allgosts.ru67. ПРОИЗВОДСТВО ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ67.050. Общие методы проверки и анализа пищевых продуктов

ГОСТ EN 14663-2014 Продукция пищевая. Определение витамина В с индексом 6 (включая гликозилированные формы) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Обозначение:
ГОСТ EN 14663-2014
Наименование:
Продукция пищевая. Определение витамина В с индексом 6 (включая гликозилированные формы) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Статус:
Действует
Дата введения:
01.06.2017
Дата отмены:
-
Заменен на:
-
Код ОКС:
67.050

Текст ГОСТ EN 14663-2014 Продукция пищевая. Определение витамина В с индексом 6 (включая гликозилированные формы) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии


ГОСТ EN 14663-2014



МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКЦИЯ ПИЩЕВАЯ

Определение витамина (включая гликозилированные формы) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии


Foodstuffs. Determination of vitamin (including its glycosylated forms) by high performance liquid chromatography method



МКС 67.050

Дата введения 2017-06-01



Предисловие


Цели, основные принципы и порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Научно-производственным республиканским унитарным предприятием "Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации" (БелГИСС) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 25 июня 2014 г. N 45)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Код страны по
МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Беларусь

BY

Госстандарт Республики Беларусь

Киргизия

KG

Кыргызстандарт

Молдова

MD

Молдова-Стандарт

Россия

RU

Росстандарт

Таджикистан

TJ

Таджикстандарт

Узбекистан

UZ

Узстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 июня 2016 г. N 733-ст межгосударственный стандарт ГОСТ EN 14663-2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июня 2017 г.

5 Настоящий стандарт идентичен европейскому стандарту EN 14663:2005* "Продукты пищевые. Определение витамина (включая гликозилированные формы) с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии" [("Foodstuffs - Determination of vitamin (including its glycosylated forms) by HPLC", IDT].
________________
* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым здесь и далее по тексту, можно получить, перейдя по ссылке на сайт . - .


Европейский стандарт разработан Техническим комитетом по стандартизации CEN/TC 275 "Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы" Европейского комитета по стандартизации (CEN).

При применении настоящего стандарта рекомендуется вместо ссылочного европейского стандарта использовать межгосударственный стандарт, сведения о котором приведены в дополнительном приложении ДА

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ


Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

1 Область применения

1 Область применения


Настоящий стандарт устанавливает метод определения витамина в пищевой продукции с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Витамин определяется как сумма пиридоксина, пиридоксаля, пиридоксамина, включая их фосфорилированные производные, а также -гликозилированные формы, в пересчете на пиридоксин.

Настоящий метод был успешно проверен на манной крупе с молоком (детское питание), картофельном пюре, овощах с ветчиной (типичная пищевая продукция) и мультивитаминном напитке в диапазоне концентраций от 0,034 мг/100 г до 1,210 мг/100 г.

2 Нормативные ссылки


Для применения настоящего стандарта необходим следующий ссылочный стандарт*. Для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта (включая все его изменения).
________________
* Таблицу соответствия национальных стандартов международным см. по ссылке. - .

EN ISO 3696 Water for analytical laboratory use - Specification and test methods (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)

3 Сущность метода


Производные витамина (пиридоксаль, пиридоксамин и пиридоксин) извлекают из пищевой продукции путем кислотного гидролиза, затем подвергают ферментативному воздействию: дефосфорилируют, используя кислую фосфатазу, и дегликозилируют, используя -глюкозидазу.

Полученные производные витамина разделяют и количественно определяют методом ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием ([1], [2]).

4 Реактивы

4.1 Общие положения

В ходе анализа используют только реактивы признанной аналитической чистоты и воду не ниже первой степени чистоты в соответствии с EN ISO 3696 или бидистиллированную воду.

4.2 Фосфат калия двузамещенный, массовая доля ()99,9%.

4.3 Ацетат натрия безводный, ()99,0%.

4.4 Трихлоруксусная кислота (ТХУ), ()99,0%.

4.5 Раствор ацетата натрия молярной концентрацией () = 2,5 моль/дм

205 г ацетата натрия (см. 4.3) растворяют в 1 дм воды.

4.6 Реагент послеколоночный (дополнительно), раствор с концентрацией () = 0,15 моль/дм.

Растворяют 34,2 г фосфата калия двузамещенного (см. 4.2) в воде, доводят до 1000 см, перемешивают и дегазируют.

4.7 Соляная кислота, (HCI) = 1 моль/дм.

4.8 Соляная кислота, (HCI) = 0,1 моль/дм.

4.9 Соляная кислота, (HCI) = 0,2 моль/дм.

4.10 Серная кислота, () = 1 моль/дм.

4.11 Эфир петролейный, диапазон кипения от 40°С до 60°С.

4.12 Фосфатаза кислая из картофеля. Ферментативная активность составляет около 5,3 U/мг.
_______________

U - данная единица измерения (международная или стандартная единица) определяется количеством фермента, который катализирует трансформацию 1 мкмоль субстрата в минуту при стандартных условиях.


Необходимо, чтобы используемый фермент с положительным результатом проходил проверку ферментативной активности согласно 4.13.2 (более подробная информация приведена в [2], [7]).

4.13 Раствор кислой фосфатазы

4.13.1 Общие положения

Растворяют 60 мг кислой фосфатазы (см. 4.12) в 10 см воды в конической колбе, перемешивая в течение 2 мин.

Раствор готовят в день проведения анализа.

4.13.2 Проверка ферментативной активности кислой фосфатазы

Взвешивают 10 г свинины, 5 г картофельного пюре или 5 г муки из цельного зерна в конической колбе и экстрагируют кислотой, как описано в 6.2.1. Добавляют к 12,5 см раствора экстрагированной пробы 1 см раствора кислой фосфатазы (см. 4.13.1) и опционально 1 см раствора -глюкозидазы (см. 4.15) и перемешивают. Инкубируют раствор в течение не менее 12 ч или в течение ночи при температуре 37°С при постоянном перемешивании. Повторяют эту операцию с двойным количеством раствора кислой фосфатазы.

Определяют массовую концентрацию витаминов в соответствии с 6.6. Ферментативная активность используемого фермента считается достаточной, если значения массовой концентрации соединений витамина в обоих растворах пробы эквивалентны. На хроматограмме должен отсутствовать пик фосфата пиридоксамина.

Примечание - Для межлабораторного испытания использовали кислую фосфатазу производства Sigma Nr Р 3752.
_______________
Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой указанного продукта со стороны CEN. Допускается использовать аналогичную продукцию, если она позволяет получать сопоставимые результаты.

4.14 -глюкозидаза из миндаля с ферментативной активностью приблизительно 3,2 U/мг

Необходимо, чтобы используемый фермент с положительным результатом проходил проверку ферментативной активности согласно 4.15.2 (более подробная информация приведена в [2], [7]).

4.15 Раствор -глюкозидазы

4.15.1 Общие положения

Растворяют 100 мг -глюкозидазы (см. 4.14) в 10 см воды в конической колбе, перемешивая в течение 2 мин.

Раствор готовят в день проведения анализа.

4.15.2 Проверка ферментативной активности -глюкозидазы

Взвешивают 10 г свинины, 5 г картофельного пюре или 5 г муки из цельного зерна в конической колбе и экстрагируют кислотой, как описано в 6.2.1. Добавляют к 12,5 см раствора экстрагированной пробы 1 см раствора кислой фосфатазы (см. 4.13.1) и 1 см раствора -глюкозидазы (см. 4.15.1) и перемешивают. Инкубируют раствор в течение не менее 12 ч или в течение ночи при температуре 37°С при постоянном перемешивании. Данную операцию повторяют с двойным количеством раствора -глюкозидазы.

Определяют массовую концентрацию витаминов в соответствии с 6.6. Ферментативная активность используемого фермента считается достаточной, если значения массовой концентрации соединений витамина в обоих растворах пробы эквивалентны. На хроматограмме должен отсутствовать пик фосфата пиридоксамина.

Примечание - Для межлабораторного испытания использовали кислую фосфатазу Sigma Nr G-0395.
_______________
Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой указанного продукта со стороны CEN. Допускается использовать аналогичную продукцию, если она позволяет получать сопоставимые результаты.

4.16 Подвижная фаза для ВЭЖХ (серная кислота, () = 0,015 моль/дм, содержащая 0,005 моль/дм трихлоруксусной кислоты)

(817±5) мг трихлоруксусной кислоты (см. 4.4) растворяют в 15 см серной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм (см. 4.10), переливают в мерную колбу вместимостью 1000 см, объем содержимого в колбе доводят до метки водой, перемешивают и дегазируют.

4.17 Силиконовое масло для удаления пены.

4.18 Образцы сравнения

4.18.1 Общие положения

Пиридоксамин (РМ), пиридоксаль (PL) и пиридоксин (PN) могут быть получены у различных поставщиков. Чистота образцов сравнения может варьироваться, поэтому необходимо определить их концентрацию и чистоту (см. 4.19.4 и 4.20.7).

4.18.2 Пиридоксамина (РМ) дигидрохлорид, ()98%.

4.18.3 Пиридоксаля (PL) гидрохлорид, ()98%.

4.18.4 Пиридоксина (PN) гидрохлорид, ()98%.

4.19 Исходные растворы

4.19.1 Исходный раствор пиридоксамина (РМ), массовой концентрацией (РМ) приблизительно 500 мкг/см

71,7 мг пиридоксамина дигидрохлорида (см. 4.18.2) растворяют в соляной кислоте молярной концентрацией 0,1 моль/дм (см. 4.8) в мерной колбе вместимостью 100 см, объем содержимого в колбе доводят до метки этим же раствором соляной кислоты.

Срок хранения раствора - 1 неделя при температуре 4°С или 2 мес при температуре минус 18°С.

4.19.2 Исходный раствор пиридоксаля (PL) массовой концентрацией (PL) приблизительно 500 мкг/см

60,9 мг пиридоксаля гидрохлорида (см. 4.18.3) растворяют в соляной кислоте молярной концентрацией 0,1 моль/дм (см. 4.8) в мерной колбе вместимостью 100 см, объем содержимого в колбе доводят до метки этим же раствором соляной кислоты.

Срок хранения раствора - 1 неделя при температуре 4°С или 2 мес при температуре минус 18°С.

4.19.3 Исходный раствор пиридоксина (PN), массовой концентрацией (PN) приблизительно 500 мкг/см

60,8 мг пиридоксина гидрохлорида (см. 4.18.4) растворяют в соляной кислоте молярной концентрацией 0,1 моль/дм (см. 4.8) в мерной колбе вместимостью 100 см, объем содержимого в колбе доводят до метки этим же раствором соляной кислоты.

Срок хранения раствора - 1 неделя при температуре 4°С или 2 мес при температуре минус 18°С.

4.19.4 Определение концентраций растворов

Отбирают пипеткой 1 см исходного раствора пиридоксамина (см. 4.19.1), пиридоксаля (см. 4.19.2) и пиридоксина (см. 4.19.3) соответственно в мерные колбы вместимостью 50 см и содержимое колб доводят до метки 0,1 моль/дм HCI (см. 4.8). Измеряют оптическую плотность растворов в кювете из кварцевого стекла с толщиной поглощающего слоя 1 см при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения относительно 0,1 моль/дм HCI (см. таблицу 1).


Таблица 1 - Примеры молярных коэффициентов поглощения соединений витамина

Соединение

Растворитель

, ммоль см

, г/моль

F

PM·2HCI

0,1 моль/дм HCI, рН ~1

292

8,2

241,1

0,698

PL·HCI

0,1 моль/дм HCI, рН ~1

288

9,0

203,6

0,821

PN·HCl

0,1 моль/дм HCI, рН ~1

291

8,6

205,6

0,823

PM·2HCI - Пиридоксамина дигидрохлорид (4.18.2).

PL·HCI - Пиридоксаля гидрохлорид (4.18.3).

PN·HCI - Пиридоксина гидрохлорид (4.18.4).


Массовую концентрацию пиридоксамина, пиридоксаля и пиридоксина в исходных растворах , мкг/см, вычисляют, используя молярный коэффициент поглощения, по формуле

, (1)


где - значение оптической плотности растворов пиридоксамина, пиридоксаля и пиридоксина при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения (см. таблицу 1);

- молярная масса образцов сравнения РМ, PL или PN соответственно согласно таблице 1, г/моль;

- коэффициент разбавления, см (в данном случае 50 см);

- коэффициент для вычисления доли свободных форм соединений витамина ;

- молярный коэффициент поглощения РМ, PL или PN при соответствующем рН согласно таблице 1, ммоль см.

Данные значения массовой концентрации используют для вычисления точных концентраций веществ, приведенных в пунктах 4.19.1-4.19.3 и 4.20.1-4.20.6.

4.20 Стандартные растворы

4.20.1 Стандартный раствор пиридоксамина (РМ) I, массовой концентрацией (РМ) приблизительно 10 мкг/см

Разбавляют 2 см исходного раствора пиридоксамина (см. 4.19.1) 0,1 моль/дм HCI (см. 4.8) и доводят до 100 см. Полученный раствор хранению не подлежит.

4.20.2 Стандартный раствор пиридоксаля (PL) I, (PL) приблизительно 10 мкг/см

Разбавляют 2 см исходного раствора пиридоксаля (см. 4.19.2) 0,1 моль/дм HCI (см. 4.8) и доводят до 100 см. Полученный раствор хранению не подлежит.

4.20.3 Стандартный раствор пиридоксина (PN) I, (PL) приблизительно 10 мкг/см

Разбавляют 2 см исходного раствора пиридоксаля (см. 4.19.3) 0,1 моль/дм HCI (см. 4.8) и доводят до 100 см. Полученный раствор хранению не подлежит.

4.20.4 Стандартный раствор пиридоксамина (РМ) II, (РМ) приблизительно 1 мкг/см

Разбавляют 10 см исходного раствора пиридоксамина (см. 4.20.1) 0,1 моль/дм HCI (см. 4.8) и доводят до 100 см. Полученный раствор хранению не подлежит.

4.20.5 Стандартный раствор пиридоксаля (PL) II, (PL) приблизительно 1 мкг/см

Разбавляют 10 см стандартного раствора пиридоксаля (см. 4.20.2) 0,1 моль/дм HCI (см. 4.8) до 100 см. Полученный раствор хранению не подлежит.

4.20.6 Стандартный раствор пиридоксина (PN) II, (PL) приблизительно 1 мкг/см

Разбавляют 10 см стандартного раствора пиридоксина (см. 4.20.3) 0,1 моль/дм HCI (см. 4.8) и доводят до 100 см. Полученный раствор хранению не подлежит.

4.20.7 Проверка хроматографической чистоты методом ВЭЖХ

Чистота образцов сравнения может быть проверена методом ВЭЖХ, как описано ниже: вводят соответствующие объемы РМ, PL и PN стандартных растворов I (см. 4.20.1, 4.20.2, 4.20.3) в систему ВЭЖХ и анализируют, как установлено в 6.4.

Степень чистоты образцов сравнения , %, вычисляют по формуле

, (2)


где - площадь пика образца сравнения ;

- сумма площадей пиков загрязняющих веществ (без пика растворителя).

Хроматографическая чистота образцов сравнения должна быть не менее 98%, в ином случае используют новые образцы сравнения или готовят новые стандартные растворы.

4.21 Смешанный градуировочный раствор (например (РМ, PL, PN) = 0,1 мкг/см до 10 мкг/см)

Отбирают пипеткой подходящие объемы исходных растворов РМ, PL и PN (см. 4.19.1-4.19.3) или стандартных растворов (см. 4.20.1-4.20.6) в мерную колбу вместимостью 20 см и при необходимости доводят 0,1 моль/дм HCI (см. 4.8) до объема 6,5 см. Доводят рН до значения 4,8 ед. рН, используя раствор ацетата натрия молярной концентрацией 2,5 моль/дм (см. 4.5), а затем доводят рН до значения 3,0 ед. рН, используя серную кислоту (см. 4.10), объем содержимого в колбе доводят водой до метки и перемешивают (градуировочные растворы). Рекомендуется использовать не менее трех градуировочных точек. При необходимости допускается разбавление смешанных градуировочных растворов подвижной фазой до ввода в хроматограф.

5 Оборудование

5.1 Общие положения

Используют общепринятое лабораторное оборудование, стеклянную посуду, вспомогательное оборудование и следующие средства измерений.

5.2 УФ-спектрофотометр, пригодный для измерения оптической плотности при определенных длинах волн.

5.3 Нагревательные приборы

Используют лабораторный автоклав и печь или водяную баню, оборудованные мешалками и позволяющие устанавливать температуру на уровне 37°С.

5.4 Система для ВЭЖХ

Система для ВЭЖХ состоит из насоса, устройства для ввода проб, флуоресцентного детектора, обеспечивающего длину волны возбуждения 290 нм и длину волны регистрации 390 нм, интегратора или устройства для обработки данных, устройства для постколоночной дериватизации.

5.5 Колонки для ВЭЖХ

Используют обращенно-фазовую колонку со следующими характеристиками:

Luna™ RP , 5 мкм, размер частицы 5 мкм, диаметр 4,0 мм, длина 250 мм. Другие примеры подходящих колонок для ВЭЖХ приведены в приложении В.
_______________
Luna™ - это пример продукта, доступного на рынке, поставляемого фирмой Phenomenex. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой указанного продукта со стороны CEN. Допускается использовать аналогичную продукцию, если она позволяет получать сопоставимые результаты.

Допускается использовать размеры частиц или колонок, которые отличаются от установленных в настоящем стандарте. Параметры разделения должны адаптироваться к таким материалам, чтобы гарантировать эквивалентные результаты. Критерий эффективности функционирования подходящих аналитических колонок является базовым разрешением рассматриваемых веществ, определяемых при анализе.

5.6 Устройства фильтровальные

Фильтрация подвижной фазы, а также раствора анализируемой пробы через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм перед использованием или вводом проб увеличит срок службы колонок.

6 Методика проведения испытания

6.1 Подготовка анализируемой пробы

Отбирают и гомогенизируют анализируемую пробу. Измельчают материал в соответствующем смесителе-мельнице и снова перемешивают. Чтобы не подвергать пробу воздействию высокой температуры в течение длительного периода времени, необходимо предварительно ее охладить. После гомогенизации пробу сразу анализируют.

6.2 Подготовка раствора анализируемой пробы

6.2.1 Экстракция

6.2.1.1 Общие положения

Из проб с высоким содержанием жира (более 25%) следует удалить жир, например, путем обработки петролейным эфиром перед кислотным гидролизом.

Для обработки пенящихся материалов рекомендуется использование нескольких капель силиконового масла (см. 4.17).

Значение рН экстрагированного раствора должно быть приблизительно 1 ед. рН. В ином случае рекомендуется уменьшить массу пробы или использовать соляную кислоту с более высокой концентрацией [(например, 0,2 моль/дм (см. 4.9) или 1 моль/дм (см. 4.7)].

6.2.1.2 Экстракция из сухих продуктов (содержание воды менее 20%; например, в крупах, сухом молоке, сушеных овощах)

Взвешивают от 1 до 10 г гомогенизированной анализируемой пробы (см. 6.1) с точностью до миллиграмма в конической колбе вместимостью 150 см, добавляют 50 см 0,1 моль/дм соляной кислоты (см. 4.8), перемешивают и проверяют, чтобы значение рН составляло приблизительно 1 ед.рН.

Нагревают в автоклаве (см. 5.3) в течение 30 мин при температуре 120°С, затем охлаждают до комнатной температуры, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см, объем содержимого в колбе доводят водой до 100 см (с возможным силиконовым слоем выше метки) и перемешивают.

Фильтруют или центрифугируют при 3000 об/мин аликвотную часть (приблизительно 50 см) пробы, обработанной кислотой, и отбирают верхний слой в герметичные стеклянные емкости (данный раствор является экстрактом пробы).

6.2.1.3 Экстракция из продуктов с высоким содержанием влаги (более 20%) и жидких продуктов (например, в мясе, овощах, соках)

Взвешивают от 2 до 40 г гомогенизированной пробы (см. 6.1) с точностью до миллиграмма в конической колбе вместимостью 150 см, добавляют 10 см 1 моль/дм соляной кислоты (см. 4.7), доводят водой до приблизительно 50 см, перемешивают и проверяют, чтобы значение рН составляло приблизительно 1 ед.рН.

Нагревают в автоклаве (см. 5.3) в течение 30 мин при температуре 120°С, затем охлаждают до комнатной температуры, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и объем содержимого в колбе доводят водой до 100 см (с возможным силиконовым слоем выше метки) и перемешивают.

Фильтруют или центрифугируют при 3000 об/мин аликвотную часть (приблизительно 50 см) пробы, обработанной кислотой, и отбирают верхний слой в герметичные стеклянные емкости (данный раствор является экстрактом пробы).

Примечание - Во время автоклавирования может произойти взаимное превращение различных форм витамина, например, путем трансаминирования. Это часто наблюдается в приготовленном мясе или в пробах с высоким содержанием свободных аминогрупп (см. [2], [7]).

6.2.2 Ферментативная обработка и этапы подготовки проб трансформации

Для проб пищевой продукции животного происхождения (свинина, молоко, рыба и т.д.), которые не содержат -глюкозилированного связанного пиридоксина, ферментативная обработка -глюкозидазой не является необходимой. Лабораторные эксперименты показывают, что результаты определения общего содержания витамина в пищевой продукции, полученные с применением и без применения -глюкозидазы для ферментативной обработки, были приблизительно одинаковыми (см. [2], [7]).

Отбирают пипеткой 12,5 см экстракта пробы по 6.2.1.2, 6.2.1.3 в коническую колбу вместимостью 20 см и доводят рН до значения (4,8±0,1) ед. рН, используя раствор ацетата натрия (см. 4.5). Добавляют 1 см раствора кислой фосфатазы (см. 4.13) и 1 см раствора -глюкозидазы (см. 4.15) и перемешивают. Накрывают коническую колбу и инкубируют раствор в течение не менее 12 ч или в течение ночи при температуре 37°С, постоянно перемешивая.

После охлаждения до комнатной температуры доводят рН до значения приблизительно 3 ед. рН, используя серную кислоту (см. 4.10), переливают отрегулированный раствор количественно в мерную колбу вместимостью 20 см и объем содержимого в колбе доводят до метки водой. Встряхивают и фильтруют через сухой складчатый бумажный фильтр, удаляют первые 5 см фильтрата.

Подготовленный раствор пробы хранят до 3 сут в холодильнике при температуре около 4°С.

Перед хроматографическим анализом фильтруют аликвоту (приблизительно 2 см) через мембранный фильтр (см. 5.6) и разбавляют подвижной фазой, если необходимо.

6.3 Подготовка "холостой" пробы

Отбирают пипеткой 12,5 см раствора соляной кислоты (см. 4.8) в коническую колбу вместимостью 20 см и доводят рН до значения (4,8±0,1) ед. рН, используя раствор ацетата натрия молярной концентрацией 2,5 моль/дм (см. 4.5). Добавляют 1 см раствора кислой фосфатазы (см. 4.13) и 1 см раствора -глюкозидазы (см. 4.15) и перемешивают. Инкубируют раствор в течение не менее 12 ч или в течение ночи при температуре 37°С при постоянном перемешивании.

После охлаждения до комнатной температуры доводят рН до значения приблизительно 3 ед. рН, используя серную кислоту (см. 4.10), переливают количественно в мерную колбу вместимостью 20 см, объем содержимого в колбе доводят водой до метки, встряхивают и фильтруют через сухой складчатый бумажный фильтр, удаляя первые 5 см фильтрата.

Перед хроматографическим анализом фильтруют аликвоту (приблизительно 2 см) через мембранный фильтр (см. 5.6) и разбавляют подвижной фазой, если необходимо.

6.4 Условия хроматографического анализа

Эффективность системы ВЭЖХ должна обеспечивать разделение пиков РМ, PL и PN друг от друга, а также от пиков всех других веществ пробы до базовой линии.

Установлено, что разделение и количественное определение является удовлетворительным при следующих условиях:

Колонка ВЭЖХ - в соответствии с 5.5;

Подвижная фаза - в соответствии с 4.16;

Расход жидкости - 1,5 см/мин;

Вводимый объем - от 1 до 50 мм;

Детектор - флуоресцентный:

длина волны возбуждения () - 290 нм;

длина волны эмиссии () - 390 нм.

6.5 Идентификация

Вводят одинаковые подходящие объемы раствора анализируемой пробы (см. 6.2.2), "холостой" пробы (см. 6.3) и смешанных градуировочных растворов (см. 4.21) в систему ВЭЖХ в условиях по 6.4.

Идентифицируют пики РМ, PL и PN путем сравнения времени удерживания пиков на хроматограммах раствора анализируемой пробы и стандартного раствора. Идентификацию пика допускается также проводить с помощью сдвига значения рН в сторону увеличения, например при установлении рН = 6,6 ед. рН при использовании устройства постколоночной дериватизации (см. 5.4) при скорости потока послеколоночного реагента 0,1 см/мин (см. 4.6). Обнаружение осуществляется при возбуждении при 330 нм и регистрации при 390 нм (см. [2], [4], [5]).

Примечание - Увеличение значения рН путем использования послеколоночного реагента (см. 4.6) приводит к сдвигу длины волны возбуждения до 330 нм. Кроме того, избирательность матриц улучшается в связи с уменьшением матрицы пиков ([2], [4], [5]).

6.6 Определение

Вводят одинаковые подходящие объемы стандартного раствора, а также раствора анализируемой пробы в систему ВЭЖХ согласно условиям по 6.4. Для определения содержания методом внешней градуировки определяют среднее значение площади пиков или высоты пиков и сравнивают результаты с соответствующими значениями образца сравнения.

7 Вычисление результата

7.1 Вычисление проводят с использованием градуировочной зависимости либо соответствующих программ интегратора, либо в соответствии с нижеприведенными формулами (3)-(6).

Массовую долю пиридоксамина (РМ), пиридоксаля (PL) или пиридоксина (PN), , мг/100 г пробы вычисляют по формуле

, (3)


где - содержание РМ, PL и PN, определенное по площади пика или высоте пика с использованием линейной регрессии или градуировочной зависимости, мкг/20 см раствора анализируемой пробы (см. 6.2.2);

- масса пробы, г;

- коэффициент разбавления из формулы (6).

Значение вычисляют по формуле

, (4)


где , - коэффициенты регрессии для РМ, PL или PN, вычисленные методом линейной регрессии на основе концентрации и площади пика в градуировочных растворах;

- откорректированная площадь пика раствора анализируемой пробы РМ, PL или PN.

Значение вычисляют по формуле

, (5)


где - площади пика РМ, PL или PN для раствора анализируемой пробы;

- площади пика РМ, PL или PN для "холостой" пробы.

Коэффициент разбавления вычисляют по формуле

, (6)


где - общий объем раствора кислой вытяжки пробы (см. 6.2.1.2), (см. 6.2.1.3), см;

- общий объем раствора кислой вытяжки пробы, подвергнутый ферментативной обработке (см. 6.2.2), см.

7.2 Массовую долю витамина в пересчете на пиридоксин , мг/100 г пробы вычисляют по формуле

, (7)


где 1,006 - коэффициент для пересчета РМ на PN;

- содержание пиридоксамина, мг/100 г пробы;

1,012 - коэффициент для пересчета PL на PN;

- содержание пиридоксаля, мг/100 г пробы;

- содержание пиридоксина, мг/100 г пробы.

7.3 Массовую долю витамина в пересчете на пиридоксин выражают в миллиграммах на 100 г пробы.

Примечание - Если необходимо представить результат в пересчете на гидрохлорид пиридоксина, используют коэффициент пересчета 1,216. Сведения о проведении пересчета должны быть четко указаны в протоколе испытания.

8 Прецизионность

8.1 Общие положения

Данные по прецизионности для определения витамина были установлены в ходе межлабораторных испытаний в соответствии с [8], проведенных бывшим BgVV (Bundesinstitut gesundheitlichen Verbraucherschutz und (Немецкий федеральный институт по защите прав потребителей и ветеринарной медицине).

Подробная информация о совместном испытании точности метода приведена в приложении А. Значения, полученные в ходе межлабораторных испытаний, могут быть не применимы к диапазонам концентраций и пробам, не приведенным в приложении А.

Применимость и надежность настоящего метода были подтверждены в ходе испытаний различной пищевой продукции, например мяса, рыбы, молока, овощей, фруктов и злаков (см. [2], [3]). Полученные результаты были в достаточной степени воспроизводимы, и только иногда наблюдались относительно небольшие мешающие влияния матричных пиков проб, которые могут быть легко устранены. Для градуировочных растворов наблюдается сильно выраженная корреляция и линейная регрессия между площадью пика и концентрацией РМ, PL и PN соответственно. Относительные стандартные отклонения от общего содержания витамина в последовательности, включающей от трех до пяти определений в различных продуктах, варьируются от 2% до 6%.

Полнота извлечения РМ, PL и PN варьируется от 85% до 105% (см. [2], [3]). Определение общего содержания витамина настоящим методом дает в результате значительно более высокие значения в пищевой продукции растительного происхождения (содержащих гликозилированный пиридоксин), чем другие методы, в которых не используется обработка -глюкозидазой (см. [2], [3], [7]).

8.2 Повторяемость

Абсолютное расхождение между двумя отдельными результатами испытания, которые были получены при использовании одного и того же метода на идентичном испытательном материале одним и тем же оператором на одном и том же оборудовании в течение короткого промежутка времени, не должно превышать предел повторяемости более чем в 5% случаев.

Значения для порошковой манной крупы с молоком:

Пиридоксамин

0,065 мг/100 г

0,008

Пиридоксаль

0,080 мг/100 г

0,022

Пиридоксин

0,523 мг/100 г

0,067

Витамин

0,667 мг/100 г

0,084


Значения для порошкового картофельного пюре:

Пиридоксамин

0,163 мг/100 г

0,016

Пиридоксаль

0,032 мг/100 г

0,012

Пиридоксин

1,008 мг/100 г

0,080

Витамин

1,204 мг/100 г

0,089


Значения для овощей с ветчиной (детское питание):

Пиридоксамин

0,043 мг/100 г

0,005

Пиридоксаль

0,009 мг/100 г

0,004

Пиридоксин

0,047 мг/100 г

0,010

Витамин

0,107 мг/100 г

0,011


Значения для мультивитаминного напитка:

Пиридоксамин

0,004 мг/100 г

0,003

Пиридоксаль

0,004 мг/100 г

0,003

Пиридоксин

0,374 мг/100 г

0,056

Витамин

0,380 мг/100 г

0,056

8.3 Воспроизводимость

Абсолютное расхождение между результатами двух единичных испытаний, полученными на идентичном объекте испытаний двумя лабораториями, должно превышать предел воспроизводимости не более чем в 5% случаев.

Значения для порошковой манной крупы с молоком:

Пиридоксамин

0,065 мг/100 г

0,035

Пиридоксаль

0,080 мг/100 г

0,071

Пиридоксин

0,523 мг/100 г

0,151

Витамин

0,667 мг/100 г

0,193


Значения для порошкового картофельного пюре:

Пиридоксамин

0,163 мг/100 г

0,089

Пиридоксаль

0,032 мг/100 г

0,022

Пиридоксин

1,008 мг/100 г

0,314

Витамин

1,204 мг/100 г

0,369


Значения для овощей с ветчиной (детское питание):

Пиридоксамин

0,043 мг/100 г

0,013

Пиридоксаль

0,009 мг/100 г

0,013

Пиридоксин

0,047 мг/100 г

0,021

Витамин

0,107 мг/100 г

0,039


Значения для мультивитаминного напитка:

Пиридоксамин

0,004 мг/100 г

0,005

Пиридоксаль

0,004 мг/100 г

0,005

Пиридоксин

0,374 мг/100 г

0,086

Витамин

0,380 мг/100 г

0,095

9 Протокол испытания


Протокол испытания должен содержать по меньшей мере следующие сведения:

a) всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;

b) ссылку на настоящий стандарт или используемый метод;

c) дату и метод отбора пробы (если они известны);

d) дату поступления пробы в лабораторию;

e) дату проведения испытания;

f) результаты и единицы, в которых выражены результаты испытания;

g) информацию о других специфичных особенностях, которые наблюдались в ходе проведения испытания;

h) информацию о других особенностях, не установленных в настоящем методе или рассматриваемых как дополнительные, которые могут повлиять на результаты испытания.

Приложение А (справочное). Данные по прецизионности

Приложение А
(справочное)


Имеющиеся данные были получены с использованием методов ВЭЖХ, установленных в приложении С. Данные результатов испытаний для определения витамина были установлены в ходе межлабораторных испытаний в соответствии с [8], проведенных бывшим BgVV [Bundesinstitut gesundheitlichen Verbraucherschutz und (Немецкий федеральный институт по защите прав потребителей и ветеринарной медицине)].


Таблица А.1 - Данные результатов испытаний для порошковой манной крупы с молоком

Проба

Порошковая манная крупа с молоком

Вещество, определяемое при анализе

Пиридоксамин

Пиридоксаль

Пиридоксин

Витамин

Год совместного исследования

2000

Количество лабораторий

11

Количество проб

5

Количество лабораторий, оставшихся после исключения выбросов

10

Количество оставшихся результатов

53

Среднее значение , мг/100 г

0,065

0,080

0,523

0,667

Стандартное отклонение повторяемости , мг/100 г

0,003

0,008

0,024

0,030

Относительное стандартное отклонение повторяемости , %

4,6

10,0

4,6

4,5

Значение повторяемости (2,8·), мг/100 г

0,008

0,022

0,067

0,084

Стандартное отклонение воспроизводимости , мг/100 г

0,013

0,025

0,053

0,068

Относительное стандартное отклонение воспроизводимости , %

20,5

31,3

10,1

10,2

Значение воспроизводимости (2,8·), мг/100 г

0,035

0,071

0,151

0,193

Среднее значение коэффициента извлечения компонента, %

97,2

94,7

93,9

-

Стандартное отклонение коэффициента извлечения компонента, %

9

8,2

9,7

-

Количество результатов, использованных для расчета

23

20

23

-

См. формулу (7).



Таблица А.2 - Данные результатов испытаний для порошкового картофельного пюре

Проба

Порошковое картофельное пюре

Вещество, определяемое при анализе

Пиридоксамин

Пиридоксаль

Пиридоксин

Витамин

Год совместного исследования

2000

Количество лабораторий

10

Количество проб

5 (9)

Количество лабораторий, оставшихся после исключения выбросов

9

Количество оставшихся результатов

49

Среднее значение , мг/100 г

0,163

0,032

1,008

1,204

Стандартное отклонение повторяемости , мг/100 г

0,006

0,004

0,028

0,032

Относительное стандартное отклонение повторяемости , %

3,7

12,3

2,8

2,7

Значение повторяемости (2,8·), мг/100 г

0,016

0,012

0,080

0,089

Стандартное отклонение воспроизводимости , мг/100 г

0,031

0,008

0,111

0,131

Относительное стандартное отклонение воспроизводимости , %

19,0

25,0

11,0

10,9

Значение воспроизводимости (2,8·), мг/100 г

0,089

0,022

0,314

0,369

Среднее значение коэффициента извлечения компонента, %

97,7

85,2

90,8

-

Стандартное отклонение коэффициента извлечения компонента, %

9,4

7,4

9,9

-

Количество результатов, использованных для расчета

19

20

20

-

См. формулу (7).



Таблица А.3 - Данные результатов испытаний для овощей с ветчиной (детское питание)

Проба

Овощи с ветчиной (детское питание)

Вещество, определяемое при анализе

Пиридоксамин

Пиридоксаль

Пиридоксин

Витамин

Год совместного исследования

2000

Количество лабораторий

9

Количество проб

5 (2)

Количество лабораторий, оставшихся после исключения выбросов

8

Количество оставшихся результатов

37

Среднее значение , мг/100 г

0,043

0,009

0,047

0,107

Стандартное отклонение повторяемости , мг/100 г

0,002

0,001

0,003

0,004

Относительное стандартное отклонение повторяемости , %

4,4

15,4

7,2

3,6

Значение повторяемости (2,8·), мг/100 г

0,005

0,004

0,010

0,011

Стандартное отклонение воспроизводимости , мг/100 г

0,005

0,005

0,007

0,014

Относительное стандартное отклонение воспроизводимости , %

11,0

50,5

15,7

12,8

Значение воспроизводимости (2,8·), мг/100 г

0,013

0,013

0,021

0,039

Среднее значение коэффициента извлечения компонента, %

95,1

90,6

88,9

-

Стандартное отклонение коэффициента извлечения компонента, %

4,5

12,0

10,2

-

Количество результатов, использованных для расчета

18

16

19

-

См. формулу (7).



Таблица А.4 - Данные результатов испытаний для мультивитаминного напитка

Проба

Мультивитаминный напиток

Вещество, определяемое при анализе

Пиридоксамин

Пиридоксаль

Пиридоксин

Витамин

Год совместного исследования

2000

Количество лабораторий

11

Количество проб

5

Количество лабораторий, оставшихся после исключения выбросов

10

Количество оставшихся результатов

53

Среднее значение , мг/100 г

0,004

0,004

0,373

0,380

Стандартное отклонение повторяемости , мг/100 г

0,001

0,001

0,020

0,020

Относительное стандартное отклонение повторяемости , %

25,0

25,0

5,4

5,3

Значение повторяемости (2,8·), мг/100 г

0,003

0,003

0,056

0,056

Стандартное отклонение воспроизводимости , мг/100 г

0,002

0,002

0,030

0,034

Относительное стандартное отклонение воспроизводимости , %

38,6

49

8,0

8,8

Значение воспроизводимости (2,8·), мг/100 г

0,005

0,005

0,086

0,095

Среднее значение коэффициента извлечения компонента, %

98,1

94,5

98,2

-

Стандартное отклонение коэффициента извлечения компонента, %

11,4

6,2

8,4

-

Количество результатов, использованных для расчета

23

23

23

-

См. формулу (7).


Приложение В (справочное). Примеры подходящих условий проведения ВЭЖХ для определения соединений витамина В(6)

Приложение В
(справочное)



Таблица В.1 - Примеры подходящих условий ВЭЖХ для определения соединений витамина

Лабо-
рато-
рия

Раздели-
тельная колонка

Размеры, мммм

Температура, °С

Подвижная фаза

Расход, см/мин

Обнару-
жение, нм

Время удерживания, мин








PM

PL

PN

LUNA RP , 5 мкм

250х4,0

30

(0,015 моль/дм), содержание ТХУ (0,005 моль/дм)

1,5

290

390

~3

~7

~11,4

1b

LUNA RP , 5 мкм

250х4,0

30

(0,015 моль/дм), содержание ТХУ (0,005 моль/дм) и послеколоночный реагент: (0,15 моль/дм)

1,5

0,5

330

390

~2,4

~6,9

~11,2

2

LUNA RP , 5 мкм

250х4,0

30

(0,015 моль/дм), содержание ТХУ (0,005 моль/дм)

1,5

290

390

~3

~7,9

~13,0

3

AQUA , 5 мкм

250х4,6

30

(0,015 моль/дм), содержание ТХУ (0,005 моль/дм)

2,0

290

390

~2,2

~4,7

~6,4


Предколонка: RP , 5 мкм

4,0x3,0



1,5



~2,7

~5,4

~6,9

4

LiChrospher 60 RP

250х4,0

30

(0,03 моль/дм), содержание ТХУ (0,05 моль/дм) от 0 до 14 мин В: Метанол, от 14 до 21 мин

3,0

290

390

~2,5

~4,8

~6,1

Выборка В, 5 мкм

5

Nucleosil 120 , 5 мкм

250х4,0

~20

(0,015 моль/дм), содержание ТХУ (0,005 моль/дм)

2,0

290

390

~2,0

~4,9

~7,0

Предколонка: RP

6

LUNA RP , 5 мкм

250х4,0

30

(0,015 моль/дм), содержание ТХУ (0,005 моль/дм)

2,0

290

390

~2,5

~6,3

~9,2

7

LUNA RP , 5 мкм

250х4,0

30

(0,015 моль/дм), содержание ТХУ (0,005 моль/дм)

2,0

290

390

~2,8

~6,5

~11,8

8

LUNA RP , 5 мкм

250х4,0

30

(0,015 моль/дм), содержание ТХУ (0,005 моль/дм)

2,0

290

390

~2,8

~6,9

~11,4

9

Spherisorb 80 ODS-2, 5 мкм

250х4,6

30

(0,015 моль/дм), содержание ТХУ (0,005 моль/дм)

2,0

290

390

~5,5

~10,4

~16,1

10

LUNA RP , 5 мкм

250х4,0

30

(0,015 моль/дм), содержание ТХУ (0,005 моль/дм) и послеколоночный реагент: (0,15 моль/дм)

1,0

0,5

330

390

~6,9

~17,9

~28,4

Phenomenex, 125 А.

РМ - пиридоксамин.

PL - пиридоксаль.

PN - пиридоксин.


Приложение С (справочное). Примеры молярных коэффициентов поглощения

Приложение С
(справочное)


Таблица С.1 - Примеры молярных коэффициентов поглощения Е соединений витамина (см. [3], [4])

Соединение

Растворитель

, нм

, ммоль см

, г моль

Пиридоксина гидрохлорид

0,1 моль/дм HCI, рН приблизительно 1

290

8,6

205,6

Пиридоксина гидрохлорид

0,1 моль/дм фосфатный буферный раствор, рН 7

323,8

7,3

205,6

Пиридоксаля гидрохлорид

0,1 моль/дм HCI, рН приблизительно 1

288

8,96 (9,0)

203,6

Пиридоксаль-5'-фосфат

0,1 моль/дм фосфатный буферный раствор, рН 7

388

5,02

247,1

Пиридоксамина дигидрохлорид

0,1 моль/дм HCI, рН приблизительно 1

292

8,2

241,1

Пиридоксамина дигидрохлорид

0,1 моль/дм фосфатный буферный раствор, рН 7

253

4,6

241,1

Пиридоксамин-5'-фосфат гидрохлорид

0,1 моль/дм фосфатный буферный раствор, рН 7

326

8,37

241,1


Приложение D (справочное). Примеры хроматограмм

Приложение D
(справочное)


Рисунок D.1 - Хроматограммы образцов сравнения и пробы картофельного пюре

Обозначения:

LU - интенсивность флуоресценции

Рисунок D.1 - Хроматограммы образцов сравнения и пробы картофельного пюре


Условия хроматографического анализа:

колонка ВЭЖХ - в соответствии с 5.5;

подвижная фаза - в соответствии с 4.16;

расход - 1,5 см/мин;

детектор - флуоресцентный: длина волны возбуждения - 290 нм;

длина волны эмиссии - 390 нм.

Приложение ДА (справочное). Сведения о соответствии ссылочных европейских стандартов межгосударственным стандартам

Приложение ДА
(справочное)



Таблица ДА.1

Обозначение ссылочного европейского стандарта

Степень соответствия

Обозначение и наименование межгосударственного стандарта

EN ISO 3696

IDT

ГОСТ ISO 3696-2013 "Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы контроля"

Примечание - В настоящей таблице использовано следующее условное обозначение степени соответствия стандарта:

- IDT - идентичный стандарт.

_______________
В Российской Федерации действует ГОСТ Р 52501-2005 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

Библиография

[1]

Bognar, A.: Bestimmung von Vitamin in Lebensmitteln mit Hilfe der (HPLC) Z Lebensm Unters Forsch A, 1985, 181: 200-205 (Определение содержания витамина в продуктах питания с использованием ВЭЖХ)

[2]

, A., Ollilainen, V.: Influence of Extraction on the Determination of Vitamin in Food by HPLC Z Lebensm Unters Forsch A, 1997, 204: 327-335 (Влияние экстракции на определение витамина в пищевых продуктах методом ВЭЖХ)

[3]

Metzler, D.Е., and Snell, Е.Е.: Spectra and lonisation Constants of the Vitamin - Group and Related 3-Hydroxypyridine Derivates Journal of the American Chemical Society. 1955, 77:2431-2437 (Константы спектра и ионизации группы витамина - группа и связанные производные 3-гидроксипиридина)

[4]

Bitsch, R., , J., J Chromatogr 1989, 463: 207-211 (Журнал хроматографии)

[5]

Ollilainen, V.: HPLC Analysis of Vitamin B6 in Agricultural and Food Science in Finland Department of Applied Chemistry and Microbiology University of Helsinki 1999. Vol. 8:No. 6: 515-619 (Анализ ВЭЖХ витамина B6 в науках о сельском хозяйстве и продуктах питания в Финляндии)

[6]

+Bergaentzle, М., Arella, F., Bourguignon, J.В., Hasselmann, С.: Determination of vitamin in foods by HPLC A collaborative study. Food Chemistry, 1995, 52: 81-86 (Определение витамина в пищевых продуктах методом ВЭЖХ)

[7]

Ndaw, S., Bergaentzle, М., Aoude-Werner, D., Hasselmann, С: Extraction procedures for the liquid chromatographic determination of thiamin Riboflavin and vitamin B6 in foodstuffs Food Chemistry 2000, 71, 129-138 (Процедуры экстракции для определения тиамина, рибофлавина и витамина в пищевых продуктах методом жидкостной хроматографии)

[8]

ISO 5725:1986

Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests (Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений)

_______________
ISO 5725:1986 отменен и заменен на ISO 5725-1:1994, ISO 5725-2:1994, ISO 5725-3:1994, ISO 5725-4:1994, ISO 5725-5:1998, ISO 5725-6:1994.

УДК 664:543.544.5.068.7:006.354

МКС 67.050

IDT

Ключевые слова: продукция пищевая, определение, витамин , гликозилированные формы, высокоэффективная жидкостная хроматография




Электронный текст документа
и сверен по:
официальное издание
М.: Стандартинформ, 2016