База ГОСТовallgosts.ru » 07. МАТЕМАТИКА. ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ » 07.100. Микробиология

ГОСТ ISO 21871-2013 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Метод обнаружения и подсчета наиболее вероятного числа Bacillus cereus

Обозначение: ГОСТ ISO 21871-2013
Наименование: Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Метод обнаружения и подсчета наиболее вероятного числа Bacillus cereus
Статус: Действует
Дата введения: 07/01/2014
Дата отмены: -
Заменен на: -
Код ОКС: 07.100.30
Скачать PDF: ГОСТ ISO 21871-2013 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Метод обнаружения и подсчета наиболее вероятного числа Bacillus cereus.pdf
Скачать Word:ГОСТ ISO 21871-2013 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Метод обнаружения и подсчета наиболее вероятного числа Bacillus cereus.doc

Текст ГОСТ ISO 21871-2013 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Метод обнаружения и подсчета наиболее вероятного числа Bacillus cereus



МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

ГОСТ ISO

21871-

2013

МИКРОБИОЛОГИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВИ КОРМОВ для животных

Метод обнаружения и подсчета наиболее вероятного числа Bacillus cereus

(ISO 21871:2006, IDT)

Издание официальное

Москва

Стенда ртинформ 2013

ГОСТ ISO 21871—2013

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стан» дартизации установлены ГОСТ 1.0—92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2—2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН Государственным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИКОП Россельхозакадемии) и ОАО «Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации» (ОАО «6НИИС»)

2    ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 7 июня 2013 г. № 43)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК {ИСО Э1вв> 004-97

Код страны

по МК {ИСО Э1вв) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Казахстан

KZ

Госстандарт Республики Казахстан

Киргизия

KG

Кыргызстандарт

Россия

RU

Росстандарт

Таджикистан

TJ

Таджикстандарт

Узбекистан

U2

Узстандарт

4    Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 июня 2013 г. На 229>ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 21871—2013 введен е действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2014 г.

5    Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 21871:2006 Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the determination of low numbers of presumptive Bacillus cereus — Most probable number technique and detection method (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод определения малых количеств презумптивных бактерий Bacillus cereus. Метод обнаружения и метод наиболее вероятного числа).

Международный стандарт разработан подкомитетом ISO/ТС 34/SC 9 «Микробиология» технического комитета по стандартизации 1ЭОЯС 34 «Пищевые продукты» Международной организации лостан-дартизации (ISO).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного между* народного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5 (подраздел 3.6).

Сведения о соответствии межгосударственных стандартов ссылочным международным стандартам приведены в дополнительном приложении ДА.

Перевод с английского языка (еп)

Официальный экземпляр международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, имеется в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации.

Степень соответствия — идентичная (ЮТ).

6    Настоящий стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р ИСО 21871—2010

7 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

ГОСТ ISO 21871—2013

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты». а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано е ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ. 2013

8 Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

in

ГОСТ ISO 21871—2013

Содержание

1    Область применения...................................................1

2    Нормативные ссылки..................................................1

3    Термины и определения................................................2

4    Сущность метода.....................................................2

5    Питательные среды и реактивы............................................2

6    Оборудование и стеклянная посуда.........................................7

7    Отбор проб.........................................................8

8    Приготовление анализируемой пробы........................................8

9    Методика проведения анализа............................................8

10    Обработка результатов...............................................10

Приложение А (обязательное) Диаграмма процедуры подсчета........................11

Приложение ДА (справочное) Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов

ссылочным межгосударственным стандартам........................12

Библиография........................................................14

IV

ГОСТ ISO 21871—2013

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

МИКРОБИОЛОГИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ И КОРМОВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ

Метод обнаружения и подсчета наиболее вероятного числа Bacillus cereus

Microbiology of food and animal feeding etuffa.

Moat probable number count and detection method for Bacitlu8 cereus

Дата введения* — 2014—07—01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и корма для животных и устанавливает методы выявления илодсчета наиболее вероятного числа жизнеспособных лреэумптивныхВасШиз cereus.

Данный метод не предусматривает дифференциации Bacillus cereus от других близких видов рода Bacillus, таких как Bacillus weihenstephanensis. Bacillus anthracis. Bacillus thuringiensis. Bacillus mycoides и Bacillus pseudomycoides.

2    Нормативные ссылки

8 настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ISO 6887-1:1999 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть 1. Общие правила приготовления исходной суспензии и десятичных разведений

ISO 6887-2:2003 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходной суспензии и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть 2. Специальные правила для приготовления мяса и мясных продуктов

ISO 6887-3:2003 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть 3. Специальные правила для приготовления рыбы и рыбных продуктов

ISO 6887-4:2003 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть4. Специальные правила для приготовления продуктов, кроме молока и молочных продуктов, мяса и мясных продуктов и рыбы и рыбопродуктов

ISO 7218:2007 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ISO 8261:2001 Молоко и молочные продукты. Общие правила приготовления проб для анализа, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований

ISO/TS11133-1:2000 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Правила приготовления и производства питательных сред. Часть 1. Общие правила по обеспечению качества приготовления питательных сред в лаборатории

ISO/TS 11133-2:2003 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству питательных сред. Часть 2. Практические руководящие указания по определению эффективности питательных сред

* Дату введения стандарта в действие на территории присоединившихся государств устанавливают их национальные органы по стандартизации.

Издание официальное

1

ГОСТ ISO 21871—2013

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением:

3.1 преэумптивные Bacillus cerous {presumptive Bacillus cereus): Микроорганизм, который образует типичные или атипичные колонии на поверхности селективной питательной среды и который дает положительные реакции по морфологическим и биохимическим свойствам, установленным в настоящем стандарте

Примечание - Для реализации метода испытанийданное определение презумптивных Bacillus cereus применяют для установленной процедуры идентификации.

4    Сущность метода

4.1    Метод подсчета

4.1.1    Посев в три пробирки с жидкой селективной обогатительной средой двойной концентрации [5.3.1.1 а)) установленным количеством первичного разбавления (исходная суспензия).

4.1.2    Посев в три пробирки с жидкой селективной обогатительной средой нормальной концентра* ции [5.3.1.1 Ь)] установленным количеством первичного разбавления (исходная суспензия). Затем, в тех же условиях, пересев на жидкую селективную обогатительную среду нормальной концентра* ции [5.3.1.1 Ь))устаноеленными количествами десятичных разбавлений десятикратных разведений первичного разбавления (исходная суспензия).

4.1.3    Инкубирование пробирок с жидкой селективной обогатительной средой двойной и нормальной концентрации (5.3) в течение 48 ч при температуре 30 *С.

4.1.4    Пересев на твердую селективную среду (5.4 или 5.5) из жидкой селективной обогатительной среды (5.3).

4.1.5    Инкубирование твердой селективной среды (5.4 или 5.5) в течение 18—48 ч при температуре 37 *С (5.4) или 30 вС (5.5) и исследование чашекс целью проверки присутствия колоний, которые, согласно своим характеристикам, должны быть лрезумптивными бактериями Bacillus cereus.

4.1.6    Подтверждение принадлежности типичных колоний к презумптивным Bacillus cereus проводят при проверке предполагаемых колоний при помощи гемолиза (9.1.5.3) или исследования под микроскопом (9.1.5.4).

4.1.7    Расчет наиболее вероятного числа презумптивных бактерий Bacillus cereus в выражении на грамм или на см3 пробы выбранных разбавлений проводят с использованием таблиц наиболее вероятного числа.

4.2 Метод обнаружения

4.2.1    Посев на жидкую селективную обогатительную среду (5.3) установленным объемом исходной суспензии пробы для испытаний.

4.2.2    Инкубирование пробирки в течение 48 ч при температуре 30 *С.

4.2.3    Пересев на твердую селективную среду (5.4 или 5.5) из жидкой селективной обогатительной среды (5.3).

4.2.4    Инкубирование твердой селективной среды (5.4 или 5.5)е течение 18—48 ч при температуре 37 °С (5.4) или 30 "С (5.5) и анализ чашекс целью проверки присутствия колоний, которые, согласно своим характеристикам, могут соответствовать презумптивным бактериям Bacillus cereus.

4.2.5    Подтверждение наличия предполагаемых колоний при помощи гемолиза (9.1.5.3) или исследования под микроскопом (9.1.5.4).

4.2.в Результат приводится в форме «присутствие)» или «отсутствие» презумптивных бактерий Bacillus cereus в граммах или кубических сантиметрах продукции.

5    Питательные среды и реактивы

5.1    Общие положения

В лабораторной практике применяют ISO 7218. ISO/TS11133*1 и ISO/TS11133-2.

5.2    Разведение — по ISO 6887 (все части), ISO 8261 и любой конкретный стандарт, распространяющийся на анализ продукции.

5.3    Жидкая селективная обогатительная среда: триптон-соевый полимиксиновый бульон (TSPB) по [11.

2

ГОСТ ISO 21871—2013

5.3.1    Основа среды

5.3.1.1    Состав

Наииемоеакне компонента

а>

Среда двойной концентрации

Ь)

Среда нормальной концентрации

Продукт ферментативного перевариваний казеина, г

34.0

17.0

Продукт ферментативного перевариваний сои. г

6.0

3.0

Хлорид натрия (NaCl). г

10.0

S.0

Глюкоза, г

S.0

2.5

Фосфорнокислый калий двузамещенный (К2НРО<), г

S.0

2.5

Вода.см*

1000

1000

5.3.1.2    Приготовление

Ингредиенты или готовую основу среды растворяют в воде, нагревают на слабом огне до кипения и кипятят 2—3 мин при постоянном перемешивании. При необходимости корректируют pH так. чтобы после стерилизации он был равен 7.3 ±0.2 ед. pH при температуре 25 *С.

Среды распределяют в объеме по 10 см3 [среда двойной концентрации (5.3.1.1 а)} и по 9 см3 (среда нормальной концентрации (5.3.1.1 Ь)) в пробирки размером 16 мм * 160 мм (6.7).

Стерилизуютвавтоклаве(6.1)при температуре 121 еС в течение 15 мин.

5.3.2    Раствор сульфата полимиксина В

5.3.2.1 Состав

Сульфат полимиксина В. ЕД активности (или г)

500000 (или 0.05)

Вода.см*

50

5.3.2.2 Приготовление

Сульфат полимиксина в растворяют в воде. Стерилизуют путем фильтрации.

5.3.3    Полная среда

Непосредственно перед использованием добавляют 0,2 см3 (для среды двойной концентрации) или 0.1 см3 (для среды нормальной концентрации) раствора сульфата полимиксина 8 (5.3.2) в каждую пробирку, содержащую основу среды (5.3.1).

5.3.4    Проверка эксплуатационных характеристик с целью гарантии качества питательной среды

Определение селективности и продуктивности — по ISO/TS11133-1. Тестирование эффективности питательного триптон-соевого полимиксинового бульона (TSP8) проводится no ISO/TS 11133-2 и в соответствии с таблицей 1.

Таблица 1 — Результаты проверки эксплуатационных характеристик триптон-соевого полимиксинового бульоне (TSP8)

Функция

Инкубирование

Контрольные штаммы

Метод контроля

Критерии

Характерные реакции

Производи

тельность

48 ч При 30*С

B.cereus АТСС 11776 или тот же штамм, зарегистрированный в других коллекциях

Полуколичвст-

венный

г 10 КОЕ на PEMBA или MYP

Характерные колонии на РЕМ8А или MYP (см. 5.4.5 или 5.5.6)

Селектив

ность

48 ч при 30‘С

Е. coll АТСС 25922 или 8739 или тот же штамм, зарегистрированный в других коллекциях

Полуколичвст-

венный

Полное ингибирование

3

ГОСТ ISO 21871—2013

5.4 Твердая селективная среда: агар с полимиксином, лируватом, яичным желтком, маннитом и бромтимоловым синим (PEMBA) по [2]

5.4.1    Основа питательной среды

5.4.1.1    Состав

Продукт ферментативного переваривания казеине, г

1.0

О-Маннит. г

Ю.О

Пируввт натрия.г

Ю.О

Сульфвт магния (MgS047H?O), г

0.1

Хлорид натрия, г

2.0

Гидрофосфат динатрия (Na,HP04). г

2.5

Дигидрофосфат калия (КН,Р04). г

0.25

Бромтимоловый синий, г

0,12

Агар, г*'

9—18

вода, см3

940

В зависимости от прочности геля агара.

5.4.1.2    Приготовление

Компоненты или готовую сухую основу питательной среды растворяют в воде, нагревают на слабом огне до кипения и кипятят 2—3 мин при постоянном перемешивании.

При необходимости корректируют pH так. чтобы после стерилизации он был равен 7.2 ± 0.2 ед. pH при температуре 25 *С.

Стерилизуют в автоклаве (6.1) при температуре 121 *С в течение 15 мин.

5.4.2    Раствор сульфата полимиксина 8

Готовят по 5.3.2.

5.4.3    Эмульсия яичного желтка

Используют свежие чистые куриные яйца с неповрежденной скорлупой. Яйца промывают в жидком моющем средстве, используя щетку. Ополаскивают впроточной воде, погружают в 70%-ный (пообъему) раствор этилового спирта на 30 с и высушивают. Соблюдая стерильность, разбивают каждое яйцо и отделяют желток от белка путем многократного переноса желтка с одной половины яичной скорлупы на другую. Желтки помещают в стерильный мерный цилиндр и добавляют четыре объемные части стерильной воды. Соблюдая стерильность, переносят содержимое в стерильную колбу (6.7) и интенсивно перемешивают.

Смесь нагревают в течение 2 ч на водяной бане (6.4). при температуре 47 °С. Затем оставляют на 18—24 ч при температуре (3 ±2) 'С для образования осадка.

Надосадочную эмульсию собирают в стерильных условиях.

Эмульсию можно хранить при температуре (3 ± 2) *С не более 72 ч.

Обе твердые селективные среды, описываемыев настоящем стандарте, были первоначальнолри-готовлены из 20 %-ной эмульсии яичного желтка, как это изложено в [3]. Допускается использовать готовые эмульсии яичного желтка с различной концентрацией. Вместе с тем. необходимо следовать инструкциям производителя, особенно касающихся времени хранения. Следует принять меры для обеспечения того, чтобы данная эмульсия была пригодна для использования в питательных средах, описанных в 5.4 и 5.5.

5.4.4    Полная среда (агар PEMBA)

5.4.4.1 Состав

Основа питательной среды (5.4.1). см3

940

Раствор сульфате полимиксина В (5.4.2). см3

10

Эмульсия яичного желтка (5.4.3). см3

50

5.4.4.2    Приготовление

В основу питательной среды (5.4.1). расплавленную и охлажденную до температуры 47 ’С. добавляют другие компоненты, раздельно при непрерывном перемешивании.

5.4.4.3    Приготовление чашек Петри с агаром

Переносят около 12.5 см3 аликвоты полной среды в чашки Петри (6.9) и дают им затвердеть. Примечание — Вейду технических причин (2]. вместо обычного количества 15 см3 используют 12.5 см3.

ГОСТ ISO 21871—2013

Чашки хранят при температуре (3 ± 2) *С до четырех дней.

Непосредственно перед использованием чашки с агаром подсушивают при снятых крышках и наклонив поверхность агара вниз, в сушильном шкафу, или термостате (6.2) лритвмпературеот25 вС до 50 *С. до тех пор. пока с поверхности агара не исчезнут капли влаги, но не более 20—30 мин.

5.4.5 Проверка качества питательной среды

Проверка качества питательной среды — по ISO/TS11133-2.8 таблице 2 представлены результаты проверки качества агара с полимиксином, пируватом. яичным желтком, маннитом и бромтимоловым синим.

Таблица 2

Функция

Инкубирование

Контрольные штаммы

Метол контроля

Критерии

Характерные реакции

Производи

тельность

18—48 ч при 37 *С

В. cereus АТСС 11778 или тот же штемм. зарегистрированный в других коллекциях

Качественный

Значительный

рост

Колонии бирюзового цвета с ореолом осадка

Селектив

ность

18—48 ч при 37 вС

Е. coll АТСС 25922 или 8739 или тот же штамм, зарегистрированный в других коллекциях

Качественный

Полное ингибирование

5.5 Твердая селективная среда: агар с маннитом, яичным желтком и полимиксином (МУР) по [4]

5.5.1    Основа питательной среды

5.5.1.1    Состав

Мясной экстракт, г

1.0

Продукт ферментативного переваривания казеина, г

10.0

О-Мвннитол. г

10.0

Хлорид натрия (NaCl). г

10.0

Феноловый красный, г

0.025

Агар. г*>

9—18

Вода, см3

900

•' В зависимости от прочности геля агара.

5.5.1.2    Приготовление

Компоненты или готовую сухую основу питательной среды растворяют в воде, нагревают на слабом огне до кипения и кипятят 2—3 мин при постоянном перемешивании.

При необходимости корректируют pH так. чтобы после стерилизации он был равен 7.2 ±0.2 ед. pH при температуре 25 *С.

Разливают среду по 90 см3 в колбы (6.7) вместимостью 250 см3.

Стерилизуют в автоклаве (6.1) при температуре 121 *С в течение 15 мин.

5.5.2    Раствор полимиксина сульфата В Готовят П05.3.2.

5.5.3    Эмульсия яичного желтка Готовят по5.4.3.

5.5.4    Полная среда (агар МУР)

5.5.4.1 Состав

Основа питательной среды (5.5.1), см3

90.0

Рествор полимиксина сульфата 8 (5.3.2). см3

1.0

Эмульсия яичного желтка (5.S.3). см3

10.0

5.5.4.2 Приготовление агара МУР

8 основу питательной среды (5.5.1). расплавленную и охлажденную до температуры 47 *С. добавляют другие компоненты, раздельно при непрерывном перемешивании.

S

ГОСТ ISO 21871—2013

5.5.5    Приготовление чашек Петри с агаром МУР

Готовый агар МУР (5.5.4) разливают по 15—20 см3 в стерильные чашки Петри (6.9) и дают затвердеть.

Чашки можно хранить при температуре (3±2) 9С до четырех дней.

Непосредственно перед использованием чашки с агаром подсушивают при снятых крышках и наклонив поверхность агара вниз, в сушильном шкафу, или термостате(6.2) при температуре от 25 *Сдо 50 вС. до тех лор пока с поверхности агара не исчезнут капли влаги, но не более 20—30 мин.

5.5.6    Проверка качества питательной среды — по 1SO/TS 11133*2 и в соответствии с таблицей 3.

Таблице 3 — Результаты проверки эксплуатационных характеристик агара с маннитолом. яичным желтком и полимиксином (МУР)

Функция

Инкубирование

Контрольные штампы

Метод контроля

Критерии

Характерные

реакции

Производитель

ность

24—46 ч при 30 ‘С

6. cereus ATCC 11778 или тот же штамм, зарегистрированный а других коллекциях

Качественный

Значительный

рост

Колонии розового цвета с ореолом осадка

Селективность

46 ч при 30 *С

E.collATCC 25922 или 8739 или тот хе штамм, зарегистрированный в других коллекциях

Качественный

Полное ингибирование

5.6 Окрашивающие растворы для микроскопической идентификации

5.6.1    Раствор оксалата малахитового зеленого

5.6.1.1    Состав

Оксалат малахитового зеленого, г

S.0

вода, см3

100

5.6.1.2    Приготовление

Оксалат малахитового зеленого растворяют в воде.

5.6.2    Раствор Судана черного в

5.6.2.1 Состав

Судан черный В. г

0.3

Этиловый спирт. 70 %-ный (по объему), см3

100

5.6.2.2 Приготовление раствора Судана черного В Судан черный В растворяют в этиловом спирте.

5.6.3    Ксилол

5.6.4    Раствор сафранина

5.6.4.1 Состав

Сафранин, г

0.S

вода, см3

100

6

S.6.4.2 Приготовление раствора сафранина Сафранин растворяют в дистиллированной воде.

ГОСТ ISO 21871—2013

5.7 Агар с бараньей кровью

5.7.1    Основа питательной среды

5.7.1.1    Состав

Продукт ферментативного переваривания казеина, г

1S

Продукт ферментативного переваривания сои. г

5

Хлорид натрия (NaCI). г

5

Агар, г*»

9—18

Вода.см*

1000

*' В зависимости от прочности геля агара.

5.7.1.2    Приготовление агара сбараньей кровью

8 основу питательной среды (5.7.1) добавляют другие компоненты раздельно при непрерывном перемешивании. Компоненты или полную сухую среду растворяют в воде и доводят до кипения.

При необходимости корректируют pH так. чтобы после стерилизации он был равен 7.3 ±0.2 ед. pH при температуре 25 *С.

Распределяют в колбы (6.7) и стерилизуют в автоклаве (6.1) при температуре 121 °С в течение 15мин.

5.7.2    Баранья кровь без фибрина

5.7.3    Полная среда

5.7.3.1 Состав

Основа питательной среды (5.7.1). см3

100

Баранья кроеь без фибрина (5.7.2), см*

5—7

5.7.3.2 Приготовление

8 основу питательной среды (5.7.1). расплавленную и охлажденную до температуры 47 °С. добавляют баранью кровь без фибрина (5.7.2) и перемешивают.

Готовую среду хорошо перемешивают и разливают в чашки Петри (6.9) в количестве по 15 см3 и дают затвердеть.

6 Оборудование и стеклянная посуда

Применяют микробиологическое лабораторное оборудование no ISO 7218.

6.1    Оборудование для сухой стерилизации (сушильный шкаф) или влажной стерилизации (автоклав).

6.2    Шкаф сушильный или термостат, проветриваемый конвекционными потоками, для сушки ага* роеого слоя, работающий при температуре в диапазоне от 25 *С до 50 вС.

6.3    Термостат, работающий при температуре (30 ± 1) *С или (37 ±1) вС.

6.4    Баня водяная, работающая при температуре (47 ± 2) вС и приблизительно 80 *С.

6.5    Петли, изготовленные из платиново-иридиевой или никеле-хромовой проволоки или платмас-сы. с размером диаметра приблизительно 3 мм.

6.6    рн*метр. с точностью 10.1 единицы pH при температуре 25 *С.

6.7    Пробирки достаточных размеров с объемом 20 сма (например. 16 мм х 160 мм), и колбы для культур для стерилизации и сохранности питательной среды.

6.8    Мешалка вихревая.

6.9    Чашки Петри, изготовленные из стекла или пластмассы, с размером диаметра от 90—100 мм или 140 мм. при необходимости.

6.10    Пипетки градуированные, номинальной вместимостью 10 см3 или 1 см3, соответственно, градуированные на 0.5 или 0.1 см3.

6.11    Микроскоп собъективом для масляно-иммерсионной микроскопии.

6.12    Стеклапредметныедлямикроскопасразмврами76мм х26мм.

6.13    Бумага мелкопористая фильтровальная.

6.14    Колбы соответствующей вместимости.

7

ГОСТ ISO 21871—2013

7    Отбор проб

В лабораторию необходимо доставить представительную пробу. Проба не должна быть повреждена или модифицирована при транспортировании или хранении.

Отбор проб не является частью метода, устанавливаемого в настоящем стандарте. В случае отсутствия конкретного стандарта наотборпроб продукта рекомендуется, чтобы заинтересованные стороны достигли согласия по процедуре отбора проб.

8    Приготовление анализируемой пробы

Анализируемую пробу приготовляют в соответствии с ISO 6887 или ISO 8261 или конкретным стандартом. распространяющимся на конкретный продукт. Допускается в случае отсутствия конкретного стандарта, чтобы заинтересованные стороны достигли согласия по данному вопросу.

9    Методика проведения анализа

9.1    Метод подсчета

9.1.1    Анализируемая проба, исходная суспензия и порядок разбавления разведения — по ISO 6887. в зависимости от конкретного продукта, или ISO 8261.

Примечание — Для подсчета только презумлтиеных бактерий 8acillus cereus. исходное разбавление может быть нагрето на водяной бане <в.4)при температуре 80 *С в течение 10 мин.

9.1.2    Посев и инкубирование

Проводят посев на три пробирки, каждая из которых содержит среду двойной концентрации [5.3.1.1 а)), в каждую добавляют по 10 см3 исходного разбавления (исходная суспензия) (равной 1 г пробы в каждой пробирке)и перемешивают пробы со средой при помощи перемешивающего устройства для пробирок (6.8).

Проводят посев на три пробирки, каждая из которых содержит среду нормальной концентрации [5.3.1.1 Ь)). добавляют 1 см3 в каждую пробирку исходного разбавления (исходная суспензия) (равной 0.1 г пробы в каждой пробирке) или последующих разбавлений (равных 0,01 г. 0.001 г и т. д. пробы в каждой пробирке) и перемешивают пробы со средой при помощи перемешивающего устройства для пробирок (6.8).

Инкубируют пробирки в термостате (6.3) при температуре 30 °С в течение (48 ±4)ч.

9.1.3    Выделение чистой культуры

После тщательного перемешивания с использованием перемешивающего устройства для пробирок (6.8) делают посев культуры инокуляционной петлей из каждой пробирки на поверхность агара с лолимиксином. пируеатом. яичным желтком, маннитом и бромотимольным синим (PEMBA) (5.4)или агара с маннитом, яичным желтком и полимиксином (МУР) (5.5).

Инкубируют чашки Петри с питательной средой крышками вниз при температуре 37 *С (PEMBA) или 30 °С (МУР) 18—24 ч. Если колонии нельзя четко определить, продолжают выращивание втермоста-тах дополнительно в течение 24 ч. При использовании агара PEMBA дальнейшее инкубирование может быть продолжено при комнатной температуре.

9.1.4    Отбор чашек Петри

9.1.4.1    Общие положения

После завершения инкубирования чашки Петри анализируют на наличие типичных или атипичных колоний.

9.1.4.2    Типичные колонии

На PEMBA типичные колонии лрезумптивных бактерий Bacillus cereus имеют размеры от 2 мм до 5 мм. неровные края с зазубринами и разветвлениями на гладкой стеклянной поверхности, цвет от бирюзового до голубого (допускается беловато-серый цвет в центре колонии и синий фон) и ореол осадка (реакция на яичный желток) шириной до 5 мм.

На МУР типичные колонии имеют размеры от2ммдо5мми имеют зазубрины. Они обладают розовой окраской, темно-красным фоном и окружены ореолом осадка (реакция на яичный желток) шириной до 5 мм.

9.1.4.3    Атипичные колонии

Если на чашках Петри имеется неоднородный рост бактерий, которые ферментируют маннит, характерная окраска колоний и фон могут быть ослаблены или стать невидимыми.

8

ГОСТ ISO 21871—2013

Некоторые штаммы презумптивных бактерий Bacillus cereusобладают слабой реакцией на яичный желток или не обладают никакой реакцией. В подобных случаях и в других сомнительных случаях такие колонии подлежат дополнительной проверке.

9.1.5 Подтверждение

9.1.5.1    Общие положения

Типичные колонии (9.1.4.2) и атипичные колонии (9.1.4.3) на PEMBA или МУР должны быть подтверждены посредством испытания с помощью гемолиза на агаре с бараньей кровью. 8 качестве альтернативы типичные колонии на среде PEMBA или среде МУР проверяют с использованием микроскопа.

9.1.5.2    Отбор и очистка колоний для подтверждения

Отбирают по три колонии с каждой чашки Петри, выбранные по 9.1.4. Если на поверхности агара находится менее трех колоний, отбирают все имеющиеся колонии. Данные колонии проверяются по 9.1.5.3или9.1.5.4.

Если на чашках Петри получен сплошной рост микроорганизмов по линии пересева, то отбирают посевной материал из трех точек этого пересева и проводят посев на другие чашки Петри, содержащие твердую селективную среду (5.4 или 5.5).Эффективней предварительно перед посевом отобранный материал развести. Если слои переполнены колониями и нет возможности отобрать четко изолированные колонии, отбирают материал колоний из трех точеки производят посев на слоях, содержащих твердую селективную среду (5.4 или 5.5). Инкубируют в термостате (6.3) при температуре 37 *С (PEMBA) или при 30 *С(МУР)от 18 до 24 ч. Отбираютскаждогослоя по меньшей мере одну четко изолированную колонию. Подтверждают эти колонии, как это указано в 9.1.5.3 или 9.1.5.4.

9.1.5.3    Подтверждение тестом на гемолитическую активность на агаре с бараньей кровью (МУР или РЕМ8А)

Проводят посев отобранных (9.1.4.2 или 9.1.4.3)с МУР или PEMBA колоний на поверхность агара с бараньей кровью (5.7)таким образом, чтобы получить рост изолированных колоний и дать возможность четко разделенным колониям развиваться.

Инкубируют при температуре 30 ®С в течение 24 ч и фиксируют реакцию гемолиза.

Каждая колония, окруженная зоной просветления, рассматривается как гемолиз-лоложительная.

9.1.5.4    Подтверждение с использованием микроскопа (PEMBA)

9.1.5.4.1    Окрашивание

Переносят часть материала из центра колонии в случае, если возраст культуры составляет 24 ч. или с периферии, если культуры более старые: переносят, используя петлю для посева (6.5), на обезжиренное предметное стекло (6.12) и растирают в малой капле воды. Высушивают на воздухе и фиксируют путем нагрева. Затем окрашивают споры над кипящей водой раствором малахитового зеленого (5.6.1) или нагревают в течение одной минуты до появления паров жидкости. Через две минуты смывают избыток красителя водой, высушивают предметное стекло и покрывают его споем раствора Судана черного В (5.6.2) для окрашивания внутриклеточного жира. Процедуру проводят 15 мин. затем промывают ксилолом (5.6.3). высушивают при помощи фильтровальной бумаги (6.13) и окрашивают снова раствором сафранина (5.6.4) для окрашивания спорангий и вегетативных клеток спор. Через 20 с сливают избыток красителя, промывают водой и сушат на воздухе.

9.1.5.4.2    Исследование с помощью микроскопа

Окрашенный препарат на предметном стекле. Предметное стекло исследуют под микроско-пом(6.11). используя иммерсионное масло. Клетки презумптивных бактерий Bacillus cereus вформе кирпичиков располагаются цепочками и имеют длину от 4 до 5 мкм, ширину — от 1 до 1.5 мкм и содержат довольно большие количества внутриклеточного жира, который окрашен в черный цвет. Окрашенные в зеленый цвет споры могут быть в центре или почти в конце, ноони никогда не раздувают спорангии, окрашенные в красный цвет.

9.2    Метод определения

9.2.1    Анализируемые пробы и исходную суспензию готовят по ISO 6887 в зависимости от конкретного продукта или ISO 8261.

9.2.2    Посев и инкубирование

1 см3 исходной суспензии добавляют к 9 см3 TSPB (5.3) нормальной концентрации (т. е. 0.1 г или 0.1 см3 пробы) или 10 см3 исходной суспензии к 10 см3 TSPB(5.3) двойной концентрации (т.е. 1 гили 1 смпробы). Для больших объемов анализируемые пробы готовят исходную суспензию добавлением х смили хг к9хсм3 разбавителя (см. соответствующую часть ISO 6887 или ISO 8261). затем добавляют все количество исходной суспензии к 90х см3 TSPB (5.3) нормальной концентрации (например, добавляют

9

ГОСТ ISO 21871—2013

5 см3 или 5 г пробы к 45 см3 разбавителя, и затем добавляют весь объем этой исходной суспензии к 450 см3 TSPB нормальной концентрации).

Инокулированную пробирку (6.7) или колбу (6.14) инкубируют в термостате (6.3) при температуре 30 *С в течение(48 ± 4)ч.

9.2.3    Чистая культура

После тщательного перемешивания проводят посевкультуры инокуляциокной петлей из пробирки или колбы на поверхность агара PEMBA (5.4) или агара MYP (5.5). Далее поступают, как это указано в 9.1.3.

9.2.4    Отбор чашек Петри

Отбор чашек Петри — по9.1.4.

9.2.5    Подтверждение

Подтверждение — по 9.1.5.

10 Обработка результатов

10.1    Метод подсчета для определения наиболее вероятного числа (НВЧ)

Для каждого посева жидкой селективной обогатительной среды (9.1.2) фиксируют количество пробирок. в которых было подтверждено (9.1.5) присутствие презумптивных бактерий Bacillus cereus. Обозначают данные пробирки как положительные.

Выражение результатов определения наиболее вероятного числа (НВЧ) — no ISO 7218.

10.2    Метод определения

В соответствии с обработкой результатов, фиксируют «присутствие» или «отсутствие» презумптивных Bacillus cereus в анализируемой пробе, указывая массу в граммах или объем в см3.

Ю

Приложение А (обязательное)

ГОСТ ISO 21871—2013

Диаграмма процедуры подсчета

и

ГОСТ ISO 21871—2013

Приложение ДА (справочное)

Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов ссылочным межгосударственным стандартам

Таблице ДА.1

Обозначение и наименование ссылочного международного стандарта

Степень

соответствия

Обозначение и иаименоыиие межгосударственного стандарта

ISO 6887-1:1999 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть 1. Общие правила приготовления исходной суспензии и десятичных разведений

ISO 6887-2:2003 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Подготовка проб, исходной суспензии и десятикратных разведений для микробиологических исследований. Часть 2. Специальные правила подготовки мясе и мясных продуктов

ISO 6887-3:2003 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходных суспензий и десятичных резведений для микробиологических исследований. Часть 3. Специальные правила для приготовления рыбы и рыбных продуктов

ISO 6887-4:2003 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть 4. Специальные правила для приготовления продуктов, кроме молока и молочных продуктов, мяса и мясных продуктов и рыбы и рыбопродуктов

ISO 7218:2007 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

IDT

ГОСТ ISO 7218—2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ISO 8261:2001

ISO 11133-1:2000 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления культурных сред в лаборатории

IDT

ГОСТ ISO 11133-1—2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления культурных сред в лаборатории

12

ГОСТ ISO 21871—2013

Окончание твбпииы ДА.1

Обозначение и наименование ссылочного международного стандарта

Степень

соответствия

Обозначение и наименование межгосударственного стандарта

ISO 11133-2:2003 Микробиологий пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие уквэвния по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 2. Практические руководящие указания по эксплуатационным испытаниям культуральных сред

IDT

ГОСТ ISO 11133-2—2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Честь 2. Практические руководящие указания по эксплуатационным испытаниям культуральных сред

'Соответствующий межгосударственный стандарт отсутствует. До его принятия рекомендуется использовать перевод на русский язык денного международного стандарта или гармонизированный с ним национальный (государственный) стандарт страны, на территории которой применяется настоящий стандарт. Информация о наличии перевода данного международного стандарта в национальном фонде стандартов или в ином месте, а также информация о действии не территории страны соответствующего национального (государственного) стандарте может быть приведена в национальных информационных данных, дополняющих настоящий стандарт.

13

ГОСТ ISO 21871—2013

Библиография

[1| Lencetie. G.A. и Harmon S.M. Подсчет и подтверждение Becillus сегеиз в пищевых продуктах: совместное исследование. J. Левое. Off. Anal. Chem.. 63. 1980, с. 581—586 (2| Holbrook R. и Anderson J.M. Усовершенствованная селективная и диагностическая среда для изоляции и подсчета Bacillus cereus в пищевых продуктах. Свп. J. Mtcroblol. 26. 1980. с. 753—759 (Э| Biling Е. и Luckhurst E.R. Упрощенный метод приготовления среде яичным желтком. J, Appl. Bacl.,20,1957, с. 90

[4| MosselD-A.A.. Koopman M.J. и JongeriusE. Подсчет Baclllue cereus в пищевых продуктах. Appl. Microbiol., 15. 1967. с. 650—653

14

ГОСТ ISO 21871—2013

УДК 664:636.085:543.9:006.034    МКС 07.100.30    ЮТ

Ключевые слова: пищевые продукты, корма для животных, микробиология, метод обнаружения и под* счета, презумптивные бактерии Bacillus cereus. питательные среды, селективные среды, гемолиз, агар с бараньей кровью, инкубирование посевов, типичные колонии, атипичные колонии, наиболее вероятное число

1S

Редактор U.E. Никулина Технический редактор В.Н. Прусакова Корректор М.С. Кабашова Компьютерная верстка ГО.0. Деиеиимой

Сданоа набор 31.10.2013. Подписаноепечать 14.11.2013. Формат в0«в4£ Гарнитура Ариал Уел. печ. и. 2.32. Уч.-иад. л. 1.75. Тирам 103 экэ. Зак. 1337.

ФГУП кСТАНДАРТИНФОРМ». 123095 Москва, Гранатный лер.. 4.     info^gostinforu

Набрано во ФГУП кСТАНДАРТИНФОРМ» на ПЭВМ.

Отпечатано в филиале ФГУП кСТАНДАРТИНФОРМ» — тип. «Московский печатник». 105462 Москва. Лялин пер., б.