания нуклеотидных оснований (base calling), если это применимо.

• 4.2 Файл с исходными данными

Для генерации файлов чтения последовательностей следует использовать программное обеспечение и/или конвейеры, специфичные для конкретного прибора. Контролируемые физические параметры, такие как соотношение сигнал/шум, должны быть задокументированы. Также эти физические параметры необходимо контролировать во время каждого эксперимента по секвенированию.

Файлы чтения последовательностей должны быть сконфигурированы в соответствующий формат файла, содержащий компиляцию отдельных чтений последовательностей, каждое из которых имеет свой собственный идентификатор, и ассоциированную оценку качества основания для каждого нуклеотида.

Примечание — Формат FASTQ (или конвертируемый в формат FASTQ) может использоваться в качестве стандартного формата де-факто для последующего анализа качества наборов данных MPS. FASTQ широко признан в качестве кроссплатформенного формата обмена файлами.

Файл выходных данных, полученных после проведения секвенирования, и соответствующие метрики качества должны быть проанализированы в последующем биоинформатическом конвейере с использованием соответствующего программного обеспечения.

• 4.3 Оценка качества исходных данных
  
  4.3.1 Общие требования

  Показатели контроля качества могут отличаться в зависимости от платформы MPS, метода подготовки библиотеки и предполагаемого использования анализа.

Результаты секвенирования должны интерпретироваться компетентным персоналом. Интерпретацию выполняют таким образом, чтобы соответствовать уровню качества, соответствующему предполагаемой цели анализа, с учетом статистически достоверного числа повторных прочтений.

Инструменты обработки ридов применяют с учетом оценки качества и обрезки необработанных прочтений.

• 4.3.2 Базовая статистика

Необходимо зарегистрировать основные статистические данные, включая, но не ограничиваясь ими:

• а) тип платформы;

• Ь) тип рида;

• с) набор для подготовки библиотеки;

• d) длину рида;

• е) количество ридов;

• f) общее содержание GC;

д) общую длину последовательностей.

• 4.3.3 Показатели качества

К показателям контроля качества для оценки исходных данных относятся, но не ограничиваются:

• а) распределение длины последовательностей;

• Ь) на содержание GC последовательности;

• с) показатель качества;

• 1) качество последовательности оснований;

• 2) показатель качества последовательности.

Примечание 1 — Низкое качество оценки может указывать на увеличение числа ложноположительных вызовов вариантов;

• 3) все последовательности должны быть помечены как «предупреждение» или «пройдено» для качества последовательности по каждому основанию;

• d) состав последовательности по нуклеотидам;

• е) допустимость соотношения сигнал/шум;

• f) уровни дупликаций последовательности;

• д) уровень перепредставленности последовательностей;

• h) плотность кластера;

• i) отношение транзиция/трансверсия для секвенирования целого экзома или целого генома или секвенирования больших ампликонов;

• д) доля адаптеров/загрязнение (контаминация) последовательности адаптерами;

• к) загрязняющие вещества (идентификация, количественное определение);

• I) частота ошибок.

Примечание 2 — Включает в себя ошибки гомополимера: ошибки в количестве оснований, вызванные тем, когда один нуклеотид встречается в последовательности более одного раза в последовательном порядке;

гл) анализ к-меров.

Примечание 3 — В вычислительной геномике k-меры относят ко всем возможным подпоследовательностям (длиной к) из последовательности нуклеиновой кислоты. Перепредставленность k-меров может быть проанализирована для обнаружения потенциальной неправильной сборки генома, если повторяющиеся последовательности ДНК, возможно, были объединены;

n) N фрагмент.

Примечание 4 — Количество и/или процент неоднозначных вызовов;

о) повторение растяжки и повторение последовательности;

р) распределение нуклеотидов между циклами.

• 4.4 Предварительная обработка исходных данных

Предварительная обработка исходных данных может включать следующие вычислительные этапы, если они применимы, но не ограничивается ими:

• а) удаление/обрезку некачественных последовательностей/баз;

• Ь) демультиплексирование;

• с) удаление адаптеров/праймеров и загрязнений;

• d) исправление ошибок;

• е) фильтрацию дуплицированных ридов;

• f) обрезку ридов до фиксированной длины;

д) вызов CCS-ридов.

При использовании данных CCS необходимо получить и отфильтровать риды CCS перед последующим анализом.

• 5 Выравнивание последовательностей и картирование

• 5.1 Общие требования

Стратегия выравнивания последовательностей и картирования должна быть выбрана на основании приложения.

Пример — Существует сплайсированное картирование для РНК и несплайсированное картирование для стратегии картирования секвенирования РНК.

Для выравнивания допускается использовать программное обеспечение и инструменты для выравнивания и картирования.

Качество выравнивания допускается оценивать визуально, используя соответствующие виды выравнивания, а также используя информацию, представленную в файле выравнивания.

Примеры программного обеспечения для выравнивания и картирования последовательностей различного назначения приведены в приложении С.

Для картирования используются референсные геномы/референсные целевые области нуклеиновых кислот, которые должны быть тщательно подобраны в зависимости от плана эксперимента.

Примечание 1 — Изучение содержит версию референсного генома/референсной целевой области нуклеиновой кислоты, выбор различных штаммов в одном организме и выбор геномов с маской, мягкой маской или без маски.

Примечание 2 — Программное обеспечение для выравнивания и картирования секвенирования с открытым исходным кодом доступно онлайн.

• 5.2 Последовательность и формат файла картирования

Данные выравнивания последовательностей всегда хранятся в следующих форматах файлов.

• а) Карта выравнивания последовательностей (SAM) [17], [24].

Примечание 1 — SAM представляет собой текстовый формат с разделителем ТАВ, состоящий из заголовка, который является необязательным, и секции выравнивания. Каждая строка выравнивания имеет 11 обязательных полей для основной информации о выравнивании, такой как положение сопоставления, и переменное количество необязательных полей для гибкой или специфической для выравнивателя информации.

• Ь) Карта двоичного выравнивания (ВАМ) [15], [17].

Примечание 2 — Это сжатый формат, аналогичный формату SAM в двоичном виде.

• с) Сжатая карта выравнивания, ориентированная на ссылку (CRAM) [16].

Примечание 3 — CRAM — это формат файла чтения секвенирования, который экономит место за счет сжатия данных последовательностей на основе ссылок и предлагает режимы сжатия без потери информации и с потерями.

• d) Группа экспертов по движущимся изображениям в геномике (MPEG-G) [3]—[8].

Примечание 4 — MPEG-G — это формат представления геномики, основанный на концепции геномной записи, структуре данных, состоящей либо из одного прочтения последовательности, либо из парных прочтений последовательности и связанной с ними информации о секвенировании и выравнивании; она может содержать подробные данные сопоставления и выравнивания, идентификатор одиночного или парного чтения (имя чтения) и значения качества. Геномные записи агрегируются и кодируются в структурах, называемых единицами доступа. Эти структуры представляют собой единицы закодированной геномной информации, к которым можно получить отдельный доступ и проверить их.

Примечание 5 — MPEG-G определен в серии стандартов ИСО/МЭК 23092.

Файл выравнивания должен содержать информацию о расположении, ориентации и качестве каждого чтения (рида) в выравнивании.

Для работы с файлами выравнивания могут применяться алгоритмы и инструменты в зависимости от их применения.

• 5.3 Контроль качества выравнивания последовательностей и картирование
  
  5.3.1 Базовая статистика выравнивания

  5.3.1.1 Общие требования

Необходимо получить и записать основные статистики выравнивания или картирования.

Базовая статистика выравнивания или картирования может отличаться в зависимости от плана эксперимента и типа считывания.

• 5.3.1.2 Статистика картирования для одноконцевых ридов

• а) Общее количество ридов относится к количеству прочтений, которые сопоставлены с эталонной последовательностью или геномом.

• Ь) Несопоставленные риды означают количество прочтений, которые не удалось сопоставить с эталонной последовательностью или геномом.

• с) Сопоставленные риды означают количество прочтений, выровненных с эталонной последовательностью или геномом.

• d) Уникально сопоставленные риды означают количество прочтений, точно выровненных с эталонной последовательностью или геномом.

Примечание 1 — Уникальность картирования зависит от обстоятельств. Риды, уникально сопоставленные на основе одного набора параметров сопоставления, могут быть многократно сопоставленными прочтениями при другом наборе параметров сопоставления.

• е) Многохитовые сопоставленные риды означают количество прочтений, выровненных более одного раза с эталонной последовательностью или геномом.

Примечание 2 — Мультихит зависит от специфики картирования.

• 5.3.1.3 Статистика картирования для парно-концевых ридов

• а) Общее количество спаренных концевых ридов относится к количеству парно-концевых прочтений, сопоставленных с эталонной последовательностью или геномом.

• Ь) Сопоставленные спаренные концевые риды — число парных ридов, в которых оба были сопоставлены.

• с) Частично сопоставленные спаренные концевые риды — число парных прочтений, в которых сопоставлен только один из них.

• d) Несопоставленные спаренные концевые риды — число парных ридов, которые не удалось сопоставить с эталонной последовательностью или геномом.

• е) Неправильно сопоставленные спаренные концевые риды — число парных ридов, из которых один был сопоставлен с дискордантной ориентацией.

Примечание 1 — Также известны под наименованием: несогласованно сопоставленные пары.

• f) Под правильно сопоставленными спаренными концевыми ридами понимается общее число парных прочтений, из которых оба сопряженных рида были сопоставлены с согласованной ориентацией.

Примечание 2 — Также известны под наименованием: согласованно сопоставленные пары.

• 5.3.1.4 Длина сопоставленного субрида

Длина выравнивания субрида с целевой эталонной последовательностью не включает последовательность адаптера.

• 5.3.2 Индикаторы качества

В зависимости от условий применения рекомендуется использовать следующие параметры контроля качества:

• а) скорость выравнивания.

Примечание 1 — Низкое качество картирования может быть результатом неспецифической амплификации, захвата загрязнения внецелевой ДНК или других причин;

• Ь) длина фрагмента или длина ДНК/РНК, которая должна быть секвенирована;

• с) статистика размера вставки для парного прочтения — длина ДНК/РНК, предназначенная для секвенирования между адаптерами.

Примечание 2 — Пик распределения размера вставки используют для оценки качества;

• d) уровень дупликации только для секвенирования на основе ампликонов;

• е) покрытие по назначению, включая глубину, ширину и диапазон покрытия.

Примечание 3 — В приложении В приведен список рекомендуемого покрытия для различных использований;

• f) смещение AT/GC.

Примечание 4 — Оценку допускается проводить в соотношении % GC с глубиной секвенирования/ покрытием;

• д) оценка качества картирования;

• h) эффективность захвата.

Примечание 5 — Эффективность захвата является наиболее важным параметром контроля качества для секвенирования экзома или других секвенирований на основе захвата мишени;

• i) средняя или медианная глубина, процент генома, охваченного секвенированием на данной глубине;

• j) количество дискордантно сопоставленных пар;

• к) высокое качество выровненных прочтений;

• I) частота несовпадений;

• т) точность консенсуса.

Примечание 6 — Точность консенсуса основывается на выравнивании нескольких секвенированных прочтений и субридов вместе, не обязательно с эталонной последовательностью;

• п) точность кругового консенсуса.

Примечание 7 — Точность кругового консенсуса основана на нескольких проходах секвенирования вокруг одной круговой молекулы шаблона. Это используется в CCS;

• о) точность субридов.

Примечание 8 — Точность распознавания оснований после картирования.

• 5.3.3 Методы оценки качества выравнивания и картирования

Для оценки качества выравнивания следует применять подход, основанный на балльной системе оценивания.

Примечание — Выбор матрицы подсчета баллов зависит от области применения.

• 5.4 Постобработка выравнивания

Постобработка выравнивания может включать, но не ограничиваться:

• а) локальное выравнивание вокруг инделов или расчет выравниваний по основанию;

• Ь) удаление дубликатов;

• с) перекалибровку оценок качества оснований;

• d) среднюю длину ридов после обрезки по качеству оснований.

• 6 Идентификация вариантов

  • 6.1 Общие требования

    • 6.1.1 Существует четыре основных класса вариантов последовательности (SNV, инделы, CNVs и SVs). Для разных классов вариантов последовательности следует применять различные вычислительные подходы для чувствительной и специфической идентификации.

    • 6.1.2 Диапазон программных инструментов и тип необходимой валидации зависят от плана анализа.

  • 6.2 Файл данных для идентификации вариантов

    • 6.2.1 Распознанные варианты должны быть аннотированы с использованием соответствующей спецификации. Спецификация должна содержать метаинформацию, строку заголовка и строки данных, каждая из которых содержит информацию о позиции в геноме и информацию о генотипе образцов для каждой позиции.

Пример 1 — Выявленные варианты аннотируются с использованием формата идентификации вариантов (VCF) [31].

Пример 2 — Существуют альтернативные спецификации для представления и хранения вариантов:

• а) геномные конвенции VCF;

• Ь) Онтология последовательностей, версия формата вариации генома 1.10;

• с) Общество по изучению вариаций генома человека, Общество по изучению вариаций генома человека (HGVS), простая версия 15.11;

• d) Гповальный альянс по геномике и здоровью (GA4GH), форматы файлов.

• 6.2.2 Файлы вариантов должны включать как спецификацию, так и используемую версию.

• 6.2.3 Устройства распознавания вариантов должны быть сконфигурированы на вывод; эталоны, варианты и отсутствие вызовов вместе с местной информацией, по крайней мере в области целевых областей.

• 6.3 Показатели качества при определении вариантов

Метрики контроля качества должны включать, но не ограничиваться (если применимо):

• а) пороговые значения для глубины покрытия ридов в позиции варианта;

• Ь) оценку качества вариантов;

• с) смещение цепочек;

• d) процент аллельных прочтений;

• е) дополнительные конкретные метрики, относящиеся к точности и чувствительности вызова вариантов, которые могут включать, но не ограничиваются:

• 1) общее число вариантов,

• 2) количество ложноположительных результатов,

• 3) количество ложноотрицательных вариантов,

• 4) количество несовпадений аллелей и генотипов,

• 5) соотношение транзиций/трансверсий,

• 6) соотношение гетерозигот/гомозигот (het/hom);

• f) анализ контаминации перекрестной выборки.

• 6.4 Обработка ложноположительных вариантов

Ложноположительные варианты должны быть отмечены или отфильтрованы из исходных файлов вариантов на основе нескольких выравниваний последовательностей и метрик контроля качества, связанных с поиском вариантов.

• 6.5 Аннотация секвенированной последовательности

Варианты могут быть аннотированы для определения их биологической значимости, что позволяет определить функциональные приоритеты и интерпретировать последующие данные.

• 7 Валидация

  • 7.1 Общие требования

    • 7.1.1 Лаборатории, предлагающие тестирование на основе MPS, должны провести «внутреннюю» валидацию биоинформатического конвейера.

    • 7.1.2 Требования к производительности анализа необходимо установить в ходе процедуры валидации и те же спецификации следует использовать для мониторинга производительности анализа при каждой обработке образца.

    • 7.1.3 Конкретные параметры контроля качества и обеспечения качества должны оцениваться в ходе валидации и использоваться для определения удовлетворительных характеристик.

    • 7.1.4 Каждая лаборатория должна определить критерии и средства мониторинга всех показателей качества для обеспечения оптимальных аналитических характеристик. Метрики качества, используемые для мониторинга, должны быть внесены в документы и периодически проверяться.

Рекомендуемые показатели качества и их конкретные значения для некоторых платформ приведены в приложении А.

• 7.1.5 Лаборатории должны предусмотреть конкретные меры по обеспечению сохранности каждого файла данных, созданных в биоинформатическом конвейере, и обеспечению предупреждения или предотвращению использования файлов данных, которые были изменены несанкционированным или непреднамеренным образом.

• 7.1.6 Дополнительная валидация требуется каждый раз, когда в любой компонент биоинформатического конвейера вносят значительные изменения.

• 7.2 Валидация показателей качества

  • 7.2.1 Валидацию анализа следует проводить на основе уточненной и документированной цели анализа. Необходимо определить целевое назначение измерения и внести его в документы.

  • 7.2.2 Лаборатории должны установить приемлемые пороговые значения оценки качества сырой базовой идентификации для анализа во время валидации.

  • 7.2.3 Для снижения частоты ложного распознавания следует разработать методы предварительной обработки для удаления некачественных базовых вызовов.

  • 7.2.4 Степень смещения GC во всех частях генома, включенных в анализ, должна быть определена в ходе валидации.

  • 7.2.5 Параметры качества картирования должны быть установлены в плане валидации и должны показывать, что тест оценивает только те риды, которые отображаются на области, являющиеся мишенью анализа. При необходимости следует установить фазы для фильтрации прочтений, которые отображаются в нецелевых областях.

  • 7.2.6 Охват определяется для достижения адекватной чувствительности и специфичности в областях, представляющих интерес.

  • 7.2.7 Каждая лаборатория должна установить минимальные критерии глубины покрытия, характерной для конкретной области в стандартных условиях анализа, в зависимости от цели проведения секвенирования. Для однородного образца последовательность должна быть подтверждена; меньшая глубина допустима. В процессе вызова вариантов по области или редкой последовательности в смешанном образце, составляющем 1 %, необходимо глубокое секвенирование.

  • 7.2.8 Требуемый уровень покрытия в целевых областях должен быть определен на этапе валидации (диапазон покрытия). Рекомендуемый диапазон для различных приложений описан в приложении В.

  • 7.2.9 Для каждого анализа должны быть установлены приемлемые параметры для максимальной частоты дупликации.

  • 7.2.10 Для увеличения количества пригодных для использования данных секвенирования и предотвращения перекосов в долях аллелей следует установить фильтрацию дуплицированных ридов с помощью аналитического конвейера.

  • 7.2.11 Каждая лаборатория должна определить допустимый уровень смещения цепочек и изложить конкретные критерии, когда следует проводить альтернативное тестирование.

  • 7.2.12 Показатели качества могут быть проверены с помощью соответствующих эталонных стандартов, которые были хорошо охарактеризованы и имеют надежные эталонные последовательности для точного выравнивания, поиска вариантов и т. д.

  • 7.2.13 Рекомендуется проведение секвенирования по методу Сэнгера для подтверждения наиболее важной связующей области.

• 8 Документирование

  • 8.1 Лаборатории должны документировать все алгоритмы, программное обеспечение и базы данных, используемые при анализе, интерпретации и представлении результатов MPS. Версия каждого из этих компонентов в общем биоинформатическом конвейере должна быть записана и отслеживаться для каждого результата.

  • 8.2 В документации лаборатории должны содержаться сведения о любых пользовательских настройках, которые отличаются от конфигурации по умолчанию, или должно быть указано, какие параметры были изменены.

  • 8.3 При необходимости следует указать номер версии эталонной последовательности и подробную информацию.

  • 8.4 Лаборатории также должны документировать параметры контроля качества для оптимальной работы.

Пример — На первичном этапе лаборатория определяет приемлемые критерии, такие как количество прочтений, проходящих через фильтры качества, определенные прибором.

• 8.5 Лаборатории должны фиксировать в протоколах процессы биоинформатики, используемые для сокращения большого набора данных о вариантах до списка причинных генов и/или генов-кандидатов и/или вариантов.

• 8.6 Доказательства соответствия установленным требованиям должны быть также задокументированы.

Приложение А (справочное)

Показатели качества для конкретных примеров платформ MPS

Для секвенирования нуклеиновых кислот, как правило, используют приведенные далее платформы MPS. Примеры показателей качества, используемые для оценки качества, представлены в таблице А.1.

Примечание — Секвенирование целого генома человека используют в качестве примера, чтобы обеспечить конкретные значения для каждого показателя качества.

Таблица А.1 —Показатели качества для конкретных платформ MPS

Приложение В (справочное)

Охват и рекомендации по прочтению по приложениям

В таблице В.1 представлены примеры охвата и уровней считывания множеством различных приложений для секвенирования.

Таблица В.1 — Охват и рекомендации по прочтению по приложениям

Окончание таблицы В. 1

Приложение С (справочное)

Программное обеспечение для выравнивания и сопоставления последовательностей

В таблице С.1 представлены примеры программного обеспечения для выравнивания и сопоставления последовательностей.

Таблица С.1 — Программное обеспечение для выравнивания и картирования последовательностей

Библиография

• [1] ISO/TS 20428, Health informatics — Data elements and their metadata for describing structured clinical genomic sequence information in electronic health records

• [2] ISO 22174:2005, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions

• [3] ISO/IEC 23092-1:2020, Information technology — Genomic information representation — Part 1: Transport and storage of genomic information

• [4] ISO/IEC 23092-2:2020, Information technology — Genomic information representation — Part 2: Coding of genomic information

• [5] ISO/IEC 23092-3:2020, Information technology — Genomic information representation — Part 3: Metadata and application programming interfaces (APIs)

• [6] ISO/IEC 23092-4:2020, Information technology — Genomic information representation — Part 4: Reference software

• [7] ISO/IEC 23092-5:2020, Information technology — Genomic information representation — Part 5: Conformance

• [8] ISO/IEC 23092-6¹), Information technology — Genomic information representation — Part 6: Coding of genomic

annotations

• [9] Ardui S. et al. Single molecule real-time (SMRT) sequencing comes of age: applications and utilities for medical diagnostics. Nucleic acids research. [Online]. March 2018; 46(5) 2159-2168 [viewed 2019-09-15]. Available at: https://academic.oup.eom/nar/article/46/5/2159/4833218

• [10] Aziz N. et al. College of American Pathologiests’ Laboratory Standards for Next-Generation Sequencing Clinical Tests. Arch Pathol Lab Med [Online]. April 2015, 139(4), 481-493 [viewed 2018-4-10]. Available at: https://www. ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/25152313

• [11] Carver T. et al. Bamview: viewing mapped read alignment data in the context of the reference sequence. Bioinformatics. [Online]. March 2010; 26(5):676-677 [viewed 2019-01-15] Available at: https://www.ncbi.nlm.nih. gov/pmc/articles/PMC2828118/

• [12] Dunnen J.T. et al. HGVS recommendations for the description of sequence variants: 2016 update. March 2nd 2016. [online]. Human mutation, [viewed May 1^st 2020] Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/ humu.22981

• [13] Daehwan K. et al. Graph-based genome alignment and genotyping with HISAT2 and HISAT-genotype. Nature Biotechnology. August 2nd 2019. [online]. Springer, [viewed May 1st 2020] Available from: https://www.nature.com/ articles/s41587-019-0201-4

• [14] Dobin A. et al. STAR: Ultrafast universal RNA-seq aligner. 25th Oct. 2012 [online] Bioinformatics, [viewed May 1st 2020] Available from: https://academic.oup.com/ bioinformatics/article/29/1 /15/272537

• [15] Li H., Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-wheeler transform. May 18th 2009. [online] Bioinformatics, [viewed May 1st 2020]. Available from: https://academic.oup.com/bioinformatics/ article/25/14/1754/225615

• [16] European Nucleotide Archive (ENA) CRAM, [online]. EMBL-EBI 2019 [viewed 2019-01-15] Available at: https:// www.ebi.ac.uk/ena/software/cram-toolkit

• [17] Github. SMA/BAM and related specificaitons. [online]. May 5th 2020 Github. [viewed May 27st 2020] Available from: https://samtools.github.io/hts-specs/

• [18] Github. The Sequence Ontology Genome Variation Format Version 1.10. May 19th 2014 [viewed May 1st 2020]. Available from: https://github.com/The-Sequence-Ontology/Specifications/blob/master/gvf.md

• [19] Gvcftools. gVCF Conventions. September 2012 [online]. Gvcftools [viewed May 1st 2020] Available from: https:// sites.google.com/site/gvcftools/home/about-gvcf/gvcf-conventions Illumina. An introduction to next generation sequencing technology, [online]. Illumina, [viewed 2018-4-15]. Available at: https://www.illumina.com/ content/dam/ illumina-marketing/documents/products/illumina_sequencing_ introduction.pdf

• [20] Jennings L. J. et al. Guidelines for Validation of Next-Generation Sequencing-Based Oncology Panels. Journal of Molecular Diagnostics [Online]. May 2017, 19 (3), 341-365 [viewed 2018-4-15]. Available at: http://jmd.amjpathol. org/article/S1525-1578(17)30025-9/ fulltext

В стадии подготовки.

• [21] Kuczynski J. et al. «Direct sequencing of the human microbiome readily reveals community differences». Genome biology 11.5 (2010): 210.

• [22] Kuczynski J. et al. «Microbial community resemblance methods differ in their ability to detect biologically relevant patterns». Nature methods 7.10 (2010): 813.

• [23] Langmead B. Salzberg S.L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. Nat Methods. [Online]. March 2012; 9 (4) [viewed 2019-1-15] Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22388286

• [24] LI H. et al. The Sequence Alignment/Мар format and SAMtools. Bioinformatics. [Online]. 2009 Aug; 25(16): 2078-9. [viewed 2019-01-15] Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19505943

• [25] Pfeifer S. From next-generation resequencing reads to a high-quality variant data set. Heredity. [Online]. February 2017,118 (2) [viewed 2018-4-15]. Available at: https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5234474/

• [26] Reinert K. et al. Alignment of Next-Generation Sequencing Reads. Annu Rev Genomics Human Genetics [Online]. May 2015, 16: 133-151 [viewed 2018-05-25] Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25939052

• [27] Rhoads A., AU K.F. PacBio Sequencing and its Applications. Genomics Proteomics Bioinformatics [Online]. October 2015; 13 (5): 278-289 [viewed 2019-09-15] Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26542840

• [28] Rouven N. et al. The tole of quality control in targeted next-generation sequencing library preparation. Genomics Preteomics Bioinformatics [online]. March 2016, 14, 200-206 [viewed 2018-08-01] Available at: https://www. sciencedirect.com/ science/article/pii/S1672022916301073

• [29] Samtools organisation and repositories. The variant call format specification. April 2nd 2020. [online] samtoools organisation and repositories, [viewed May 1st 2020]. Available from: https://samtools.github.io/hts-specs/ VCFv4-3.pdf

• [30] Somak R.O.Y. et al. Standards and Guidelines for Validating Next-Generation Sequencing Bioinformatics Pipeline A Joint Recommendation of the Association for Molecular Pathology and the College of American Pathologists. The Journal of Molecular Diagnostics [Online], Elsevier. November 2017, 20 (1) [viewed 2018-4-12]. Available at: http:// jmd.amjpathol.org/article/S1525-1578(17)30373-2/pdf

• [31] Trivedi U. H. etal. Quality control of next generation sequencing without a reference. Front Gene [Online]. May 2014, 5, 111 [viewed 2018-4-10]. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4018527/

• [32] Yan G.U.O. et al. Three stage quality control strategies for DNA re-sequencing data. Briefing in Bioinformatics [Online]. September 2013, 15 (6), 879-889 [viewed 2018-04-13] Available at: https://academic.oup.com/bib/ article/15/6/879/180439

• [33] ISO/TS 17822-1:2020, In vitro diagnostic test systems — Nucleic acid amplification-based examination procedures for detection and identification of microbial pathogens — Laboratory quality practice guide

УДК 615.07:006.354

Ключевые слова: секвенирование, массовое параллельное секвенирование, оценка и контроль качества

Редактор Е.В. Якубова Технический редактор И.Е. Черепкова Корректор Л. С. Лысенко Компьютерная верстка А.Н. Золотаревой

Сдано в набор 14.08.2023. Подписано в печать 18.08.2023. Формат 60x84%. Гарнитура Ариал. Усл. печ. л. 2,79. Уч.-изд. л. 2,40.

Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта

Создано в единичном исполнении в ФГБУ «Институт стандартизации» , 117418 Москва, Нахимовский пр-т, д. 31, к. 2.