База ГОСТовallgosts.ru » 67. ПРОИЗВОДСТВО ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ » 67.120. Мясо, мясные продукты и другие животные продукты

ГОСТ 34106-2017 Продукция пищевая и сырье. Метод секвенирования фрагментов митохондриального генома животных и рыб для определения видовой принадлежности в однокомпонентной продукции

Обозначение: ГОСТ 34106-2017
Наименование: Продукция пищевая и сырье. Метод секвенирования фрагментов митохондриального генома животных и рыб для определения видовой принадлежности в однокомпонентной продукции
Статус: Принят

Дата введения: 07/01/2018
Дата отмены: -
Заменен на: -
Код ОКС: 67.120.10, 67.120.30
Скачать PDF: ГОСТ 34106-2017 Продукция пищевая и сырье. Метод секвенирования фрагментов митохондриального генома животных и рыб для определения видовой принадлежности в однокомпонентной продукции.pdf
Скачать Word:ГОСТ 34106-2017 Продукция пищевая и сырье. Метод секвенирования фрагментов митохондриального генома животных и рыб для определения видовой принадлежности в однокомпонентной продукции.doc


Текст ГОСТ 34106-2017 Продукция пищевая и сырье. Метод секвенирования фрагментов митохондриального генома животных и рыб для определения видовой принадлежности в однокомпонентной продукции



МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

ГОСТ

34106-

2017

ПРОДУКЦИЯ ПИЩЕВАЯ И СЫРЬЕ

Метод секвенирования фрагментов митохондриального генома животных и рыб для определения видовой принадлежности в однокомпонентной продукции

Издание официальное

Москва

Стандартииформ

2017

ГОСТ 34106—2017

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0—2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2—2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)

2    ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от1 июня2017г.М?51)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Код страны

по МК (ИСО 3166) 004- 97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Армения

AM

Минэкономики Республики Армения

Беларусь

BY

Госстандарт Республики Беларусь

Казахстан

К Z

Госстандарт Республики Казахстан

Киргизия

KG

Кыргызстандврт

Россия

RU

Росстандарт

Таджикистан

TJ

Твджикстандарт

Узбекистан

U Z

Уэствндарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 19 июля 2017 г. № 724-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34106—2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2018 г.

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — е ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уев• домление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет ()

©Стандартинформ, 2017

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

ГОСТ 34106—2017

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКЦИЯ ПИЩЕВАЯ И СЫРЬЕ

Метод секвенирования фрагментов митохондриального генома животных и рыб для определения видовой принадлежности в однокомпонентной продукции

Food end raw materials. Sequencing of me mitochondrial genomes of animals and fish for species identification »n single

component products

Дата введения — 2018—07—01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на однокомпонентную пищевую продукцию и сырье из мяса животных, рыбы, икры и устанавливает метод определения видовой принадлежности свкаениро-ванием фрагмента митохондриального генома.

2    Нормативные ссылки

8 настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004—91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005—88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007—76 Система стандартов безопасности труда, вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019—79* Система стандартов безопасности труда. Электробеэопаскость. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009—83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объ-екгое. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.131—83 Халаты женские. Технические условия ГОСТ 12.4.132—83 Халаты мужские. Технические условия

ГОСТ OIML R 76-1—2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 1770—74 (ИСО 1042—83. ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3164—78 Масло вазелиновое медицинское. Технические условия ГОСТ 6709—72 Вода дистиллированная. Технические условия ГОСТ 9805—84 Спирт изопропиловый. Технические условия ГОСТ 12026—76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия ГОСТ ИСО/МЭК 17025—2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 25336—82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26678—85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического рода. Общие технические условия

ГОСТ 28311—89 Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний

* 8 Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019—2009.

Издание официальное

1

ГОСТ 34106—2017

ГОСТ 31719—2012 Продукты пищевые и корма. Экспресс-метод определения сырьевого состава (молекулярный)

ГОСТ IEC 60335-2-25—2014 Безопасность бытовых и аналогичных электрических приборов. Часть 2-25. Частные требования к микроволновым печам, включая комбинированные микроволновые печи

Применение — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей ату ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями.

3.1    алгоритм BLAST: Алгоритм поиска родственных нуклеотидных или аминокислотныхпоследо-еательностей в базах данных.

Применение — В настоящем стандарте под базами денных подразумеваются базы данных GenBank. EM8L и DOBJ. доступные через поисковой интернет-ресурс . содержащие охарактеризованные последовательности НК организмов различных видов и доступные пользователям на безвозмездной основе.

3.2    амплификатор: Автоматический прибор, выполняющий необходимые для ПЦР циклы нагрева и охлаждения с заданными условиями.

3.3    амплификация ДНК: Процесс, многократно увеличивающий число копий фрагмента генома какого-либо организма.

3.4    бу^юрный раствор: Реакционная среда, содержащая различные компоненты, в том числе ионы Мд2*, необходимые для поддержания оптимальной активности и стабильности фермента.

3.5    выравнивание нуклеотидных последовательностей: Процесс сопоставления сравниваемых последовательностей до такого их взаиморасположения, при котором наблюдается максимальное количество совпадений нуклеотидов.

3.6    дезоксирибонуклеаза: Фермент, разрушающий ДНК.

3.7    денатурация ДНК: Процесс, в результате которого двухцепочечная ДНКразделяется на одно-цепочечные.

3.8    ДНК-полимераза: Термостабильный фермент (ДНК-зависимая ДНК-полимераэа). катализирующий циклический синтез ДНК.

3.9    идентификация: Процесс определения принадлежности микроорганизма к определенному таксону.

3.10    идентичность: Отношение количества совпадающих оснований в выровненных позициях двух нуклеотидных последовательностей к общему количеству выровненных позиций, выраженное в процентах.

3.11    лабораторная проба: Проба, предназначенная для лабораторных испытаний.

3.12    мастермикс: Смесь реагентов, необходимых для амплификации ДНК в ПЦР. включающая специфические праймеры и дНТФ.

3.13    матрица: Одноцелочечная НК. комплементарная синтезируемой цепи ДНК. определяющая последовательность нуклеотидов в синтезируемой цепи.

3.14    нуклеиновые кислоты; НК: Макромолекулы, являющиеся носителями генетической информации или выступающие в качестве посредника при синтезе полипептидной цепи.

3.15    нуклеотидная последовательность: Порядок чередования нуклеотидных остатков в НК.

3.16    очистка ДНК: Процесс обработки выделенной ДНК. позволяющий повысить ее чистоту с целью снижения ингибирования реакции ПЦР.

3.17    отжиг: Гибридизация праймера с комплементарной последовательностью нуклеиновых кислот в заданных условиях.

3.18    отрицательный контрольный образец; ОКО: Раствор, используемый вместо анализируемой пробы для контроля чистоты выделения ДНК.

3.19    отрицательный контроль ПЦР; К-: Реакционная смесь для проведения ПЦР. заведомо не содержащая целевой нуклеиновый материал.

2

ГОСТ 34106—2017

3.20    отрицательный контроль выделения (контроль чистоты выделения) Кв: Контроль, про* шедший все этапы выделения ДНК. но в отсутствие анализируемой пробы.

3.21    полимеразная цепная реакция; ПЦР: Ферментативная реакция, позволяющая амплифици-ровать фрагмент ДНК in vitro.

3.22    положительный контроль ПЦР; К+: Реакционная смесь для проведения ПЦР. заведомо содержащая целевой нуклеиновый материал (ПКО).

3.23    положительный контрольный образец; ПКО: Раствор, содержащий определенное коли* чество целевого нуклеинового материала для проведения ПЦР.

3.24    праймер: Олигонуклеотид с определенной длиной и последовательностью, комплементар* ный фрагменту аналитически значимой последовательности ДНК.

Примечание — Праймеры ограничивают целевую последовательность ДНК.

3.25    проба для анализа: Проба, подготовленная для проведения испытаний, которую полностью и единовременно используют для проведения испытания.

3.26    ПЦР*продукт: Фрагмент ДНК. амплифицированный в ПЦР.

3.27    ПЦР с горячим стартом: Активация термосгабильной ДНК-лолимеразы с помощью этапа прогрева перед основной программой, позволяющая избежать неспецифической амплификации.

3.28    секвенирование ДНК: Определение нуклеотидной последовательности фрагмента генома организма.

3.29    смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов; дНТФ: Раствор, содержащий дезоксиаденоэин* трифосфат. дезоксицитидинтрифосфат. дезоксигуанинтрифосфат. дезохситимидинтрифосфат. являющиеся «строительными блоками» для синтеза новых комплементарных цепей ДНК.

3.30    смесь дидеэоксинуклеозидтрифосфатов; ддНТФ: Смесь производных дНТФ. у которых гидроксильная группа у третьего атома углерода деэоксирибозы замещена атомом водорода.

Примечание — Флуоресцентно-меченые ддНТФ используют при секвенироввнии в качестве терминаторов элонгации праймеров, так как их включение прерывает возможность дальнейшего удлинения цепи ДНК.

3.31    специфичность: Способность применяемого метода распознавать исключительно целевую последовательность и отличать ее от сходных последовательностей и загрязняющих примесей.

3.32    целевая ДНК: Выбранная для амплификации последовательность ДНК.

3.33    экстракция ДНК: Обработка анализируемой пробы, высвобождающая ДНК.

3.34    элюция: Извлечение вещества из твердого носителя вымыванием подходящим растворителем.

3.35    элонгация праймера: Ферментативная реакция, приводящая к синтезу новой цепи ДНК путем добавления одиночных дезоксирибонуклеотидое кЗ'-концу праймера.

4    Условия выполнения испытаний и требования безопасности

4.1    Условия выполнения испытаний

4.1.1    Общие требования, предъявляемые к компетентности испытательной лаборатории и проведению испытаний. — поГОСТИСО/МЭК17025.

4.1.2    Требования к персоналу — по ГОСТ ИСО/МЭК17025.

4.2    Требования безопасности

4.2.1    При работе с химическими реактивами необходимо соблюдать общие требования безопасности обращения с вредными веществами, установленные ГОСТ 12.1.007.

4.2.2    Содержание вредных веществ ввоздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных в ГОСТ 12.1.005.

4.2.3    При работе с электроустановками следует соблюдать требования электробезопасности, установленные в ГОСТ 12.1.019.

4.2.4    Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004. быть оснащено средствами пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

5    Средства измерений, оборудование, реактивы, посуда и материалы

5.1    При проведении испытаний оборудование следует обслуживать в соответствии с инструкциями производителя и требованиями ГОСТ ИСО/МЭК 17025.

5.2    Для проведения испытаний применяют следующие средства измерений и оборудование: з

з

ГОСТ 34106—2017

•    весы электронные по ГОСТ OIML R 76*1 II (высокого) класса точности с действительной ценой деления d £0,01 г; при взвешивании в диапазоне от 0,02 до 50.00 г пределом допускаемой погрешности при первичной поверке ±4 мг. при эксплуатации — 15 мг;

•    набор дозаторов электронных или механических медицинских лабораторных по ГОСТ 28311. с варьируемыми объемами доз;

•    анализатор генетический для разделения фрагментов дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) методом капиллярного электрофореза с детекцией сигнала флюоресценции, позволяющий осуществить прочтение нуклеотидной последовательности длиной до 950 пар нуклеотидов (л. н.) с точностью не менее 98.5%*:

•    бокс ламинарный с классом биологической безопасности II типа А для выделения НК;

-    ПЦР-бокс с бактерицидной лампой:

•    амплификаторы для микропробирок вместимостью 0.2 и 0,6 см3 с возможностью активного регулирования температуры по раствору в пробирке;

-    термостат твердотельный с диапазоном твмпвратурот 25 вС до 100 *С для микропробирок вместимостью 1.5 см3;

•    отсасыеатель вакуумный медицинский с колбой-ловушкой;

•    микроцентрифуги с угловым ротором для микропробирок вместимостью 1.5 см3 со скоростью вращения до 14800 об/мин. максимальным ускорением 21100 д;

•    миницентрифуги-встряхиеатели с роторами для микропробирок вместимостью 0.2; 0.6 и 1.5 см3, скоростью вращения не менее 2400 об/мин и максимальным ускорением до 700 д;

-    холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678. обеспечивающий поддержание температуры от 2 *С до 8 *С. с морозильной камерой. обеспечивающий поддержание температуры не выше минус 16 *С;

-    камеру для горизонтального электрофореза;

•    источник питания для электофореза постоянного тока с напряжением от 150 до 460 В;

-    трансиллюминатор ультрафиолетовый с кабинетом для просмотра гелей:

-    видеосистемус цифровой видеокамерой для регистрации результатов и передачи изображения;

•    печь микроволновую мощностью не менее 800 Вт. соответствующую требованиям ГОСТ IEC 60335-2-25.

5.3 Для проведения испытаний применяют следующие реактивы:

а)    набор реагентов для экстракции ДНК**, включающий:

1)    буфер для лизирующего реагента, содержащий хаотропный агент гуанидин хлорид;

2)    лизирующий реагент, содержащий протеиназу К;

3)    раствор для отмывки N91 для очистки от клеточных белков, содержащий хаотропный агент гуанидин тиоционат;

4)    раствор для отмывки № 2 для очистки от солей, содержащий водный раствор изопропилового спирта;

5)    сорбент (25 %-ная взвесь частиц Si02 размером от 20 до 50 мкм в растворе Трис-HCI молярной концентрации 5 ммоль/дм3};

б)    буфер для элюции ДНК (Трис-HCI молярной концентрации 10 ммоль/дм3; натриевая соль эти-лендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) молярной концентрации 1 ммоль/дм3};

6)    растворы прямого и обратного ПЦР-праймеров молярной концентрацией 10 ммоль/дм3 и чистотой специфического олигонуклеотида не менее 98 %. позволяющие амплифицировать фрагмент генов митохондриального генома cytB:

«Glu»5'-AAACTAATGACATGAAAAA(C/T)CA(T/C)CGTTG.3;

«CytB»5,-CCCTCAGAATGATATTTGNCC(C/T)CA-3'.

в) «ПЦР-смесь-2»***. содержащую термостабильную ДНК-полимераэу активностью 0.25 ед./мм3, магния сульфат MgS04 молярной концентрации 5 ммоль/дм3: Трис-HCI молярной концентрации 66 ммоль/дм3 с pH б.Зед. pH; аммония сульфат (NH4)2S04 молярной концентрации 16.7 ммоль/дм3; рас-т вор «Теин-20» 0.01 %-ный; раствор глицерина 20 %-ный: краситель крезоловый красный;

* Примером подходящего оборудования может служить генетический анализатор «A8I PRISM 3130 Genetic Analyzer» (Applied Biosysteme. США}с капиллярным блоком типа «3130/3100-Avant* Genetic Analyzer Capillary Array. 4 * SO cm (Applied Biosyetems. США). Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.

** Примером может служить набор «ДНК-сорб С» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнвдэора. РФ). Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.

**' Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.

4

ГОСТ 34106—2017

г)    раствор дНТФ, содержащий натриевые соли дНТФ оостепенью очистки более 98% и концентрацией каждого 2 моль/дм3. pH % 7,5 ед. pH;

д)    воду деионизованную, класса чистоты I, свободную от рибонуклеаэ. дезоксирибонуклеаз, неорганических и органических примесей с удельным сопротивлением не менее 18 Мом - см;

е)    воск для ПЦР;

ж)    масло вазелиновое медицинское по ГОСТ 3164;

и)    агарозу, пригодную для электрофоретического разделения ДНК:

к)    трис-ацетатный электродный буфер (ТАЕ-буфер) для электрофореза (50-кратный концентрированный буферный раствор, содержащий трис-ацетат 2 моль/дм3. ЭДТА молярной концентрации 50 ммоль/дм3, pH = 8.4 ед. pH:

л)    раствор бромистого этидия концентрацией 10 мг/см3:

м)    маркер молекулярных масс ДНК. содержащий фрагменты ДНК размером от 100 до 1000 л. н. концентрацией 100 нг/мм3, объемом для нанесения в лунки геля 3—5 мм3:

н)    набордляочисткипродуктовПЦР*;

л) реагентдлясекеенироеанияДНК**;

р)    спирт изопропиловый по ГОСТ 9805 массовой долей основного вещества 99.8 %;

с)    воду дистиллированную по ГОСТ 6709;

т)    формамид высокоочищенный деионизированный с электропроводностью в диапазоне 19—34 мкСм/см***:

у)    полимер для капиллярного электрофореза*4;

ф)    концентрат буфера для капиллярного электрофореза*5.

5.4 Для проведения испытаний применяют следующие посуду и материалы:

•    пробирки одноразовые полипропиленовые плотно закрывающиеся градуированные вместимостью 0.6 и 1,5 см3;

•    пробирки для ПЦР с плоской крышкой вместимостью 0,2 см3;

•    колбу коническую по ГОСТ 25336. из термостойкого стекла вместимостью 250 см3:

•    мерную колбу вместимостью 2000 см3 по ГОСТ 1770;

•    цилиндры мерные вместимостью 50 см3 и 250 см3 по ГОСТ 1770;

•    ножницы;

•    шпатели металлические:

•    наконечники одноразовые универсальные для электронных или механических дозатороес варьируемыми объемами доз;

•    штативы для микропробирок и наконечников;

•    планшеты 96-луночные для автоматического генетического анализатора с уплотнителем, основанием (штативом) и фиксатором*6;

* Примером может служить набор «ExoSAP-IT™* (USB Corporation. США). Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.

'• Примером подходящего реагента может служить «BigDye$ Terminator v1.1 Ready Reaction Mix» из набора реактивов для секвенирования «BigOye® Terminator vl.1 Cycle Sequencing Kit» (Applied Bioayeteme. США). Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.

••• Примером может служить формамид «Hi-Di Formamide» (Applied Biosystems. США). Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.

’* Примером подходящего полимера может служить «РОР-7"* Polymer for 3130/3130x1 Genetic Analyzers» (Applied 8iosystems. США). Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.

*5 Примером подходящего концентрата буфера может служить «310 and 31хх Running Buffer. ЮХ» (Applied Biosysteme. США). Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей нестоящего стандарта.

6 Примером может служить планшет «MicroAmp& Optical 96-Wen Reaction Plate» (Applied Biosysteme. США) c уплотнителем типа «96-Well Plate Septa» (Applied Biosysteme. США), основанием типа «3130 and 3100 senes Plate Base 96-Well» (Applied Biosystems. США) и фиксатором типа «3130 and 3100 senes Plate Retainer 96-WeU» (Applied Biosystems. США). Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.

S

ГОСТ 34106—2017

•    емкости для сброса наконечников;

•    вмкостидлярастеороесуплотнителями* •*;

•    емкостьдляанодногобуфера’*;

•    пакеты полиэтиленовые одноразовые с застежкой-молнией;

•    салфетки для очистки линз, химически чистые;

•    ленту лабораторную влагостойкую эластичную:

•    халатылоГОСТ 12.4.131 иГОСТ 12.4.132;

•    перчатки одноразовые из латекса без пудры;

•    бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026.

5.5 Допускается использование других средств измерений с метрологическими характеристиками. а также оборудования, материалов, посуды и реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных.

6    Сущность метода

6.1    Сущность метода заключается в определении нуклеотидной последовательности участка митохондриального генома разных видов животных и рыб и их сравнении с известными последовательностями для идентификации их видовой принадлежности.

6.2    Испытание состоит из следующих этапов:

•    экстракция и очистка ДНК. На данном этапе осуществляется лизис клеток с последующей очисткой ДНКот балластных веществ (белков, полисахаридов и других соединений);

•    ПЦР с парой праймеров, фланкирующей участок митохондриального генома в области cytB гена. На данном этапе осуществляется накопление копий определенной нуклеотидной последовательности генома;

•    детекция ПЦР-лродуктов методом электрофореза в агарозном геле для выявления специфической полосы амплифицированной ДНК и оценка концентрации ПЦР-продукта;

•    секвекирование ПЦР-лродукта. очищенного от кевключившихся праймеров и дНТФ дидезокси-нуклеотидным методом с флуоресцентными красителями;

- определение нуклеотидной последовательности путем разделения продуктов реакции секвени-рования. очищенных от избытка дНТФ. флуоресцентно-меченых ддНТФ, праймера и солей, методом капиллярного электрофореза;

•    сравнение полученной нуклеотидной последовательности фрагмента генома, выделенного из анализируемой пробы, сизвестными последовательностями избаэданныхв целях его идентификации.

7    Отбор проб

7.1    Отбор лабораторной пробы

7.1.1    Отбор проб, их транспортирование в лабораторию проводят по ГОСТ 31719 (раздел 5) с учетом требований, предъявляемых для данного вида продукции.

7.1.2    Не допускается отбор для испытания проб многокомпонентной продукции, т. е. содержащей помимо исследуемого компонента (мяса, рыбы, икры) другие компоненты животного происхождения (например, сметанный соус. яйца).

7.1.3    Для продукции в упаковке: перед вскрытием упаковки ее очищают от загрязнений. Стеклянные или металлические банки вскрывают с использованием чистого консервного ножа. Полимерные пакеты, пачки изкартона и комбинированных материалов, стаканы из полимерных материалов, формочки из фольги вскрывают при помощи стерильных ножей, ножниц, шпателей и других подручных инструментов.

Замороженную продукцию перед вскрытием размораживают: при температуре (4 ± 2) *С — не более 18 ч; при температуре от 18 "С до 20 *С — в течение 1 ч.

7.1.4    Отбор проб мяса или рыбы: кусок мяса (тушку рыбы) разрезают, из средней части вырезают фрагмент тканей массой 30—200 г. Мелкую рыбу берут на испытание целиком.

•    Примерами могут служить емкости для растворов «8uffer. Water, Waste Reservoir», уплотнитель «Reservoir Septa» (Applied 8losystems, США). Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.

•* Примером может служить емкость для анодного буфера «3130/3130x1 Buffer Jar» (Applied Biosystems, США). Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.

6

ГОСТ 34106—2017

7.1.5    Отбор проб икры: для испытания отбирают 50 г развесной икры либо отбирают одну упаковочную единицу фасованной икры (массой до 200 г).

7.1.6    Отбор проб готовой продукции и полуфабрикатов: на испытание отбирают 30—200 г продукции.

7.1.7    Пробы отбирают в одноразовые плотные полиэтиленовые пакеты с застежкой-молнией или чистые емкости из стекла или пластика с герметично закрывающимися крышками.

7.1.6 Каждый образец отбирают отдельным набором стерильных инструментов в одноразовых перчатках.

7.1.9 Лабораторные пробы хранят в соответствии с условиями, предусмотренными для хранения данного вида продукции.

7.2 Отбор и подготовка анализируемых проб

7.2.1    Подготовку анализируемых проб проводят в одноразовых перчатках.

7.2.2    Для подготовки анализируемых проб используют ступки и пестики, предварительно обработанные хромовой смесью, и инструменты, выдержанные в 96 %-ном этиловом спирте и обожженные в пламени газовой горелки.

7.2.3    Отбор анализируемых проб

7.2.3.1    Отбор анализируемых проб мяса. рыбы, готовой продукции, полуфабрикатов однокомпо-нентного состава: подготовленным по 7.2.2 скальпелем срезают верхнюю часть продукта, высекают из середины куска небольшой фрагмент массой 3—5 г, растирают пестиком и аккуратно переносят шпателем 10—50 мг в пластиковую одноразовую пробирку вместимостью 1.5 см3.

7.2.3.2    Отбор проб рыбной икры: для испытания отбирают 1—2 икринки в пластиковую одноразовую пробирку вместимостью 1.5 см3.

7.2.4    Анализируемые пробы в закрытых пробирках передают на выделение ДНК.

7.2.5    После отбора анализируемой пробы рабочую поверхность обрабатывают дезинфицирующим раствором, дистиллированной водой и подвергают ультрафиолетовому излучению в течение 15мин.

8 Экстракция и очистка ДНК из исследуемого материала

Экстракцию ДНК из анализируемой пробы, полученной по 7.2. осуществляют с использованием набора реагентов для экстракции ДНК сорбционным методом по 5.3.

8.1    Буфер для лизирующего реагента и раствор для отмывки № 1 (если они хранились при температуре от2 *Сдо8 *С)лрогрвваютна поверхности твердотельного термостата при температуреотбО *С до 64 9С до полного растворения кристаллов.

8.2    Отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1.5 см3 (включая отрицательный контроль выделения). В пробирки вносят анализируемые пробы. В пробирку отрицательного контроля выделения ДНК вносят 100 мм3 воды деионизованной по 5.3.

8.3    Отдельными наконечниками с аэрозольным барьером вносят в каждую пробирку по 400 ммбуфера для лизирующего реагента и по 17 мм3 лизирующего реагента. Тщательно перемешивают содержимое пробирок.

8.4    Инкубируют пробирки при температуре (64 ± 1) 9С в течение 1 ч на твердотельном термостате, периодически встряхивая на миницентрифуге-встряхивателе (пять раз через каждые 10—12 мин).

8.5    Осаждают нерастеоренные частицы образцов центрифугированием при 13000 об/мин в течение 5 мин.

8.6    Надосадочную жидкость в объеме 200—350 мм3 очень аккуратно (так. чтобы не попали взвешенные частицы и капли жира) отбирают отдельными наконечниками с аэрозольными барьерами и переносят в новые пробирки.

8.7    Пробы центрифугируют в течение 5 с при 5000об/мин на микроцентрифуге для сброса капельс крышки пробирок.

8.8    Тщательно ресуспендируют сорбент универсальный на миницентрифуге-встряхивателе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавляют по 25 мм3 ресуспендированного сорбента универсального. Перемешивают на встряхивателе. оставляют в штативе на 10—15 мин. перемешивая через каждые 2 мин.

8.9    Осаждают сорбент универсальный в пробирках центрифугированием при 5000 об/мин в течение 1 мин. Удаляют надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

8.10    Добавляют в пробы по 300 мм3 раствора для отмывки No 1. перемешивают на встряхивателе до полного ресуспендирования сорбента универсального. Осаждают сорбент универсальный центри

7

ГОСТ 34106—2017

фугированием при 5000об/мин на микроцентрифуге е течение 1 мин. Удаляют надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыеатель и отдельный наконечник для каждой пробы.

8.11    Добавляют в пробы ло 500 мм3 раствора для отмывки № 2. перемешивают на встряхивателе до полного ресуслендирования сорбента универсального, центрифугируют 1 мин при 10000 об/мин на микроцентрифуге. Отбирают надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

8.12    Повторяют процедуру отмывки по 8.11. отбирают супернатант полностью. Помещают про* бирки в термостат при температуре (64 ± 1) *С на 5—10 мин для подсушивания сорбента универсального. При этом крышки пробирок должны быть открыты.

8.13    В пробирки добавляют по 50 мм3 ТЕ-буфера для элюцииДНК. Перемешивают на встряхивателе. Помещают в термостат при температуре (64 ± 1) ’Сна 5—8 мин. периодически (один раз в минуту) перемешивая на встряхивателе.

8.14    Центрифугируют пробирки при 13000 об/мин в течение 2 мин на микроцентрифуге. Надоса-дочная жидкость содержит очищенную ДНК.

8.15    Очищенную ДНК можно хранить в течение одной недели при температуре от 2 *Сдо 8 °С и в течение года при температуре не выше минус 16 *С. Для этого рекомендуется перенести надосадочную жидкость в чистые микропробирки вместимостью 1.5 см3.

8.16    Для постановки ПЦР разводят полученную ДНК в 100 раз. в отдельные пробирки вместимостью 1.5 см3 вносят по 99 мм3 буфера для элюции ДНК и по 1 мм3 очищенной ДНК. тщательно перемешивают на встряхивателе. центрифугируют в течение 5 с при 5000 об/мин на микроцентрифуге для сброса капель с крышки пробирок. Пробы готовы к постановке ПЦР.

9 Амплификация фрагмента митохондриального генома

9.1 Для видовой идентификации фрагмента митохондриального генома используют пару праймеров. позволяющих амплифицировать фрагмент митохондриального генома в области гена cytB длиной 476 п. н.. в соответствии с таблицей 1.

Таблица 1 — Праймеры для видовой идентификации

Наименование

Направление

Нуклеотидная последовательность

Положение*

Glu

Прямой

AAACTAATGACATGAAAAA(C/T)CA(T/C)CGTTG

14482—14509

CytB

Обратный

CCCTCAGAATGATATTTGNCC(C/T>CA

14957—14934

* Указаны позиции первого и последнего нуклеотида соответствующего праймера, выравненного относительно последовательности митохондриального генома Воз taurue с регистрационным номером KJ789953 в ба-

зах данных.

9.2    Для проведения ПЦР готовят мастер-микс «ПЦР-смесь-1». смешивая по 0.10 см3 растворов прямого и обратного ПЦР-праймеров. 0,25 см3 раствора дНТФ и 0,05 см3 деионизованной воды.

9.3    Для ПЦР используют среднестенные микропробирки вместимостью 0.6 см3. Для повышения специфичности применяют «горячий старт» с восковой прослойкой, для чего воск расплавляют в термостате при температуре 90 вС.

9.4    В микропробирки вносятпо5 мм3 «ПЦР-смеси-1». наслаивают сверху по 10 мм3 расплавленного воска так. чтобы он полностью накрыл жидкость. Закрывают крышки, делают пометки с наименованием используемой пары праймеров. Если воск покрыл жидкость неровно или образовались пузыри, прогревают пробирки в термостате в течение 1 мин при температуре 95 *С и охлаждают.

9.5    Срок хранения мастермикса «ПЦР-смесь-1» под воском при температуре минус 20 *С — не более шести месяцев.

9.6    Для амплификации в микропробирки на поверхность наносят по 10 мм3 «ПЦР-смеси-2», при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с «ПЦР-смесью-1». В противном случае пробирку считают браком и утилизируют.

9.7    Сверху добавляют по капле вазелинового масла для ПЦР (примерно 25 мм3).

Затем в одну микропробирку вносят 10 мм3 Кв. а в остальные — по 10 мм3 ДНК по 8.16.

9.8    В двух микропробирках ставят контрольные реакции амплификации:

К--вместо ДНК-лробы вносят 10мм3 ДНК-буфера;

К+ — вместо ДНК-лробы вносят 10 мм3 ПКОсу1В.

9.9    Запускают на амплификаторе программу термоциклирования в соответствии с таблицей 2.

8

ГОСТ 34106—2017

Таблица 2 — Условия термоциклирования

Температура*. *С

время*, с

Числе циклов*

95

Пауза

95

300

1

95

20

10

50

20

72

40

95

20

25

54

20

72

40

72

300

1

10

Хранение

9.10    При достижении температуры 95 ®С микропробирки помещают в ячейки амплификатора и снимают программу с паузы.

9.11    После завершения реакции микропробирки отправляют в помещение детекции и учета результатов ПЦР методом электрофореза в соответствии с разделами 10 и 11.

9.12    Срок хранения анализируемых проб после амплификации при комнатной температуре — не более 16 ч. при температуре от 2 *С до 8 *С — не более семи суток, при температуре минус 16 *С — не более шести месяцев.

10 Детекция ПЦР-лродуктов методом электрофореза в агарозном геле

10.1    Готовят рабочий буфер для электофореза: в мерный цилиндр вливают 40 см3 ТАЕ-буфера. переносят в мерную колбу вместимостью 2000 см3, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.

10.2    На весах по 5.2 взвешивают 1,8 г агарозы для электрофореза ДНК. навеску помещают в стеклянную колбу из термостойкого стекла вместимостью 250 см3. Мерным цилиндром вместимостью 250 см3 вносят 100 см3 рабочего электрофореэного буфера, перемешивают вращением колбы и плавят в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Время плавления агарозы в микроволновой печи мощностью 800 Вт при ее загруженности одной колбой — 1.5 мин.

10.3    Вынимают колбу с расплавленной агарозой из микроволновой лечи, аккуратно перемешивают. вращая колбу. После этого вновь помещают колбу с агарозой в микроволновую печь на 1.5 мин (при мощности 800 Вт), доводят агарозу до кипения. Вынимают колбу из микроволновой печи и остужают агарозу до температуры (65—70) *С. вращая колбу.

10.4    К раствору агарозы добавляют 5 мм3 раствора бромистого этидия концентрацией 10 мг/см3, тщательно перемешивают раствор. Полученный агарозный гель используют для заливки в рамку камеры.

10.5    Выравнивают столик для заливки гелей, заливают агарозный гель в рамку камеры. Устанавливают гребенки, не касаясь дна рамки камеры, на расстоянии не менее 3 см другот друга. Толщина агарозного геля должна быть около 0,6 см.

10.6    После полного застывания агарозного геля (30 мин при комнатной температуре), осторожно вынимают из него гребенки, не повредив лунки. Помещают рамку с готовым агарозным гелем в камеру так. чтобы лунки располагались ближе к отрицательному электроду. Заливают в камеру рабочий элек-трофорезный буфер так. чтобы он полностью покрыл агарозный гель.

10.7    Из пробирок с продуктами амплификации поочередно отбирают дозатором по 5.2 по 10 мманализируемых и контрольных (К*. К-. Кв) проб и вносят в лунки агарозного геля. В каждом ряду лунок агарозного геля обязательно вносят маркер молекулярных масс ДНК и К+.

* Приведенные режимы ПЦР оптимизированы не амплификаторах «Терцик». Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобстве пользователей настоящего стандарта. При использовании других ам-плификагорое необходимо оптимизировать условия термоциклирования.

9

ГОСТ 34106—2017

10.8    Подключают камеру «источнику тока, соблюдая полярность (ДНК должна двигаться в направлении положительного электрода). Электрофорез проводят при напряжении от 180 до 250 В в течение 20—30 мин. при этом краситель крезоловый красный, входящий в «ПЦР-смесь-2». должен продвинуться не менее чем на 2 см от старта. Оптимальная напряженность электрического поля при этом составляет ЮВ/см.

10.9    По завершении времени электрофореза выключают источник тока, переносят рамку с гелем на УФ-трансиллюминатор. расположив полосы горизонтально лунками вверх. Получают изображение агарозного геля (электрофореграмму) на компьютере с помощью видеосистемы.

11 Учет результатов ПЦР

11.1 Учет результатов ПЦР проводят по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфической полосы амплифицированной ДНК размером около 476 л. н. (данная длина фрагмента характерна Bos taurus. ПКО cyt8).

Примечание — Точная длине аыплнфицироаанного специфического фрагмента ДНК зависит от вида объекта испытания и может варьировать а пределах 1—5 нуклеотидов.

11.2 Учет начинают с оценки результатов амплификации положительных и отрицательных конт-ролей в соответствии с таблицей 3.

Таблица 3 — Ожидаемый результат амплификации положительных и отрицательных контролер ПЦР

Контроль

Наличие специфической полосы, соответствующей фрагменту cytB

Экстракции ДНК. Кв

ПЦР. К-

ПЦР. К*

«♦*

Примечание — Знак *♦» означает, что обнаружен ПЦР-лродукт. знак «-» — не обнаружен.

В дорожке К+ должна наблюдаться специфическая полоса амплифицированной ДНК размером 476 п.н.

В дорожках К-и Кв не должно быть никаких полос, за исключением возможных димеров праймеров, находящихся ниже уровня 100п. н.

11.3    Если результаты анализа положительных и отрицательных контролей не соответствуют приведенным в таблице 3. испытание повторяют со следующих этапов:

- если в дорожках отрицательных контролей Кв и/или К- выявляется специфическая полоса, значит. произошла контаминация реактивов или проб. Принимают меры по выявлению источника контаминации. Повторяют испытание с этапа выделения ДНК:

•    если в дорожке К+ не выявляется специфическая полоса, повторяют испытание с этапа ПЦР:

•    если в дорожках электрофореграммы наблюдаются неспецифические полосы на разных уровнях. то испытание повторяют с этапа ПЦР. Возможные причины неспецифической амплификации — отсутствие «горячего старта» или неверный температурный режим в ячейках амплификагора.

11.4    Если результаты амплификации контролей не противоречат ожидаемому результату в соответствии стаблицей 3. учитывают результаты амплификации анализируемых проб. Для проб, содержащих митохондриальную ДНКживотных и рыб. в дорожке должна наблюдаться яркая светящаяся полоса на уровне, близком уровню К+.

11.5    Оценивают концентрацию ПЦР-продукта. сравнивая визуально интенсивность свечения соответствующей ему полосы и полос маркера молекулярных масс ДНК на электрофореграмме. Испытания (секвенирование ДНК) пробы продолжают при условии, если свечение полосы ПЦР-продукта той же интенсивности или более интенсивно по отношению к свечению полос маркера молекулярных масс ДНК.

11.6    В случае, если полоса ПЦР-продукта менее интенсивна по отношению к полосам маркера молекулярных масс ДНК. то проводят повторное испытание, начиная с этапа выделения ДНК.

Ю

ГОСТ 34106—2017

12    Секвенированиеамплифицированных фрагментов ДНК

12.1    Перед секвенированием амллифицироеанмого фрагмента генома проводят очистку ПЦР-продукта. полученного в соответствии с разделом 9. от невключившихся праймеров и дНТФ. Для очистки берут 5 мм3 ПЦР-продукта. добавляют 2 мм3 реагента для очистки продуктов ПЦР и перемешивают пилотированием.

12.2    Полученный по 12.1 раствор инкубируют при температуре 37 *С в течение 15 мин. Затем встряхивают и осаждают капли кратковременным центрифугированием и снова инкубируют при температуре 60 вС втечение 15 мин.

12.3    Очищенные в соответствии с 12.2 ПЦР-продукты секвенируют с использованием cytB праймера.

12.4    Для проведения реакции в тонкостенные микропробирки вместимостью 0.2 см3 вносят 1 ммочищенного по 12.2 ПЦР-продукта. 0.6 мм3 cytB праймера молярной концентрации 1 мкмоль/дм3. а также 1 мм3 смеси реагента для секвенирования ДНК и 2.2 мм3 воды деионизованной по 5.3. Общий объем реакционной смеси должен быть 5 мм3.

12.5    Термоциклирование проводят на амплификаторах с термостатируемой крышкой, соблюдая следующий режим:

а)    начальная денатурация — 1 мин при температуре 96 ®С:

б)    затем 25 циклов:

1)    денатурация при температуре 96 *С — Юс;

2)    отжиг праймера при температуре 55 *С — 5 с;

3)    элонгация праймера при температуре 60 вС — 4 мин.

Полученную реакционную смесь объемом 5 мм3 используют для дальнейшего испытания в соответствии с разделом 13.

13    Определение нуклеотидной последовательности методом капиллярного электрофореза

13.1    Проводят очистку реакционной смеси, полученной в соответствии с 12.5, от избытка дНТФ. флуоресцентно-меченых ддНТФ. секвенирующего праймера и солей осаждением полинуклеотидов изопропиловым спиртом. Для этого к реакционной смеси объемом 5 мм3 в микропробирке добавляют 30 мм3 75 %-ного изопропилового спирта и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре.

13.2    Микропробирки с полученной по 13.1 смесью центрифугируют при 14000 об/мин в течение 20 мин и удаляют надосадочную жидкость.

13.3    К полученному осадку добавляют 100 мм3 75 %-ного изопропилового спирта, центрифугируют при 14000 об/мин в течение 2 мин и удаляют надосадочную жидкость.

13.4    высушивают полученный по 13.3 осадок в термостате при температуре 65 вС в течение 10 мин и растворяют в 20 мм3 формамида по 5.3.

13.5    Полученные анализируемые пробы в формамиде переносят в 96-луночный планшет, закрывают уплотнителем и подвергают тепловой денатурации при температуре 95 *С в течение 3 мин. а затем при температуре 4 °С — в течение 5 мин.

13.6    Подготовленные в соответствии с 13.5 анализируемые пробы, содержащие продукты секвенирования. разделяют методом капиллярного электрофореза с детекцией сигнала флюоресценции в соответствии с инструкцией по эксплуатации генетического анализатора по 5.2.

13.7    Программное обеспечение генетического анализатора автоматически анализирует полученные сигналы (хроматограммы) и определяет последовательность нуклеотидов. Результатом анализа является расшифрованная последовательностьнуклеотидов, приведенная над пиками хроматограммы в формате abi файла.

14    Контроль качества секвенирования

14.1    Для оценки качества секвенирования. поиска причин и путей устранения проблем рекомендуется использовать примеры типовых результатов, приведенные в приложении А.

14.2    Для последующей видовой идентификации есоответствиисраэделом 15 используют нуклеотидные последовательности на хроматограммах с высокой интенсивностью сигнала флюоресценции и хорошо разделенными пиками.

и

ГОСТ 34106—2017

14.3 Корректность чтения нуклеотидов проверяют дополнительно вручную в целях исключения ошибки автоматического анализа. Удаляют плохо читаемые из-за всплесков фона нуклеотиды в начале хроматограммы и область обратного праймера на конце секвенируемого ПЦР-продукта.

15 Интерпретация результатов испытания

15.1    Для видовой идентификации сравнивают полученную в соответствии с разделом 14 нуклеотидную последовательность фрагмента генома с известными последовательностями из баз данных.

15.2    Таксономическая принадлежность (биологический вид. род) устанавливается на том уровне, который позволяют выявленные нуклеотидные различия.

15.3    Если полученная нуклеотидная последовательность 100 % идентична аналогичным участкам генома определенного биологического вида, при этом гомология с последовательностями других видов более низкая — принимают, что геном принадлежит данному биологическому виду.

15.4    Если полученная нуклеотидная последовательность 100 % идентична с аналогичными участками геномов сразу нескольких видов, устанавливают таксономическую принадлежность на том уровне, который позволяют выявленные нуклеотидные различия (например, биологический род).

15.5    Если полученная нуклеотидная последовательность не имеет 100 %-ной идентичности ни с одной последовательностью из баз данных, проводят филогенетический анализ родства нуклеотидных последовательностей. Это позволяет отнести исследуемый геном к наиболее близкой таксономической группе (биологический вид. род).

12

Приложение А (справочное)

Примеры результатов секвенирования ДНК

Л.1 примеры результатов секвенирования днк. возможные причины неудачах испытаний и пут и уст ранения проблем приведем в таблице А.1.

Т а б л и ц а А.1

ГОСТ 34106—2017

Продолжение таблицы А.1

№ nJn

Получений результат

Фрагмент хроматограммы

возможные причины

Устранимо проблей

3

Отсутствие аыражежых лихое. сигнал не уровне шуме приборе

1 > в реакционную

смесь не добавлен один иэ компонентов: готовая смесь для секеешрования. матрице или праймер.

2)    Недостаточное количество матрицы в анализируемой пробе.

3)    Праймер не комплементарен денной матрице

Повторение испытания с этапа проведения реакции секаемироеаиия. В случае воспроизведения неудачного результата ислытате повторяют с этапа выделения ДНК

4

Основной сигнал чтения матриц ДНК идет на фойе более или менее выраженного второго сигнале или нескольких сигналов

Т A A G С Т Т С Т б АС 1 С С Г А С С С С Cl Т СА

1)    Нарушение режима пцр. приводящее к появление несле-цифических продуктов амплификации

2)    Анализируемая проба не является однокомпонентной продукцией

1)    Повторное испытание анализируемой пробы, начиная с этапа ПЦР

2)    Проба не подлеют испытанию

иЛШШЫк

ГОСТ 34106—2017

Продолжение таблицы А.1

у»

№ n*i полученный резулыет

5 Пики очень высокой ин

тенсивности в начале хроматограммы. быстрое падение сигнала, короткое прочтение матрицы

6

Перегрузка короткими фрагментами матрицы (20—40 л. н.) в начале хроматограммы, далее высота пиков резко смежается

7

Пжи на хроматограмме слева имеют крутые края, а справа — пологие

фрагмент хроматограммы

Возможные причины

Устранение проблем

QQCQGT АСТОААОСТ О

Перегрузка реакционной смеси ДНК мат-рщей. а результате чего нарабатывается одновременно слми-ком много коротких фрагментов, амплификация ДЛИМ4ЫХ фрагментов тормозится недостатком флуоресце нт но-ме-ченыхддНТФ

Уменьшение концентрации ДНК матрицы на зтапе проведения реакции секвестрования

ссвс свет т асссотстсс ст * а ас • о с д о

О - О С О С О - С 1адС*СС0*0*0

Присутствие в анализируемой пробе большого количества димерое праймеров, образовавшихся в результате ЛЦР

Загрязнение матрицы побочными веществами. например, солями

Повторение испытания. начиная с этапа ПЦР. Улучшение качества очистки ДНК матрицы для сек-веиироеаиия (например. вырезание фрагмента основного продукта ПЦР изагарозного геля)

Повторяют испытаннее этапа очистки ПЦР продукта, используют альтернатив we методы    очистки

(например, лере-осаждеиие ДНК этиловым спиртом в присутствии ацетата калия)

ГОСТ 34106—2017

Окончание таблицы А.1

№ п/п

Полученный результат

Фрагмент хроматограммы

Возможные причины

Устранение проблем

8

Вс л лески флюоресцен-ции н«связавшихся во время ПЦР-реакции флюоресцентно-меченых терминаторов

Т С I Я • T 1 1 1 1 • ' • COC'OOGG'O

ад/^/Ил^^Мл/\маМ

Недостаточно эффективная очистка реакционной смеси от несеязаешкхся флюоресцентно-ме-чешх терминаторов

Оптимизация условий реакцм* сакве-иирования Оптимизация условий очистки реакционной смеси. использование других доступных наборов реагентов

9

Появление е произвольном месте узкого и высокого лика всех четырех цветов

' САСС* СС^С »в* 1 С * С G * CITAAC

Попадание в капилляр кристалла полимере. дефект электрофореза

Повторение этапа

капиллярного

электрофореза

анализируемой

пробы

10

Размывание ликов на хроматограмме

л . I ijgo 0 0 0 ' ХАССССССССО О

Ухудшение качества полимера, истощение буферного раствора. загрязнение капилляров

Проведение технического обслуживания анализатора с заменой буфера и полимера. Повторение этапа капиллярного электрофора за анализируемой пробы

ГОСТ 34106—2017

ГОСТ 34106—2017

УДК 637.5:6378:006.35    МКС67.120.10

67.120.30

Ключевые слова: мясная продукция, рыбная продукция, выделение нуклеинового материала. ПЦР. сек* венироеакие ДНК. определение нуклеотидной последовательности, митохондриальный геном, видовая идентификация

17

БЗ 8—2017/240

Редактор Л.В- Коретникоеа Технический редактор В.Н. Прусакова Корректор М.8. Вучнап Компьютерная еерстка А.Н. Золотаревой

Сдано о набор 21.07.2017. Подписано в мчать 08.08.2017. Формат 80» 84^ Гарнитура Арнап. Усп. печ. л. 2,32. Уч.-иад. л. 2.11. Тираж 25 эка Зак. 1401 Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта

Иадано и отпечатано во ФГУП «СТАНДЛРТИНФОРМн. 123001 Москва, Гранатный пер.. 4. www.90atinfo.1u