База ГОСТовallgosts.ru » 67. ПРОИЗВОДСТВО ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ » 67.160. Напитки

ГОСТ 31717-2012 Соки и соковая продукция. Идентификация. Определение аскорбиновой кислоты ферментативным методом

Обозначение: ГОСТ 31717-2012
Наименование: Соки и соковая продукция. Идентификация. Определение аскорбиновой кислоты ферментативным методом
Статус: Действует
Дата введения: 07/01/2013
Дата отмены: -
Заменен на: -
Код ОКС: 67.160.20, 67.080
Скачать PDF: ГОСТ 31717-2012 Соки и соковая продукция. Идентификация. Определение аскорбиновой кислоты ферментативным методом.pdf
Скачать Word:ГОСТ 31717-2012 Соки и соковая продукция. Идентификация. Определение аскорбиновой кислоты ферментативным методом.doc

Текст ГОСТ 31717-2012 Соки и соковая продукция. Идентификация. Определение аскорбиновой кислоты ферментативным методом



МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

ГОСТ

31717-

2012

СОКИ И СОКОВАЯ ПРОДУКЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ

Определение аскорбиновой кислоты ферментативным методом

Издание официальное

Москва

Стандартинформ

2013

ГОСТ 31717—2012

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0—92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 12—2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения. обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН Государственным образовательным учреждением высшего профессионального образования «Московский государственный университет пищевых производств» Министерства образования Российской Федерации (ГОУ ВПО «МГУПП»)

2    ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 15 ноября 2012 г. № 42)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО Э16«> 004-97

Код страны

по МК (ИСО 3166) 004-9?

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Беларусь

BY

Госстандарт Республики Беларусь

Киргизия

KG

Кыргызствндарт

Молдова

MD

Мол доа е-C та нда рт

Россия

RU

Росстандврт

Таджикистан

TJ

Таджикствндарт

Узбекистан

UZ

Узстандарт

4    Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. № 1594-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31717—2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.

5    Настоящий стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 53139—2008

6    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — е ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ. 2013

в Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

ГОСТ 31717—2012

Содержание

1    Область применения............................................1

2    Нормативные ссылки............................................1

3    Обозначения и сокращения........................................2

4    Сущность метода..............................................2

5    Отбор проб.................................................2

6    Проведение определения.........................................2

6.1    Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы...........2

6.2    Приготовление растворов реактивов.................................3

6.3    Подготовка пробы...........................................4

6.4    Условия определения.........................................5

6.5    Ферментативное определение....................................5

7    Обработка результатов измерений....................................6

8    Дополнительные указания.........................................6

9    Метрологические характеристики метода.................................9

Приложение А (справочное) Информация о медленно текущих реакциях...............10

Приложение Б (справочное) Метрологические характеристики метода.................11

Библиография................................................11

in

ГОСТ 31717—2012

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

СОКИ И СОКОВАЯ ПРОДУКЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ

Определение аскорбиновой кислоты ферментативным методом

Juices and jutce products. Identification. Determination of ascorbic acid by en2ymatic method

Дата введения — 2013—07—01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на соки и соковую продукцию, включая соки и соковую про* дукцию для детского питания, в т. ч. фруктовые и овощные соки, нектары, морсы и сокосодержащие на* литки, фруктовые и овощные пюре, а также на концентрированные фруктовые и овощные соки, концентрированные морсы, концентрированные фруктовые и овощные пюре и устанавливает метод ферментативного определения массовой концентрации аскорбиновой кислоты (витамина С) в виде кис* лоты или ее соли. Диапазон определения массовой концентрации аскорбиновой кислоты составляет от 0.0003 до 0.2 г/дм3 включительно.

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие межгосударственные стандарты: ГОСТ 245—76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия

ГОСТ 641—76 Реактивы. Кислота метафосфорная. Технические условия ГОСТ 1625—89 Формалин технический. Технические условия

ГОСТ 1770—74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3652—69 Реактивы. Кислота лимонная моногидрат и безводная. Технические условия

ГОСТ 6709—72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 12026—76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 24104—2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 24363—80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336—82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26313—84 Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора

проб

ГОСТ 26671—85 Продукты переработки плодов и овощей, консервы мясные и мясорастительные. Подготовка проб для лабораторных анализов

ГОСТ 28498—90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29227—91 (ИСО 835-2—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулирований и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному

Издание официальное

1

ГОСТ 31717—2012

указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3    Обозначения и сокращения

в настоящем стандарте применены следующие сокращения и обозначения:

МТТ — бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил>-2.5-дифвнил-2Н-тетраэолия.

ФМС — переносчик электронов — феказинметосульфаг.

МТТ — формазан — комплекс МТТ и формаэана.

АО — аскорбатоксидаза.

4    Сущность метода

Аскорбиновая кислота {витамин С) и другие редуцирующие вещества (х - Н2) восстанавливают бромид 3-(4-5-диметилгиазол*2-ил)'2.5-дифенил*2Н-тетразолия (МТТ) в присутствии переносчика электронов феназинметосульфата (ФМС) при pH 3.5 до комплекса МТТ-формазана. В кювете с пробой измеряют сумму редуцирующих веществ:

Аскорбиновая кислота (х-Нг) МТТ—<?-с- »дегидраэскорбиновая кислота [х) ♦ МТТ-фориазан + Н\

Для обеспечения специфичного определения аскорбиновой кислоты в контрольной кювете проводят окисление аналита аскорбатоксидаэой (АО) в присутствии кислорода воздуха. Образующаяся де-гидроаскорбиновая кислота не взаимодействует с МТТ и ФМС:

Аскорбиновая кислота +1/203 ■■ ■— > дагидроаскорбиновая кислота ♦ НгО.

Количество образовавшегося комплекса МТТ-формазан. эквивалентное количеству аскорбиновой кислоты в исходной пробе, определяют спектрофотометрическим измерением оптической плотности исследуемого раствора пробы при длине волны 578 нм.

5    Отбор проб

5.1    Отбор проб — по ГОСТ 26313, подготовка проб — по ГОСТ 26671.

6    Проведение определения

6.1    Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

Гидроокись калия по ГОСТ 24363. ч. д. а. раствор молярной концентрации с (КОН) - 10 моль/дм3.

Поливиниллолилирролидон (код пищевой добавки Е1202) с содержанием основного вещества не

менее 95 %.

Фосфорнокислый однозамещенный 2-водный натрий. МаН2Р04гО по ГОСТ 245. ч. д. а.

Лимонная кислота моногидрат. С6Н#07 Н20. по ГОСТ 3652. ч. д. а.

Аскорбиновая кислота. С6Н9Об х. ч.

Формалин по ГОСТ 1625. раствор с объемной долей 5 %.

3-(4.5-диметилтиаэол-2-ил)-2.5-дифенил-2Н-тетразолий бромид (МТТ) с содержанием основного вещества не менее 95 %.

Феназинметосульфат (феназин/ФМС) с содержанием основного вещества не менее 95 %.

Аскорбатоксидаза (сухой лиофилизат/АО). Е 1.10.3.3 с содержанием основного вещества не менее 95 %.

Метафосфорная кислота. (НР04)п. по ГОСТ 841. раствор массовой концентрации 15 г/дм3.

Дистиллированная вода по ГОСТ 6709.

Спектрофотометр, позволяющий проводить измерения при длине волны 578 нм. или фотометр фотоэлектрический с шириной спектральной полосы не более 10 нм и допустимой абсолютной погрешностью измерений не более ± 1 %. или спектрофотометр на ртутной лампе, позволяющий проводить измерения при 578 нм.

Кюветы из оптического стекла или полимерных материалов с длиной оптического пути 1 см.

Держатель для кювет.

Иономер или pH-метр с погрешностью измерения не более 10.05 pH.

2

ГОСТ 31717—2012

Пипетки номинальной вместимостью 0,01.0.02. 0.1. 0.2. 0.5.1. 2. 5 и 10 см3 с относительной погрешностью дозирования ± 1 % по ГОСТ 29227 1-го класса точности или дозаторы пипеточные с аналогичными или изменяемыми объемами доз с относительной погрешностью дозирования не более ± 1 % или импортные с аналогичными характеристиками.

Колбы мерные по ГОСТ 1770 вместимостью 100, 250 и 1000 см3.

Стаканы по ГОСТ 25336 вместимостью 20 и 200 см3.

Цилиндры ло ГОСТ 1770 вместимостью 50 и 100 см3.

Лабораторная воронка по ГОСТ 25336 диаметром 5 см.

Часы лабораторные.

Электроплитка.

Термометр жидкостный стеклянный по ГОСТ 26498 для диапазона температур от 0 *Сдо 100 *С с пределом допускаемой погрешности не более ± 1 *С.

Весы лабораторные ло ГОСТ 24104 с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0,1 мг.

Шпатели пластиковые или палочки стеклянные оплавленные длиной от 6 до 10 см диаметром 2—3 мм для перемешивания содержимого кювет при проведении ферментативного определения.

Бумага фильтровальная лабораторная ло ГОСТ 12026.

Водяной или воздушный термостат, обеспечивающий поддержание заданной температуры ферментативной реакции в диапазоне 30 *С—40 *С и контроль температуры с погрешностью не более 0.5 *С.

Допускается применять другие средства измерений с метрологическими характеристиками, вспомогательные устройства с техническими характеристиками, а также реактивы, в том числе готовые наборы реактивов, по качеству не ниже перечисленных в настоящем разделе.

6.2 Приготовление растворов реактивов

6.2.1    Фосфатно-цитратный буферный раствор (натрий фосфорнокислый одноэамещен-ный молярной концентрации 0,2 моль/дм3, раствор моногидрата лимонной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм3, pH 3,6)

Растворяют 35.6 г натрия фосфорнокислого од незамещенного в мерной колбе вместимостью 1000 см3 в 500 см3 дистиллированной воды, полученной непосредственно перед приготовлением раствора реактива. После полного растворения реактива объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой.

Растворяют 21,0 г лимонной кислоты моногидрата в мерной колбе вместимостью 1000 см3 в 500 см3 свежей дистиллированной воды. После полного растворения реактива объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой.

Для приготовления фосфатно-цитратного буферного раствора с pH 3.6 смешивают 31.6 части раствора натрия фосфорнокислого одноэамещенного молярной концентрации 0.2 моль/дмэ и 66.4 части раствора моногидрата лимонной кислоты молярной концентрации 0.1 моль/дм3.

Фосфатно-цитратный буферный раствор годен для применения в течение 1 мес при условии хранения при температуре 4 °С. Перед использованием необходимо контролировать pH и температуру фосфатно-цитратного буферного раствора, значения которых должны составлять соответственно 3,6 и 20 *С—25 *С. Контроль температуры осуществляют термометром. При отклонении от требуемого значения pH фосфатно-цитратный буферный раствор готовят заново.

6.2.2    Рабочий раствор МТТ массовой концентрации 5 мг/см3

Растворяют 200 мг МТТ в 40 см3 фосфатно-цитратного буферного раствора с pH 3,6 (см. 6.2.1). Объем рабочего раствора МТТ достаточен для проведения примерно 20 отдельных определений аскорбиновой кислоты (см. 6.4).

Рабочий раствор МТТ годен для применения в течение 1 мес при условии хранения при температуре 4 ®С (без доступа света!). Перед использованием необходимо контролировать pH и температуру рабочего раствора МТТ. значения которых должны составлять соответственно 3.6 и 20 *С~-25 *С. Контроль температуры осуществляют термометром. При отклонении от требуемого значения pH рабочий раствор МТТ готовят заново.

6.2.3    Рабочий раствор ФМС массовой концентрации 0,6 мг/см3

Растворяют 30 мг ФМС в 50 см3 дистиллированной воды, полученной непосредственно перед приготовлением раствора реактива и нагретой на электроплитке до 40 "С—50 ®С. Рабочий раствор ФМС годен для применения в течение 12 мес при условии хранения при температуре 4 °С. Незначительно

з

ГОСТ 31717—2012

красное окрашивание, которое может появиться при хранении рабочего раствора ФМС. не влияет на ре* зультаты ферментативного определения аскорбиновой кислоты.

6.2.4    Рабочий раствор АО (1700 U/см3)

Навеску сухого лиофилизата, соответствующую активности фермента 1700 U. растворяют в

1.0 см3 фосфатно-цитратного буферного раствора с pH 3.6 (см. 6.2.1). Раствор готовят непосредственно перед использованием.

6.2.5    Раствор гидроокиси калия молярной концентрации с (КОН) * 10 моль/дм3

Растворяют 14.03 г гидроокиси калия в мерной колбе вместимостью 250 см3 в 150 см3 дистиллированной воды, полученной непосредственно перед приготовлением раствора реактива. После полного растворения реактива объем раствора в колбе доводят до метки.

6.2.6    Раствор формалина с объемной долей 5 %

8 химический стакан на 20 см3 вносят 3 см3 раствора формалина с объемной долей формальдегида 35 %. Добавляют 4 см3 дистиллированной воды. Раствор перемешивают стеклянной палочкой и используют для подготовки пробы согласно 6.3.3.

6.2.7    Раствор метафосфорной кислоты массовой концентрации (НР04)п * 15 г/дм3

Растворяют 15 г метафосфорной кислоты массовой долей 33,5 % в мерной колбе вместимостью

1000 см3 в 500 см3 дистиллированной воды, полученной непосредственно перед приготовлением раствора реактива. После полного растворения реактива объем раствора в колбе доводят до метки.

6.3 Подготовка пробы

Концентрированные соки и пюре перед определением восстанавливают согласно нормативным документам свежей дистиллированной водой до содержания растворимых сухих веществ согласно нормативным документам для соответствующего вида продукции.

6.3.1 Прозрачные или мутные слабоокрашенкые пробы

С помощью раствора гидроокиси калия (10 моль/дм3) проводят корректировку pH пробы до значения 3.5—4.0. В зависимости от количества аскорбиновой кислоты пробу разбавляют дистиллированной водой или раствором метафосфорной кислоты (15 г/дм3) согласно таблице 1.

Таблица 1

Массовая концентрация аскорбиновой кислоты в пробе", т/ды1

Разбавление

Фактор разбавления F

<0.20

1

0.20—2.0

1 * в

10

2.0-20.0

1 ♦ 99

100

>20

1 + 999

1000

" Для оценки количества аскорбиновой кислоты используют документы ков и соковой продукции [1].

. содержащие сведения о составе со-

Пробу, содержащую мутную взвесь, после разбавления фильтруют через бумажный складчатый фильтр. Для определения аскорбиновой кислоты используют визуально прозрачный слабоокрашенный фильтрат в количестве 0.100 см3.

6.3.2    Прозрачные или мутные сильноокрашеиные пробы

С помощью раствора гидроокиси калия молярной концентрации 10 моль/дм3 проводят корректировку pH пробы до значения 3,5—4.0. В зависимости от количества аскорбиновой кислоты пробу разбавляют дистиллированной водой или раствором метафосфорной кислоты массовой концентрации 15 г/дм3 согласно таблице 1.

Для удаления природных красящих пигментов к 10 см3 пробы добавляют 100 мг поливинилполи-пирролидока. Пробу перемешивают в течение 1 мин. затем фильтруют через бумажный складчатый фильтр. Для определения аскорбиновой кислоты используют визуально прозрачный слабоокрашенный фильтрат в количестве 0.100 см3.

6.3.3    Подготовка проб, содержащих в повышенных количествах диоксид серы

К10 см3 пробы добавляют одну каплю разбавленного раствора формалина объемной долей 5 %. Пробу перемешивают и выдерживают 5 мин при комнатной температуре. Значение pH пробы при необходимости корректируют раствором гидроокиси калия (10 моль/дм3) и разбавляют согласно таблице 1.

4

ГОСТ 31717—2012

Мутные пробы дополнительно фильтруют (см. 6.3.1. 6.3.2). Сильноокрашенные пробы обрабатывают поливинилполипирролидоном согласно 6.3.2.

В определении по 4.5 используют от 0,200 до 0.500 см3 фильтрата.

6.4    Условия определения

Длина волны при фотометрическом измерении составляет 576 нм. Для измерения используют стеклянную кювету1’с толщиной оптического слоя 1 см. равной ширине грани. Ферментативное определение проводят при температуре 37 *С. Общий объем инкубационной смеси в кювете составляет 2.70 см3.

Измерение оптической плотности инкубационной смеси проводят против воздуха (без кюветы в световом пути прибора). Проба в инкубационной смеси в кювете должна содержать от 0.5 до 20 мкг ас* корбиновой кислоты в 0,1—1,6 см3 пробы.

6.5    Ферментативное определение

Ферментативное определение аскорбиновой кислоты в пробе проводят по схеме дозирования и смешивания реактивов, приведенной в таблице 2. Если в определении используют иммобилизованную АО и готовые наборы реактивов, дозирование и смешивание реактивов проводят по схеме таблицы 3.

Таблица 2 — Схема дозирования и смешивания реактивов для ферментативного определения аскорбиновой кислоты

Дозирование в кювету

Контрольная проба

Проба

Рабочий раствор МТТ’Чсм. 6.2.2)

1.000 СМ3

1.000 см3

Дистиллированная вода

1.490 СМ3

1,500 см3

Пробе71 (см. 6.3)

0.100 СМ3

0.100 см3

Рабочий раствор АО (см. 6.2.4)

0,01 см3

Перемешивают. Помещают контрольную кювету и кювету с пробой в термостат при температуре 37 *С. В течение 6 мин5' интенсивно перемешивают содержимое кюветы с контрольной пробой пластиковой или стеклянной палочкой с целью насыщения инкубационной смеси воздухом (необходимое условие полного окисления аскорбиновой кислоты в контрольной пробе!}. После выдержки в контрольной кювете и в кювете с пробой измеряют значение оптической плотности А,. Продолжают реакцию добавлением:

Рабочий раствор ФМС4* (см. 6.2.3)

0.100 см3

0.100 см3

Перемешивают. Инкубируют (в темноте!) при температуре 37 *С в течение 1S мин. после чего немедленно измеряют значение оптической плотности А2 в кювете с контрольной пробой и в кювете с пробой.

’> Температуре раствора должна составлять 37 *С.

2> Перед дозированием в кювету пипетку или наконечник дозатора следует ополоснуть фильтратом пробы (см. 6.3).

э> При определении аскорбиновой кислоты в пробах, содержащих повышенные количества диоксида серы, время выдержки кюветы с контрольной пробой увеличивают до 10 мин.

4> После внесения рабочего раствора ФМС кюветы изолируют от доступа света.

Таблица 3 — Схема дозирования и смешивания реактивов для ферментативного определения аскорбиновой кислоты при использовании иммобилизованной АО

Дозирование в кювету

Кошрольпая проба

Пробе

Рабочий раствор МТТ (см. 6.2.2)

1.000 СМ3

1.000 см3

Дистиллированная вода

1.S00 см3

1.500 см3

Проба (см. 6.3)

0.100 см3

0.100 см3

Иммобилизованная АО

Один шпатель

Перемешивают. Помещают контрольную кювету и кювету с пробой в термостат при температуре 37 ‘С. В течение 6 мин интенсивно перемешивают содержимое кюветы с контрольной пробой шпателем с иммобилизованной АО с целью насыщения инкубационной смеси воздухом (необходимое условие полного окисления аскорбиновой кислоты а контрольной пробе!). После выдержки в контрольной кювете и в кювете с пробой измеряют зна-

чение оптической плотности а2. Продолжают реакцию добавлением:

Вместо кювет из оптического стекла допускается использование одноразовых кювет из полимерных материалов.

S

ГОСТ 31717—2012

Окончание таблицы 3

Дозирование в моему

Контрольная проба

Проба

Рабочий раствор ФМС (см. 6.2.3)

0.100 СМ9

0.100 СМ3

Перемешивают. Инкубируют (в темноте!) при темпервтуре 37 *С в течение 15 мин. после чего немедленно измеряют значение оптической плотности А, е кювете с контрольной пробой и в кювете с пробой.

7 Обработка результатов измерений

Значение разницы между конечным и начальным значениями оптической плотности контроля и пробы рассчитывают по формуле

АА = (А2 - Дувров “ (А2 - AJmm, •    (1)

Значение разницы оптических плотностей ДА должно составлять не менее 0.100.

Искомую массовую концентрацию аскорбиновой кислоты в исходной пробе, г/дм3, рассчитывают по общей формуле

с~-

VMW е a v 1000

•АА,

(2)

где V— общий объем инкубационной смеси, см*; и— объем пробы. смэ;

MW— молекулярный вес аскорбиновой кислоты или аскорбата (176.13 и 175.12 г/моль соответственно);

d — длина оптического пути кюветы, см;

с—молярный коэффициент оптической плотности формаэана (при измерении и длине волны 578 нм составляет 16.9 дм3/ммоль см).

Подставляя в формулу (2) необходимые значения для аскорбиновой кислоты, получают модифицированную формулу (3) для расчета массовой концентрации аскорбиновой кислоты (в г/дм3) в пробе:

2.70 176.13

с--

16.9-1 0.100 1000

• ДА а 0,2814 - ДА.

(3)

Если перед ферментативным определением проба подвергалась разбавлению, то результат, полученный по формуле (3). умножают на коэффициент разбавления F.

в случае концентрированных соков или пюре результат определения выражают в г/100 г продукта. Расчет осуществляют с учетом навески, взятой для получения восстановленного продукта (см. 6.3). по формуле

с =i-. ЮО.    (4)

т

где с — массовая концентрация аскорбиновой кислоты в исследованной пробе, рассчитанная по формуле (2). г/дм3:

т — навеска концентрированного сока или пюре, взятая для получения восстановленного продукта (см. 6.3). г.

8 Дополнительные указания

8.1 Факторы, влияющие на определение

Если общая разница оптических плотностей ДА менее 0.100. то необходимо повторно провести определение, используя большую навеску или увеличенный объем пробы, дозируемой в инкубационную смесь (до 1.490 см3 по схеме дозирования таблицы 2 или до 1.500 см3 по схеме дозирования таблицы 3). В этом случае объем воды, добавляемой в кювету, должен быть уменьшен на соответствующее

6

ГОСТ 31717—2012

значение для сохранения общего объема инкубационной смеси (2.70 см3) в кювете с неизменными кон* тролем и пробой. Увеличенный объем пробы необходимо принимать во внимание при расчете конечного результата согласно формуле (3).

8.2    Специфичность определения

Метод специфичен для определения общей аскорбиновой кислоты, включающей D- и Ьизомеры.

В анализе коммерческих препаратов аскорбиновой кислоты {например, витаминов) в свежеприготовленных растворах можно ожидать, что степень повторного нахождения искомого вещества составит 94 %—100 %. На качество результатов определения степени повторного нахождения влияет срок хранения коммерческого препарата аскорбиновой кислоты и растворитель, используемый для получения растворов. Рекомендуется использовать раствор метафосфорной кислоты (см. 4.1 )с доведением pH пробы до 3.5—4.0.

На стабильность аскорбиновой кислоты в водных растворах сильно влияет присутствие ионов металлов. например железа и меди, а также наличие в пробе кислорода. В этом случае ожидаемая степень повторного нахождения будет составлять менее 100 %, что обусловливается частичной лотерей аскорбиновой кислоты.

С помощью настоящего ферментативного метода нельзя определить L-асхорбилпальмитат, так как в ходе щелочного гидролиза происходит спонтанное разрушение свободной аскорбиновой кислоты.

8.3    Причины возможных ошибок при проведении определения

Сахароза, содержащаяся в соках и соковой продукции, не мешает определению, если ее концентрация в кювете не превышает 30 мг.

Определению аскорбиновой кислоты мешает D-сорбит (при концентрации более 20 мг в кювете), который ингибирует аскорбзтоксидазу. а также этанол в высоких концентрациях, превышающих 100 мг/юовета. Влияние большинства мешающих факторов на результат определения исключается путем увеличения длительности инкубации контрольной пробы с аскорбатоксидаэой до 10 мин.

Диоксид серы в высоких концентрациях, превышающих 50 мкг/кювета. взаимодействует с МТТ и ФМС и вызывает тем самым медленно текущую реакцию. В этом случае пробу подвергают предварительной обработке согласно 6.3.3.

Ионы металлов в концентрациях более 100 мкг/кювета могут понизить pH системы и. тем самым, ингибировать действие аскорбатоксидазы.

Нитрит, который может содержаться в некоторых овощных соках, не мешает определению. Однако его присутствие в системе может привести к спонтанному распаду аскорбиновой кислоты.

Ионы оксалата в концентрациях от 30 мкг/кювета способны оказывать значительное ингибирующее действие на аскорбатоксидазу. высокую концентрацию оксалата устраняют путем добавления ионов кальция до концентрации 30 мкг/кювета и выше, а также созданием в системе слабокислой среды (pH 5—6).

8.4    Выявление и устранение мешающих факторов при проведении анализа.

Контроль ферментативного определения

8.4.1    Общие указания

Если разница оптических плотностей ЛА менее 0.100. следует провести повторную подготовку пробы к определению, увеличив ее навеску или уменьшив разбавление. Значение pH пробы в любом определении должно находиться в интервале от 3.5 до 4.0.

8.4.2    Операции с контрольной пробой

Содержимое кюветы с контрольной пробой интенсивно перемешивают стеклянной или пластиковой палочкой (или шпателем с иммобилизованной АОг) в течение предварительной реакции.

После внесения рабочего раствора ФМС реакция проявляет повышенную чувствительность к свету. поэтому инкубирование при температуре 37 *С необходимо проводить в полной темноте. Для чего кюветы, находящиеся, например, в держателе, помещенном в водяной или воздушный термостат, накрывают плотной светонепроницаемой тканью. Попадание света приводит к возникновению нежелательной медленно текущей реакции.

В случае медленно текущей реакции, вызванной попаданием света, значение оптической плотности А2 системы определяют в соответствии с рекомендациями 6.4.5. Так как кюветы с пробой и контрольной пробой содержат одинаковый объем инкубационной смеси, медленно текущие реакции в них идентичны. От экстраполяции в этом случае можно отказаться. Однако необходимо принимать во ени*

7

ГОСТ 31717—2012

мание, что оптическую плотность А2 а кювете с контрольной пробой и в юоаете с пробой необходимо измерять непосредственно одну за другой.

Если разница оптических плотностей (А2—4,) контрольной пробы менее 0,020. то следует соблюдать следующие правила: рабочий раствор МТТ должен храниться в темноте; при использовании рабочего раствора МТТ его нельзя подвергать прямому облучению солнечным или электрическим светом; содержимое кюветы с контрольной пробой необходимо интенсивно перемешивать стеклянной или пластиковой палочкой (или шпателем с иммобилизованной АО) с целью насыщения инкубационной смеси воздухом; после внесения в инкубационную смесь рабочего раствора ФМС кюветы с контрольной пробой и пробой защищают от солнечного или электрического света.

8.4.3    Стабильность аскорбиновой кислоты

Водные растворы аскорбиновой кислоты нестабильны. При анализе твердых проб рекомендуется проводить выделение аскорбиновой кислоты раствором метафосфорной кислоты концентрации 15 г/дм2. После экстрагирования pH вытяжки корректируют раствором гидроокиси калия (10 моль/дм3) до 3,5—4.0.

Для стабилизации аскорбиновой кислоты не рекомендуется применять растворы оксалатов, так как их ионы ингибируют аскорбатоксидазу.

Разбавление пробы дистиллированной водой или метафосфорной кислотой проводят непосредственно перед определением. В этом случае нет необходимости в проведении корректировки pH до 3.5—4.0.

8.4.4    Медленно текущие реакции

Из практики применения метода следует, что оптическая плотность инкубационной смеси может увеличиваться даже после окончания ферментативной реакции (возникает медленно текущая реакция). В этом случае расчет значения конечной оптической плотности проводят экстраполированием на момент внесения в инкубационную смесь рабочего раствора ФМС (см. 6.2.3).

Экстраполяцию проводят графическим способом или согласно следующей схеме: по истечении 15 мин после добавления в кюветы рабочего раствора ФМС (см. 6.2.3) проводят измерение оптической плотности (А2). измерения повторяют каждые две минуты до тех пор. пока приращение \A/\t не будет принимать постоянные значения. Измерения останавливают и действительное значение конечной оптической плотности инкубационной смеси на момент внесения рабочего раствора ФМС (см. приложение А) рассчитывают по формуле

Аг(д = А2(Г,6)-

IS-ДДШ

2

(5)

Затем по формуле (1) рассчитывают значение разницы между значениями конечной и начальной оптической плотности контроля и пробы.

8.5 Контроль ферментативного определения

Контроль определения осуществляют при необходимости проверки качества реактивов, оценки уровня квалификации персонала лаборатории, осуществляющего анализ аскорбиновой кислоты, а также для выявления и устранения случайных и систематических ошибок определения.

8.5.1    Приготовление стандартного раствора аскорбиновой кислоты

Берут навеску в 200 мг аскорбиновой кислоты и количественно переносят ее в мерную колбу вместимостью 100 см3. Объем раствора в колбе доводят до метки метафосфорной кислотой (15 г/дм3), затем тщательно перемешивают. Переносят 10 см3 приготовленного раствора в другую мерную колбу вместимостью 100 см3, затем доводят объем раствора до метки метафосфорной кислотой (15 г/дм3). Содержимое колбы тщательно перемешивают.

Стандартный раствор аскорбиновой кислоты стабилен в течение суток при температуре 20 *С. в течение трех дней при температуре 4 *С и в течение одной недели при минус 20 °С. В схемах дозирования и определения (таблицы 2. 3 и 4) допускается использовать в качестве внешнего стандарта только свежеприготовленный стандартный раствор аскорбиновой кислоты.

8.5.2    Применение стандартного раствора аскорбиновой кислоты в качестве внутреннего стандарта

Ферментативное определение с применением стандартного раствора аскорбиновой кислоты (см. 6.5.1) в качестве внутреннего стандарта проводят по следующей схеме дозирования (см. таблицу 4).

8

ГОСТ 31717—2012

По формуле (1) рассчитывают разницу значений оптических плотностей для юоеет «Проба + стандарт (внутренний)». «Стандарт (внешний)» и «Проба». Степень повторного нахождения (ПН. %) для аскорбиновой кислоты, содержащейся в стандартном растворе (см. 6.5.1). рассчитывают ло формуле

-станша» ~ -^л»ова    ^

Ферментативное определение проведено без ошибок, если степень повторного нахождения аскорбиновой кислоты находится в интервале от 95 % до 100 %.

Таблица 4 — Схема дозирований и смешивания реактивов для ферментативного определения с использованием раствора аскорбиновой кислоты в качестве внешнего и внутреннего стандарта (8.5.2)

Дозирует в кювету

Контрольная

проба

Проба

Стандарт

(контроль!

Стандарт

(внешний)

Контроль

4

стандарт

(внутренний)

Пробе

4

стандарт

{внутренний)

Рабочий раствор МТТ (см. 6.2.2)

1.000 СМ3

1.000 СМ*

1.000 СМ*

1.000 СМ*

1.000 см*

1.000 см»

Дистиллированная вода

1.490"см’ <1.500»» см»)

1.490’» см* (1.500** см»)

1.490’>СМ* (1.500»' СМ»)

1.490" СМ* <1.S00»'cm»)

1.490" см* (1.500»» см*)

1.490"см* <1.500»‘см*)

Проба (см. 6.3)

0.100 см3

0.100 см*

0.050 см*

0.050 см*

Стандартный раствор аскорбиновой кислоты (см. 6.5.1)

0.100 см’

0.100 см*

0.050 см*

0.050 см»

Рабочий раствор АО (см. 6.2.4) или иммобилизованная АО

0.010" см* (один шпатель»»)

0.010" см» (один шпатель2')

0.010’»ем* (один шпатель2')

Рабочий раствор АО (см. 6.2.4) или иммобилизованная АО

0.010" см* (один шпатель2')

0.010" см» (один шпатель2»)

0.010" см* (один шпатель2')

Перемешивают. Помешают кюветы в термостат при 37 *С. В течение 6 мин интенсивно перемешивают содержимое контрольных кювет с целью насыщения инкубационной смеси воздухом (необходимое условие полного окисления аскорбиновой кислоты!). После выдержки измеряют значение начальной оптической плотности А1. Продолжают реакцию добавлением:

Рабочий раствор ФМС (см. 6.2.3)

0.100 см*

0.100 см*

0.100 см’

0.100 см*

0.100 см»

0.100 см»

Перемешивают. Инкубируют (в темноте!) при температуре 37 *С е течение 15 мин. после чего немедленно измеряют значение конечной оптической плотности А3.

»' При использовании рабочего раствора АО (см. 6.2.4).

»> При использовании иммобилизованного препарата АО (например, шпателя с иммобилизованной АО).

8.6    Граница чувствительности метода

Граница чувствительности метода составляет 0,30 мг/дм3 при ЛА =0,015 (при 578 нм) и максимальном объеме пробы v в 1.490 (или 1.600) см3.

8.7    Линейность определения

Линейность определения сохраняется в интервале от 0,5 мкг аскорбиновой кислоты в кювете (0.3 мг аскорбиновой кислоты/дм3 пробы; объем пробы — v = 1.600 см3) до 20 мкг аскорбиновой кислоты в кювете (0.2 г аскорбиновой кислоты/дм3 пробы: объем пробы v - 0.100 см3).

9 Метрологические характеристики метода

В параллельном определении возможны различия между значениями оптических плотностей, которые будут составлять от 0,005 до 0,010. Это соответствует объему пробы v - 0.100 см3 и концентрации аскорбиновой кислоты от 1,5 до 3 мг/дм3. При использовании в определении навески пробы в 1 г/100см{= 10 г/дм3) ожидаемые различия между параллельными определениями составят 0.015—0.030 г/100 г. Метрологические характеристики метода приведены в приложении Б.

9

ГОСТ 31717—2012

Приложение А (справочное)

Информация о медленно текущих реакциях

Ферментативные реакции а большинстве случаев являются реакциями нулевого порядка. Основная реакция характеризуется высокой скоростью. Для побочной — медленно текущей реакции — характерны низкие скорости. С практической точки зрения начало основной реакции связано с началом побочной реакции нулевого порядка. Характерным признаком медленно текущей реакции является постоянное количественное изменение оптической плотности с течением времени. Для получениядостоверных результатов значение имеет только основная реакция. Концентрацию искомого вещества (субстрата в основной реакции) рассчитывают на основе количественной разницы между значением оптической плотности суммарной реакции (основная * медленно текущая реакции) и значением оптической плотности медленно текущей реакции.

Медленно текущая реакция начинается в отправной точке суммарной реакции (рисунок А.1). В этот момент времени в инкубационной смеси отсутствуют продукты ферментативной реакции, в том числе продукты медленно текущей реакции, которые могли бы привести к изменению оптической плотности системы. Для количественного определения общей разницы оптических плотностей значение конечной оптичесхой плотности инкубационной смеси экстраполируют на момент начала основной реакции — внесение фермента или добавление рабочего реактива (рабочего раствора ФМС в ферментативном определении аскорбиновой кислоты). Контроль медленно текущей реакции позволяет получить только один количественный результат — значение оптической плотности в начальной точке суммарной реакции (основная * побочная реакции). Присутствие в инкубационной смеси медленно текущей реакции регистрируют с момента завершения основной реакции.

Рисунок А.1 — Графическое определение конечной оптической плотности инкубационной смеси, а которой присутствует медленно текущая реакция

10

ГОСТ 31717—2012

Приложение Б (справочное)

Метрологические характеристики метода

Метрологические характеристики метода, полученные е трех лабораториях, приведены в таблицах Б.1 и Б.2.

Таблица Б.1

Показатель

Водной серии определений (количество измерений е серии » * 15)

Лаборатория 1

Лаборатория 2

Лаборатория Э

Среднеарифметическое значение (х). г/дм3

O.OS9

0.192

0.380

Среднеквадратичное отклонение повторяемости результатов определения (з,). г/дм

0.00142

0.00346

0.004 56

Козффициент вариации. %

2.4

1.6

1.2

Таблица Б.2

Показатель

В повторны* сериях определений (общее количество измерений п ■ ! 5)

Лаборатория 1

Лаборатория 2

Лаборатория Э

Среднеарифметическое значение (х). г/дм3

0.059

0.192

0.380

Среднеквадратичное отклонение повторяемости результатов определения (з,). г/дм

0.00224

0.00422

0.0076

Коэффициент еаривции. %

3.8

2.2

2.0

Библиография

|1) Свод правил для оценки качества фруктовых и овощных соков Ассоциации промышленности соков и нектаров из фруктов и овощей Европейского союза (Свод правил AIJN) (издание на русском языке). — М.; Новови-та. —2004

11

ГОСТ 31717—2012

УДК 664.863.001.4:006.354    МКС 67.080    Н59

Ключевые слова: соки фруктовые и овощные, пюре фруктовые и овощные, концентрированные соки фруктовые и овощные, концентрированные пюре фруктовые и овощные, морсы, концентрированные морсы, нектары, сокосодержащие напитки, соковая продукция, определение, измерение, аскорбиновая кислота, ферментативный метод определения, идентификация, соки и соковая продукция для детского питания

Редактор М.И. Максимова Технический редактор в.И. Прусакова Корректор U.8. Вучная Компьютерная верстка В.И. Грищенко

Сдано а набор 15.10.2013 Подписано в печать 01.11 2013. Формат 60>64'/«. Гарнитура Ариал Усп. печ. л. 1.66.

Уч.-иад л. 1.46. Тираж 143 экз. Зак. 1280

ФГУП кСТАНДАРТИНФОРМ». 123995 Москва. Гранатный пер.. 4. info£gostinfo.ru Набрано во ФГУП кСТАНДАРТИНФОРМ» на ПЭВМ

Отпечатано а филиале ФГУП кСТАНДАРТИНФОРМ» — тип. кМоскоеский печатник», 106062 Москва, Лилии пер.. 6.