allgosts.ru11. ЗДРАВООХРАНЕНИЕ11.100. Лабораторная медицина

ГОСТ ISO 10993-5-2011 Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследования на цитотоксичность: методы in vitro

Обозначение:
ГОСТ ISO 10993-5-2011
Наименование:
Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследования на цитотоксичность: методы in vitro
Статус:
Действует
Дата введения:
01/01/2013
Дата отмены:
-
Заменен на:
-
Код ОКС:
11.100.20

Текст ГОСТ ISO 10993-5-2011 Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследования на цитотоксичность: методы in vitro



МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

ГОСТ ISO 10993-5-2011


МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

ИЗДЕЛИЯ МЕДИЦИНСКИЕ ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ МЕДИЦИНСКИХ ИЗДЕЛИЙ

Часть 5

Исследования на цитотоксичность: методы in vitro

(ISO 10993-5:1999, IDT)

Издание официальное

Москва

Стандартинфоры

2014


Предисловие

Цели, основные принципы и порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0—92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2—2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации ло межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения. обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным унитарным предприятием «Всероссийский научно-исследовательский институт стандартизации и сертификации в машиностроении» (ВНИИНМАШ)

2    ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 29 ноября 2011 г. Не 40)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны no МК (ИСО 3166) 004-9?

Код страны

по МК (ИСО 3166) 004- 97

Сокращенное наименование национального органа ло стандартизации

Беларусь

8Y

Госстендерт Республики Беларусь

Казахстан

К 2

Госстандарт Республики Казахстан

Киргизия

KG

Кыргызствндврт

Россия

RU

Росстандарт

Таджикистан

TJ

Таджикстандарт

Узбекистан

U2

Уэстандарт

4    Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 декабря 2011 г. № 1308-ст межгосударственный стандарт ГОСТ IS010993-5—2011 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2013 г.

5    Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 10993-5:1999 Biological evaluation of medical devices — Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity (Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследования на цитотоксичность: методы in vitro).

Сведения о соответствии межгосударственных стандартов ссылочным международным стандартам приведены в дополнительном приложении ДА.

Степень соответствия — идентичная (ЮТ).

Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р ИС0 10993-5—2009

в ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется е ежегодном информацией• ном указателе «Национальные стандарты», а текст изменении и поправок — е ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также е информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ. 2014

В Российской Федерации настоящий стандартне может быть полностью или частично воспроизведен. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

Содержание

Приложение ДА (справочное) Сведения о соответствии межгосударственных стандартов ссылочным

in

Введение

Соблюдение положений стандартов серии IS0 10993 «Оценка биологического действия медицинских изделий» позволит обеспечить системный подход к исследованию биологического действия медицинских изделий.

Целью этих стандартов не является безусловное закрепление единообразных методов исследований и испытаний за группами однородных медицинских изделий в соответствии с принятой классификацией их по видуи длительности контактасорганизмом человека. Поэтому планирование и проведение исследований и испытаний должны осуществлять специалисты, имеющие соответствующую подготовку и опыт в области санитарно-химической, токсикологической и биологической оценок медицинских изделий.

Стандарты серии ISO 10993 являются руководящими документами для прогнозирования и исследования биологического действия медицинских изделий на стадии выбора материалов, предназначенных для их изготовления, а также для исследований готовых изделий.

В серию ISO 10993 входят следующие части под общим названием «Оценка биологического действия медицинских изделий»:

Часть 1 — Оценка и исследования:

Часть 2 —Требованиякобращениюсживотными:

Часть 3 — Исследования генотоксичности. канцерогенности и токсического действия на репродуктивную функцию:

Часть 4 — Исследование изделий, взаимодействующих с кровью;

Часть 5 — Исследование на цитотоксичность: методы in vitro:

Часть 6 — Исследование местного действия после имплантации;

Часть 7 — Остаточное содержание этиленоксида после стерилизации;

Часть 9 — Основные принципы идентификации и количественного определения потенциальных продуктов деградации:

Часть 10 — Исследование раздражающего и сенсибилизирующего действия;

Часть 11 — Исследованиеобщетоксического действия;

Часть 12 — Приготовление проб и стандартные образцы:

Часть 13 — Идентификация и количественное определение продуктов деградации полимерных медицинских изделий;

Часть 14 — Идентификация и количественное определение продуктов деградации изделий из керамики:

Часть 15 — Идентификация и количественное определение продуктов деградации изделий из металлов и сплавов;

Часть 16 — Моделирование и исследование токсикокинетики продуктов деградации и вымывания;

Часть 17 — Установление пороговых значений для вымываемых веществ;

Часть 18 — Исследование химических свойств материалов;

Часть 19 — Исследование физико-химических, морфологических и топографических свойств материалов;

Часть 20 — Принципы и методы исследования иммунотоксического действия медицинских изделий.

По причине широкого применения исследований цитотоксичности in vitro и распространенности их использования при оценке широкого круга медицинских изделий и материалов, целью настоящего стан* дарта IS0 10993 является не обозначение одного исследования, а. скорее, определение схемы испытаний, которая требует принятия решений посредством серии шагов. Такой подход должен привести к выбору наиболее подходящего исследования.

Приводятся три категории исследований: экстракционный метод, метод прямого контакта и метод опосредованного контакта.

Выбородной или нескольких из этих категорий зависит от характера оцениваемого образца, потенциального места использования и характера использования.

Затем этот выбор определяет детали приготовления испытуемых образцов, приготовление клеточных культур, а также способ, при помощи которого клетки подвергаются воздействию образцов или их экстрактов.

В конце периода воздействия проводится оценка наличия и степени эффекта цитотоксичности. Настоящий стандарт IS0 10993 намеренно предоставляет свободу при выборе типа оценки. Такая стратегия делает доступными целый ряд испытаний, что отражает подход многих групп, поддерживающих биологические испытания in vitro.

Многочисленные используемые методы и конечные точки, измеряемые при определении цитоток* сичности, могут быть объединены в категории по типу оценки:

a)    оценка повреждения клеток морфологическим способом;

b)    оценка повреждения клеток;

c)    оценка роста клеток;

d)    оценка специфических аспектов клеточного метаболизма.

Слвдовательно.сущвстеувтнесколькоальтернативных способов получения результатов е каждой из этих четырех категорий. Исследователь должен быть осведомлен о категориях испытаний, а также знать, к какой из них относится определенная методика, для того, чтобы проводить сравнения с другими результатами на схожих медицинских изделиях или материалах и для проведения межлабораторных испытаний.

При планировании испытаний необходимо учитывать природу испытуемого материла. Многие факторы оказывают значительное влияние на тест-систему, что может привести к ложным результатам. Например, известно, что натуральный латекс может стимулировать неблагоприятную биологическую реакцию в клетках млекопитающих иэ*эа содержания природных растительных протеинов, что не исключает его применения в медицинских изделиях при условии отсутствия раздражающего и сенсибилизирующего действия.

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ИЗДЕЛИЯ МЕДИЦИНСКИЕ

ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ МЕДИЦИНСКИХ ИЗДЕЛИЙ

Ч а с т ь 5

Исследования на цитотоксичность: методы /л vitro Medical devices. Biological evaluation of medical devices. Parts. Tests for to vitro cytotoxicity

Дата введения — 2013—01—01

1    Область применения

Настоящийстандартустанаеливаег методы исследования цитотоксичности медицинских изделий in vitro.

Данные методы предусматривают проведение инкубации клеточной культуры непосредственно либо путем диффузии:

a)    с экстрактами из изделия и (или);

b)    в контакте с изделием.

Данные методы разработаны для определения in vitro биологической реакции клеток млекопитающих по определенным биологическим параметрам.

2    Нормативные ссылки

8 настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты, содержа* щие положения, которые могут рассматриваться как разделы настоящего стандарта.

ISO 10993-1 Biological evaluation of medical devices — Part 1: Evaluation and testing (Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 1. Оценка и исследования)

ISO 10993-12:1996 Biological evaluation of medical devices —Part 12: Sample preparation and reference materials (Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 12. Приготовление проб и стандартные образцы)

3    Термины и определения

8 настоящем стандарте применены термины по IS010993-1. а также следующие термины ссоотве-тствующими определениями:

3.1    отрицательный контрольный образец: Материал, который, подвергаясь исследованию в соответствии с настоящим стандартом, не проявляет цитотоксичности.

Примечание — Назначение отрицательного контрольного образца — продемонстрировать фоновую реакцию клеток, например, в качестве отрицательного контрольного образца использовались полиэтилен высокой плотности1)— для синтетических полимеров, стержни изокиси алюминия и керамики — для стоматологических материалов.

3.2    положительный контрольный образец: Материал, ксторый. подвергаясь исследованию в соответствии с настоящим стандартом, проявляет цитотоксичность, при этом результаты воспроизводимы.

Полиэтилен высокой плотности может быть приобретен в Фармакопее США (Rockville. Maryland. USA) и f DA. Исследовательском институте Хатвно (Ochial 729-5. Hadanoshi. Kanagawa 257 — Japan). Эта информация приведена для удобства пользователя настоящим стандартом и не является рекламой этой продукции со стороны ISO.

Издание официальное

Примечание — Назначение положительного контрольного образца — продемонстрировать соответствующую реакцию тест-системы, например, стабилизированный оловоорганический попи(винилхлорид)1* используют в качестве положительного контрольного образца для твердых материалов и экстрактов, разведения фенола — в качестве положительного контрольного образца для экстрактов.

3.3    контроль реактива: Модельная среда без исследуемого материала, которая подвергается воздействию условий и процедур исследования.

Примечание — Для целей настоящего стандарта это определение заменяет приведенное в ISO 10993-12.пункт3.1.

3.4    посуда для культуры: Посуда, приемлемая для культуры клеток, включая стеклянные чашки Петри, пластмассовые чашки для культуры, пластмассовые флаконы для культуры или пластмассовые планшеты и микротитровальные пластины.

Примечание — Используют посуду, соответствующую требованиям класса ткани и подходящую для использования с клетками млекопитающих.

3.5    субкокфлуэнтность: Примерно 80 % коифлуэнтности, т. е. завершение логарифмической фазы роста.

4 Подготовка образцов

4.1    Основные положения

Исследование проводят:

a)    на экстракте из материала и (или)

b)    на самом материале.

Материал должен представлять собой конечный продукт или часть конечного продукта, предназначенного для применения. Подготовка образцов должна быть в соответствии с IS0 10993-12.

4.2    Приготовление экстрактов из материала

4.2.1    Принципы экстракции

Условия приготовления экстрактов должны приближаться к условиям клинического применения, но быть более жесткими, чтобы определить потенциальную токсическую опасность, не вызывая значительных изменений в исследуемом материале, такихкаксллавление. плавление или растворение кусочков материала, или изменение химической структуры.

Примечание — Концектрациялюбогоэндогенногоилиэкстрагенногоевщестаавэкстрв1ле.а.следовательно. число подвергающихся воздействию исследуемых клеток, зависит от площади контакта, объема модельной среды. pH. химической растворимости, скорости диффузии, осмомоляльности. встряхивания, температуры, времени и других факторов

4.2.2    Модельная среда

Для исследования проб на клетках млекопитающих необходимо использовать следующие модельные среды:

a)    культуральнуюсредуссывороткой:

b)    культуральную среду без сыворотки;

c)    физиологический солевой раствор;

d)    другую подходящую модельную среду.

Примечание — Модельные среды представлены по мере убывания степени предпочтительности, выбор растворителя должен отражать цель экстракции, причем необходимо рассмотреть использование и полярного. и неполярного растворителей. К другим подходящим модельным средам относят очищенную воду, растительное масло и димвтилсульфоксид (ДМСО). ДМСО известен как цитотоксичный в определенных тест-системах при концентрации, превышающей 0.S % общего объема.

11 Оловоорганический поли(винилхлорид) а качестве положительного контрольного образца можно приобрести a SIMS Portex Ltd. Hythe. Kent, CT21 6JL. UK. (продукт Ne 499-300-000). Полиуретаны ZDEC и ZDBC доступны от FDA, Исследовательского института Хатано (Ochiai 729-5, Hadanoshi, Kanagawa 2S7 — Japan). Эта информация приведена для удобства пользователя настоящим стандартом и не является рекламой этой продукции со стороны ISO.

4.2.3 Условия приготовления экстракта

4.2.3.1    Приготовление экстрактов следует проводить в стерильных, химически инертных закрытых контейнерах ссоблюдением правил асептики в соответствии с IS0 10993-12.

4.2.3.2    Рекомендуемыми условиями экстракции являются:

a)    не менее 24 ч при (37±2)*С;

b)    {72 ±2) ч при {50 ± 2) вС;

c)    (24 ±2) ч при (70 ±2) *С;

d)    {1 ±0.2)чпри(121 ±2)вС.

Рекомендуемые условия применяют в соответствии с характеристиками изделия и конкретными условиями использования. Методы экстракции с использованием культуральной среды с сывороткой могут применяться только при условиях, приведенных в 4.2.3.2. перечисление а).

4.2.3.3    Если экстракт (перед контактом склетхами) фильтруют, центрифугируют или обрабатывают каким-либо другим способом, это необходимо внести в окончательный отчет в соответствии с разделом 9. Подбор pH экстракта также заносят в отчет. Манипуляции с экстрактом, например, подбор pH. могут повлиять на результат.

4.3    Приготовление материала для исследования методом прямого контакта

4.3.1    Материалы различных форм, размеров или физических состояний (например, жидкое или твердое) в исследованиях на цитотоксичность изучают без изменений.

Желательно, чтобы хотя бы одна из сторон твердого образца была плоской. Другие формы и физические состояния требуют внесения изменений в образец.

4.3.2    Следует учитывать стерильность образца.

4.3.2.1    С исследуемыми материалами стерилизованных изделий обращаются с соблюдением условий асептики в течение всего процесса исследования.

4.3.2.2    Исследуемые материалы изделий, которые выпускают нестерильными, но подвергают стерилизации перед применением, стерилизуют методом, рекомендованным изготовителем, и применяют с соблюдением условий асептики в течение всего процесса исследования.

Воздействие методовстерилизации и стерилизующих агентов на изделие принимают во внимание при выборе процедуры приготовления исследуемого материала до его использования в тест-системе.

4.3.2.3    Исследуемые материалы изделий, которые могут применяться нестерильными, используют в таком виде, в каком они выпускаются, процесс приготовления экстрактов проводят ссоблюдением условий асептики в течение всего процесса исследования.

4.3.3    Жидкости исследуют:

a)    прямым осаждением: или

b)    осаждением на биологически инертную абсорбирующую матрицу.

Примечание — Для этой иели подходят фильтровальные диски.

4.3.4    Если необходимо, материалы, являющиеся суперабсорбентами всоответствии с классификацией. погружают в культуральную среду перед исследованием, чтобы избежать сорбции культуральной среды в сосуде, используемом для исследования.

5 Линии клеток

5.1    Обычно используют известные линии клеток из известных источников1 >.

5.2    Если требуется особая чувствительность, используют лишь первичные клеточные культуры, линии клетоки культурыорганическоготипа. полученные непосредственно изживых тканей, если можно продемонстрировать воспроизводимость и точность ответной реакции.

5.3    Если маточная культура линии клеток сохраняется, то ее содержат при температуре минус 80 *С или ниже в соответствующей культуральной среде, содержащей вещество, защищающее от воздействия низких температур (криопротектор), например, диметилсульфоксид или глицерол. Длительное хранение (от нескольких месяцев до многих лет) возможно только при температуре минус 130 "С или ниже.

** Например, рекомендуемыми линиями клеток являются Amencen Type Culture Collection CCL 1 (NCTC клон 929). CCL 163 (Balb/ЗТЗ клон A31). CCL 171 (MRC-S) и CCL 75 (WI-38). CCL 61 (Vero) и CCL 10 ((BHK-21 (С-13)] и V-79 379A. Эта информация приводится для удобстве пользователя нестоящим стандартом и не является рекламой этой продукции со стороны ISO. Возможно использование других линий клеток, если доказано, что они приводят к таким же или более релевантным результатам.

5.4 Для исследования используют лишь клетки, не содержащие миколлазму.

Перед использованием маточные культуры исследуют надежным методом, чтобы убедиться в отсутствии микоплаэмы.

6    Культуральная среда

6.1    Культуральная среда должна быть стерильной.

6.2    Культуральная среда ссывороткой или без нее должна соответствовать условиям, требованиям роста или поддержания жизнеспособности определенной линии клеток.

Примечание - Можно включить в состав среды антибиотики, убедившись, что они не оказывают неблагоприятного воздействия на пробы.

Стабильность культуральной среды может различаться в зависимости от композиции и условий хранения. Среду, содержащую сыворотку и глютамин, хранят при температуре от 2 вС до 8 ®С не более 7 сут. Среду без сыворотки, содержащую глютамин, хранят при температуре от 2*Сдо8*Сне более двух недель.

6.3    рК культуральных сред поддерживают на уровнях 7.2 и 7.4.

7    Приготовление маточной клеточной культуры

7.1    Используя выбранную линию и культуральную среду, готовят достаточное число клеток для проведения исследования. Если клетки должны быть выращены из культур, взятых из хранилища, необходимо удалить криопротектор при его наличии. Перед использованием клеточную культуру пересевают хотя бы один раз.

7.2    Клетки удаляют и вновь приводят во взвешенное состояние путем ферментной и/ипи механической дезагрегации, используя наиболее подходящий метод для клеток каждой линии.

8    Методы исследования

8.1    Число дублей

Для исследуемых проб и контроля необходимо использовать не менее трех дублей.

8.2    Испытание экстрактов

8.2.1    Это испытание позволяет оценить цитотоксичность качественно и количественно.

8.2.2    Определенное количество постоянно перемешиваемой клеточной суспензии капают в каждый из достаточного числа сосудов для экспонированиясэкстрактом. Равномерно распределяют клетки по поверхности каждого сосуда легким вращением.

8.2.3    Культуры инкубируют при (37 ± 2) *С в воздухе в присутствии 5 % (доля объема) двуокиси углерода или без нее в соответствии с выбранной для культуральной среды буферной системой.

Исследование можно осуществлять на субконфлюэнтном монослое, клетки которого прикрепляются к какому-либо твердому субстрату, или на свежесуспендированных клетках.

Приоценкеобраэования колоний следует использовать соответственнонизкую плотность клеток.

8.2.4    Перед началом исследования субкоифлуэнтность и морфологию культур проверяют с помощью микроскопа.

8.2.5    Проводят исследование:

a)    на исходном экстракте и

b)    серии разведений экстрактов, используя как разбавитель культуральную среду.

Если в исследовании используют монослой, то культуральную среду следует удалить и добавить кратное количество экстракта или его разведения в каждый из сосудов.

Если в исследовании используют суспензионные клетки, то добавляют экстракт или его разведение в каждый из дублирующих сосудов сразу же после приготовления клеточной суспензии.

8.2.6    Когда используют не изотонический экстракт, например воду, испытывают экстракт при наиболее физиологически совместимой концентрации после разведения в культуральной среде.

Примечание — Рекомендуется использовать концентрированную культуральную среду, например 2х. 5х. для разведения водных экстрактов.

8.2.7    Добавляют определенное количество пустого реактива, отрицательного и положительного контрольных образцов в дополнительные дублирующие сосуды.

Примечание — Контроль свежей культуральной среды при необходимости подвергают исследованию.

8.2.8    Сосуды инкубируют, используя условия, описанные в 8.2.3. в течение периода времени, соответствующего специфическим условиям конкретной пробы.

8.2.9    После периода инкубации, длительностью по меньшей мере 24 ч. определяют эффект цитотоксичности в соответствии с 8.5.

8.3 Испытание методом прямого контакта

8.3.1    Это испытание позволяет осуществить качественную и количественную оценки цитотоксичности.

8.3.2    Определенное количество постоянно перемешиваемой клеточной суспензии капают в каждый из достаточного числа сосудов для прямого воздействия на исследуемый образец. Клетки равномерно распределяют по поверхности каждого сосуда, осторожно вращая сосуд в горизонтальной плоскости.

8.3.3    Культуру инкубируют при температуре (37 ±2) *С в воздухе в присутствии 5 % (доля объема) двуокиси углерода или без него в соответствии с выбранной для культуральной среды буферной системой до тех пор. пока культуры не вырастут до субконфлуэнтности.

8.3.4    Перед началом исследования субконфлуэнтность и морфологию культур проверяют с помощью микроскопа.

8.3.5    Удаляют культуральную среду. Затем в каждый сосуд доливают свежую культуральную среду.

8.3.6    Осторожно помещают исследуемые образцы на клеточный слой в центре каждого дублирующего сосуда и убеждаются в том. что образец покрывает приблизительно 1/10 поверхности клеточного слоя.

Проявляют осторожность для предотвращения нежелательного движения образцов, поскольку оно может привести к физическому повреждению клеток, например их смещению.

Примечание — При необходимости образен перед добавлением клеток помещают а сосуд.

8.3.7    Готовят дублирующие сосуды для отрицательного и положительного контрольных образцов.

8.3.8    Сосуды инкубируют в условиях, описанных вв.З.З в течение необходимого периода времени (не менее 24 ч). соответствующего специфическим условиям конкретной пробы.

8.3.9    Надосадочкую культуральную среду сливают и определяют цитотоксический эффект всоот-ветствиис8.5.

8.4 Испытание методом непрямого контакта

8.4.1    Испытание методом диффузии на агаре

8.4.1.1    Это исследование используют для качественной оценки цитотоксичности. Исследование непригодно для вымываемых веществ, которые не могут диффундироватьчереэ слой агара или которые вступают в реакцию с агаром.

8.4.1.2    Для исследования капают определенное количество постоянно перемешиваемой клеточкой суспензии в каждый из достаточного числа дублирующих сосудов. Клетки равномерно распределяют по поверхности каждого сосуда, осторожно вращая сосуды в горизонтальном направлении.

8.4.1.3    Культуры инкубируют при (37 ± 2) *С в воздухе с 5 % (доля объема) двуокиси углерода или без нее в соответствии с выбранной для культуральной среды буферной системой до тех лор. пока культуры не вырастут приблизительно до конфлуэнтности в конце логарифмической фазы кривой роста.

8.4.1.4    Перед началом исследования субконфлуэнтность и морфологию культур проверяют с помощью микроскопа.

8.4.1.5    Удаляют из сосуда культуральную среду. Затем смешивают свежую культуральную среду, содержащую сыворотку с растопленным агаром, чтобы окончательная концентрация агара составляла от0,5 % до 2%. и вносят соответствующий объем в каждый сосуд. Используют исключительноагар. который подходит для выращивания клеток млекопитающих в культуре. Смесь культуральной среды с агаром должна находиться в жидком состоянии, при температуре, совместимой с температурой клеток млекопитающих.

Примечание — Доступен вгар с достаточным диапазоном молекулярной массы и чистоты.

8.4.1.6    Осторожно помещают несколько исследуемых образцов на отвердевший слой агара в каждый сосуд. Убеждаются, что образец покрывает приблизительно 1/10 поверхности клеточного слоя.

s

Все абсорбирующие материалы до помещения на агар следует предварительно поместить в культуральную среду во избежание дегидратации агара.

8.4.1.7    Готовят дублирующие сосуды с обоими препаратами отрицательного и положительного контрольных образцов.

8.4.1.8    Сосуды инкубируют в условиях описанных в 8.4.1.3. от 24 до 72 ч.

8.4.1.9    Осматривают клетки для определения цитотоксичности до и после осторожного удаления образцов с поверхности агара. Использование витальной окраски, например, нейтрального красного, может способствовать обнаружению цитотоксичности. Витальный краситель можно добавлять до или после инкубации с образцом. Если краситель добавлен перед инкубацией, то культуры защищают от воздействия света во избежание повреждения клеток вследствие фотоактивации витального красителя.

8.4.2 Испытание методом диффузии на фильтре

8.4.2.1    Это исследование используют для качественной оценки цитотоксичности.

8.4.2.2    Свободный от поверхностно-активных веществ фильтр с размером пор 0,45 мкм помещают в каждый сосуд и добавляют определенное количество постоянно перемешиваемой клеточной суспензии в каждый из достаточного числа дублирующих сосудов для испытания. Осторожным вращением клетки равномерно распределяют по поверхности каждого фильтра.

8.4.2.3    Культуры инкубируют при (37 ± 2) *С в воздухе в присутствии 5 % (доля объема) двуокиси углерода или без нее в соответствии с выбранной для культуральной среды буферной системой до тех пор, пока культуры не вырастут приблизительно до конфлуэнтности в конце логарифмической фазы кривой роста.

8.4.2.4    Перед началом исследования субконфлуэнтностъ и морфологию культур проверяют с помощью микроскопа.

8.4.2.5    Удаляют из сосудов культуральную среду. Затем фильтр стороной, на которой находятся клетки, помещают на слой застывшего агара (см. 8.4.1.6).

8.4.2.6    Осторожно помещают дублирующие исследуемые образцы на верхнюю (без клеток) сторону фильтра. Жидкие экстракты и свежесмешанные смеси помещают на фильтр.

в.4.2.7 Готовят дублирующие фильтры с препаратами отрицательного и положительного контрольных образцов.

в.4.2.8 Сосуды инкубируют в условиях, описанных в 8.4.2.3. в течение 2 ч ± 10 мин.

8.4.2.9    Осторожно удаляют образцы сфильтра и отделяют фильтр от поверхности агара.

8.4.2.10    Определяют цитотоксичность, используя соответствующую методику окрашивания.

8.5 Определение цитотоксичности

8.5.1 Определяют цитотоксичность методом качественной или количественной оценки.

а) Качественная оценка, осматривают клетки через микроскоп, при желании, используя цитохимическую окраску, чтобы оценить изменения, например, изменение общей морфологии, вакуолизацию, расщепление, лизис клеток и целостность мембран. Отклонение от нормальной морфологии регистрируют в отчете об исследовании описательно или цифрами. В таблице приведен удобный способ оценки испытуемых материалов.

Таблица 1

Шкала цитотоксичности

Интерпретация

0

Не цитотоксичный

1

Легкая цитотоксичность

2

Средняя цитотоксичность

3

Значительная цитотоксичность

Описывают метод оценки в отчете. Метод и результаты оценки должны быть включены в отчет об исследовании.

Ь) Количественная оценка: измеряют число погибших клеток, замедление роста клеток, пролиферацию клеток или образование колоний. Число клеток, количество белка, высвобождение ферментов, высвобождение или сокращение витальной окраски или другой измеримый параметр могут быть количественно оценены с помощью объективных средств. Объективные средства и результат регистрируют в отчете об исследовании.

Примечание — Для отдельных методов определения может потребоваться нулевое время или базовая контрольная линия клеточной культуры.

8.5.2    Необходимо убедиться е тщательности выбора методов исследования, так как результаты исследования могут оказаться недействительными, если исследуемый образец выделяет вещества, создающие помехи в тест-системе или в измерении.

Примечание — Материалы, которые могут выделять формальдегид, возможно достоверно исследовать только при оценке жизнеспособности клеток.

8.5.3    При наличии очевидных различий в результатах исследований между дублирующими сосудами с клеточной культурой исследование следует считать неприемлемым или неудовлетворительным.

8.5.4    Если отрицательный, положительный контрольные образцы или любой другой контроль (эталонный контроль, контроль среды, пустой, контроль реактива и т. д.) не вызывают ожидаемого ответа в тест-системе, то испытания повторяют.

9    Отчетов исследовании

8 отчете об исследовании должны быть приведены следующие детали:

a)    описание образца;

b)    линии клеток и обоснование выбора:

c)    культуральная среда;

d)    метод проб и обоснование;

e)    процедура экстракции неприменимости и. по возможности, характер и концентрация вымываемых веществ;

0 отрицательный, положительный контрольные образцы и контрол и других видов;

д) клеточный ответ и другие наблюдения;

h) любые соответствующие данные, необходимые для оценки результатов.

10    Оценка результатов

Общие результаты исследования должны оцениваться лицами, способными принимать обоснованные решения на основе данных исследования. Если результаты среди дубликатов не являются последовательными или недействительны, исследование повторяют.

Приложение ДА (справочное)

Сведения о соответствии межгосударственных стандартов ссылочным международным стандартам

Таблице ДА.1

Обозначение и наименование международного стандарта

Обозначение и наименование международного стандарта другого года издания

Степень

соответствия

Обозначение и наименование межгосударственного стандарта

ISO 10993-1:1997 Оценка биологического действия медицинских изделий. Честь 1. Оценка и исследования

ISO 10993-1:2003 Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 1. Оценка и исследования

ют

ГОСТ ISO 10993-1—2011 Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 1. Оценка и исследования

ISO 10993-12:1996 Оценка биологическая медицинских изделий. Честь 12. Подготовке проб и эталонных материалов

ISO 10993-12:2007 Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 12. Приготовление проб и стандартные образцы

ют

ГОСТ ISO 10993-12—2011 Изделия медицинские. Оценке биологического действия медицинских изделий. Честь 12. Приготовление проб и контрольные образцы

Примечание — 8 нестоящем стандарте использовано следующее условное обозначение степени соответствия стандартов:

• ЮТ — идентичные стандарты.

УДК 615.46:002:006.354    МКС 11.100.20    Р20    ЮТ

Ключевые слова: медицинские изделия, цитотоксичность, исследования, субконфлуэнтность. исследования in vitro

Редактор Н.в. Галанова Технический редактор 8.Н. Прусакова Корректор М.8. fiyvwa*

Компьютерная верстка А.Н. Золотаревой

Сдано в набор 10.06.2014. Подписано в печать 20.06.2014. Формат 60.64^ Гарнитура Ариел. Уел. печ. л. 1Д6. Уч.-иад.л. 1.30. Тираж 56 экз Зак. 2302.

Издано и отпечатано во ФГУП кСТАМДАРТИНФОРМ». 123965 Москва, Гранатный пер., 4. www.90stinfo.1u