ГОСТ Р ИСО 20391-2-2023 Биотехнология. Подсчет клеток. Часть 2. Планирование эксперимента и статистический анализ количественной оценки эффективности метода подсчета

        ГОСТ Р ИСО 20391-2-2023

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Биотехнология

ПОДСЧЕТ КЛЕТОК

Часть 2

Планирование эксперимента и статистический анализ количественной оценки эффективности метода подсчета

Biotechnology. Cell counting. Part 2. Experimental design and statistical analysis to quantify counting method performance

ОКС 07.080

Дата введения 2024-03-01

Предисловие

1 ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным бюджетным учреждением "Российский институт стандартизации" (ФГБУ "Институт стандартизации") на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 4

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 326 "Биотехнологии"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 10 августа 2023 г. N 632-ст

4 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 20391-2:2019* "Биотехнология. Подсчет клеток. Часть 2. Планирование эксперимента и статистический анализ количественной оценки эффективности метода подсчета" ("Biotechnology - Cell counting - Part 2: Experimental design and statistical analysis to quantify counting method performance", IDT).

Международный стандарт разработан Техническим комитетом ИСО/ТК 276 "Биотехнология" Международной организации по стандартизации (ИСО).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочного международного стандарта соответствующий ему национальный стандарт, сведения о котором приведены в дополнительном приложении ДА

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

6 Некоторые элементы настоящего стандарта могут являться объектами патентных прав

Правила применения настоящего стандарта установлены в статье 26 Федерального закона от 29 июня 2015 г. N 162-ФЗ "О стандартизации в Российской Федерации". Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе "Национальные стандарты", а официальный текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.rst.gov.ru)

Введение

Подсчет клеток влияет на многие аспекты биотехнологии, от биопроизводства до медицинской диагностики и передовой терапии. Подсчет клеток выполняет функции технологического контроля качества, или его результаты используют в процессе принятия решений. Подсчитанное количество клеток также является важным параметром многих анализов, включая оценку удельной активности и жизненного потенциала, которые часто нормализуют к подсчитанному количеству клеток для обеспечения возможности сравнения данных.

Обычно подсчитанное количество клеток выражают как концентрацию, отражающую общее количество клеток в популяции (общее количество клеток в суспензии) или субпопуляции (дифференциальное количество клеток). Развитие технологий приборостроения привело к появлению целого ряда методик и специальной аппаратуры для подсчета общего и/или дифференциального количества клеток. При отсутствии доступных стандартных образцов или экспериментально проверенных данных трудно определить точность метода измерений. Ситуацию усугубляет сложность приготовления биологических препаратов (например, поиск необходимых типов клеток, определение источников поставок и т.д.). Существуют несколько стандартов, устанавливающих методы подсчета количества клеток, отражающих специфику их конкретного применения или использования особых измерительных систем (см. ИСО 20391-1 и [16]). В некоторых из этих методов применяют подход сопоставимости, при котором результат каждого нового метода испытаний для подсчета количества клеток сравнивают с результатами, полученными при выполнении более распространенного метода подсчета. Но несмотря на то, что такой сопоставимый подход позволяет сравнивать данные новых исследований с результатами традиционных методов, он не отражает аспекты качества этих измерительных процессов [17]. В связи с отсутствием стандартных образцов или стандартных методов [17] остается необходимость разработки методов обеспечения качества определения количества клеток.

Настоящий стандарт устанавливает метод оценки аспектов качества определения количества клеток за счет использования серии разбавлений при проведении эксперимента. По этой схеме выбирают показатели качества для оценки эффективности метода определения количества клеток. В частности, показатели качества дают возможность оценить точность и пропорциональность метода определения количества клеток. Этот подход особенно полезен при невозможности определения точности (например, при отсутствии отслеживаемых связей со стандартным методом или стандартным образцом), а также он применим в общем плане к таким аспектам, как валидация и мониторинг качества процедуры определения количества клеток [17].

Требования, приведенные в настоящем стандарте, определяют достоверность данных выбранного метода определения количества клеток. Этот подход используют для выбора или оптимизации процесса измерения заданного клеточного препарата. Также этот подход позволяет получить вспомогательные параметры эффективности, которые можно использовать при аттестации характеристик эффективности конкретного метода определения количества клеток.

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод оценки аспектов качества определения количества клеток конкретного клеточного препарата посредством набора показателей качества, установленных на основании плана эксперимента с серией разбавлений и статистического анализа данных. В основе показателей качества лежат повторяемость измерений и степень соответствия результатов идеальной пропорциональной реакции на разбавление. Данный метод применяют к определению общего и дифференциального количеств клеток, а также к способам прямого и косвенного подсчетов при условии соответствия процедуры измерения критериям плана эксперимента (например, клетки, суспендированные в растворе).

Данный метод является наиболее подходящим в период разработки, оптимизации, валидации, оценки и/или верификации процедуры подсчета количества клеток.

Указанный метод применяют при отсутствии надлежащих стандартных образцов для оценки точности измерений. Однако, он напрямую не обеспечивает точность подсчета количества клеток.

Данный метод главным образом применяют для исследований эукариотических клеток.

Примечание - Существуют несколько международных и национальных стандартов, устанавливающих методы подсчета количества клеток, отражающих специфику их конкретного применения. При необходимости используют действующие стандарты при выполнении работ в рамках их области применения.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использована нормативная ссылка на следующий стандарт [для датированной ссылки применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированной - последнее издание (включая все изменения)]:

ISO 20391-1, Биотехнология. Подсчет клеток. Часть 1. Общее руководство по методам подсчета клеток

3 Термины, определения, обозначения и сокращения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями.

ИСО и МЭК ведут терминологические базы данных для использования в области стандартизации по следующим адресам:

- электропедия МЭК: доступна на http://www.electropedia.org/.

- платформа онлайн-просмотра ИСО: доступна на http://www.iso.org/obp.

3.1 Термины и определения

3.1.1 точность (измерения) (accuracy): Близость измеренного значения величины к истинному значению измеряемой величины.

[Руководство ISO/IEC Guide 99:2007, 2.13, с изменениями - примечания удалены]

3.1.2 смещение (измерения) (bias): Оценка систематической погрешности измерения.

[Руководство ISO/IEC Guide 99:2007, 2.18]

Примечание 1 - Систематическая погрешность измерения представляет собой составляющую погрешности измерения, которая остается постоянной или закономерно изменяется при повторных измерениях. Стандартным значением величины для систематической погрешности измерения является истинное значение величины или измеренное значение величины эталона с пренебрежимо малой неопределенностью измерений, или принятое значение величины.

Примечание 2 - Данный термин также определяют как разницу между ожидаемым результатом испытания и принятым стандартным значением (см. ИСО 3534-1).

3.1.3 концентрация клеток (cell concentration): Количество клеток на единицу объема.

Примечание 1 - Этот термин обычно используют для обозначения количества клеток в суспензии (например, количество клеток на миллилитр).

Примечание 2 - Термин "концентрация клеток" также относят к общему количеству клеток или количеству клеток определенной подсистемы в объеме жидкости (например, количество жизнеспособных клеток на миллилитр).

3.1.4 количество клеток (cell count): Дискретное число клеток.

Примечание 1 - Количество клеток, как правило, выражают в виде концентрации клеток.

3.1.5 подсчет клеток (cell counting): Измерительный процесс определения количества клеток.

3.1.6 клеточная суспензия (cell suspension): Клетки, диспергированные в жидкой среде.

3.1.7 продукты клеточного распада (в клеточной суспензии) (debris): Фрагменты клеток и/или частицы вещества биологического и не биологического происхождения.

3.1.8 дифференциальное количество клеток (differential cell count): Численность подмножества клеток, которые отличаются от других субпопуляций клеток, по крайней мере, одним отличительным признаком, идентифицированным в процессе измерения.

Примечание 1 - Концентрации, выведенные из дифференциального количества клеток, могут быть выражены в виде абсолютной концентрации или относительной величины (т.е. в процентах) по отношению к общей численности клеток или иной предварительно определенной популяции.

3.1.9 доля разбавления (dilution fraction): Доля снижения концентрации растворенного вещества в растворе по сравнению с первоначальной концентрацией.

Примечание 1 - Долю разбавления измеряют в диапазоне от 0 до 1.

Примечание 2 - Долю разбавления также называют "степенью разбавления" или "коэффициентом разбавления".

Пример - Степень снижения концентрации клеток (растворенное вещество) в клеточной суспензии (раствор) по сравнению с первоначальной концентрацией клеток в суспензии.

3.1.10 серия разбавлений (dilution series): Ряд растворов, имеющих последовательно повышающиеся или последовательно понижающиеся концентрации одного и того же вещества.

Примечание 1 - Серию разбавлений можно получить способом последовательного или индивидуального разбавления.

Примечание 2 - В отношении клеточной суспензии термин "серия разбавлений" означает ряд суспензий с последовательно повышающимися или последовательно понижающимися концентрациями клеток.

3.1.11 планирование эксперимента (experimental design): Процесс планирования исследования для достижения поставленных целей.

Примечание 1 - План распределения условий проведения эксперимента среди участников и статистический анализ выполнения этого плана. Обычно сюда входит определение независимых переменных величин, зависимых переменных величин, количества участников и метод отбора проб, порядок распределения участников по условиям эксперимента, а также последовательность выдачи тестовых заданий.

3.1.12 индивидуальное разбавление (independent dilution): Серия разбавлений, в которой каждый раствор готовят отдельно от других.

Примечание 1 - В общем, серию индивидуальных разбавлений готовят из общего базового раствора с учетом заранее заданной (или целевой) доли разбавления.

3.1.13 промежуточная прецизионность (intermediate precision): Один из наборов условий измерений, включающий применение одной и той же методики измерений, то же местоположение и выполнение повторных измерений на одном и том же или подобных объектах в течение длительного периода времени, а также другие условия, которые могут изменяться.

Примечание 1 - Изменения могут включать новые калибровки, калибраторы, измерительные системы, а также новых операторов.

Примечание 2 - Системная погрешность оператора относится, в частности, к ошибкам, допускаемым операторами в силу недостатка опыта работы.

[Руководство ISO/IEC Guide 99:2007, 2.22, с изменениями - удалено примечание 3]

3.1.14 предел количественного определения (содержания клеток); LoQ (limit of quantitation; LoQ): Наименьшее количество аналита в пробе, которое можно определить количественно конкретным аналитическим методом с требуемой прецизионностью и точностью.

Примечание 1 - Предел количественного определения описывает количественный анализ низких уровней клеток в матрицах пробы.

3.1.15 линейность (linearity): Способность получать результаты измерений, которые прямо или косвенно посредством конкретных математических преобразований будут пропорциональны количеству клеток в пределах заданного диапазона.

[[14], с изменениями]

Примечание 1 - Для подсчета клеток, термин "концентрация аналита" означает концентрацию клеток (общую или дифференциальную) в пробе.

Примечание 2 - Когда совокупность измерений демонстрирует линейность в диапазоне заданных входных параметров (при всех других неизменных входных параметрах и условиях измерений), ожидаемое значение измеряемой величины выражают как сумму постоянных составляющих систематической погрешности и входного параметра, помноженного на фиксированную константу.

3.1.16 измеряемая величина (measurand): Величина, подлежащая измерению.

[Руководство ISO/IEC Guide 99:2007, 2.3 с изменениями - удалены примечание и примеры]

3.1.17 измеренная доля разбавления (measured dilution fraction): Доля разбавления, измеренная с помощью поверенных приборов.

Примечание 1 - Например, количество жидкости можно проверить путем измерения массы жидкости (с учетом ее плотности) с использованием калиброванных и контролируемых весов надлежащей чувствительности.

3.1.18 процесс измерения (подсчет количества клеток) (measurement process): Весь процесс определения количества клеток.

Примечание 1 - Процесс измерения включает приготовление проб, системы измерений, параметры настройки [например, выбор апертуры, гейтирование (гейтинг) размера клеток, кратность увеличения, время подсветки и т.д.] и анализ данных.

3.1.19 прецизионность измерения (measurement precision): Близость между показаниями или измеренными значениями величины, полученными при повторных измерениях для одного и того же или аналогичных объектов при заданных условиях.

Примечание 1 - Прецизионность измерения обычно имеет числовое выражение в виде расхождения результатов, например стандартное отклонение, вариативность или коэффициент вариативности (CV) в заданных условиях измерения.

Примечание 2 - Термин "заданные условия" может означать, например повторяемость измерений, промежуточную прецизионность измерений или воспроизводимость измерений (см. ISO 5725-1).

[Руководство ISO/IEC Guide 99:2007, 2.15 с изменениями - удалены примечание 3 и примечание 4.]

3.1.20 пропорциональность (proportionality): Характеристика, демонстрируемая совокупностью измерений, в которой при изменении значения входного параметра (и неизменности всех других вводных и условий измерения) отношение ожидаемого значения измерения к значению этого входного параметра, при котором были произведены измерения, остается постоянным.

Примечание 1 - Для подсчета клеток, термин "концентрация аналита" означает концентрацию клеток (общую или дифференциальную) в пробе.

Примечание 2 - Если ряд измерений показывает пропорциональность на некотором диапазоне данного входного параметра, то ожидаемое значение измерений можно выразить как произведение входного параметра на фиксированную константу, в отсутствии систематической погрешности.

Примечание 3 - Когда ряд проведенных измерений демонстрирует пропорциональность в диапазоне заданных входных параметров, тогда Y = cX, где Y - ожидаемое значение измерений - выражают как входной параметр X, помноженный на фиксированную константу c, без составляющей систематической погрешности.

3.1.21 константа пропорциональности (proportionality constant): Постоянный множитель, напрямую соотносящий измеряемую величину и входной параметр.

3.1.22 индекс пропорциональности (подсчета клеток) (proportionality index): Мера отклонения от пропорциональности в экспериментальной схеме серии разбавлений.

Примечание 1 - Индекс пропорциональности PI является специфичным для клеточного препарата и подлежащего оценке подсчета клеток.

3.1.23 p-значение (p-value): Выходные данные для статистической проверки гипотезы

Примечание 1 - P-значение получают следующим образом: устанавливают распределение статистики при выполнении нулевой гипотезы, т.е. распределение статистики на основе предположения, что нулевая гипотеза верна. P-значение вычисляют на основании нулевого распределения как вероятности соблюдения тестовой статистики, имеющей такие же предельные значения или даже превышающие предельные значения тестовой статистики, полученной на основании фактических данных.

3.1.24 величина (quantity): Свойство материального объекта или явления, общее в качественном отношении для многих объектов или явлений, но в количественном отношении индивидуальное для каждого из них.

[Руководство ISO/IEC Guide 99:2007, 1.1 с изменениями - удалены примечания и примеры]

3.1.25 диапазон (range): Количественный интервал, ограниченный округленными или приблизительными предельными показателями.

3.1.26 стандартный образец; эталонный образец (reference material; reference standard): Материал, достаточно однородный и стабильный в отношении определенных свойств для того, чтобы использовать его при измерении или при оценивании качественных свойств в соответствии с предполагаемым назначением.

[Руководство ISO/IEC Guide 99:2007, 5.13 с изменениями - удалены примечания и примеры]

3.1.27 референтный метод; референтная процедура выполнения измерений (reference method; reference measurement procedure): Тщательно изученная методика измерений, дающая значения с неопределенностью измерения, соответствующей предполагаемому применению, особенно при оценке правильности других методик измерения для той же величины и при определении характеристик стандартного образца.

[Руководство ISO/IEC Guide 99:2007, 2.7]

3.1.28 повторяемость (repeatability): Прецизионность измерений в заданных условиях измерения.

Примечание 1 - Повторяемость также можно рассматривать как степень совпадения результатов последовательных измерений одной и той же измеряемой величины в тех же условиях [17].

3.1.29 остаточная погрешность (количественный анализ) (residual): Численная разница между наблюдаемым значением зависимой переменной и прогнозным значением.

3.1.30 проба (sample): Одна или несколько частей (материала), взятых из системы и предназначенных для того, чтобы получить информацию относительно системы.

Примечание 1 - Часто проба служит основанием для принятия решения в отношении системы или продукции.

Примечание 2 - Например, небольшое количество или аликвота клеточной суспензии, взятой из большого объема этого материала [17].

[ISO 15198:2004, 3.22 с изменениями - термин "популяция" заменен термином "система", добавлены примечания]

3.1.31 серийное разбавление (serial dilution): Поэтапное разбавление вещества в растворе, при котором снижение концентрации носит накопительный характер, то есть, уменьшение значения происходит при каждом последующем разбавлении.

Примечание 1 - В серийно разбавленных растворах количественные показатели всех растворов, кроме первого, находятся в зависимости от предыдущего разбавления.

3.1.32 базовый клеточный раствор (stock cell solution): Достаточно устойчивая (во времени) клеточная суспензия относительно высокой концентрации, пригодная для разбавления до уровня рабочих экспериментальных растворов.

3.1.33 систематическая погрешность (systematic error): Составляющая погрешности измерения, остающаяся постоянной или же закономерно изменяющаяся при повторных измерениях одной и той же величины.

Примечание 1 - Стандартным значением величины для систематической погрешности измерения является истинное значение величины или измеренное значение величины эталона с пренебрежимо малой неопределенностью измерений, или принятое значение величины

Примечание 2 - Систематическая погрешность измерения и ее причины могут быть известны или неизвестны. Для компенсации известной систематической погрешности может вводиться поправка.

Примечание 3 - Систематическая погрешность измерения равна разности погрешности измерения и случайной погрешности измерения.

[Руководство ISO/IEC Guide 99:2007, 2.17]

3.1.34 целевая доля разбавления (target dilution fraction): Доля разбавления, получаемая при добавлении заданного количества раствора.

3.1.35 испытательный образец (test sample): Небольшая аликвота, взятая из пробы материала и подготовленная для измерений заданным методом.

Примечание 1 - Обычно испытательные образцы являются репрезентативными образцами пробы, из которой проводят отбор материала, иногда их называют "репрезентативными испытательными образцами".

3.1.36 общий подсчет клеток (total cell count): Подсчет всех клеток, независимо от их характерных признаков.

3.1.37 точный подсчет; точное количественное значение (true count; true quantity value): Количественное значение, соответствующее определению термина "количество".

Примечание 1 - При подходе, основанном на прогнозируемой ошибке, точное количественное значение считают уникальной величиной, которую практически невозможно установить. Подход на основе неопределенности допускает, что, благодаря очевидному и неполному количеству элементов в описании термина "количество", не может быть установлено единое точное количественное значение, но возможно существование набора точных количественных значений, соответствующих определению. Однако, этот набор значений на практике установить невозможно. В других подходах полностью отсутствует понятие "точного количественного значения", исследователи применяют концепцию метрологической совместимости результатов измерений для оценки их адекватности.

Примечание 2 - В особых случаях, при наличии фундаментальной константы, считают, что "количество" имеет единое точное количественное значение.

Примечание 3 - Когда дефинициальную неопределенность, связанную с измеряемой величиной, считают ничтожной в сравнении с другими компонентами неопределенности измерения, считают, что измеряемая величина имеет "существенно уникальное" точное количественное значение. Этот подход принят в Руководстве ISO/IEC Guide 98-3 и сопутствующих документах, в которых слово "точный" считают излишним.

[Руководство ISO/IEC Guide 99:2007, 2.11 с изменениями - Документ "Руководство по погрешностям в измерении" (GUM) заменен на руководство "ISO/IEC Guide 98-3"]

3.1.38 валидация (validation): Подтверждение посредством представления объективных свидетельств того, что требования, предназначенные для конкретного использования или применения, выполнены.

[ISO 9000:2015, 3.8.13 с изменениями - удалены примечания]

3.1.39 вариативность (variability): Количественное выражение функции распределения вероятностей в отношении переменной величины, параметра или условия.

[ISO 16732-1:2012, 3.29]

3.2 Список сокращений и условных обозначений

Список сокращений и условных обозначений в порядке употребления

4 Сущность эксперимента

4.1 Общие положения

Высокая достоверность результатов подсчета клеток предполагает, что измерения выполняют с надлежащей точностью и прецизионностью [15]. Для контролируемой серии разбавлений можно использовать концепцию пропорциональности в качестве внутреннего стандарта, а отклонение от пропорциональности может служить альтернативой прямой оценки точности результатов [16]. В частном случае использование плана эксперимента и статистического анализа, показателей качества, описывающих отклонение от пропорциональности, и коэффициента вариативности CV оценивают для определения аспектов качества процесса подсчета клеток.

Показатели качества используют для оценки общего качества процесса подсчета клеток, когда процесс измерения включает приготовление и обработку проб, получение и обработку/корректировку данных.

В идеальной ситуации точность подсчета оценивают с использованием стандартного метода и/или эталонного образца с известным "точным" значением результата (дополнительная информация приведена в ИСО 5725-1 и ИСО 5725-2). При отсутствии надлежащего эталонного образца или недоступности стандартного метода качество подсчета клеток можно косвенно оценить по степени выдерживания или отклонения от фундаментального принципа пропорциональности, предполагающего, что количество подсчитанных клеток должно быть пропорционально доле разбавления DF в идеальных экспериментальных условиях. Отклонение от пропорциональности будет означать появление систематической ошибки измерения, снижающей общую степень достоверности подсчета.

Прецизионность подсчета клеток указывает на степень совпадения результатов, полученных при повторных измерениях того же самого или аналогичного клеточного препарата в заданных условиях. Экспериментальные данные, имеющие низкую прецизионность, но среднее значение результатов подсчета клеток, хорошо вписывающиеся в принцип пропорциональности, снижают качество процесса измерения. Низкая прецизионность измерений (то есть, большая случайная погрешность) может скрывать отклонения от пропорциональности.

4.2 Пропорциональность

Теоретические точные подсчеты образцов, взятых из общего, идеально гомогенизированного базового раствора, связаны между собой соответствующими долями разбавления в соответствии с формулой

Примечание - Погрешности измерений, значение которых увеличивается по мере разбавления раствора, не приведут к значительным изменениям пропорциональности и, следовательно, не будут обнаружены при выполнении анализа отклонений от пропорциональности.

4.3 Отклонение от пропорциональности

Отклонение от пропорциональности оценивают способом сложения отклонений обработанных данных подсчетов клеток от модели пропорциональности (см. рисунок 1).

Примечание - Это схематическое отображение гипотетического исследования с использованием пяти целевых долей разбавления и трех испытательных образцов на каждую долю разбавления.

Рисунок 1 - Схематическое отображение гипотетических результатов подсчета клеток по плану эксперимента с серией разбавлений

Остаточные погрешности e могут возникать как результат систематических погрешностей, случайных погрешностей или их комбинаций в процессе измерения. Функции остаточных погрешностей чувствительны к изменениям систематической погрешности и прецизионности.

Примечание - Оценка отклонения от пропорциональности посредством проверки гипотезы (получение p-значения), в которой нулевая гипотеза предполагает, что ожидаемые подсчитанные количества будут пропорциональны доле разбавления, а альтернативной гипотезой является более гибкая модельная оценка (например, линейная или квадратичная) p-значения, в настоящем документе не рассматривается, потому, что высокая случайная погрешность измерения снижает возможность обнаружения статистически значимых отклонений от пропорциональности.

5 План эксперимента

5.1 Общие положения

Выбор метода подсчета клеток, требования к процедуре выполнения измерений, вероятные источники неопределенности, требования к аттестации измерительного оборудования, валидации метода измерений и отчетности описаны в ИСО 20391-1.

Выбор метода подсчета клеток, валидацию метода измерений и подготовку отчетности необходимо выполнять в соответствии с ИСО 20391-1.

5.2 Требования к процессу подсчета клеток

Описанные в настоящем стандарте методы планирования эксперимента и статистического анализа используют для оценки качества процесса подсчета клеток, в котором испытательный образец находится в формате суспензии.

Этот метод применяют к процессам общего, дифференциального, прямого и косвенного подсчета клеток.

Примечание 1 - Если перед началом подсчета клетки требуют существенной подготовки, например в случае выращивания клеток в скоплениях, которые необходимо отделить друг от друга, эти этапы индивидуализации клеток считают частью процесса подсчета клеток. В этом случае базовый клеточный раствор содержит скопления клеток, который впоследствии будут разбавлять и делить на отдельные испытательные образцы. После чего, до начала измерений каждый отдельный испытательный образец проходит этапы обработки по разделению клеточных скоплений на отдельные клетки. В этом случае проблемы возникают с поддержанием целостности раствора, когда испытательные образцы содержат скопления клеток.

Примечание 2 - Если клетки находятся в погруженном состоянии в матрицу или держатся на поверхности, процедуру помещения клеток в формат суспензии не считают частью процесса подсчета клеток применительно к целям настоящего стандарта.

В случае процесса измерения, когда редкие клеточные явления или малые количества клеток будут подсчитывать относительно больших фоновых популяций клеток, применяют дополнительные требования, кроме выполнения планирования эксперимента и статистического анализа, описанных в настоящем стандарте.

5.3 Приготовление образцов для эксперимента

5.3.1 Общие положения

Тестовым материалом для планирования эксперимента должна быть клеточная суспензия. Клетки могут быть в состояниях, отражающих их поведение (то есть, одиночные клетки, клеточные скопления и клеточные агломераты).

Процедуры приготовления и обработки репрезентативных испытательных образцов для подсчета клеток должны быть оптимизированы для поддержания неизменности свойств испытательных образцов, необходимых для подсчета.

При приготовлении образцов следует избегать повреждений клеток, приводящих к потере способности участвовать в подсчете, а также не использовать методики, способствующие возникновению или снижению количества клеточного дебриса, который может помешать процессу подсчета или искусственно улучшить его параметры.

Примечание 1 - В [18]-[21] даны дополнительные руководства в отношении порядка приготовления образцов определенных типов клеток.

Процедуры приготовления образцов следует выполнять в течение времени и в условиях, обеспечивающих устойчивость свойств клеток, способных повлиять на процесс подсчета.

Примечание 2 - Образцы, содержащие живые клетки, динамичны и следовательно могут быть неустойчивы в отношении свойств, способных повлиять на процесс подсчета. Такие виды взаимодействия, как межклеточное взаимодействие и взаимодействие клеток с материалом, вызывают изменения в образцах, способные повлиять на процесс подсчета клеток.

Образцы для процесса дифференциального подсчета клеток (например, концентрации жизнеспособных клеток) имеют определенную степень неоднородности, на которую может повлиять процедура разбавления. Процедуры приготовления должны быть направлены на получение испытательных образцов, являющихся репрезентативными для неоднородности базового клеточного раствора.

Примечание 3 - У неоднородных образцов некоторые клетки могут испытывать на себе влияние условий культуры/среды в большей степени, чем другие, и в свою очередь влиять на репрезентативность испытательных образцов.

5.3.2 Базовый клеточный раствор

Для приготовления всех репрезентативных испытательных образцов необходимо использовать один и тот же базовый клеточный раствор. Дополнительные базовые растворы можно использовать при условии, что их концентрации и состав являются номинально эквивалентными.

Концентрацию клеток в базовом клеточном растворе следует оценивать по результатам одного и того же оцениваемого процесса измерений.

В сценарии использования системы, когда оценке подвергают несколько процессов измерений (см. приложение D), следует выбрать один процесс измерения для оценки стартовой концентрации клеток в базовом клеточном растворе и отразить это в протоколе.

Следует выбрать значение концентрации базового клеточного раствора для приготовления генерации реплицированных репрезентативных испытательных образцов по всему диапазону концентраций целевого использования в рамках процесса подсчета клеток.

Показатели качества, определенные по результатам выполнения методов подсчета, описанных в настоящем стандарте, являются специфичными для клеточного препарата (то есть, базового клеточного раствора), исследованного по схеме эксперимента. Следовательно, базовый клеточный раствор и репрезентативные испытательные образцы должны быть идентичны испытательным образцам, предназначенным для процесса измерения.

Необходимо поддерживать сходство характерных признаков клеточного препарата, способных повлиять на процесс подсчета клеток. В целях оценки качества процесса подсчета, характерными признаками, которые должны быть аналогичными у репрезентативных испытательных образцов данного плана эксперимента и у испытательных образцов, предназначенных для процесса измерения, считают состав суспензионной среды, присутствие остатков органических веществ, степень агрегирования клеток, неоднородность клеточной популяции, оптические характеристики клеток, морфологию клеток и т.д. (см. раздел "Библиография").

5.3.3 Доля разбавления согласно плану эксперимента

Иллюстрация обобщенного плана эксперимента с долями разбавления дана на рисунке 2. Дополнительные примеры приведены в приложениях C и D.

Выбирают надлежащий план (например, устанавливают количество долей разбавления DF, количество реплицированных репрезентативных испытательных образцов, количество измерений) на основании заданной цели и с учетом доступности образца и устойчивости репрезентативных испытательных образцов с течением времени эксперимента. Анализ мощности (то есть, способности исследования обнаружить альтернативную гипотезу при точности измерения) может помочь в выборе надлежащего плана [22]. Анализ неопределенности измерения также может облегчить выбор надлежащего плана эксперимента.

Если доступность образца и (или) его устойчивость являются ограничивающими факторами, план эксперимента должен в максимально возможной степени и в первую очередь определять количество долей разбавления, затем количество реплицированных репрезентативных испытательных образцов и в конечном итоге - количество параллельных наблюдений.

Рисунок 2 - Схема, отображающая примерный план эксперимента с долями разбавления для процесса подсчета клеток

5.3.4 Требования к получению долей разбавления

Разбавляющее вещество выбирают таким образом, чтобы оно обеспечивало устойчивость свойств репрезентативного испытательного образца, способных повлиять на процесс подсчета клеток, в течение всего времени исследования серии разбавлений.

Необходимо гарантировать, что доли разбавления получают в результате точной повторяемости процесса.

Перед приготовлением последовательно разбавленных растворов следует тщательно перемешать базовый клеточный раствор до образования однородной клеточной суспензии. Клеточные растворы следует разбавлять таким образом, чтобы минимизировать их вариативность.

Примечание 1 - Сокращение количества операций разбавления может свести до минимума вариативность разбавленных растворов.

Процесс разбавления не должен сопровождаться появлением органических остатков и (или) повреждением клеток.

Во избежание ошибок смешивания, возникающих при серийном разбавлении, каждую долю разбавления необходимо получать индивидуально из базового раствора. Способ серийного разбавления можно применять, если этот процесс понятен, а доли разбавления находятся в пределах заданных параметров или могут быть скорректированы посредством надлежащего моделирования.

Примечание 2 - Дополнительные общие указания по использованию пипеток приведены в [10] и в ИСО 8655-1, ИСО 8655-2 и ИСО 8655-6.

Необходимо обращать особое внимание на влияние погрешностей пипетирования на достоверность разбавления.

Примечание 3 - В контексте настоящего стандарта, термин "ошибка пипетирования" означает ошибку, возникающую вследствие неточного предположения об объемах суспензии, отмеряемых пипеткой при приготовлении репрезентативного испытательного образца. Ошибки из-за ненадлежащего смешивания или обработки образца не относятся к ошибкам пипетирования.

Влияние погрешностей пипетирования на достоверность разбавления следует оценить посредством отдельного исследования до начала выполнения плана эксперимента (предварительная оценка). В A.2 даны примерные процедуры предварительной оценки влияния ошибок пипетирования на достоверность разбавления.

Примечание 4 - В некоторых случаях желательно учитывать влияние ошибки пипетирования на значение DF для каждого испытательного образца по мере их получения для выполнения исследований серии разбавлений. Примеры: в случае ограниченного количества испытательных образцов для предварительной оценки или если предполагают, что ошибка пипетирования при получении долей разбавления может быть выше желаемой.

5.4 Маркировка испытательных образцов

Репрезентативные испытательные образцы необходимо маркировать с нанесением на них достаточной информации, обеспечивающей возможность их отслеживания до базового раствора и доли разбавления испытательных образцов.

Если процесс подсчета клеток предполагает ручные способы определения количества клеток (например, способ ручного подсчета клеток с использованием гемоцитометра) и (или) ручные способы идентификации клеток/клеточных популяций [например, ручное гейтирование (гейтинг) в проточной цитометрии], с целью снижения влияния человеческого фактора, репрезентативные испытательные образцы должны быть промаркированы таким образом, чтобы данные по разбавлению образцов и концентрациям клеток были обезличены для операторов, выполняющих измерения и (или) анализы.

5.5 Измерение испытательного образца

Измерения репрезентативных испытательных образцов необходимо проводить в течение времени и в условиях, обеспечивающих устойчивость репрезентативных испытательных образцов в плане сохранения их свойств, способных повлиять на процесс подсчета клеток в период выполнения исследования серии разбавлений.

Образцы для измерений должны быть получены из каждого репрезентативного испытательного образца в соответствии с процедурами, установленными для оцениваемого процесса подсчета клеток. Требования к приготовлению образцов для измерений приведены в ИСО 20391-1.

Перед приготовлением каждого образца для измерений репрезентативные испытательные образцы необходимо хорошо промешать.

Измерения проводят в соответствии с процедурами, установленными для оцениваемого процесса подсчета клеток. Процесс подсчета клеток включает приготовление образца (например, окрашивание, растворение, дизагрегация), обработку образца (например, пипетирование, смешивание), получение данных (например, настройка аппаратуры, загрузка образца) и обработку/корректировку данных [например, исправление совпадений, гейтирование (гейтинг), установка параметров визуального анализа]. Дополнительная информация приведена в ИСО 20391-1.

Измерения необходимо проводить таким образом, чтобы снизить влияние временного фактора.

Примечание - Произвольный порядок измерения образцов может снизить чувствительность PI и других показателей качества процесса подсчета клеток к систематическим временным эффектам.

Время, прошедшее между приготовлением конечного репрезентативного испытательного образца и выполнением каждого наблюдения, необходимо регистрировать документально для контроля непредусмотренных временных эффектов во время исследования серии разбавлений.

6 Статистические методы

6.1 Общие положения

Обобщенная функциональная диаграмма анализа данных приведена на рисунке 3.

Рисунок 3 - Диаграмма, иллюстрирующая процесс анализа для расчета показателей качества на основании плана эксперимента с серией разбавлений

6.2 Подсчет среднего количества клеток

6.3 Прецизионность измерений

Прецизионность измерений оценивают с использованием коэффициента вариативности CV повторяемости результатов параллельных наблюдений и выражают в процентах (% CV).

6.4 Сглаженная модель пропорциональности

Выбирают соответствующее допущение при моделировании соотношений средних значений отклонения для сглаживания модели пропорциональности.

Пропорциональность подсчитанных количеств клеток и долей разбавления оценивают с использованием метода взвешенных наименьших квадратов и допущенного соотношения средних значений отклонения.

Примечание - Количества клеток идеально моделируют с использованием допущения Пуассона для соотношения средних значений отклонения (вариативное значение равно среднему) вместо постоянного соотношения средних значений отклонения (метод обычных наименьших квадратов). Однако в биологических исследованиях данные подсчетов часто бывают "сверхразбросанными". В этих случаях, по закону распределения Пуассона, получают модели с заниженным значением вариативности данных. Можно рассмотреть другие варианты взаимоотношений между ожидаемым средним количеством подсчитанных клеток и ожидаемым вариативным количеством подсчитанных клеток. Например, квазипуассоновское соотношение средних значений отклонения (то есть, вариативность результатов параллельных наблюдений с фиксированной долей разбавления является пропорциональной (а не равной) ожидаемому результату с заданной долей разбавления) или вогнутое соотношение средних значений отклонения (то есть, вариативность параллельных наблюдений с фиксированной долей разбавления имеет большее значение при слабом и сильном разбавлении и меньшее значение при промежуточных разбавлениях). Для обоснования выбора конкретного соотношения среднего и вариативных значений проводят проверку по критерию согласованности ожидаемых и полученных данных.

Для каждого образца вычисляют прогнозное количество клеток на основании модели пропорциональности по формуле

6.5 Коэффициент детерминации

6.6 Индекс пропорциональности PI

6.6.1 Общие положения

Примечание 1 - Оценки на основании несглаженных остаточных погрешностей могут быть надлежащим показателем того, насколько близки результаты отдельных подсчетов клеток к их соответствующим идеальным значениям, по сравнению с систематической погрешностью в отклонении от пропорциональности. Даже после "сглаживания", отклонения от идеального поведения возникают в результате того, что пропорции смеси произвольной вариативности и систематической погрешности не известны, однако, оценка сглаженных остаточных погрешностей, по сравнению с оценкой отдельных остаточных погрешностей, снижает влияние случайной погрешности и дает более ясную картину систематической погрешности в отклонении от пропорциональности.

Примечание 2 - PI - это значение, специфическое для рассматриваемого процесса подсчета клеток, включая клеточный препарат, систему измерений, заданные настройки и корректировки данных, параметры обработки данных, процедуры отбора проб и выполнения измерений, а также план проведения эксперимента и метод статистического анализа, использованный при выведении значения PI (например, количество выполненных наблюдений и исследованных долей разбавления).

Примечание 3 - При вычислении значений PI в значительной степени полагаются на точность доли разбавления [допущение по формуле (2)]. Неучтенные случайные или систематические погрешности в долях разбавления повышают вариативность PI.

6.6.3 Вычисление индекса пропорциональности PI

Пользователь должен выбрать подход для вычисления значения PI на основании целевого использования результатов подсчета клеток.

В таблице 1 даны примеры подходов к вычислению значения PI.

Примечание - Значение PI может быть определено с использованием разных подходов, в каждом из которых делают разный упор на влияние каждой сглаженной остаточной погрешности.

Для выбора способа вычисления PI можно применять комбинацию подходов, соответствующих целевому применению.

Примеры формул для вычисления значений PI приведены в приложении C.

6.7 Дополнительный статистический анализ и параметры качества

Методы дополнительного статистического анализа, пригодные для целевого использования, можно применять к данным подсчетов клеток, полученным по результатам плановых экспериментов и используемым для выработки дополнительных параметров, применимых для оценки качества процесса подсчета клеток (например, линейности, промежуточной прецизионности, %CV по всем реплицированным репрезентативным испытательным образцам и т.д.). При регистрации дополнительных параметров в протоколе эксперимента им должны быть даны определения и описаны способы их получения.

6.8 Интерпретация данных

6.8.1 Общие положения

Показатели качества, полученные в результате эксперимента и статистического анализа данных, описанные в настоящем стандарте, позволяют оценить весь процесс подсчета клеток, включая процедуры приготовления образцов, обработки образцов, получения данных и обработки и корректировки данных. Показатели качества специфичны для процесса измерения и исследуемого клеточного образца.

6.8.2 Интерпретация %CV

Низкие значения %CV означают, что процесс подсчета клеток более точен. Для сравнения значений CV, полученных при разных измерительных процессах, можно использовать p-значение или доверительный интервал.

6.8.4 Интерпретация значений PI

Значения PI указывают на отклонение процесса подсчета клеток от пропорциональности. Значение PI частично используют для оценки качества процесса подсчета клеток, поскольку любое отклонение от пропорциональности свидетельствует о присутствии случайных или систематических погрешностей измерения. Например, низкая чувствительность процесса подсчета клеток или использование процесса подсчета клеток без соблюдения пределов количественной оценки могут привести к возникновению ошибок измерений, снижающих значения PI.

Для PI должны быть установлены требования на основании целевого применения результатов.

Индекс пропорциональности PI наиболее чувствителен к погрешностям измерений, которые не масштабируются при разбавлении. Погрешности измерений, масштабирующиеся пропорционально разбавлению, не приводят к существенным изменениям значений PI и должны оцениваться отдельно.

Примечание - Значения PI не подходят для оценки общей эффективности устройства подсчета клеток.

6.8.5 Сопоставление значений PI

Сопоставление значений PI применимо в случае использования одного и того же плана эксперимента с серией разбавлений (включая номинально аналогичную базовую концентрацию клеток) и одного и того же метода статистического анализа.

Значения PI сравнивают для оценки различий в отклонениях от пропорциональности между процессами подсчета клеток, между типами клеток и во времени.

Для получения среднего значения PI выполняют три или более оценок PI по общему плану эксперимента с серией разбавлений в аналогичных условиях с интервалами доверительности, обеспечивающими сравнение значений PI по всему процессу измерений.

Как альтернативный вариант, для оценки значимости различий между значениями PI по всему процессу подсчета клеток, при выполнении разовой оценки PI, применяют метод непараметрического бутстрэп-анализа для выработки интервалов доверительности для значений PI.

При выполнении непараметрического бутстрэп-анализа необходимо заранее установить предварительные условия, включая, например, количество бутсрэп-итераций и уровень доверительности; условия непараметрического бутстрэп-моделирования должны быть отражены в протоколе эксперимента (например, количество бутсрэп-итераций и уровень доверительности).

Примечание 1 - Непараметрический бутстрэп-анализ применяют, когда предварительные условия моделирования и выполненный анализ согласованы между собой.

Примечание 2 - Большое количество значений PI, полученных по результатам параллельных измерений Р/, используют для установления тенденций и (или) резко отклоняющихся значений для процесса подсчета клеток.

7 Отчетность

7.1 Регистрация показателей качества

Результаты подсчета клеток выражают в контексте концентрации клеток в единицах "клеток/мл".

Протокол должен содержать следующие показатели качества:

d) PI.

7.2 Документальное оформление плана эксперимента и метода статистического анализа

7.2.1 Протокол должен содержать информацию по плану эксперимента и методу статистического анализа для обеспечения возможности выполнения независимой оценки лицами, изучающими эти данные, но не принимавшими участие в исследовании, включая следующее:

a) описание исследованных систем подсчета клеток, включая следующее:

1) использованные в исследовании клеточные типы,

2) оцениваемые методы подсчета клеток,

3) исследованные диапазоны концентрации;

b) элементы плана эксперимента с долями разбавления, включая следующее:

c) метод оценки вкладов погрешностей пипетирования в надежность разбавления (например, предварительная оценка в соответствии с A.1 или измеренная гравиметрическим способом доля разбавления во время оценки значения PI в соответствии с A.2); когда делают предварительную оценку вкладов погрешностей пипетирования в надежность разбавления, то установленные пользователем критерии приемлемости вкладов погрешностей пипетирования в надежность разбавления должны быть зарегистрированы в протоколе эксперимента;

d) допущение по соотношению средних значений отклонения, использованное при подгонке модели пропорциональности;

e) формулу для подгонки модели пропорциональности [см. формулу (10)];

f) метод вычисления PI.

7.2.2 Дополнительные элементы отчетности по плану эксперимента и методу статистического анализа могут включать следующую информацию:

a) базовый клеточный раствор - концентрация и метод оценки концентрации;

b) план эксперимента - процесс получения разбавлений (например, этапы смешивания, разбавитель, индивидуальное или серийное разбавление), включая время, прошедшее после приготовления репрезентативного испытательного образца;

c) время выполнения каждого подсчета клеток и (или) время, прошедшее между приготовлением образца и получением результата измерения;

d) процедуры статистического анализа - дополнительные параметры, определение дополнительных параметров, обоснование выбора способа моделирования, параметры бутстрэп-моделирования;

e) неожиданные результаты, полученные во время выполнения плана эксперимента и статистического анализа.

7.3 Дополнительные элементы отчетности по процессу подсчета клеток

Дополнительные элементы отчетности по процессу подсчета клеток включают следующую информацию:

a) клетки - тип, количество пассажей или удвоений популяции, номер партии, источник получения;

b) реактивы - наименование, источник получения, номер партии, страна происхождения, человеческого или животного происхождения;

c) процесс измерения для метода подсчета клеток - включая аппаратуру, настройки приборов, приготовление образца, обработку данных.

Примеры оценки качества процесса подсчета клеток и соответствующих элементов отчетности приведены в приложениях D и E.

Приложение A

(справочное)

Метод оценки вклада погрешности пипетирования в надежность разбавления

A.1 Общие положения

В данном приложении термин "надежность разбавления" относится к вкладу погрешности пипетирования в надежность разбавления и не включает другие аспекты надежности разбавления. Данное приложение содержит примеры процедур для оценки надежности разбавления (в отношении погрешности пипетирования), применимые к настоящему стандарту.

A.2 Примерная процедура предварительной оценки вкладов погрешности пипетирования в надежность разбавления с использованием градуированной шкалы для получения точных расчетных значений объема при пипетировании.

A.2.1 Примерную процедуру, обозначенную для предварительной оценки надежности разбавления, также используют в качестве средства повышения надежности разбавления таким образом, чтобы итоговая процедура пипетирования, выбранная для выполнения плана эксперимента согласно настоящему стандарту, отвечала техническим требованиям пользователя. Кроме того, процедуру, обозначенную для предварительной оценки надежности разбавления, используют для тренировки операторов эксперимента, до начала выполнения процедур, предусмотренных в настоящем стандарте.

Ниже изложена примерная процедура предварительной оценки вкладов погрешности пипетирования в надежность разбавления.

Разбавление должен выполнять тот же оператор с использованием той же пипетки (или пипетки с таким же типом микродозатора), процедуры пипетирования, аналогичной той, что будет использована для оценки PI.

Разбавляемым образцом может быть один из следующих:

a) клеточная суспензия, аналогичная клеточной суспензии, по которой предполагают оценивать значение PI;

b) суспензионная среда, аналогичная клеточной суспензии, по которой предполагают оценивать значение PI.

Не рекомендуют использовать воду для разбавления намеченного образца, поскольку погрешность пипетирования для воды, как правило, ниже погрешности пипетирования клеточных суспензий.

Разбавитель должен быть аналогичен разбавителю, предполагаемому для использования при оценке значения PI.

Необходимо подобрать градуированную шкалу достаточной чувствительности для измерения массы пипетированной суспензии. При отсутствии подходящей шкалы можно использовать альтернативный способ для получения достоверных значений образца.

Например, градуированную шкалу с чувствительностью 0,0001 г можно использовать для получения точных значений объема образца до 0,01 мл (дополнительная информация приведена в ИСО 8655-2).

A.2.3 Определяют предварительно оцененную надежность разбавления

Для поддержания надежности разбавления при малой доле разбавления используют многоэтапный процесс разбавления. Например, образец большего объема можно получить из базового клеточного раствора, чем серийно разбавляемый для достижения желаемой целевой доли разбавления. Погрешность, возникающую на каждом этапе разбавления, следует учитывать при вычислении надежности разбавления.

Таблица A.1 - Примерная таблица для сбора данных и оценки надежности разбавления

A.3 Примерная процедура получения измеренного значения DF во время оценки PI, с использованием градуированной шкалы для достижения точных расчетных значений объема

A.3.2 Выполняют действия по схеме разбавления, установленной в плане эксперимента, для получения индивидуальных репрезентативных испытательных образцов при каждом целевом значении DF(dfj) для вычисления PI.

Необходимо подобрать градуированную шкалу достаточной чувствительности для измерения массы пипетированной клеточной суспензии и разбавителя. При отсутствии подходящей шкалы следует использовать альтернативный способ для получения достоверных значений образца.

Например, градуированную шкалу с чувствительностью 0,0001 г можно использовать для получения точных значений массы образца до 0,01 мл (дополнительная информация приведена в ИСО 8655-2).

Таблица A.2 - Примерная таблица для сбора данных и оценки измеренного значения DF для каждого репрезентативного испытательного образца

Приложение B

(обязательное)

Рисунок B.1 - Графическое отображение разных методов вычисления сглаженных остаточных погрешностей на основании целевого и измеренного значения долей разбавления (то есть метода, используемого для получения долей разбавления)

Общее количество коэффициентов, подгоняемых под модель гибкости, включая пересечение, равно количеству уникальных целевых долей разбавления l.

Например, в случае, когда план эксперимента предусматривает использование трех целевых долей разбавления (l = 3), применяют квадратичную модель после квазипуассоновского допущения распределения [см. формулу (B.1)]

Приложение C

(справочное)

Примерные формулы для вычисления PI

С.1 Подробный пример вычисления PI на основании суммы абсолютных значений масштабированных сглаженных остаточных погрешностей

C.3 Дополнительные примеры вычисления PI при использовании измеренных долей разбавления

В этих случаях, чем ближе значение PI к 0, тем больше описание процесса измерения будет содержать признаков пропорциональности.

Приложение D

(справочное)

Сценарий 1. Оценка качества разового процесса подсчета клеток

D.1 Общие положения

D.2 Описание плана эксперимента и метода статистического анализа

В данном примере исследованы пять целевых долей разбавления с тремя индивидуальными реплицированными репрезентативными испытательными образцами на каждую долю разбавления. Было выполнено три подсчета общего количества клеток с использованием метода 2; подсчитывали клетки типа A для каждого реплицированного репрезентативного испытательного образца. Бирки прикрепили к образцам в произвольном порядке, а репрезентативные испытательные образцы измеряли в порядке нумерации бирок. Для аналитика, выполнявшего общий подсчет клеток, образцы были обезличенными. Измеренную долю разбавления получили во время приготовления индивидуальных реплицированных испытательных образцов. Далее для анализа PI использовали измеренную долю разбавления, как указано в A.2 и приложении B. См. рисунок D.1.

Рисунок D.1 - Схематическое отображение плана эксперимента для примера 1 с подсчетом клеток по методу 2; подсчет общего количества клеток типа A

Общее количество клеток было смоделировано с использованием квазипуассоновского допущения (среднее значение пропорциональное отклонению) для соотношения средних значений отклонения. 95%-ные интервалы доверительности CI были определены расчетным путем с использованием непараметрического бутстрэп-анализа с 200 итерациями.

D.3 Исходные данные и анализ данных для сценария 1

Таблица исходных данных для сценария 1 приведена по интернет адресу: https://standards.iso.org/iso/20391/-2/ed-1/en. Общее представление о данных и остаточных погрешностях из сглаженной модели пропорциональности дано на рисунке D.2.

D.4 Примерный протокол эксперимента для сценария 1

D.4.1 Показатели качества (элементы отчетности - см. 7.1):

Рисунок D.2 - Подгонка модели пропорциональности под данные серии разбавлений с использованием измеренной доли разбавления

d) Индекс пропорциональности PI [см. 7.1, d)], представляющий систематическое отклонение от сглаженной модели пропорциональности, дан в таблице D.4.

Таблица D.4 - Индекс пропорциональности PI

D.4.2 Документация по параметрам плана эксперимента и методу статистического анализа (элементы отчетности для 7.2):

a) описание исследованной системы подсчета клеток:

1) тип клеток в исследовании: клетки типа A;

2) оцениваемые методы подсчета клеток: метод 2 (общая концентрация клеток);

3) исследованный диапазон концентраций: приблизительно от 108000 клеток/мл до 950000 клеток/мл согласно оценки по методу 2;

b) описание элементов плана эксперимента с долями разбавления

2) количество n реплицированных испытательных образцов j при каждой dfj (см. таблицу D.5);

Таблица D.5 - Количество n реплицированных испытательных образцов j при каждой dfj

c) описание метода оценки вкладов погрешности пипетирования в надежность разбавления:

2) для получения результатов измерения массы использовали градуированную шкалу с чувствительностью до 0,0001 г;

Таблица D.7 - Измеренная доля разбавления для каждого испытательного образца

d) описание допущения, использованного для моделирования отношения средних значений отклонения в сглаженной модели пропорциональности: допущение для соотношения средних значений отклонения: вариативность пропорциональна среднему значению;

Таблица D.8 - Формула для подгонки модели пропорциональности

f) Описание метода, использованного для вычисления PI:

D.4.3 Дополнительные элементы отчетности согласно 7.2 и 7.3 по плану эксперимента, методу статистического анализа и процедуре подсчета клеток:

a) описание базового клеточного раствора:

1) базовый раствор: базовый раствор 1,

2) суспендирующая среда: полная среда MEM с 10% FBS,

3) концентрация базового раствора (клеток/мл): приблизительно 923700,

4) метод оценки концентрации базового раствора: метод 2;

b) описание способа разбавления:

1) разбавитель: полная среда MEM с 10% FBS,

2) индивидуальные разбавления в произвольном порядке экстракции из базового раствора,

3) измеренные доли разбавления, полученные во время приготовления образца;

c) описание типа клеток и концентрации клеток:

1) тип клеток: клетки типа A, перенос 3,

2) метод подсчета: метод 2, полная концентрация клеток;

d) описание получения испытательного образца и порядка измерений:

1) порядок экстракции из базы (порядок получения): 2; 1; 3; 6; 4; 5; 8; 9; 7; 11; 12; 10; 14; 15; 13,

2) случайный номер образца (порядок измерений): 3; 6; 15; 1; 12; 14; 7; 10; 4; 13; 11; 5; 9; 2; 8;

e) описание установок непараметрического бутстрэп-анализа:

1) количество выполненных итераций бутстрэп-анализа: 200,

2) уровень доверительности для бутстрэп-анализа: 0,95;

f) описание дополнительных параметров для оценки пропорциональности приведено в таблице D.9.

Таблица D.9 - Дополнительные параметры для оценки пропорциональности

D.5 Интерпретация

Приложение E

(справочное)

Сценарий 2. Сопоставление качества нескольких процессов подсчета клеток

E.1 Общие положения

E.2 Описание плана эксперимента и статистического анализа

В данном сценарии были смоделированы четыре процесса подсчета клеток в силиконовом растворе для демонстрации пропорциональных/непропорциональных ответных реакций, а также прецизионных/непрецизионных ответных реакций. Всего были смоделированы пять целевых долей разбавления и по три индивидуальных реплицированных репрезентативных испытательных образца на каждую долю разбавления. Результаты этих моделированных подсчетов общего количества клеток были собраны с использованием следующих методов моделирования: метода 5, метода 6, метода 7 и метода 8, для моделированного типа клеток каждого реплицированного репрезентативного испытательного образца. Также были смоделированы погрешность пипетирования и сделана предварительная оценка доли разбавления. Согласно этой предварительной оценке доля разбавления отвечала критериям, установленным пользователем, а при определении качественных показателей использовали значение целевой доли разбавления.

Данные по общему подсчитанному количеству клеток моделировали с использованием квазипуассоновского допущения (среднее значение пропорциональное отклонению) для соотношения средних значений отклонения. 95%-ные интервалы доверительности были определены расчетным путем с использованием непараметрического бутстрэп-анализа с 200 итерациями. См. рисунок E.1.

Рисунок E.1 - Схематическое отображение плана эксперимента для сценария 2 сопоставления моделированных методов общего подсчета моделированного типа клеток

E.3 Исходные данные и анализ данных для сценария 2

Таблица исходных данных для сценария 2 приведена по интернет адресу: https://standards.iso.org/iso/20391/-2/ed-1/en.

Таблица E.1 - Исходные данные для предварительной оценки вкладов погрешности пипетирования в надежность разбавления с подгонкой модели пропорциональности и коэффициентом детерминации для надежности разбавления

Обзор данных и значений остаточной погрешности из сглаженной модели пропорциональности приведен на рисунке E.3.

E.4 Примерный протокол эксперимента для сценария 2

E.4.1 Показатели качества (элементы отчетности из 7.1):

d) индекс пропорциональности PI [см. 7.1d)], представляющий систематическое отклонение от сглаженной модели пропорциональности, приведен на рисунке E.7 и в таблице E.5.

X - доля разбавления; Y - концентрация клеток (клеток/мл); A - сглаженная модель пропорциональности после усреднения результатов параллельных наблюдений (клеток/мл); B - исходные значения остаточных погрешностей из модели пропорциональности (клеток/мл); C - сглаженные остаточные погрешности из модели пропорциональности (клеток/мл)

Рисунок E.3 - Сглаживание модели пропорциональности по данным серии разбавлений для каждого метода в сценарии 2

Примечание - Планки погрешности представляют 95% CI по результатам непараметрического бутстрэп-анализа для моделированных методов подсчета клеток.

Примечание - Планки погрешности представляют 95% CI по результатам непараметрического бутстрэп-анализа для моделированных методов подсчета клеток.

Рисунок E.7 - Индекс пропорциональности (PI) на основании суммы абсолютных значений масштабированных сглаженных остаточных погрешностей для моделированного типа клеток и общей концентрации клеток

Таблица E.5 - Индекс пропорциональности

E.4.2 Документация по параметрам плана эксперимента и метода статистического анализа (элементы отчетности для 7.2):

a) описание исследуемых систем подсчета клеток, включая:

1) типы клеток, использованных в исследовании: моделированный тип клеток,

2) оцениваемые методы подсчета клеток: метод 5, метод 6, метод 7, метод 8 (общая концентрация клеток),

3) исследуемые диапазоны концентраций: приблизительно от 240000 клеток/мл до 2200000 клеток/мл в соответствии с оценкой по методу 5;

b) описание элементов плана эксперимента с долями разбавления:

c) описание метода оценки вкладов погрешностей пипетирования в надежность разбавления:

1) вклады погрешности пипетирования в надежность разбавления предварительно оценивают в соответствии с А.1 (моделирование);

2) использованная суспензия для представления клеточного образца не применима (моделирование);

3) использованная суспензия для представления клеточного образца не применима (моделирование);

7) результаты предварительной оценки надежности разбавления даны в таблице E.8:

Таблица E.8 - Установленные пользователем критерии допустимости вклада погрешности пипетирования в надежность разбавления

d) описание допущения, использованного для моделирования соотношения средних значений отклонения при подгонке модели пропорциональности; предположение для соотношения среднего значения и значения вариативности пропорционально среднему значению;

f) описание метода вычисления PI:

E.4.3 Дополнительные элементы отчетности из 7.2 и 7.3 по плану эксперимента, методу статистического анализа и процессу подсчета клеток:

a) описание базового клеточного раствора:

1) базовый раствор не применим (смоделирован);

2) суспендирующая среда не применима (смоделирована);

3) концентрация базового раствора (клеток/мл): приблизительно 2500000;

4) метод оценки концентрации клеточного раствора: метод 5;

b) описание метода разбавления:

1) разбавитель не применим (смоделирован);

2) индивидуальные разбавления (смоделированы);

c) тип клеток и тип концентрации:

1) тип клеток: смоделированный тип клеток,

2) тип концентрации: общая концентрация клеток;

d) получение испытательных образцов и порядок измерений:

1) порядок экстрагирования базового раствора (порядок получения образцов) не применим (смоделирован);

2) нумерация образцов в случайном порядке (порядок нумерации) не применима (смоделирована);

e) настройки непараметрического бутстрэп-анализа:

1) количество выполненных бутстрэп-итераций: 200;

2) уровень доверительности бутстрэп-анализа: 0,95.

E.5 Сопоставление методов подсчета клеток в сценарии 2

E.5.1 Сопоставление показателей качества методов подсчета клеток

E.6 Интерпретация

Каждый метод в сценарии 2 можно оценивать индивидуально согласно описанию в D.4.

Методы 7 и 8 продемонстрировали значительно более высокое значение отклонения от пропорциональности, чем методы 5 и 6.

E.7 Согласованность результатов с основополагающей имитационной моделью

Моделированные в сценарии 2 методы подсчета клеток имеют параметры основополагающей модели, приведенные в таблице E.12 и на рисунке E.8.

Таблица E.12 - Параметры моделированных методов подсчета моделированного типа клеток в варианте использования 2

X - доля разбавления; Y - концентрация клеток (клеток на мл); М5 - метод 5; М6 - метод 6; М7 - метод 7; М8 - метод 8

Примечание - Пунктирные линии обозначают доверительный интервал 95%.

Рисунок E.8 - Графическое отображение основополагающих моделей для имитированных методов подсчета клеток в сценарии 2

Приложение ДА

(справочное)

Сведения о соответствии ссылочного международного стандарта национальному стандарту

Таблица ДА.1

Библиография