ГОСТ Р ИСО 20184-1-2021 Молекулярные диагностические исследования in vitro. Требования к процессам преаналитического этапа исследования замороженных тканей. Часть 1. Выделенная РНК

    ГОСТ Р ИСО 20184-1-2021

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Молекулярные диагностические исследования in vitro

ТРЕБОВАНИЯ К ПРОЦЕССАМ ПРЕАНАЛИТИЧЕСКОГО ЭТАПА ИССЛЕДОВАНИЯ ЗАМОРОЖЕННЫХ ТКАНЕЙ

Часть 1

Выделенная РНК

Molecular in vitro diagnostic examinations. Specifications for pre-examination processes for frozen tissue. Part 1. Isolated RNA

ОКС 11.100.10

Дата введения 2022-04-01

Предисловие

1 ПОДГОТОВЛЕН Ассоциацией специалистов и организаций лабораторной службы "Федерация лабораторной медицины" (Ассоциация "ФЛМ"), на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 4

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 380 "Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы ин витро"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 21 октября 2021 г. N 1218-ст

4 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 20184-1:2018* "Молекулярные диагностические исследования in vitro. Требования к процессам преаналитического этапа исследования замороженных тканей. Часть 1. Изолированная РНК" (ISO 20184-1:2018 "Molecular in vitro diagnostic examinations - Specifications for pre-examination processes for frozen tissue - Part 1: Isolated RNA", IDT).

Международный стандарт разработан Техническим комитетом ISO/TC 212 "Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы in vitro" Международной организации по стандартизации (ISO).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им национальные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА.

Дополнительные сноски в тексте стандарта, выделенные курсивом, приведены для пояснения текста оригинала

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Правила применения настоящего стандарта установлены в статье 26 Федерального закона от 29 июня 2015 г. N 162-ФЗ "О стандартизации в Российской Федерации". Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе "Национальные стандарты", а официальный текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.rst.gov.ru)

Введение

Молекулярная диагностика in vitro, включая молекулярную патологию, позволила добиться значительного прогресса в медицине. Ожидается дальнейший прогресс в области новых технологий анализа нуклеиновых кислот, белков и метаболитов в тканях и жидкостях человеческого организма. Однако в процессе сбора, транспортирования, хранения и обработки образцов профиль и (или) целостность молекул может претерпеть радикальные изменения, что приведет к ненадежности или даже невозможности диагностики в связи с тем, что результаты исследования будут соответствовать не реальному состоянию пациента, а искаженному профилю, возникшему в результате процессов, произошедших с образцом до проведения исследования.

Следовательно, необходима стандартизация всего процесса, начиная от сбора образцов и заканчивая исследованием РНК. Были проведены исследования с целью установления главных факторов, влияющих на эти процессы. Настоящий стандарт был разработан на основе таких исследований, чтобы регламентировать и стандартизировать этапы работы с замороженными тканями, изучение РНК которых планируется проводить, на так называемой стадии предварительного исследования.

РНК-профили тканей могут претерпеть значительные изменения до, во время и после взятия образцов (к примеру, из-за индукции или подавления экспрессии генов). Разные РНК могут изменяться различным образом в различных тканях доноров или пациентов.

Следовательно, необходимо принять особые меры к тому, чтобы минимизировать упомянутые изменения и модификации в профиле РНК ткани для последующего исследования.

В настоящем стандарте используются следующие выражения:

- "должен/должна/должно" - указывает на требование;

- "следует" - указывает на рекомендацию;

- "мог/могла/могло бы" - указывает на разрешение;

- "может/могут" - указывает на способность или возможность.

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает требования к обработке, документационному обеспечению, хранению и обработке замороженных образцов тканей, предназначенных для исследования РНК, до начала проведения молекулярного анализа.

Требования настоящего стандарта распространяются на любые молекулярные диагностические исследования in vitro, в ходе которых исследуют выделенную из замороженной ткани РНК, проводимые медицинскими лабораториями и лабораториями молекулярной патологии. Он также предназначен для использования в лабораториях, разработчиками и производителями средств диагностики in vitro, биобанками, учреждениями и коммерческими организациями, выполняющими биомедицинские исследования, и регулирующими органами.

Требования настоящего стандарта не применимы к тканям, прошедшим предварительную химическую стабилизацию перед замораживанием.

Примечание - Международные, национальные или региональные регламенты и требования также могут быть применены к конкретным процессам, рассматриваемым в настоящем стандарте.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использована нормативная ссылка на следующий стандарт [для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированных - последнее издание (включая все изменения)]:

ISO 15189:2012, Medical laboratories - Requirements for quality and competence (Медицинские лаборатории. Специальные требования к качеству и компетентности)

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины по ИСО 15189, а также следующие термины с соответствующими определениями.

Терминологические базы данных ИСО и МЭК доступны по следующим интернет-адресам:

- электронная платформа ИСО с функцией онлайн-просмотра терминов по адресу: http://www.iso.org/obp;

- электронная база МЭК Electropedia по адресу: http://www.electropedia.org/.

3.1 аликвота (aliquot): Часть от большего количества гомогенного материала, при взятии которого допустима незначительная погрешность выборки.

Примечание 1 - Данный термин обычно применим к жидкостям. Ткани гетерогенны и, как следствие, аликвота тканей взята быть не может.

Примечание 2 - Определение составлено на основе информации из [22], [23] и [24].

3.2 температура окружающей среды (ambient temperature): Нерегулируемая температура окружающего воздуха.

3.3 аналит (analyte): Компонент, представленный в наименовании измеряемой величины. [ИСО 17511:2003, 3.2]

3.4 аналитические характеристики методики (analytical test performance): Точность, полнота и чувствительность метода исследования в оценке искомого аналита.

Примечание - Также могут применяться другие характеристики метода исследования, такие как надежность, повторяемость.

3.5 экстракорпоральное хранение (холодовая ишемия) (cold ischemia): Хранение (содержание) образца от момента извлечения из организма до стабилизации и фиксации.

3.6 диагноз (diagnosis): Заключение о состоянии здоровья или наличия заболевания по его признакам и (или) симптомам; процесс постановки диагноза может включать обследования и исследования для отнесения состояния пациента к принятым классификациям и номенклатуре болезней, что позволяет принимать медицинские решения по прогнозу и лечению.

3.7 ДНК, дезоксирибонуклеиновая кислота (DNA, deoxyribonucleic acid): Полимер дезоксирибо-нуклеотидов, существующий в двухцепочечной (дцДНК) или одноцепочечной (оцДНК) формах.

[ИСО 22174:2005, 3.1.2]

3.8 ДНКаза, дезоксирибонуклеаза (Dnase, deoxyribonuclease): Фермент, который катализирует распад ДНК на более мелкие компоненты.

3.9 исследование, аналитический тест (examination, analytical test): Комплекс операций, объектом которых является определение значения или характеристики свойств.

Примечание - Процессы, которые начинаются с исследования выделенного аналита (образца) и включают в себя все виды тестирования параметров или химических манипуляций для количественного или качественного исследования.

[ИСО 15189:2012, 3.7, изменен - примечания к пунктам 1-3 удалены, примечание 1 добавлено и "аналитический тест" добавлен как предпочтительный термин.]

3.10 макроскопическое исследование (grossing, gross examination): Выявления изменений в органах или тканях невооруженным глазом для получения диагностической информации при подготовке к дальнейшему микроскопическому исследованию.

3.11 гомогенный (homogeneous): Однородный по структуре и составу.

3.12 интерферирующие вещества (interfering substances): Эндогенные или экзогенные вещества в образце/пробе (например, применяющиеся для стабилизации раствора), которые могут изменить результат исследования.

3.13 процесс подготовки, преаналитический этап, преаналитический рабочий процесс (preexamination processes, preanalytical phase, preanalytical workflow): Процесс, который начинается в хронологическом порядке с клинического запроса, включающий в себя проверку запроса, подготовку и идентификацию пациента, сбор образца, транспортирование в клиническую или морфологическую лабораторию, выделение аналита и заканчивается началом аналитического исследования.

Примечание 1 - Преаналитический этап включает подготовительные процессы, влияющие на планируемое исследование.

[ИСО 15189:2012, 3.15, изменен - "преаналитический этап" был добавлен в качестве термина, примечание 1 к данному пункту добавлено и определение расширено.].

3.14 первичная проба, образец (primary sample, specimen): Дискретная порция биологической жидкости, выдыхаемого воздуха, волос или тканей, взятая для исследования, изучения или анализа одной или нескольких величин, а также свойств, которые предполагается экстраполировать на целое.

________________

3.15 проверка квалификации (proficiency test): Оценивание характеристики функционирования участника по заранее установленным критериям посредством межлабораторных сличений.

[ИСО 17043:2010, 3.7, изменен - примечания к пункту 1 и 2 удалены.]

3.16 профиль РНК (RNA profile): Совокупность отдельных молекул РНК, которые присутствуют в образце и могут быть определены без каких-либо потерь, ингибирования и интерференции.

3.17 РНК, рибонуклеиновая кислота (RNA, ribonucleic acid): Полимер рибонуклеотидов, существующий в двухцепочечной или одноцепочечной форме.

[ИСО 22174:2005, 3.1.3]

3.18 РНКаза, рибонуклеаза (RNase, ribonuclease): Фермент, катализирующий распад РНК на более мелкие компоненты.

3.19 комнатная температура (room temperature): Температура в диапазоне от 18°C до 25°C.

Примечание - В национальных требованиях возможны другие определения.

3.20 проба (sample): Одна или несколько частей, которые взяты из первичной пробы/образца (см.3.14).

________________

3.21 стабильность (stability): Характеристика материала пробы/образца, описывающая ее/его способность сохранять значения свойства в определенных пределах в течение определенного периода времени при хранении в установленных условиях.

Примечание 1 - Для процессов, описанных в настоящем стандарте, аналитом является выделенная РНК.

[Руководство ИСО 30:2015, 2.1.15, изменен - "стандартный образец" заменен на "материал пробы", "свойство" заменена на "характеристика, описывающая способность", также изменено примечание 1].

3.22 хранение (storage): Длительный период приостановки преаналитического этапа исследования образца, например, окрашенных срезов или образцов ткани соответствующим образом в соответствующих условиях с сохранением свойств образца.

Примечание - Долгосрочное хранение обычно осуществляется в лабораторных хранилищах или в биобанках.

3.23 валидация (validation): Подтверждение посредством представления объективных свидетельств того, что требования, предназначенные для конкретного использования или применения, выполнены.

Примечание1 - Термин "валидирован" используют для обозначения соответствующего статуса.

[ИСО 9000:2015, 3.8.13, изменен - примечания к пункту 1 и 3 удалены.]

3.24 верификация (verification): Подтверждение посредством представления объективных свидетельств того, что установленные требования были выполнены.

Примечание 1 - Термин "верифицирован" используют для обозначения соответствующего статуса.

[ИСО 9000:2015, 3.8.12, изменен - Примечание 1 и Примечание 2 не должны приниматься во внимание.]

Примечание 2 - Подтверждение может включать такие действия, как:

- выполнение альтернативных расчетов;

- сравнение новой разработанной спецификации с аналогичной уже испытанной;

- проведение испытаний и демонстраций;

- рецензирование документов до момента публикации.

3.25 интракорпоральная ишемия (некритическое хранение) (warm ischemia): Состояние ткани или органа во время хирургических или диагностических манипуляций (длительность и интервалы, степень).

3.26 рабочий процесс (workflow): Ряд действий, необходимых для выполнения задачи.

4 Общие сведения

Общие сведения о системах менеджмента качества медицинских лабораторий и, в частности, о сборе, приеме и обработке образцов (включая предотвращение вторичной контаминации) приведены в ИСО 15189:2012, 4.2, 5.4.4, 5.4.6 или ИСО/МЭК 17020:2012, раздел 8 и 7.2. Требования к лабораторному оборудованию, реагентам и исходным материалам - в соответствии с ИСО 15189:2012, 5.3, ИСО 15189:2012, 5.5.1.2 и 5.5.1.3, а также ИСО/МЭК 17020:2012, подраздел 6.2.

Все этапы диагностического рабочего процесса могут влиять на конечный результат аналитического исследования. Таким образом, весь рабочий процесс, включая стабильность биомолекул и условия хранения образцов, должен быть проверен и валидирован. Этапы рабочего процесса, которые не всегда поддаются контролю (например, интракорпоральная ишемия), должны быть задокументированы. Должна быть проведена оценка риска неконтролируемых этапов, включая их потенциальное влияние на результаты аналитических исследований, и приняты меры по предотвращению последствий для обеспечения достоверных результатов аналитических тестов.

Поэтому до или во время разработки аналитического теста его следует детализировать и обеспечить, чтобы РНК профиль(и), предназначенный(е) для исследования, не изменился(ись) и не подверг риску влияния эффективность аналитического теста (например, путем проведения эксперимента или исследования с высокой динамичностью; см. также приложение A).

До стабилизации тканей путем заморозки профиль(ли) РНК может(гут) существенно изменяться, например, из-за индукции или подавления экспрессии генов, разрушения РНК. Эти эффекты могут возникать из-за слишком длительной интракорпоральной ишемии и экстракорпорального хранения, средней температуры окружающей среды до заморозки. Кроме того, эти изменения могут варьироваться в тканях разных доноров/пациентов.

Как правило, чем больше продолжительность интракорпоральной ишемии и экстракорпорального хранения и чем выше температура окружающей среды до заморозки образца тканей, тем больше риск того, что может произойти изменение профиля РНК.

Примечание - Интракорпоральная ишемия во время операции может приводить к более выраженным изменениям профилей РНК, чем послеоперационное экстракорпоральное хранение [7], [8]. Профили РНК также могут варьироваться в зависимости от происхождения и типа тканей, исходного заболевания, хирургической процедуры, препаратов, вводимых для обезболивания или лечения сопутствующего заболевания, а также от различных условий окружающей среды после удаления тканей из организма.

Поскольку интракорпоральную ишемию сложно стандартизировать, ее продолжительность должна быть задокументирована. Если невозможно избежать экстракорпоральное хранение, его продолжительность и температуру среды, окружающей упаковку с образцом, следует отобразить в документации. Если образец транспортируют в иных условиях заморозки, то продолжительность и условия транспортирования следует задокументировать.

Инструкции по технике безопасности при транспортировании и обработке должны рассматриваться и соблюдаться в соответствии с ИСО 15189:2012, 5.2.3 и 5.4.5, а также ИСО 15190.

В течение всего процесса, предшествующего исследованию, должны соблюдаться меры предосторожности во избежание перекрестного загрязнения между различными образцами/пробами, например, путем использования одноразовых материалов, когда это возможно, или соответствующих процедур очистки между обработкой различных образцов/проб.

Если медицинское изделие, находящееся в обращении, не используют в соответствии с инструкциями производителя, ответственность за его использование и эксплуатационные характеристики возлагается на пользователя.

5 Внелабораторная преаналитика

5.1 Сбор образцов

5.1.1 Общие положения

При сборе образцов следует учитывать требования к ним (например, патологоанатомические изменения органов при определенном заболевании, их размеры), зависящие от того, какое именно молекулярное исследование предполагается проводить (см. также раздел 6).

См. также ИСО 15189:2012, 5.4.4.

5.1.2 Информация о доноре/пациенте

Документация должна содержать идентификационный номер донора/пациента, у которого был взят образец, который может быть представлен в виде кода. Следует в числе прочего фиксировать в документации следующую информацию:

a) соответствующее состояние здоровья донора/пациента [например, отсутствие заболевания, тип заболевания, сочетанные и сопутствующие болезни, демографические данные (например, возраст и пол)];

b) информацию о плановом медицинском лечении и специальной подготовке перед взятием ткани (например, применение анестетиков, медикаментов, проведение хирургических или диагностических процедур);

c) данное в установленном порядке согласие от донора/пациента.

5.1.3 Информация об образце

В документации в числе прочего должна быть зафиксирована следующая информация:

a) время от начала ишемии до извлечения из тела перевязки/пережатия сосудов (обычно время пережатия артерии);

Примечание - Не требуется в случае проведения биопсии малого участка ткани для замораживания.

b) время и дата извлечения ткани из организма и метод извлечения (например, толстоигольная биопсия; резекция; медицинское изделие, используемое для биопсии);

c) тип ткани; орган, из которого она взята; состояние ткани (например, поражена или не поражена болезнью), включая информацию о любых маркировках, нанесенных в операционной или вне ее, сделанных хирургом, рентгенологом или патологоанатомом.

Если заморозку ткани выполняют за пределами лаборатории, возникает необходимость задокументировать этапы, описанные в 6.2 и 6.3, в которых требуется оценка патологии.

В документацию также следует включить сведения об ответственном лице, осуществившем сбор образца.

5.1.4 Обработка образцов

Ткани, заморозку которых необходимо осуществить с целью дальнейшей диагностики, могут быть взяты из большего образца ткани или они могут быть небольшим образцом - например, взятым при биопсии во время эндоскопического исследования или во время хирургического вмешательства, когда постановка диагноза по результатам исследования замороженного образца должна осуществляться быстро.

Ткани, взятые после смерти, могут замораживаться с целью дальнейшей диагностики. Однако сохранность РНК зависит от времени, прошедшего с момента смерти до вскрытия и температурой хранения тела после смерти.

Любые дополнения к образцу или его изменения после изъятия из тела (например, маркировка для правильного расположения образца [например, с помощью чернил, швов, надрезов]) должны быть отражены в сопроводительных документах.

Для постановки патологоанатомического диагноза отбор образца должен проводиться под наблюдением или руководством врача-патологоанатома, имеющего медицинскую квалификацию (например, действующий сертификат специалиста) (см. 6.2).

Если образец был взят не для постановки патологоанатомического диагноза, то оценка и отбор образцов могут быть выполнены другим квалифицированным специалистом, а также на основании представленной документации.

Заморозка образца или части, взятой из образца, может быть выполнена в лаборатории или вне ее.

Неправильное хранение может отразиться на профиле РНК; в связи с этим следует отдавать предпочтение способу заморозки, позволяющему уменьшить его срок:

a) если заморозка образца или часть образца осуществляется вне лаборатории, следует без промедления выполнить указания 6.2;

b) если заморозка образца или его части происходит в лаборатории, свежие образцы ткани необходимо доставить в лабораторию. Указания, описанные в 5.2 для свежих образцов ткани, должны быть выполнены без промедления.

5.2 Требования к транспортированию свежих тканей

5.2.1 Общие положения

Если для заморозки образца необходимо транспортирование в лабораторию, то лаборатории и клиническому или хирургическому отделению рекомендуется вместе составить протокол процедуры транспортирования образца.

5.2.2 Подготовка к транспортированию

Должны быть выполнены следующие указания:

a) выбирают и используют тару (например, холодильную камеру, бокс для хранения и транспортирования, вакуумную упаковку) в соответствии с правилами перевозки;

b) выбирают и используют для транспортирования процедуры, направленные на стабилизацию (например, методы охлаждения);

Примечание - Случайная заморозка ткани (например, при неправильном использовании тары для охлаждения) приведет к разрушению РНК при оттаивании ткани. Это также может повлиять на морфологическую характеристику.

c) упакованный образец маркируют (например, регистрационным номером, штрихкодом, указанием типа образца, размера, органа, из которого он был взят) и дополнительно задокументируют [в соответствии с требованиями 5.1.2-5.1.4 и 5.2.2 a) и b)].

Несколько образцов, взятых от одного и того же пациента/донора, имеющие сходные признаки (макроскопический вид, тип ткани, наличие или отсутствие заболевания, анатомическое расположение), могут быть помещены в одну тару/отделение внутри тары.

После взятия из организма образцы следует переместить в тару немедленно. Затем тару следует держать на ледяной бане или при температуре от 2°C до 8°C, чтобы минимизировать изменения профиля РНК.

Температуру окружающей среды, в которой находилась тара в период экстракорпорального хранения (например, температура в разных помещениях, транспорте) следует задокументировать. Если не проводят измерение температуры, ее следует принять равной температуре окружающей среды, комнатной температуре или температуре в диапазоне от 2°C до 8°C.

5.2.3 Требования к транспортированию

Контроль температуры следует осуществлять соответствующим образом.

Если образец еще не заморожен, транспортирование следует осуществлять немедленно на влажном льду или при температуре от 2°C до 8°C, чтобы минимизировать изменения профиля РНК.

Примечание - Существуют доказательства того, что РНК в тканях могут быть стабилизированы при транспортировании в полиэтиленовых пакетах в вакууме при температуре от 0°C до 4°C, прежде чем образцы будут подготовлены к хранению в биобанках или использованы для гистологической оценки. [9].

Соблюдение процедуры транспортирования установленным требованиям должно быть задокументировано. Любые расхождения с протоколом должны быть описаны и задокументированы.

6 Внутрилабораторная преаналитика

6.1 Информация о приеме образца

Фамилия, имя, отчество (Ф.И.О.) лица, принявшего образец, должны быть задокументированы. Дата и время доставки образца и иные условия (например, маркировка; условия транспортирования, включая температуру; тип ткани и размер образца; факт протечки/разрушения тары) должны быть задокументированы. Любые расхождения с установленными требованиями к транспортированию (см. 5.2) должны быть отражены в сопроводительном документе.

Примечание - Температурные условия во время транспортирования могут оказать влияние на профиль РНК и его качество.

Должно быть проверено, соответствует ли образец информации в представленном сопроводительном документе. В процедуру проверки следует включить проверку клинической информации (см. 5.1.1 и 5.1.3) об образце, сведения о госпитализации и/или о доноре/пациенте, имени пациента, дате рождения пациента.

6.2 Оценка патологии образца и отбор части образца

Оценка и документирование патологического биопсийного и операционного материала и отбор его части для дальнейшей обработки должна осуществляться квалифицированным патологоанатомом, имеющим, например, соответствующую квалификацию специалиста или под его наблюдением.

Могут применяться региональные, национальные правила или требования.

Факторы, влияющие на выбор образца для исследования РНК:

a) выбор подходящих частей образца для молекулярных и гистологических исследований, а также для возможных дальнейших исследовательских целей должен проводиться специалистом, имеющим медицинскую квалификацию (например, сертификат патологоанатома), гарантирующее, что отбор образца для исследования РНК не приведет к невозможности гистологического анализа. Для молекулярного исследования следует выбирать подходящие части ткани, что означает, по возможности не использовать части, которые могут потенциально сделать молекулярное исследование невозможным - например, те, в которых наблюдается кровотечение или некроз. Для определения или выделения тех или иных клеточных особенностей заболевания следует применять микродиссекцию ткани.

Примечание - Отбор подходящих частей образцов также может осуществляться вне лаборатории, например, в операционной, если это допускают правила лаборатории медицинской организации (см. 5.1.4).

При макроскопической оценке операционного материала до и/или после заморозки следует проверить представленную информацию (см. 5.1.2 и 5.1.3) об образце (к примеру тип, размер, учетный номер), номер истории болезни пациента или данные о доноре, имя пациента, его дату рождения и тип ткани. Должно быть соответствующим образом составлено описание операционного материала и всех результатов исследований, удовлетворяющее рекомендациям и указаниям соответствующих организаций здравоохранения и отражающее клиническую информацию, и возникающие вопросы. Должно быть указано, из какого органа или ткани был взят материал, при необходимости может быть описан край резекции и важные сведения о других областях, которые могут быть необходимы при последующем проведении микроскопической оценки; можно делать фотографии. Репрезентативные части от образца для гистологического исследования должны браться при макроскопическом исследовании в соответствии с конкретными рекомендациями и указаниями соответствующих организаций здравоохранения;

Примечание - Данная оценка или документирование может проводиться также и вне лаборатории - например, в операционной.

b) если для образца ткани, взятого из трупа, не требуется постановка гистологического диагноза, может быть проведено документирование этого образца, а также оценка, взятие и документирование проб не только патологоанатомом, но и другим квалифицированным специалистом;

c) если требуется постановка диагноза для образца, который планируется заморозить, выбранная часть образца должна быть подвергнута заморозке (см. 6.3) в подходящей морозильной среде. Использование той или иной морозильной среды должно быть задокументировано. Замороженные срезы должны оцениваться специалистом, имеющим соответствующую медицинскую квалификацию (например, сертифицированным патологоанатомом).

6.3 Заморозка образца или пробы (проб)

Заморозка образца или пробы (проб) должна быть проведена немедленно после забора. Следует выбрать оптимальный метод заморозки (см. 6.3.2) для образца или пробы в соответствии с дальнейшим их использованием и эксплуатационным режимом.

Контейнер должен быть маркирован до его предварительного охлаждения.

Ниже описаны три возможные процедуры заморозки:

После заморозки образец ткани должен быть помещен в предназначенную для него предварительно охлажденную промаркированную криопробирку. Пробирка должна быть закрыта в соответствии с инструкцией изготовителя. Если в нижней части пробирки наблюдается осадок ткани, изопентан следует заменить на новый.

Изопентан - чрезвычайно летучая и легковоспламеняющаяся при комнатной температуре и давлении жидкость. В связи с этим следует обеспечить в лаборатории хорошую вентиляцию. Изопентан в пробирке следует охладить;

b) быстрая заморозка: Ткань должна быть заморожена на предварительно охлажденной металлической пластине или в металлической емкости, размещенной на поверхности жидкого азота или на сухом льду. Поверхность металла должна быть предварительно охлаждена до температуры от минус 196°C до минус 80°C включительно. Металлическая пластина или емкость может быть закреплена с помощью подходящего штатива и зажима. Также образец может быть заморожен прямо в жидком азоте или даже в промаркированной и закрытой пробирке для хранения, помещенной в жидкий азот или сухой лед. Однако медленная заморозка может вызвать разрушение мембран клеток в образце из-за увеличения концентрации солей и образования кристаллов, что может серьезно повлиять на структуры тканей и органов. Чтобы избежать перекрестного загрязнения, следует очистить емкость или пластину между замороженными образцами;

Примечание - Для заморозки в жидком азоте характерно возникновение эффекта Лейденфроста [11], вызванного кипением жидкого азота вокруг ткани, имеющей относительно высокую температуру. Это затрудняет передачу теплоты от образца к жидкому азоту; еще больше передача теплоты затруднена, если образец помещен в контейнер с наклеенной этикеткой.

c) получение замороженных срезов: Если необходима заморозка тканей для быстрой диагностики замороженных срезов, ткань следует немедленно транспортировать в лабораторию свежей. Выбранная часть образца должна быть заморожена на специализированных металлических решетках, которые устанавливают на криостат в подходящей морозильной среде. Использование той или иной морозильной среды следует задокументировать. Металлическая решетка, на которой располагается ткань, и морозильная среда замораживаются посредством погружения металла в жидкий азот или сухой лед до тех пор, пока ткань не будет заморожена. После получения замороженных срезов следует удалить остатки с металлической сетки, не допуская оттаивания, и поместить на длительное хранение в предварительно охлажденную пробирку.

Примечание 1 - Использование замораживающей среды может отрицательно сказываться на качестве масс-спектрометрии белков: разделительная колонка может стать менее отчетливой.

Примечание 2 - Пробы, помещенные в морозильную среду, следует хранить при температуре минус 70°C во избежание сушки; качество РНК каждой пробы, помещенной в морозильную среду, следует оценивать до использования.

Действия до, во время и после процедуры заморозки должны выполняться в соответствии со следующим алгоритмом:

a) задокументировать процедуру заморозки (например, заморозка в жидком азоте; мгновенная заморозка в изопентане, охлажденном жидким азотом или сухим льдом; заморозка в подходящей морозильной среде; заморозка с контролируемой скоростью охлаждения);

b) задокументировать время и дату заморозки (временной интервал равен промежутку времени между взятием из тела до замораживания образца или пробы);

c) убедиться до заморозки, что размер образца ткани, которую требуется заморозить, соответствует размеру выбранной криопробирки, поскольку размер ткани определяет размер тары; в связи с этим рекомендуется, чтобы образец не превышал 1 см в одном измерении;

d) контейнер для хранения образца в замороженном виде должен:

1) иметь достаточный объем для хранения образца или пробы данного размера,

2) быть сертифицирован для использования при температуре хранения,

3) надежно закрываться, лучше всего закручивающейся крышкой; контейнер с откидной крышкой использоваться не должна,

Примечание - Контейнер может взорваться при взятии образца или пробы при хранении в жидком азоте.

4) иметь маркировку, которая сохраняется в условиях хранения в заморозке,

e) маркировка должна соответствовать установленным условиям хранения в заморозке;

Примечание - Подходящими видами маркировки являются, например, самоклеящиеся этикетки, рукописная маркировка, радиочастотная идентификация (RFID), предварительно маркированная упаковка, которая была верифицирована для использования по назначению.

f) маркировка упаковки должна обеспечивать возможность отслеживать образцы и пробы надлежащим образом, следовательно, маркировка должна содержать следующую минимальную информацию:

1) о доноре/пациенте, у которого был взят образец; уникальный учетный номер образца/пробы и дату, когда он/она был/а взят/а; эта информация может быть оформлена в виде кода (уникального для каждого образца/пробы),

2) основные сведения о, например, типе ткани, состоянии ткани - поражена (например, опухолью) или нет - в случае, если система отслеживания проб не может отразить эту информацию при идентификации образца, использованного/ой в 6.3.3 f) 1),

3) уникальный учетный номер каждой упаковки [может быть включен в 6.3.3 f) 1)],

g) задокументировать типы, количество и описание образца (образцов).

Следует учитывать, что при некоторых заболеваниях, таких как опухоли, молекулярные особенности могут неодинаково наблюдаться во всем образце ткани. Поэтому важно, чтобы часть образца ткани, используемой для молекулярного исследования, оценивалась специалистом, имеющим медицинскую квалификацию (например, патологоанатом). В связи с этим следует отразить в документации, какой аспект заболевания фактически наблюдается в образце ткани, используемом для молекулярного исследования (например, различные молекулярные механизмы могут быть задействованы в центре или на периферии опухолевой ткани, также опухоли могут состоять из областей, для которых оценка дифференцировки варьируется).

6.4 Требования к хранению

Должна поддерживаться постоянная температура ниже или равной минус 70°C. Следует внедрить и использовать системы мониторинга и контроля.

Морозильные камеры или емкости с жидким азотом должны иметь систему оповещения об изменении температуры.

Во время извлечения образца (образцов) или проб могут возникать значительное изменение температуры. В связи с этим время извлечения следует сокращать настолько, насколько возможно, чтобы избежать оттаивания образцов.

Происходящие изменения температуры, которые могут привести к случайному оттаиванию образца (образцов) или пробы (проб), предназначенных для обработки или дальнейшего хранения, должны быть задокументированы.

Следует предусмотреть резервные криохранилища.

Расположение хранения, температура хранения, время и дата изъятия из системы хранения любых образцов или проб должны быть задокументированы.

6.5 Выделение РНК

6.5.1 Общие положения

Гистологическую характеристику клеточного состава и патологических изменений образца или его части следует выполнять (например, на срезах, окрашенных гематоксилином/эозином) в соответствии с признанной на международном уровне гистопатологической классификацией (например, классификация опухолей ВОЗ/МАИР [12]). Если образец или пробу используют для молекулярной диагностики, фракция клеток-мишеней должна быть оценена до выделения РНК. Количество клеток-мишеней должно быть достаточным для проведения исследования. Если образец или пробу используют не для диагностики, а, например, для изучения, рекомендуется использовать аналогичный подход.

Замораживание ткани может привести к разрушению клеточных мембран и органелл в ней. Как следствие, после оттаивания ферменты могут высвобождаться и проявлять активность, что может привести к разрушению РНК. Следовательно, не должно допускаться оттаивание образца или его части до их гомогенной дисперсии в лизирующем буфере, содержащем вещества, ингибирующие РНКазу. Образец или пробу следует тщательно измельчить или нарезать на мелкие части в замороженном состоянии и тщательно диспергировать в лизирующем буфере, содержащем вещества, ингибирующие РНКазу. Последующая гомогенизация замороженного образца или пробы в лизирующем буфере должна быть проведена сразу после помещения ткани в лизирующий буфер. Этот этап оказывает существенное влияние на стабилизацию целостности РНК и ее выхода, и его проведение следует контролировать лаборатории. Подходящие приборы для гомогенизации с целью выделения РНК из тканей имеются в продаже.

Альтернативный вариант - срезы, сделанные на криотоме (рекомендуемая толщина от 4 до 20 мкм), должны погружаться, еще будучи замороженными, непосредственно в лизирующие буферы, содержащие вещества, ингибирующие РНКазу.

Если обработанный образец или проба содержит морозильную среду, то это должно быть задокументировано.

6.5.2 Требования и рекомендации

a) Все материалы, которые могут контактировать с образцом или предметными стеклами, включая лизирующий буфер и пробирку, содержащую этот буфер, пробирки и инструменты, используемые в работе с замороженным образцом для приготовления криосреза или переноса в лизирующий буфер, не должны содержать нуклеазы. Все материалы (за исключением лизирующего буфера и пробирки, содержащей этот буфер) и инструменты, используемые в работе с замороженным образцом для криосреза или для ее переноса в лизирующий буфер, должны быть охлаждены до температуры ниже 0°C, а до использования должны храниться при температуре ниже или равной минус 20°C. Гистологи должны быть в перчатках. Соответствующие части микротома, включая многоразовое лезвие, должны очищаться после изготовления срезов каждого замороженного образца ткани/пробы. Следует рассмотреть возможность использования новых одноразовых лезвий на микротоме, чтобы избежать перекрестного загрязнения.

b) Если наблюдаются изменения в морфологии (например, из-за опухоли), это может повлиять на результаты исследования, поэтому необходимо использовать криосрезы для выделения РНК и проверять морфологию через каждые 50 мкм, делая срез для окрашивания гематоксилином и эозином.

c) Рекомендуется включение в процедуру выделения РНК стадии обработки ДНКазой. ДНКаза, другие реагенты и расходные материалы, вступающие в контакт с РНК, не должны содержать РНКазы.

d) Используемый метод, а также используемые в процессе наборы реагентов и номера партий необходимо задокументировать.

e) Извлеченную РНК следует хранить на влажном льду или при температуре от 2°C до 8°C (например, в блоке охлаждения), ее анализ следует проводить без промедления.

f) Чтобы избежать перекрестного загрязнения амплифицированным материалом при исследовании РНК, выделение РНК не следует проводить в том же месте, что и этапы амплификации, если не используется закрытая система, предназначенная для предотвращения перекрестного загрязнения.

Если есть сомнения в правильной идентификации образца или пробы, должна быть проведена верификация идентификации.

Выделение РНК является ключевым этапом диагностического рабочего процесса, которому должно быть уделено особое внимание во время валидации всего рабочего процесса.

Эффективность выделения РНК следует проверить в программе проверки квалификации РНК.

6.5.3 Использование промышленных наборов

При использовании наборов реагентов, находящихся в обращении и предназначенных для выделения белка из замороженных тканей, должны соблюдаться инструкции производителя по их использованию.

6.5.4 Использование собственных протоколов лабораторий

Если набор используют не в соответствии с его назначением, но в целях, определенных пользователем, должны быть написаны и использованы соответствующие инструкции пользователя.

Если лаборатория использует свой собственный протокол, отличающийся от протокола производителя набора, то должна быть проведена валидация в целях подтверждения, что он пригоден для этой цели.

Использование реагентов из наборов разных производителей может привести к ухудшению результатов, т.к. эти реагенты могут быть несовместимы. Следует использовать вместе компоненты для диагностического тестирования только в том случае, если компоненты совместимы и проведена валидация их совместной работы.

6.6 Количественная и качественная оценка выделенной РНК

Количество и качество РНК следует проверять в соответствии с инструкциями производителя диагностического набора или, если данные инструкции отсутствуют, с помощью общепринятых физических, химических и биохимических методов [13]-[15]. Возможно использование одного или нескольких из приведенных ниже методов, в зависимости от специфики исследования:

a) количественная оценка путем измерения оптической плотности (A260) или спектрофторометрия;

b) испытание на чистоту путем измерений оптической плотности (например, определение длины волны, отношение A260/A280);

c) тест на целостность РНК (например, с помощью электрофореза, хроматографии, молекулярных методов, таких как анализ 3 3’/5’ или соотношение длин ампликонов [16]-[18] или микрофлюидные методы для определения показателей качества [например, показатель целостности РНК (RIN), показатель качества РНК (RQI));

d) тест на присутствие интерферирующих веществ [с использованием внешнего контроля (с добавлением РНК- и ДНК-контроля) или проверкой кривых амплификации qPCR на аномалии] [19], [20] или использованием внутренней РНК для теста на ингибирование RT-PCR путем введения увеличивающихся объемов элюата в исследовании.

Примечание - Для качественных исследований, таких как на наличие или отсутствие РНК профиля, применение методов a) и b) может быть достаточным; для количественных исследований, таких как исследование генной экспрессии, может быть необходимо применение методов a)-d).

6.7 Хранение выделенной РНК

6.7.1 Общие положения

Для долгосрочного хранения выделенная РНК подвергается заморозке. Однако для сохранения РНК также могут быть использованы другие валидированные методы подготовки к хранению.

Для длительного хранения следует брать аликвоты выделенной РНК, чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания или повторного изъятия из других систем хранения. Аликвоты не следует дополнительно разбавлять, чтобы избежать снижения качества РНК.

Для хранения небольших количеств РНК следует использовать емкости с пониженной адсорбцией нуклеиновых кислот на стенке пробирки.

Следует избегать непреднамеренной лиофильной сушки, выделенной РНК во время длительного хранения, возникающей из-за испарения воды, так как РНК может разлагаться, а восстановление из емкости для хранения может быть трудным или даже невозможным. Поэтому во избежание испарения воды при длительном хранении следует использовать соответствующие емкости для хранения, такие как криопробирки. Тип емкости для хранения и тип крышки следует задокументировать.

Для долгосрочного хранения следует утвердить валидированный процесс выбора и уникальной маркировки тары для хранения выделенной РНК или полученных из нее аликвот.

Должна быть обеспечена возможность отслеживания, например, с помощью считываемых RFID, 1D- или 2D-штрихкодов или предварительно маркированных емкостей для хранения с уникальными кодами, предоставленными производителями, подходящими для низких температур хранения.

6.7.2 Использование промышленных наборов

До исследования следует соблюдать инструкции по хранению выделенной РНК, указанные поставщиком конкретного набора для выделения РНК. Если инструкции, разработанные в лаборатории медицинской организации, проводящей исследование, являются более строгими, то должны соблюдаться и они.

6.7.3 Использование собственных протоколов лабораторий

Если нет инструкций ни от поставщика набора для выделения РНК, ни от организации, проводящей исследование, или если используются собственные валидированные процедуры выделения РНК лаборатории следует немедленно провести анализ выделенной клеточной РНК; лаборатория должна использовать верифицированные процедуры [включая соответствующую среду хранения (например, вода, очищенная от РНКазы)] хранения выделенной РНК до аналитического этапа.

Примечание - В зависимости от процедуры выделения РНК и качества полученного элюата РНК, хранение на влажном льду в течение короткого периода времени (то есть, 1 ч) может быть допустимо при определенных обстоятельствах.

Для длительного хранения выделенную РНК следует элюировать в соответствующем буфере и хранить при температуре ниже или равной минус 70°C. Другие проверенные методы подготовки к хранению также могут быть использованы [21].

Примечание - Некоторые процедуры выделения РНК могут допускать хранение РНК при температуре от минус 20°C до минус 70°C.

Приложение A

(обязательное)

Влияние факторов, предшествовавших исследованию на профили РНК, полученной из замороженных образцов тканей печени, взятых во время и после плановых операций

A.1 Сравнение стабильных и нестабильных генов, определенных в условиях хранения

________________

Проводилось извлечение РНК и исследование всех сохраненных проб с использованием микрочипов. Были выбраны гены, в которых проявились изменения профиля РНК из-за предшествовавших исследованию факторов. Эти изменения были в дальнейшем валидированы с помощью полимеразной цепной реакцией в реальном времени.

В условиях хранения наблюдалось изменение реакции некоторых профилей РНК от пациента к пациенту, как показано на рисунке A.2 по сравнению со стабильным профилем РНК (см. рисунок A.1), выявленным в исследовании. Эти непредсказуемые изменения могут вызвать серьезные проблемы, например, в идентификации и выявлении биомаркеров. Следовательно, рабочий процесс, предшествующий исследованию, должен быть досконально проработан и задокументирован.

Во время разработки процедуры исследования требуется выяснить, не влияют ли действия, предшествующие исследованию, на конкретный профиль (профили) РНК, предназначенные для изучения.

Рисунок A.1 - Пример стабильного профиля РНК (A) у разных доноров в условиях хранения

Рисунок A.2 - Пример нестабильного профиля РНК (B) у разных доноров в условиях хранения

A.2 Рекомендации, основанные на результатах

Экспериментальное исследование показывает, что профили РНК могут стать нестабильными во время хирургического вмешательства. Этот эффект наблюдается только у небольшого процента индивидуальных профилей РНК, некоторые из которых играют роль в онкогенезе (данные не показаны). На профили РНК могут влиять многие факторы, возникающие во время хирургической процедуры, например, перевязка/пережатие сосудов, с которого начинается экстракорпоральная ишемия; после извлечения ткани из организма начинается период экстракорпорального хранения. Может иметь значение даже генетический фон донора. Поскольку эти факторы нельзя сделать одинаковыми во всех случаях или избежать, важно задокументировать эти параметры, имеющие место до начала исследования, как описано в настоящем стандарте.

Такая информация может использоваться для достоверной интерпретации последующих результатов исследования или для отбора проб таким образом, чтобы факторы, которые предположительно могут оказать влияние на результат, были одинаковыми. Таким образом, типологическая группа может быть пригодна для прохождения очень чувствительных тестов с участием генов, которые, как известно, нестабильны на этапе, предшествующем сбору. Эти данные могут быть документированы в больничной информационной системе, и специалистам, ответственным за сбор образцов, необходимо иметь доступ к этим данным и соотносить их с данными хранения.

Приложение ДА

(справочное)

Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов национальным стандартам

Таблица ДА.1

Библиография