allgosts.ru13. ОХРАНА ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ, ЗАЩИТА ЧЕЛОВЕКА ОТ ВОЗДЕЙСТВИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ. БЕЗОПАСНОСТЬ13.080. Качество грунта. Почвоведение

ГОСТ ISO 16198-2017 Качество почв. Метод определения биодоступности микроэлементов почвы для растений

Обозначение:
ГОСТ ISO 16198-2017
Наименование:
Качество почв. Метод определения биодоступности микроэлементов почвы для растений
Статус:
Действует
Дата введения:
01/01/2019
Дата отмены:
-
Заменен на:
-
Код ОКС:
13.080.30

Текст ГОСТ ISO 16198-2017 Качество почв. Метод определения биодоступности микроэлементов почвы для растений


ГОСТ ISO 16198-2017



МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ


КАЧЕСТВО ПОЧВ


Метод определения биодоступности микроэлементов почвы длярастений


Soil quality. Plant-based test to assess the environmentalbioavailability of trace elements to plants

МКС13.080.30

Датавведения 2019-01-01

Предисловие

Предисловие


Цели, основные принципы иосновной порядок проведения работ по межгосударственнойстандартизации установлены в ГОСТ1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основныеположения" и ГОСТ1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандартымежгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственнойстандартизации. Правила разработки, принятия, обновления иотмены"

Сведения остандарте

1ПОДГОТОВЛЕН Акционерным обществом "Всероссийскийнаучно-исследовательский институт сертификации" (АО "ВНИИС") наоснове официального перевода на русский язык англоязычной версииуказанного в пункте 5 стандарта, который выполнен АО "ВНИИС"

2ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию иметрологии

3ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии исертификации (протокол от 30 августа 2017 г. N 102-П)

За принятиепроголосовали:

Краткоенаименование страны по
МК (ИСО3166) 004-97

Код страныпо
МК (ИСО3166) 004-97

Сокращенноенаименование национального органа по стандартизации

Армения

AM

Минэкономики РеспубликиАрмения

Беларусь

BY

Госстандарт РеспубликиБеларусь

Казахстан

KZ

Госстандарт РеспубликиКазахстан

Киргизия

KG

Кыргызстандарт

Россия

RU

Росстандарт

Узбекистан

UZ

Узстандарт

4ПриказомФедерального агентства по техническому регулированию и метрологииот 10 октября 2017 г. N 1377-ст межгосударственный стандартГОСТ ISO 16198-2017 введен в действие в качестве национальногостандарта Российской Федерации с 1 января 2019 г.

5Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO16198:2015* "Качество почв. Метод определения биодоступностимикроэлементов почвы для растений" ("Soil quality - Plant-basedtest to assess the environmental bioavailability of trace elementsto plants", IDT).
________________
*Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым здесь идалее по тексту, можно получить, перейдя по ссылке на сайт . - Примечаниеизготовителя базы данных.


Международный стандартразработан Техническим комитетом ISO/ТС 190 "Качество почв"Международной организации по стандартизации (ISO).

При применении настоящегостандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международныхстандартов соответствующие им межгосударственные стандарты,сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

6ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ


Информация обизменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодноминформационном указателе "Национальные стандарты", а текстизменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе"Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отменынастоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликованов ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты".Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются такжев информационной системе общего пользования - на официальном сайтеФедерального агентства по техническому регулированию и метрологии всети Интернет (www.gost.ru)

Введение


Одной из главных целейстандарта [10] является установление схемы биодоступностизагрязняющих веществ в почве и почвенных массах, а такжерекомендации по выбору методик измерений степени биодоступности,которые возможно стандартизировать. Таким образом, термин"биодоступность" был определен по-разному, в зависимости от условийреализации данного процесса:

a) "биодоступность изокружающей среды";

b) "биодоступность изпочвы";

c) "токсикологическаябиодоступность".

Биодоступность изокружающей среды - это необходимое условие для оценкитоксикологической биодоступности, которое непосредственно связано свлиянием загрязняющих веществ на основные свойства почв вэкосистеме, особенно на насыщенность почвы живыми существами исохранность почвы.

Биодоступность изокружающей среды можно оценивать физическими, химическими илибиологическими методами. Что касается микроэлементов, то применениев данном случае химических методов, как правило, является наиболеемалозатратным и простым. Более того, некоторые химические методыуже стандартизированы на национальном и международном уровне (см.[11]). Однако необходимо учитывать, что результаты примененияхимических методов, которыми определяют доступность из почв, должныкоррелировать с результатами измерений биологическими методами дотого, как химические методы будут использовать в качествеподтверждения биодоступности из окружающей среды. Какие быхимические методы ни применяли, ни один из них не адаптирован такимобразом, чтобы учитывать разнообразие реакций, наблюдаемых уразличных видов и сортов растений, для которых характерны:

a) определенныеособенности процесса доступности различных веществ (например,чувствительность, толерантность, интенсивность доступностимикроэлементов, которая в некоторых случаях бывает весьмавыраженной)

и(или)

b) способность растенийвлиять на биологические, физические и физико-химические свойстваризосферы.

Была высказана идеяприменения химических методов в отношении самой ризосферы, однакоотбор проб из зоны ризосферы является весьма трудоемким, чтобытакую процедуру могли проводить регулярно.

Врамках биологических методов исследования процессов в ризосферепроводили 4 стандартизированными биотестами, поскольку ихдопускается применять к растениям, растущим на почве ([5], [8],[12] и ISO 11269-2). Однако данные методы были адаптированы толькодля теоретической оценки токсичности микроэлементов, т.е.токсикологической биодоступности. В ходе данных биотестов корнирастений разрастались непосредственно в почве, в результате чегобыло необходимо проводить трудоемкую процедуру промывки корней,чтобы с достаточной степенью достоверности определить содержаниемикроэлементов, накопленных в корневой системе. Следует учесть, чтосодержание микроэлементов в ростках растений, которые ненакапливали микроэлементы, является не достаточно высоким, чтобыего можно было использовать для оценки биодоступности из почвы длямикроэлементов по сравнению с их содержанием во всем растении, втом числе в корнях. Таким образом, на данный момент существуетнеобходимость разработки биологических методов, которые будутприменять в отношении процессов в ризосфере, и которые дадутвозможность полного отделения корня растения от почвы дляадекватной оценки биодоступности микроэлементов растениями изпочвы.

Всоответствии с вышеизложенным настоящий стандарт устанавливаетбиотест, в основе которого лежит разрастание корня растения приконтакте с почвой, но при этом корни не должны прорастать сквозьвсю толщину слоя почвы. Несмотря на то, что даннаяэкспериментальная схема не полностью отражает реальные условиярассматриваемых процессов, происходящих в природе, тем не менее,она позволяет проводить достаточно правомерное сравнениебиодоступности микроэлементов из анализируемых видов почв. Болеетого, измерения, проводимые на последней стадии биотеста, могут вбольшей степени отражать степень биодоступности, чем любыеизмерения степени токсичности на последней стадии.

1Область применения


Настоящий стандартустанавливает метод определения интенсивности биодоступностимикроэлементов для растений или концентраций микроэлементов впобегах и корневой системе растений (далее по тексту -биотест).

Биотест состоит из двухпоследовательных стадий:

1) предварительноевыращивание растений на питательных растворах;

2) выращивание растенийна пробах почв.

Концентрациюмикроэлементов в побегах и корневой системе растений иинтенсивность биодоступность* для растений микроэлементовопределяют при завершении второй стадии биотеста.
_______________
*Текст документа соответствует оригиналу. - Примечание изготовителябазы данных.


Биотест используютпреимущественно в отношении сельскохозяйственных растений, растущихна почвах и почвенных массах в аэробных условиях. При этом три видарастений (капуста Brassica oleracea; овсяница тростниковаяFestuca arundinacea, томат Lycopersicon esculentum,см. 7.1) были предложены в качестве объектов при проведениибиотеста. Исследовали также и другие виды и сорта растений (см.7.1, приложение А).

Метод биотеставалидирован для ряда микроэлементов, таких как мышьяк, кадмий,хром, кобальт, медь, свинец, никель и цинк, однако допускаетсятакже проводить определение и некоторых других микроэлементов (см.приложение А).

При проведении биотестаиспользуют почвы и почвенные массы, в том числе почвы,видоизмененные до или после отбора проб в естественных условиях,содержащие компосты, грязь, сточные воды или иные материалы, отходыили отбросы.

Примечания

1Данный биотест не предназначен для определения биодоступности длярастений микроэлементов, имеющих свойство испаряться, а также вслучае впитывания листьями растения влаги (например, из атмосферныхосадков).

2Данный биотест не предназначен для определения биодоступности длярастений микроэлементов растениями* органических загрязнителей.Допускается использовать аналогичную экспериментальную методику,однако при этом следует обеспечить физическое отделение корнейрастения от почвы при помощи полиамидной ткани, не впитывающейорганические загрязнители.
_______________
*Текст документа соответствует оригиналу. - Примечание изготовителябазы данных.

2Нормативные ссылки


При применении настоящегостандарта необходимо использовать самые последние изданиянижеприведенных международных стандартов* с учетом всех внесенных вних изменений и технических поправок (если таковые были).
________________
*Таблицу соответствия национальных стандартов международным см. поссылке. - .


ISO 3696:1987, Water foranalytical laboratory use - Specification and test methods (Водадля лабораторного анализа. Технические требования и методыиспытаний)

ISO 10390:2005, Soilquality - Determination of pH (Качество почвы. Определение рН)

ISO 10694:1995, Soilquality - Determination of organic and total carbon after drycombustion (elementary analysis) (Качество почвы. Определениесодержания органического и общего углерода после сухого сжиганияэлементарный анализ)

ISO 11269-2:2012, Soilquality - Determination of the effects of pollutants on soil flora- Part 2: Effects of contaminated soil on the emergence and earlygrowth of higher plants (Качество почвы. Определение воздействиязагрязняющих веществ на флору почвы. Часть 2. Воздействиезагрязненной почвы на всхожесть и ранний рост высших растений)

ISO 11277:2009, Soilquality - Determination of particle size distribution in mineralsoil material - Method by sieving and sedimentation (Качествопочвы. Определение гранулометрического состава минеральных почв.Метод просеивания и осаждения)

ISO 11465:1993, Soilquality; determination of dry matter and water content on a massbasis; gravimetric method (Качество почвы. Определение содержаниясухих веществ и воды по массе. Гравиметрический метод)

3Термины и определения


Внастоящем стандарте применены следующие термины с соответствующимиопределениями:

3.1 загрязнитель(contaminant): Вещество, присутствующее в почве в результатечеловеческой деятельности (см. [3]).

Примечание - Данноеопределение не включает тот аспект, что нанесенный ущерб являетсярезультатом наличия загрязнителя.

3.2 биодоступность изокружающей среды (environmental availability): Количествозагрязнителя, которое путем десорбции, имеющей физико-химическиймеханизм, может потенциально накапливаться в растении (см.[10]).

3.3 биодоступность изпочвы (environmental bioavailability): Количество соединения,присутствующего в почве, которое поступает в организм растения врезультате физиологических процессов (см. [10]).

3.4 функциональнаяспособность почвы поддерживать естественную среду (habitatfunction): Способность почвы или почвенной массы поглощатьзагрязнители так, что они не могут быть удалены путем вымыванияводой или путем вовлечения в биоценоз через включения в пищевыецепи с участием организмов, обитающих в почве (см. [3]).

3.5 микроэлемент(trace element): Химический элемент, содержащийся в почве вконцентрации менее 100 мг/кг.

Примечание - Данноеопределение приведено в [16].

3.6 функциональнаяспособность почвы удерживать загрязнители (retention function):Способность почвы или почвенной массы поглощать загрязнители такимобразом, чтобы они не могли быть удалены путем смывания водой илипутем их вовлечения в процессы биоценоза путем их включения впищевые цепи с участием организмов, обитающих в почве (см.[3]).

3.7 ризосфера(rhizosphere): Количество почвы, окружающей живые корни растения, скоторой они взаимодействуют посредством своей физиологической (илилюбой другой) активности (см. [17]).

3.8 почва (soil):Самостоятельное естественно-историческое органоминеральноеприродное тело, возникшее на поверхности земли в результатедлительного воздействия биотических, абиотических и антропогенныхфакторов, состоящее из твердых минеральных и органических частиц,воды и воздуха и имеющее специфические генетико-морфологическиепризнаки, свойства, создающие для роста и развития растенийсоответствующие условия (см. [3]).

3.9 почвеннаямасса (soil material): Субстанция, отобранная из какой-либопочвы и модифицированная в результате человеческой деятельности (кней относятся следующие варианты: отбор вынутого грунта, отборвычерпываемого грунта, получение тепличных грунтов, обработанныхпочв, сыпучих почв и т.п. (см. [10]).

3.10 токсикологическаябиодоступность (toxicological bioavailability): Процесснакопления в организме растений загрязнителя в концентрациях,которые оказывают токсическое действие (см. [10]).

4Сущность метода


Настоящий стандартсодержит описание экспериментальной методики проведения биотеста,первоначально разработанной в [18]-[20]. Два последовательных этапабиотеста приведены на рисунке 1.

Рисунок 1 - Двухстадийная методика проведения биотеста

ГОСТ ISO 16198-2017 Качество почв. Метод определения биодоступности микроэлементов почвы для растений


Обозначения:

a) прорастание семян(период 7 дней)

b) предварительноеобразование проростков (период 7 дней)

1 - предварительное выращивание растения напитательных растворах (период 14 дней); 2 - выращиваниерастения на пробах почв (период 8 дней); 3 - алюминиеваяфольга; 4 - плавающая платформа; 5 - семена; 6- горшок для растения; 7 - питательный раствор 1; 8 -воздуходувка нагнетания воздуха; 9 - сито с диаметром пор 30мкм; 10 - воздух; 11 - корневая система; 12 -питательный раствор 2; 13 - проростки; 14 - слойпочвы толщиной 6 мм; 15 - питательный раствор 3; 16 -набор полосок фильтровальной бумаги

Рисунок 1 - Двухстадийная методика проведения биотеста


Втечение первого этапа продолжительностью 14 дней происходитобразование проростков из семян на питательном растворе длядостижения необходимой биомассы растения и образования плотнойкорневой системы. В течение второго этапа сформировавшуюся корневуюсистему приводят в контакт со слоем пробы почвы толщиной 6 мм,просеянной через сито с размером частиц 2 мм. Выращивают растенияна пробах почв в течение 8 дней.

После завершенияпредварительного выращивания растения на питательных растворахотбирают серию контрольных растений для определения общегосодержания микроэлементов в побегах и корневой системе растений дотого, как растения будут высажены на почву. Затем целые растения(побеги с корневой системой) отбирают после завершения ихвыращивания на пробах почв. Определяют биомассу растений иконцентрацию микроэлементов в побегах и корневой системе. Биотестсчитают законченным, если:

-достигнута определенная концентрация микроэлементов в побегах икорневой системе при завершении выращивания растений на пробахпочв

или

-достигнута определенная интенсивность накопления микроэлементоврастениями при завершении выращивания растений на пробах почв.

Если данные двух значенийкоррелируют между собой (см. [21]), интенсивность накопления,рассматривают как репрезентативный показатель биодоступностимикроэлементов растениями в течение периода выращивания растений напробах почв, поскольку, в отличие от значений концентрациймикроэлементов, значения интенсивности биодоступности характеризуютнакопление растениями микроэлементов только в период выращиваниярастений на пробах почв.

Если в ходепредварительного выращивания растения на питательных растворах непроявляются токсические признаки, обусловленные неблагоприятнымихимическими свойствами почвы, а также чрезмерная биодоступностьмикроэлементов растениями, то в целях адекватного сравнениядопускается проводить биотест для определения степенибиодоступности, используя широкий спектр различных почв, в томчисле почв, которые сильно загрязнены.

5Оборудование и вспомогательные материалы


Оборудование ивспомогательные материалы приведены ниже. Все оборудование, котороеконтактирует с пробами почв, растениями или реактивами, не должно взначительной степени впитывать следовые элементы. Оно также недолжно загрязнять пробы.

5.1 Сита с номинальнымразмером отверстий 2 мм.

5.2 Весы с погрешностьювзвешивания ±100 мг.

5.3 Весы с погрешностьювзвешивания ±1 мг.

5.4 Камера дляискусственного климата, в которой могут быть созданы иподдерживаться требуемые климатические условия (см. 7.4).

5.5 Сушильный шкафвентилируемый, для высушивания почв или почвенных масс притемпературе 25°С, а также побегов и корневой системы притемпературе 50°С.

5.6 Ножницы с рабочимполотном, изготовленным из оксида циркония.

5.7 Оборудование дляизмельчения, изготовленное из оксида циркония.

6Реактивы

6.1 Общиеположения

Используют реактивыквалификации ч.д.а. концентрацией не более 5 мг/кг. Используют водустепени очистки 3 (см. ISO 3696) или воду эквивалентной чистоты,например, дистиллированную или деионизированную, сэлектропроводностью не более 5 мкСм/см при температуре 25°С и сдиапазоном значений рН от 5,0 до 7,5 ед. рН.

6.2 Водорода перекись, молярной концентрацией 34,01 г/моль.

6.3 Кальций хлористыйдвухводный, молярной концентрацией 147,07 г/моль.

6.4 Борная кислота,, молярной концентрацией 61,83 г/моль.

6.5 Кальций азотнокислыйчетырехводный, молярной концентрацией 236,15 г/моль.

6.6 Калий азотнокислый, молярной концентрацией 101,1 г/моль.

6.7 Магний сернокислыйсемиводный, молярной концентрацией 246,48 г/моль.

6.8 Калий фосфорнокислый, молярной концентрацией 136,09 г/моль.

6.9Этилендиаминтетрауксусной кислоты натрия и железа (III) соль,NaFe(lll)EDTA молярной концентрацией 367,05 г/моль.

6.10 Медь хлористаядвухводная, молярной концентрацией 170,48 г/моль.

6.11 Марганец хлористыйчетырехводный, молярной концентрацией 197,91 г/моль.

6.12 Цинк сернокислыйсемиводный, молярной концентрацией 287,54 г/моль.

6.13 Натрия молибдатадигидрат, молярной концентрацией 241,95 г/моль.

7Оборудование для проведения биотеста

7.1 Видырастений

При проведении биотестаиспытывали три вида растений (В. oleracea, F. arundinacea иL. esculentum), которые были отобраны среди видов растенийпо причине их достаточно выраженной способности к биодоступности, атакже были отобраны некоторые типичные сельскохозяйственныекультуры, совместно обладающие максимально выраженнойбиодоступностью микроэлементов (особенно мышьяка, кадмия, меди,свинца и цинка) из почв, имеющих самые различные физико-химическиесвойства и первоисточник содержащихся в них микроэлементов (см.[21]). Для каждого выбранного вида были рекомендованы следующиесорта: для В. oleracea - castelard, для F.arundinacea - calina, для L. esculentum - fline.

При отсутствии указанныхсортов растений в продаже допускается использование других сортовпри условии, что они демонстрируют требуемый рост и формируютгомогенную корневую систему в ходе биотеста при испытании различныхвидов почв. Причину, по которой были выбраны сорта растений,отличные от рекомендуемых, отмечают в протоколе испытания. Дляконкретного сорта растения семена, используемые в единичной серииэкспериментов, должны быть отобраны из одной и той же партии.

Допускается отбордополнительных видов растений, например видов с особымифизиологическими характеристиками или имеющих экологическое,сельскохозяйственное или экономическое значение в конкретныхрегионах мира, либо для оценки растений, произрастающих вопределенных зонах при условии, что данные виды растенийдемонстрируют требуемый рост и формируют гомогенную корневуюсистему в ходе биотеста при испытании различных видов почв.Перечень видов растений, отвечающих требованиям биотеста в планеспособности к росту, некоторые из которых валидированы в результатепроведения стандартизированной процедуры, приведен в приложении А.Причину, по которой были выбраны дополнительные виды растений,отмечают в протоколе испытания.

Примечания

1Биотест следует проводить, используя семена, не обработанныепестицидами, насколько это возможно. При отсутствии такойвозможности, данный факт отмечают в протоколе испытания.

2Использование в биотесте сортов растений, отличных отрекомендуемых, может привести к результатам, которые будутотклоняться от типичных результатов в той же степени, как и прииспользовании различных видов растений.

7.2 Оборудование дляпроведения биотеста

Данное оборудование,контактирующее с пробами почв, растений и с реактивами, не должноадсорбировать вещества и материалы, оценку которых проводят, атакже не должно вносить загрязнение в пробы.

Всостав оборудования входят горшки для растений, которые способнывмещать растение с момента начала предварительного выращиваниярастений на питательных растворах до завершения их выращивания напробах почв. Горшки для растений должны обеспечивать формированиерастением плоской и плотной корневой системы, а также легкоеотделение растения от пробы почвы. Горшок представляет собойцилиндр, к верней части которого прикреплена верхняя крепежнаянакладка, а снизу к цилиндру с помощью регулируемого зажима прочноприкреплена полиамидная ткань с размером пор 30 мкм. Данная схемаприведена на рисунке 2.

Рисунок 2 - Схема сборной конструкции горшка для растения

1 - верхняя крепежная накладка; 2 - цилиндр;3 - регулируемый зажим; 4 - полиамидная ткань сразмером пор 30 мкм

Рисунок 2 - Схема сборной конструкции горшка для растения


Схема сборной конструкциигоршка для растения, используемой при предварительном выращиваниирастений на питательных растворах, обеспечивает прорастание семян иформирование плотной корневой системы у растений. Она обеспечиваетплотный контакт семян или образовавшейся корневой системы спитательным раствором. Данная схема включает платформу с 12круглыми отверстиями, плавающую на поверхности питательногораствора в баке. В отверстия платформы помещают горшки длярастений. Питательный раствор непрерывно насыщают воздухом припомощи системы барботирования, состоящей из воздушного насоса икапиллярных трубок, соединенных с диффузором, расположенным на днебака. Плавучесть платформы является весьма важным факторомгарантирования однородности контактирования всех горшков спитательным раствором. Рассматриваемая схема также позволяетограничить воздействие солнечного или искусственного света напитательный раствор и тем самым предотвратить разрастание в немводорослей. Данная схема приведена на рисунке 3.

Рисунок 3 - Схема конструкции, используемой при предварительномвыращивании растений на питательных растворах

1 - бак;

2 - плавающая платформа с отверстиями; 3 -питательные растворы (1 или 2); 4 - диффузор воздуха;5 - воздух; 6 - трубка; 7 - воздушныйнасос

Рисунок 3 - Схема конструкции, используемой при предварительномвыращивании растений на питательных растворах


Схема конструкции,используемой при выращивании растений на пробах почв, должнаобеспечивать плотный контакт корневой системы растения и слояпочвы. Конструкция состоит из двух компонентов, а также в нейиспользуют три полоски фильтровальной бумаги, один конец которыхконтактирует со слоем почвы, а другой - опущен в питательныйраствор в сосуде вместимостью 0,5 дм, расположенном в нижней части сборки.Данная конструкция гарантирует надежный контакт корневой системырастения со всей поверхностью слоя почвы. Полоски фильтровальнойбумаги должны быть полностью смоченными в течение всего периодавыращивания растений на пробах почв. Данная схема приведена нарисунке 4.

Рисунок 4 - Схема конструкции, используемой при выращиваниирастений на пробах почв

1 - крыльчатая гайка; 2 - горшок; 3 -слой почвы (толщиной 6 мм); 4 - винт; 5 - винтоваягайка; 6 - подложка для почвы; 7 - навинчивающаясякрышка; 8 - полоски фильтровальной бумаги; 9 - сосуд;10 - питательный раствор 3

Рисунок 4 - Схема конструкции, используемой при выращиваниирастений на пробах почв


Все части конструкций,приведенных выше, допускается использовать многократно (заисключением регулируемого зажима, полосок фильтровальной бумаги иполиамидной ткани) при условии их промывания горячей водой (дляудаления с их поверхности растительной слизи и биопленок,образованных в результате деятельности микроорганизмов), 10%-нойазотной кислотой и достаточно большим количеством дистиллированнойили деионизированной воды.

Допускается изготовлениесамодельных конструкций при условии, что размеры их частейпропорциональны и их характеристики аналогичны установленным.

Подробный перечень частейи их характеристик приведен в таблице 1.


Таблица 1 - Перечень частей конструкций, применяемых при проведениибиотеста

Стадиябиотеста

Компонент

N

Кол-во

Характеристики

-

Горшок для растения:

Цилиндр

1

1

ПВХ высокой плотности,выдерживающий высокую температуру, пищевой

Верхняя крепежная накладка

2

1

Из полиэтилена высокойплотности низкого давления, пищевой

Полиамидная ткань

-

1

Размеры 100 мм 100 мм, размеры пор 30 мкм

Регулируемый зажим

-

1

Размеры 180 мм 2,4 мм

Предварительное выращиваниерастения на питательных растворах

Бак

3

1

Вместимость 12 дм, размеры 400 мм 294 мм 165 мм, из полиэтилена высокой плотностинизкого давления, светонепроницаемый, пищевой

Плавающая платформа сотверстиями

4

1

Из экструзионногополистирола

Воздушный насос с двумявыходами

-

1

Скорость потока воздуха100-200 дм в час на один выход

Капиллярная трубка

-

2

Из ПВХ, внутренний диаметрприблизительно 4 мм

Устройство отведения

-

1

При необходимости

Диффузор воздуха

-

2

Керамический, размеры 100 мм 10 мм

Выращивание растения на пробахпочв

Сосуд с завинчивающейсякрышкой

5

1

Светонепроницаемый, из белогополипропилена, пищевой

Полоска фильтровальнойбумаги

-

3

Уплотненная, беззольнаяфильтровальная бумага

Подложка для почвы

6

1

Из полиэтилена высокойплотности низкого давления, пищевой, толщина 6 мм

Винт

-

4

Из полиэтилена высокойплотности низкого давления

Винтовая гайка

-

8

Из полиэтилена высокойплотности низкого давления

Количество компонентов в соответствии сприложением В.

Количество компонентов для каждойкомбинации из трех компонентов биотеста - горшка для растения,конструкции для предварительного выращивания растения напитательных растворах и выращивания растения на пробах почв.

Бак должен обеспечить размещение платформыс 12 горшками на поверхности питательного раствора, объем которого6 дм.

Во избежание лишних затрат временидопускается использовать только два винта, две крыльчатые гайки ичетыре винтовые гайки.

7.3 Состав питательныхрастворов

При проведении биотестаготовят три питательных раствора: для прорастания семян (раствор1), развития проростков (раствор 2) и выращивания растения на почве(раствор 3).

Раствор 1 готовят путемсмешивания раствора молярной концентрацией 600мкмоль/дм (см. 6.4) и раствора молярной концентрацией 2 мкмоль/дм (см. 6.5).

Раствор 2 готовят путемдобавления в сосуд растворов реактивов в следующейпоследовательности:

калия фосфорнокислогомолярной концентрацией 136,09 г/моль,

калия азотнокислогомолярной концентрацией 101,1 г/моль,

кальция азотнокислогочетырехводного молярной концентрацией 236,15 г/моль,

магния сернокислогосемиводного молярной концентрацией 246,48 г/моль,

меди хлористойдвухводной, молярной концентрацией 170,48 г/моль,

борной кислоты молярнойконцентрацией 61,83 г/моль,

марганца хлористогочетырехводного молярной концентрацией 197,91 г/моль,

цинка сернокислогосемиводного молярной концентрацией 287,54 г/моль,

натрия молибдатадигидрата молярной концентрацией 241,95 г/моль,

этилендиаминтетрауксуснойкислоты натрия и железа (III) соли, молярной концентрацией 367,05г/моль.

Раствор 3 готовят путемдобавления в сосуд растворов реактивов в следующейпоследовательности:

калия фосфорнокислогомолярной концентрацией 136,09 г/моль,

калия азотнокислогомолярной концентрацией 101,1 г/моль,

кальций азотнокислогочетырехводного* молярной концентрацией 236,15 г/моль,

________________

*Текст документа соответствует оригиналу. - Примечание изготовителябазы данных.


магния сернокислогосемиводного молярной концентрацией 246,48 г/моль.

7.4 Климатическиеусловия в камере искусственного климата

Допускается выращиваниерастений в камере искусственного климата, фитотроне или теплице приусловии, что в них могут быть созданы климатические условия,аналогичные приведенным в таблице 2.


Таблица 2 - Климатические условия, требуемые для проведениябиотеста

Климатическиеусловия

Кол-во дней

Кол-воночей

Фотопериод, ч

16

8

Фотосинтетически активнаярадиация (свет) (диапазон длин волн 400-700 нм), инициирующаяфотосинтез, мкмоль фотонов на кв. метр в секунду

200-400

-

Температура, °С

25±3

20±2

Относительная влажность,%

75±5

70±5

При условии нахождения растения взатемненном месте.

8Предварительная подготовка и анализ проб почв и почвенных масс

8.1 Сокращение пробпочвы и получение проб, состоящих из частиц требуемогоразмера

Пробы почвы и почвенныхмасс готовят таким образом, чтобы они состояли из частиц с размеромне более 2 мм. Не допускается тонкий помол материала проб,поскольку это может привести к изменению характеристик процессабиоаккумуляции. Частицы в пробе с размером более 2 мм, имеющиенатуральное происхождение (например, камешки, гравий, веточки ит.п.) отделяют от пробы. Если нет возможности провести дроблениеили просеивание лабораторной пробы по причине высокого содержания вней влаги, допускается уменьшить количество влаги в пробе доуровня, когда пробу станет возможным просеять. В таком случае пробусушат при температуре не более 25°С.

Примечание - Необходимоизбегать сушки проб вулканических почв, содержащих аллофаны, прилюбой температуре, даже при температуре ниже 25°С. Данные виды почвследует хранить увлажненными при температуре 4°С.

8.2 Анализ почв ипочвенных масс

Определяютфизико-химические характеристики почв и почвенных масс:

-исходное содержание влаги (по ISO 11465);

-влагоемкость (по ISO 11269-2);

-структуру (по ISO 11277);

-рН воды и раствора хлористого кальция (по ISO 10390);

-концентрацию органического углерода (по ISO 10694).

Примечание - Определениеструктуры, рН и концентрации органического углерода необходимо дляинтерпретации результатов.

9Методика проведения биотеста и дополнительных вспомогательныхпроцедур

9.1 Общая блок-схемаметодики

Общая блок-схема методикиприведена на рисунке 5.

Рисунок 5 - Блок-схема, отражающая последовательность стадийметодики, включающей проведение биотеста

ГОСТ ISO 16198-2017 Качество почв. Метод определения биодоступности микроэлементов почвы для растений


-1-й день - день начала биотеста и предварительного ПВРПР;

-14-й день - день завершения предварительного ПВРПР и начала периодаВРНПП;

-22-й день - день завершения периода ВРНПП и завершениябиотеста.

Рисунок 5 - Блок-схема, отражающая последовательностьстадий методики, включающей проведение биотеста

9.2 Отбор и подготовкасемян

Семена для биотестаотбирают в соответствии с приложением С. Не используют семена,которые повреждены, имеют неправильную форму или размер.

Во избежание прорастанияотобранные семена хранят в темном и сухом месте при оптимальнойтемпературе 4°С.

9.3 Процессыпрорастания семян и развития проростков

Поверхность семянстерилизуют путем погружения в 6%-ный раствор перекиси водорода на10 мин и трехкратного промывания дистиллированной илидеионизированной водой.

Требуемое количествосемян помещают на поверхность полиамидной ткани, находящейся вгоршке. Для В. oleracea, F. arundinacea и L.esculentum количество семян на один горшок составляет 50, 80 и40 соответственно. Информация о количестве помещаемых в горшоксемян других видов растений, используемых в рамкахстандартизированной экспериментальной методики, приведена вприложении С.

Для каждого вида почвыили почвенной массы готовят не менее пяти проб (т.е. горшков) дляданного вида растения. Кроме того, готовят не менее пяти горшков,растения в которых используют в качестве контрольных, сопределенными концентрациями в них микроэлементов (особенно этокасается меди и цинка). Данные процедуры должны быть выполнены доначала второй стадии биотеста - выращивания растений на пробахпочв.

Общее число горшков,которое необходимо подготовить для анализа конкретного видарастения, вычисляют по формуле

, (1)


где - число проб почв или почвенных масс;

- число проб (не менее 5);

- число горшков, растения в которыхиспользуют в качестве контрольных (не менее 5);

- поправочный коэффициент, обеспечивающийзапас надежности анализа (не менее 1,2).

Горшки с семенамивставляют в отверстия платформы (на одной платформе можноразместить 12 горшков), плавающей на поверхности питательногораствора 1 объемом 6 дм в баке. Семенам дают прорасти в течениедвух-четырех суток в темноте (бак закрывают алюминиевой фольгой).При появлении у проростков функционирующих фотосинтетическихорганов (зеленой пигментации семядоль или листьев), алюминиевуюфольгу снимают. Проростки продолжают расти до конца первой неделина том же самом питательном растворе.

Затем проросткам даютразвиваться в течение еще одной недели, но на питательном растворе2, который необходимо менять каждый третий день. При каждойочередной замене питательного раствора бак и плавающую платформуотделяют от сборки и тщательно промывают горячей водой, 10%-нойазотной кислотой и дистиллированной или деионизированной водой. Приэтом горшки на плавающей платформе переставляют произвольнымобразом.

9.4 Приготовление иинкубирование почв и почвенных масс

Параллельно с проведениемпредварительного выращивания растений на питательных растворах,пробы почв и почвенных масс инкубируют в течение двух недель втемноте в климатических условиях, аналогичных тем, которые былисозданы для растений (см. 7.4). Инкубирование необходимо длядостижения физико-химического равновесия в пробах, микрофлоракоторых интенсивно развивалась из-за увлажнения проб. Послепомещения требуемого количества проб (в пересчете на сухоевещество) в подходящий контейнер, пробы прессуют, чтобы достичьплотности приблизительно 1,2 г/см, затем смачивают их до такой степени, чтобыони впитали количество влаги, составляющее 70% их влагопоглощающейспособности, из питательного раствора 3. Определяютвлагопоглощающую способность почв и почвенных масс, спрессованныхдо той же плотности, что и пробы на подложке. Отверстие каждогоконтейнера должно обеспечить достижение равновесия с внешнейатмосферой. Регулярно проверяют содержание влаги и принеобходимости корректируют его путем добавления питательногораствора 3.

За один день до началавыращивания растений на пробах почв на каждую подложку для почвпомещают свежую пробу почвы (или почвенной массы) массой 9 г (впересчете на сухое вещество), чтобы образовался слой толщинойприблизительно 6 мм (плотность почвы - 1,2 г/см). Если нет возможности спрессовать почву доуказанной выше плотности, массу пробы почвы корректируют такимобразом, чтобы в любом случае получить слой толщиной 6 мм. Данныйфакт отмечают в протоколе испытания (см. раздел 13). К подложкамдля почв снизу прикрепляют сосуды вместимостью 0,5 дм, содержащие питательный раствор 3, вкоторый опущены полоски фильтровальной бумаги. В данных условияхпробы почв полностью насыщаются влагой. Подложки для проб почвплотно закрывают до начала выращивания на них растений, чтобыограничить испарение влаги и не допустить воздействия света.

9.5 Период выращиваниярастений на пробах почв

После завершенияпредварительного выращивания растений на питательных растворах,отбирают горшки с растениями, которые имеют однородную биомассу(что можно видеть невооруженным глазом). Остальные растения вдальнейшем не используют. Тщательно промывают отобранные горшкибольшим количеством дистиллированной или деионизированной воды,после чего прикрепляют их к нижней сборке таким образом, чтобыкорневая система растения плотно контактировала со слоем почвы наподложке. Растения в данных условиях выращивают в течение 8 сут.Питательный раствор 3 заменяют каждый второй день, за исключениемпоследнего дня проведения данной стадии биотеста. При каждой заменепитательного раствора нижний сосуд отделяют, тщательно промываютгорячей водой, 10%-ным раствором азотной кислоты и дистиллированнойили деионизированной водой. При замене раствора необходимособлюдать осторожность при обращении с указанными сборками и недопускать повреждения или изменения положения полосокфильтровальной бумаги, поскольку они обеспечивают отрегулированныйприток питательного раствора к корневой системе растений. Есликакая-либо полоска фильтровальной бумаги оказалась повреждена илиее положение было изменено, полоску незамедлительно заменяют другойлибо корректируют положение уже вставленной.

9.6 Отборрастений

После завершенияпредварительного выращивания растений отбирают горшки с растениями,являющиеся дублями и контрольными растениями. По завершении периодавыращивания растений на пробах почв горшки отделяют от нижнейсборки, содержащей слой почвы и также отбирают растения.

Из горшков вынимаютполиамидную ткань и тщательно промывают растения, состоящие изпобегов и корневой системы, дистиллированной или деионизированнойводой. Корневую систему промывают особо тщательно, так как онанаходилась в длительном контакте с почвой и необходимо не допуститьсущественного загрязнения ее частицами почвы размером менее 30 мкм,проникновение которых в корневую систему полиамидная ткань непредотвратила. Вынимают растения из горшков.

При определенииконцентраций микроэлементов в побегах и корневой системе побегиотрезают от корневой системы, а при определении интенсивностинакапливания микроэлементов растениями, что предположительно даетболее точные результаты, растения сохраняют целыми. Для удобствааналитика лузгу непроросших семян удаляют либо смешивают с корневойсистемой при условии, что это существенно не повлияет на биомассуили на содержание микроэлементов в корневой системе.

Пробы растений(представляющие из себя только побеги, только корневые системы илирастения целиком) помещают в подходящие контейнеры и высушивают всушильном шкафу при температуре не более 50°С. Когда масса пробстанет постоянной (что обычно происходит после 3 сут высушивания),их вынимают из шкафа, взвешивают с погрешностью ±1 мг и помещают всухие контейнеры, в целях исключения набора влаги.

Во избежание загрязненияс пробами работают в лабораторных перчатках, и побеги от корневойсистемы отрезают специальными ножницами (см. 5.6).

9.7 Измельчение иминерализация побегов и корневой системы

Измельчение пробыпроводят только тогда, когда необходима ее минерализация. В этомслучае пробы растений (побеги и корневую систему, вместе или поотдельности) измельчают при помощи соответствующего устройства (см.5.7). Если необходимо провести минерализацию пробы целиком, еенарезают на мелкие кусочки специальными ножницами (см. 5.6).

Процедура минерализациидолжна обеспечивать полное разрушение тканей растения и образованиедиоксида кремния и других малорастворимых минеральных веществ. Приопределении летучих микроэлементов (например, мышьяка или селена)методика минерализации должна быть модифицирована с цельюнедопущения потери данных элементов. Пример методики минерализацииприведен в приложении D (см. D.1).

При минерализации иопределении концентраций микроэлементов (см. 9.8) используютопределенное количество контрольных проб с целью проверкипотенциального загрязнения проб, а также учета фоновой концентрацииисследуемых элементов в пробах. Используют не менее однойконтрольной пробы. Данные контрольные пробы используют, принимая вовнимание исследуемые микроэлементы и предполагаемые диапазоны ихконцентраций.

9.8 Определениеконцентраций микроэлементов

Минерализаты пробрастений анализируют высокоточными методами, которые позволяютопределять концентрации на уровне нанограммов, микрограммов илимиллиграммов на грамм сухой биомассы. К данным методам относятсяатомно-абсорбционные методы (см. [4] и [13]), атомно-эмиссионнаяспектрометрия с индуктивно-связанной плазмой (см. [14]) имасс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой (см. [9]) либолюбой другой приемлемый метод.

Пример типичныхдиапазонов концентраций микроэлементов в минерализатах растенийприведен в приложении D (см. D.2).

10Критерии достоверности результатов биотеста


Использование в ходебиотеста горшков с растениями является приемлемым только привыполнении следующих критериев:

-прорастание семян имеет гомогенный характер, при этом в течениепервой недели предварительного выращивания растений на питательныхрастворах не образуется плесень;

-проростки имеют здоровую корневую систему, которая покрывает вседно горшка при завершении периода предварительного выращиваниярастений;

-проростки в ходе своего развития образуют гомогенную биомассу призавершении периода предварительного выращивания растений;

-побеги не содержат вредителей, здоровые, с отсутствием нарушенийпроцессов питания и фитотоксических признаков (например,пятнистости листьев, хлороза, выгорания, омертвения тканей,усыхания, увядания и т.п.) в течение всего периода проведениябиотеста;

-биомасса побегов и корневой системы значительно увеличивается смомента завершения периода предварительного выращивания до моментазавершения выращивания на пробах почв (см. 12.2);

-полоски фильтровальной бумаги должны быть всегда погружены впитательный раствор, поставлять в растения питательные вещества ине должны быть повреждены или перемещены в конце выращивания напробах почв;

-слои почв должны быть насыщены влагой в конце выращивания на нихрастений;

-должно быть обеспечено плотное контактирование корневой системырастений со слоем почвы в течение всего периода их выращивания напочвах.

11Выражение результатов

11.1 Определениеконцентрации микроэлементов в пробах растений и интенсивности ихнакопления

На основе концентрациймикроэлементов, определенных в минерализатах растений, проводят ихпересчет для проб растений (т.е. для побегов и корневой системы поотдельности либо объединенных вместе) в каждом горшке призавершении предварительного выращивания растений на питательныхрастворах (это касается горшков с контрольными растениями) и призавершении выращивания на пробах почв.

Концентрацию следовогоэлемента в пробе растения, , мкг/г сухой биомассы растения вычисляют поформуле

, (2)


где - концентрация микроэлемента в минерализатерастения, мкг/дм;

- объем минерализата растения, дм;

- масса измельченной пробы растения (впересчете на сухое вещество), подвергнутой минерализации, г.

Интенсивность накоплениямикроэлементов при выращивании растений на пробах почв , нг/м·с, при условии, что побеги и корневуюсистему анализировали по отдельности, вычисляют по формулам (3) и(4), а при условии, что побеги и корневая система были объединены,вычисляют по формуле (5)

; (3)


(4)




или

, (5)


где - масса микроэлемента, накопленногорастением при выращивании на пробах почв, нг;

- площадь поверхности корневой системы,контактировавшая с почвой, м (равна 12,6 см);

- продолжительность выращивания растений напробах почв, с (равна 8 сут);

- концентрация следового элемента в побегахрастений при завершении их выращивания на пробах почв, мкг/г сухойбиомассы;

- сухая биомасса побегов при завершениивыращивания растений на пробах почв, г;

- усредненная концентрация микроэлемента впобегах контрольных растений при завершении их предварительноговыращивания на питательных растворах, мкг/г сухой биомассы;

- усредненная сухая биомасса побеговконтрольных растений при завершении их предварительного выращиванияна питательных растворах, г;

- концентрация микроэлемента в корневойсистеме растений при завершении их выращивания на пробах почв,мкг/г сухой биомассы;

- усредненная концентрация микроэлемента вкорневой системе контрольных растений при завершении ихпредварительного выращивания на питательных растворах, мкг/г сухойбиомассы;

- усредненная сухая биомасса корневойсистемы растений при завершении их предварительного выращивания напитательных растворах, г;

- концентрация микроэлемента в растениях(побегах и корневой системе) при завершении их выращивания напробах почв, мкг/г сухой биомассы;

- сухая биомасса растений (побегов икорневой системы) при завершении их выращивания на пробах почв,г;

- усредненная концентрация микроэлемента вконтрольных растениях (побегах и корневой системе) при завершенииих предварительного выращивания на питательных растворах, мкг/гсухой биомассы;

- усредненная сухая биомасса контрольныхрастений (побегов и корневой системы) при завершении ихпредварительного выращивания на питательных растворах, г.

11.2 Представлениерезультатов

11.2.1 Табличноепредставление результатов

Полученные результатыпредставляют в виде таблиц, в которые вносят значения биомасс иконцентраций следовых элементов (для побегов, для корневой системыили для целых растений), интенсивности биоаккумуляции следовыхэлементов контрольными растениями при завершении ихпредварительного выращивания на питательных растворах, а также призавершении выращивания растений на пробах почв. В каждую таблицутакже вносят результаты статистической обработки полученныхзначений (см. раздел 12).

11.2.2 Графическоепредставление результатов

Результаты такжепредставляют в графическом виде (например, среднеарифметическиезначения биомасс побегов, корневой системы или целых растенийпредставляют в виде гистограмм) с учетом среднеквадратическогоотклонения. Значения, полученные для исследованных видов растений(в том числе для контрольных), которые выращивались на различныхвидах почв, представляют параллельно. Значения биомасс побегов иликорневой системы по отдельности представляют в виде графика,отмечая значения биомассы побегов над осью х, а значения биомассыкорневой системы - под осью х.

Среднеарифметическиезначения концентраций микроэлементов в побегах и корневой системепо отдельности со значениями среднеквадратических отклонений такжепредставляют в виде гистограмм. Значения, полученные дляисследованных видов растений (в том числе для контрольных), которыевыращивались на различных видах почв, представляют параллельно.Значения концентраций каждого микроэлемента в побегах или корневойсистеме по отдельности представляют в виде графиков (для каждогоследового элемента строят индивидуальный график), отмечая значенияконцентраций в побегах над осью х, а корневой системы - под осьюх.

Среднеарифметическиезначения интенсивности биодоступности микроэлементов растениями созначениями среднеквадратических отклонений также представляют ввиде гистограмм. Значения, полученные для исследованных видоврастений (в том числе для контрольных), которые выращивались наразличных видах почв, представляют параллельно. Для каждогоследового элемента строят индивидуальный график.

Вкаждую графическую схему вносят результаты статистической обработкизначений полученных результатов (см. раздел 12).

12Статистическая обработка результатов

12.1 Общиеположения

Значительный разбросзначений биодоступности для различных микроэлементов, различныхвидов почв, обработанных почв (например, путем добавления в нихорганических отходов), различных видов растений подвергаютобработке, используя соответствующий статистический критерий(например, анализ вариаций ANOVA множественного сравнения значений,0,05). Если статистический подход базируетсяна параметрическом анализе, то допускается гипотеза, что полученныерезультаты имеют нормальное распределение, их обработка независимаи разброс значений является однородным при различных методах ихобработки. Сначала проверяют истинность данных гипотез. Еслирезультаты биотеста соответствуют данным гипотезам, статистическуюобработку продолжают дальше. В противном случае результатыкорректируют и к ним снова применяют соответствующий статистическийкритерий. Если применение данного критерия приводит к получениюадекватных результатов и разброс результатов приемлем,параметрическую обработку продолжают дальше, даже если послекоррекции результатов имеет место их незначительное несоответствиеусловиям применяемого критерия. В противном случае, когда послекоррекции результатов несоответствие условиям критерия недопустимобольшое, проводят статистическую обработку, используянепараметрические методы.

12.2 Определениестатистически значимых особенностей значений биомассырастений

Достоверность результатовбиотеста в значительной степени зависит от степени увеличениябиомассы побегов и корневой системы в период с момента завершенияпредварительного выращивания растений на питательных растворах домомента завершения их выращивания на пробах почв. Для каждого видарастений определяют степень увеличения биомассы.

Биотест разработан такимобразом, чтобы не допустить проявления токсичности, что позволяетпроводить обоснованное сравнение влияния различных видов обработкина биодоступность микроэлементов растениями. Для каждого видарастений определяют наличие существенного различия в количествебиомассы побегов и корневой системы при применении различных видовпочв, а также по-разному обработанных почв при завершении периодавыращивания на них растений.

12.3 Определениестатистически значимых особенностей результатов, полученных призавершении определения биодоступности

Вслучае, когда побеги и корневую систему обрабатывают поотдельности, для каждого вида растений и микроэлемента определяютналичие существенного различия в концентрациях микроэлементов вкаждой пробе частей растения при применении различных видов почв, атакже по-разному обработанных почв при завершении периодавыращивания на них растений.

Независимо от того,обрабатывали ли побеги и корневую систему растений по отдельностиили вместе, рассчитывают интенсивность накопления растениямимикроэлементов (см. 11.1). Качество данного процесса сильно зависитот однородности биомасс частей растений и концентрациймикроэлементов в контрольных растениях, собранных при завершениипериода их предварительного выращивания на питательных растворах.Если результаты определения биомассы достаточно приемлемы, тоопределение концентраций микроэлементов более подверженовоздействию мешающих влияний при проведении биотеста и особенноподвержено влиянию загрязнений в пробах. Если, несмотря напредпринятые особые меры предосторожности, в течение данной стадиибиотеста контрольные растения предположительно оказалисьзагрязненными, для выявления непригодных растений при определенииконцентрации микроэлементов, накопленных в пяти пробах растений,применяют тест Граббса (см. [22]). В протоколе испытаниярегистрируют все случаи исключения непригодных растений ссоответствующим обоснованием (см. раздел 13).

Если расчет интенсивностинакопления привел к получению приемлемых результатов, для каждоговида растения и микроэлемента определяют наличие существенногоразличия в интенсивности биодоступности микроэлементов растениямипри применении различных видов почв, а также по-разномуобработанных почв при завершении периода выращивания на нихрастений.

13Протокол испытания


Протокол испытания долженсодержать следующую информацию:

a) ссылку на настоящийстандарт;

b) описание видоврастений, используемых в биотесте, в соответствии с классификациейЛиннея; описание сортов растений и указание источниковрастений;

c) описание оборудования,применяемого при проведении биотеста, особенно в тех случаях, когдаоно отличается от оборудования, приведенного в таблице 1;

d) описание климатическихусловий в камере искусственного климата, мониторинг которыхпроводили (см. 7.4);

e) описание обработанныхи необработанных почв и почвенных масс, использованных припроведении биотеста, а именно:

1) акт отбора проб иместо отбора проб;

2) протокол, в которомрегистрируют внесение в пробы почв и почвенных масс определенныхвеществ и материалов (например, органических отходов) перед началомсоответствующей стадии биотеста;

3) физико-химическиехарактеристики почв и почвенных масс (см. 8.2);

f) описание всехподробностей проведения биотеста, не установленных в настоящемстандарте и всех факторов, которые потенциально могли повлиять нарезультаты биотеста, в том числе:

1) повреждение каких-либокомпонентов, используемых при проведении биотеста, видимыхневооруженным глазом (с приложением соответствующихфотографий);

2) формирование биомассырастений или создание концентрации микроэлементов в растениях призавершении периода их предварительного выращивания на питательныхрастворах (т.е. это касается контрольных растений), значениякоторых выходят за пределы диапазонов, приведенных в приложении Е(при этом необходимо представить соответствующие данные ипоясняющий комментарий);

g) данные, полученные врезультате проведения биотеста, вместе с результатами ихстатистической обработки с указанием ее методов и описанием видовпредставления этих данных, таких как составление соответствующихтаблиц (см. 11.2.1) или графиков, схем, диаграмм и гистограмм (см.11.2.1);

h) выводы, сделанные входе обсуждения полученных результатов биотеста.

Приложение А (справочное). Виды и сорта растений, приемлемые дляиспользования в биотесте

Приложение А
(справочное)


Втаблице А.1 приведен перечень видов и сортов растений, которыевыращивали при проведении биотеста, следуя экспериментальнойметодике, которая была в некоторой степени модифицирована посравнению с методикой, описанной в настоящем стандарте.

Таблица А.1 - Виды исорта растений, приемлемые для использования в биотесте

Видрастения

Сортрастения

Микро-
элементы

Эксперимен-
тальная методика

Результатнаблюдений

Примени-
мость

Номер,ссылка

Brassica napus

Duo

Побеги легкоповреждаются при манипуляциях

+

[21]

As, Cd, Cu, Pb,Zn

2

[23]

Cu

3

[24]

137Cs,63Ni

4

[28]

Brassica oleracea

Castelard

As, Cd, Cu, Pb,Zn

1

-

++

[21]

Bromus mollis

Samson

137Cs

4

-

++

[25]

Festuca arundinacea

Calina

As, Cd, Cu, Pb,Zn

1

-

++

[21]

Festuca ovina

Spartan

137Cs, 63Ni

4

-

++

[24]

[25]

Festuca rubra

Bastide

63Ni

4

-

++

[24]

Hordeum vulgare

Campanile

As, Cd, Cu, Pb,Zn

2


Корневая система имеет слишкомбольшую толщину

+

[21]

Vertige

137Cs

4

[25]

Lactuca sativa capitata

Carmen

As, Cd, Cu, Pb,Zn

2


Побеги легко повреждаются приманипуляциях

+

[21]

Sucrine

137Cs

4

[25]

Lolium perene

Oustal

As, Cd, Cu, Pb,Zn

2

-

++

[21]

[24]

Aubisque

137Cs,63Ni

4

[25]

Lycopersicon esculentumc

Fline

As, Cd, Cu, Pb,Zn

1

-

++

[21]

SaintPierre

Cu

3

[26]

SaintPierre

137Cs

4

[25]

Medicago sativa

Prunelle

As, Cd, Cu, Pb,Zn

2

Проблемы с прорастанием иразвитием корневой системы

+/-

[21]

Maya

137Cs

4

[25]

Nicotiana tabacum

SR1

Zn

5

-

++

[27]

Raphanus sativus

Flamboyant

63Ni

4

Проблемы с развитием побегов икорневой системы

-

[24]

Sorghum bicolour

Arkanciel

As, Cd, Cu, Pb,Zn

2

Проблемы, связанные сломкостью, корневая система имеет слишком большую толщину

+

[21]

Trifolium pratense

Miskawi

137Cs, 63Ni

4

-

++

[24]

[25]

Triticum aestivum

Premio

Aroona

Songlen

Tremie

As, Cd, Cu, Pb,Zn

Cu

137Cs

2


3

4

Корневая система имеет слишкомбольшую толщину

+

[21]

[28]

[25]

Triticum turgidum durum

Acalou

Cu

3

Корневая система имеет слишкомбольшую толщину

+

[20]

Отличия от стандартизированнойэкспериментальной методики (ЭМ):

ЭМ 1: полностью аналогична;

ЭМ 2: толщина слоя почвы 1-2 мм (что соответствует 3 г сухойпочвы), оборудование для проведения биотеста немного отличается отиспользуемого в стандартизированной ЭМ;

ЭМ 3: продолжительность периода предварительного выращиваниярастений на питательных растворах - 3 недели, толщина слоя почвы1-2 мм (что соответствует 3 г сухой почвы), оборудование дляпроведения биотеста немного отличается от используемого встандартизированной ЭМ;

ЭМ 4: продолжительностьпериода предварительного выращивания растений на питательныхрастворах - 16 сут, продолжительность периода выращивания на пробахпочв - 7 сут, толщина слоя почвы 3 мм, оборудование для проведениябиотеста немного отличается от используемого в стандартизированнойЭМ;

ЭМ 5: продолжительность периода предварительного выращиваниярастений - 4 недели (2 недели на питательном геле и остальные 2недели - на питательных растворах), толщина слоя почвы 1 мм (чтосоответствует 2 г сухой почвы), оборудование для проведениябиотеста немного отличается от используемого в стандартизированнойЭМ.

Приемлемость применения в рамках ЭМ иоборудования, используемых при проведении биотеста.

Три вида растений, выбранных для проведениябиотеста в рамках стандартизированной ЭМ.

При проведении биотеста использовали тригенотипа растения, генномодифицированных и не генномодифицированных(см. [27]).


Приложение В (справочное). Чертежи различных частей оборудованиядля биотеста

Приложение В
(справочное)

В.1 Горшок длярастения

Рисунок В.1 - Часть 1: цилиндр


Рисунок В.1 - Часть 1: цилиндр

Рисунок В.2 - Часть 2: крепежный обруч


Рисунок В.2 - Часть 2: крепежный обруч

В.2 Оборудование,используемое в течение периода предварительного выращиваниярастений на питательных растворах

Рисунок В.3 - Часть 3: бак


Рисунок В.3 - Часть 3: бак

Рисунок В.4 - Часть 4: плавающая платформа с отверстиями


Рисунок В.4 - Часть 4: плавающая платформа с отверстиями

В.3 Оборудование,используемое в течение периода выращивания растений на пробахпочв

Рисунок В.5 - Часть 5: сосуд с завинчивающейся крышкой


Рисунок В.5 - Часть 5: сосуд с завинчивающейся крышкой (на чертежеприведена только крышка)

Рисунок В.6 - Часть 6: подложка для пробы почвы (или пробыпочвенной массы)


Рисунок В.6 - Часть 6: подложка для пробы почвы (или пробыпочвенной массы)


Приложение С (справочное). Инструкции по отбору семян и определениютребуемого их количества для помещения семян в горшки для различныхвидов растений, используемых в биотесте в рамках данногометода

Приложение С
(справочное)


При определении массысемян конкретного растения при помощи точного взвешивания на весах(см. 5.4), т.е. имеющих массу не менее 10 мг, взвешиваютприблизительно 100 семян, одно за другим, и составляют частотнуюгистограмму, после чего устанавливают диапазон масс семян, впределах которого семена являются приемлемыми для проведениябиотеста (см. рисунок С.1). Таким образом, требуемое количествосемян можно отобрать исходя из их массы.

Рисунок С.1 - Частотная гистограмма распределения масс семянтвердой пшеницы (сорт Acalou)


Обозначения:

=57 мг;

=8 мг;

=250;

по оси х - количествосемян;

по оси у - массаотдельных семян, мг.

Рисунок С.1 - Частотная гистограмма распределения масссемян твердой пшеницы (сорт Acalou)


Семена, приемлемые дляиспользования в биотесте, расположены в диапазоне от до .

Вслучае, когда масса семян менее 10 мг и когда нет возможностипроводить точное взвешивание каждого семени, масса количествасемян, которое необходимо поместить в один горшок, будет иметьсущественный разброс значений (см. таблицу С.1). Для удобствадопускается использовать устройство для подсчета семян. В качествеальтернативы, для каждого вида растения сначала определяют массусемян, которая соответствует количеству семян, необходимому дляпомещения в один горшок. Затем соответствующую массу семянвзвешивают и помещают семена в горшок.


Таблица С.1 - Количество семян, помещаемое в один горшок

Наименованиевида растения

Наименованиесорта растения

Количествосемян на один горшок

Brassica napus

Duo

25

Brassica oleracea

Castelard

50

Festuca arundinacea

Calina

80

Hordeum vulgare

Campanile

5

Lactuca sativacapitata

Carmen

50

Lolium perenne

Oustal

40

Lycopersiconesculentum

Fline

40

Medicago sativa

Prunelle

60

Sorghum bicolour

Arkanciel

5

Triticum aestivum

Premio

2

Количество семян данных видов растенийиспользуют при проведении биотеста в рамках данного метода,аналогичной ЭМ, установленной в настоящем стандарте, т.е. когдапериод предварительного выращивания растений на питательныхрастворах имеет продолжительность 2 недели (см. [24]).


При изменении размеровдна горшка количество или массу помещаемых в горшок семян изменяютпропорционально.

Приложение D (справочное). Минерализация и анализ пробрастений

Приложение D
(справочное)

D.1 Пример методикиминерализации проб растений

Ниже приведена методика,которую использовали в процессе различных этапов валидациистандартизированного биотеста и которая приемлема для минерализацииширокого спектра проб растений, а также для определенияконцентраций кадмия, кобальта, хрома, меди, никеля, свинца и цинка.При ее применении происходит испарение некоторого количествамышьяка и других летучих микроэлементов из проб, в результате чегоможно лишь приблизительно оценить их концентрации в пробах. Дляточного определения концентраций данных микроэлементов используютдругие методы минерализации.

Ниже перечислены этапыметодики минерализации.

Этап 1: Взвешивают 500 мгпробы растения, предварительно высушенной в сушильном шкафу иизмельченной (или разрезанной на мелкие кусочки) и помещают вплатиновый тигель. Пробу прокаливают в печи при температуре 500°С втечение 2 ч.

Этап 2: Тигель охлаждают,образовавшуюся золу смачивают несколькими каплями водыультравысокой степени очистки (с электропроводностью 1820 мкСм/м),добавляют 2 см соляной кислоты молярной концентрацией 6моль/дм, кипятят на электроплитке до полногоиспарения жидкости. Добавляют 2 см того же раствора соляной кислоты и через 10мин фильтруют через беззольную фильтровальную бумагу в мерную колбувместимостью 50 см. Осадок минерализата на фильтре смывают вмерную колбу теплой водой ультравысокой степени очистки объемомприблизительно 25 см.

Этап 3: Фильтр с осадкомминерализата помещают в платиновый тигель и прокаливают в печи притемпературе 500°С в течение 30 мин для удаления остатковорганических веществ и самого фильтра. После охлаждения добавляютнесколько капель воды ультравысокой степени очистки и 2 см концентрированной плавиковой кислоты икипятят раствор на электроплитке до полного испарения жидкости (входе данного этапа происходит удаление диоксида кремния путем егорастворения в плавиковой кислоте и испарения образовавшегосягексафторида кремния).

Этап 4: К осадкудобавляют 1 см указанного выше раствора соляной кислоты,фильтруют раствор через беззольную фильтровальную бумагу ипромывают фильтр определенным количеством воды ультравысокойстепени очистки, смывая осадок с фильтра в ту же мерную колбу,которую использовали при проведении этапа 2. Объем в мерной колбедоводят до метки водой ультравысокой степени очистки.

После завершения этапа 4минерализат пробы растения готов для определения концентрациймикроэлементов в минерализатах.

D.2 Установленныедиапазоны концентраций микроэлементов в минерализатах пробрастений

Диапазоны концентрациймикроэлементов в минерализатах проб растений определяли в рамкахмежлабораторного сравнительного испытания проб растений, отобранныхпри завершении периода предварительного выращивания растений напитательных растворах (контрольных растений), а также призавершении периода выращивания растений на пробах почв. Данныедиапазоны приведены в таблице D.1.


Таблица D.1 - Установленные диапазоны концентраций микроэлементов вминерализатах проб растений

Наименованиевида растения

Диапазоныконцентраций различных микроэлементов, в микрограммах на граммсухой биомассы

As

Cd

Со

Cr

Cu

Ni

Pb

Zn

В. oleracea

побеги

0,007-
0,300

0,020-
61,000

0,02-
1,5

0,2-
13,4

2,2-
33,2

0,4-11

0-212

18-348

корневая система

0,09-
29

0,01-
275

0,14-
21,8

1,6-
21

37-512

2-57

0-10100

43-1336

F. arundinacea

побеги

0,003-
0,4

0,01-30

0,01-
1,6

0,19-
4,5

2,8-22

0,45-
14,3

0-141

11,5-247

корневая система

0,04-
20

0,015-
288

0,1-9

1,5-
15,6

7-345

2,1-96

0-7608

32-2060

L.esculentum

побеги

0,001-
1,2

0,004-
38

0,009-
1,2

0,15-
11,3

0,65-
17,6

0,17-22

0-651

2,5-280

корневая система

0,15-
21,7

0,05-
500

0,13-20

1,4-
22

9,2-
367

2,4-105

0-9885

5-2270

Значения концентрации свинца,соответствующие нижней границе диапазона концентраций, которыеопределяют в минерализате проб растений, в некоторых случаях ниже,чем среднее значение концентрации свинца в холостых пробах. Такимобразом, концентрацию свинца в данных пробах принимают равнойнулю.


Подробная информация обэкспериментальной методике данного испытания приведена в приложенииF (см. F.1).

Приложение Е (справочное). Установленные диапазоны биомассконтрольных растений и масс микроэлементов в контрольныхрастениях

Приложение Е
(справочное)


При проведениимежлабораторного сравнительного испытания проб растений, отобранныхпри завершении периода предварительного выращивания растений напитательных растворах (контрольных растений), были установленыдиапазоны биомасс и масс микроэлементов, приведенные в таблицах Е.1и Е.2. Подробная информация, касающаяся экспериментальной методикиданного испытания, приведена в приложении F (см. F.1). Данныерезультаты были получены при использовании оборудования, описанногов настоящем стандарте (см. 7.2 и приложение В).

Необходимо учитывать, чтоизменение размеров определенных компонентов используемогооборудования может повлиять на результаты измерений.


Таблица Е.1 - Установленные диапазоны биомасс контрольныхрастений

Наименованиевида растения и количество его проб,

Диапазоныбиомасс контрольных растений (биомасса выражена вмиллиграммах)

Побеги

Корневаясистема

Целоерастение

В. oleracea, =35

69-441

16-112

120-553

F. arundinacea, =40

56-214

32-207

137-403

L esculentum, =40

79-558

14-106

120-639



Таблица Е.2 - Установленные диапазоны масс следовых элементов,аккумулированных контрольными растениями (в скобках приведеноколичество соответствующих измерений в каждом случае)

Наименова-
ние вида растения

Диапазоны массмикроэлементов; значения выражены в микрограммах

As

Cd

Со

Cr

Cu

Ni

Pb

Zn

В. oleracea

0,01-0,09
(33)

0,007-0,229
(31)

0,03-0,15
(27)

0,5-1,0
(34)

3,5-22,8
(35)

0,5-1,8
(35)

0,02-3,56
(29)

9,8-33,4
(29)

F. arundinacea

0,006-0,069
(35)

0,004-0,371
(34)

0,02-0,13
(34)

0,48-0,95
(34)

2,0-8,3
(35)

0,5-1,7
(35)

0,02-12,12
(28)

6,0-24,7
(35)

L. esculentum

0,01-0,11
(36)

0,0-0,43
(38)

0,02-0,12
(35)

0,5-1,1
(36)

2,5-7,5
(35)

0,4-1,5
(37)

0,02-9,03
(34)

9,2-35,8
(34)


Приложение F (справочное). Межлабораторное сравнительноеиспытание

Приложение F
(справочное)

F.1 Материалы иметодология, используемые при проведении межлабораторногосравнительного испытания

Межлабораторноесравнительное испытание проводили с февраля по май 2012 г. В немпринимали участие восемь лабораторий, шесть из которых ранееникогда не проводили биотест:

1- UPR Recyclage et risque, Франция;

2- INERIS, Франция;

3- INRA, UMR Eco&Sols, Франция;

4- Institute for ecological chemistry, plant analysis and storedproduct protection, Германия;

5- Eurofins IPL Est, Laboratoires Etudes et Expertises, Ecotoxicologie, Франция;

6- Free university of Bolzano, University of Udine, Италия;

7- University of Agro-Bio Tech, de Science du sol, Бельгия;

8- University of natural resources and life sciences, RhizosphereEcology and Biogeochemistry Group, Австрия.

Перед проведением данногоиспытания каждая лаборатория проходила трехдневную подготовку,включающую как теоретические, так и практические аспекты,касающиеся оборудования для проведения биотеста и соответствующейэкспериментальной методики. После этого каждая лаборатория получаладанное оборудование, а также семена и пробы почв для ихиспользования в испытании.

Каждая лаборатория,независимо и параллельно с другими, проводила выращивание трехрекомендованных видов растений (B. oleracea, F.arundinacea и L. esculentum) на четырех видах почв всоответствии с методикой настоящего стандарта. Пробы почв обладализначительным разнообразием физико-химических характеристик и былизначительно загрязнены различными следовыми элементами (см. таблицуF.1).


Таблица F.1 - Основные физико-химические характеристики почв,используемых при проведении межлабораторного сравнительногоиспытания

N поч-
вы

Концентрацииразличных компонентов почв

Песок

Ил

Гли-
на

рН


As

Cd

Cr

Cu

Ni

Pb

Zn

1

740

102

158

7,7

66

13

14

1,7

90

98

32

163

432

2

561

322

117

6,2

не опреде-
лена

13

24

0,5

33

453

14

215

74

3

550

337

113

5,9

не опреде-
лена

25

10

4,2

38

24

12

590

429

4

527

311

162

6,7

6

41

203

100

109

388

131

131340

1172

Концентрации песка, ила и глины приведены вграммах на килограмм сухой почвы в соответствии с [15].

рН измеряли в соответствии с ISO 10390.

характеризует общую концентрацию карбонатовв почве, в граммах на килограмм сухой почвы, в соответствии с[2].

- общая концентрация органического углеродав почве, в граммах на килограмм сухой почвы, в соответствии с ISO10694.

Концентрации следовых элементов в почвахприведены в миллиграммах на килограмм сухой почвы, в соответствии с[7].


Проба 1 была отобрана сверхнего слоя сельскохозяйственной почвы, содержащей большоеколичество извести и загрязненной кадмием, медью, свинцом и цинкомиз-за неоднократного пропитывания почвы сточными водами Парижа втечение нескольких десятилетий. Проба 2 была отобрана с верхнегослоя достаточно кислой почвы в винограднике, загрязненной медью врезультате неоднократной обработки медьсодержащими фунгицидами.Проба 3 была отобрана с верхнего слоя кислой сельскохозяйственнойпочвы, загрязненной медью, свинцом и цинком в результате впитыванияоседающих атмосферных выбросов плавильного завода. Проба 4 былаотобрана с верхнего слоя почвы, сильно загрязненной мышьяком,кадмием, хромом, медью, никелем, свинцом и цинком главным образом врезультате впитывания оседающих атмосферных выбросов завода попереработке аккумуляторов.

При проведении испытанияв одной лаборатории процесс выращивания В. oleracea былнарушен, в результате чего не удалось получить приемлемые пробыданного растения. По этой причине только 7 лабораторий представилисвои результаты для данного вида растения, и все 8 лабораторийпредставили результаты для видов F. arundinacea и L.esculentum.

Вкаждой лаборатории проводили высушивание проб растений (побегов икорневых систем по отдельности) в сушильном шкафу, после чего пробыдоставляли в CIRAD at Montpellier (Франция) для определения ихбиомассы и для проведения их минерализации (см. приложение D).Концентрации следовых элементов в минерализатах проб определялиметодом массовой спектрометрии с индуктивно связанной плазмой.

F.2 Результатымежлабораторного сравнительного испытания и ихинтерпретация

При отборе побегов икорневой системы растений по отдельности проводилась статистическаяобработка полученных в каждой лаборатории значений концентрациймикроэлементов в побегах и в корнях, а также значений интенсивностибиодоступности растениями микроэлементов, которые были вычислены поформулам (2) и (3) (см. 11.1). Все полученные данные для трехиспользуемых видов растений, четырех видов почв и 8 определяемыхмикроэлементов сведены в таблицы F.2-F.10.

Для порядка 3680значений, полученных для каждой конечной точки биологическойдоступности, количество выбросов в процентном выражении составляло5%, 10% и 10% для значения интенсивности биодоступности, значенийконцентраций микроэлементов в корнях и побегах соответственно. Длязначения интенсивности биодоступности процент выброса был вдвоениже, чем для значений концентраций в корнях и побегах. Кроме того,значения выбросов не зависят от конкретной лаборатории, почвы илимикроэлемента. Эти результаты одновременно указывают на то, чтопериодические выбросы не имеют особого влияния на значенияповторяемости и воспроизводимости.

Среднеарифметическоезначение коэффициентов вариаций для значений концентрациймикроэлементов в корнях и побегах, а также для значенийинтенсивности биодоступности располагаются в диапазоне между 22-32%для повторяемости и 47-61% для воспроизводимости. Самые высокиезначения коэффициентов вариации наблюдались только для одногомикроэлемента, а именно, свинца (Pb). Более высокая вариабельностьзначений для Pb связана с аналитической проблемой, поскольку самыенизкие концентрации Pb в минерализатах растений были ниже, чем теже концентрации в холостых пробах (см. приложение D.2).

Вконечном итоге, классификация четырех почв была установлена длякаждой лаборатории в условиях объединения значений интенсивностибиодоступности 8 микроэлементов в трех разновидностях растений.Данный результат служит примером способности биотеста различатьбиологическую доступность микроэлементов почвы для растений вразных образцах анализируемой почвы.


Таблица F.2 - Данные статистической обработки значений концентрациймикроэлементов в побегах растения В. oleracea

Элемент


Почва 1

As

7

35

0

0,12

0,04

37

0,06

50

Cd

6

35

5

14

0,5

0,1

19

0,3

63

Со

5

35

10

29

0,06

0,02

32

0,02

40

Cr

6

35

5

14

0,5

0,1

21

0,2

36

Cu

7

35

0

8,0

2,6

33

3,6

45

Ni

7

35

0

1,3

0,5

34

0,8

61

Pb

6

35

5

14

1,9

0,9

44

2,1

109

Zn

6

35

5

14

36

4

11

8

22

Почва 2

As

7

35

0,04

0,01

28

0,03

61

Cd

6

35

5

14

0,14

0,03

23

0,05

35

Со

6

35

5

14

0,4

0,2

52

0,2

62

Cr

6

35

5

14

0,47

0,09

20

0,13

27

Cu

7

35

23

3

14

8

33

Ni