База ГОСТовallgosts.ru » 67. ПРОИЗВОДСТВО ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ » 67.100. Молоко и молочные продукты

ГОСТ 30347-2016 Молоко и молочная продукция. Методы определения Staphylococcus aureus

Обозначение: ГОСТ 30347-2016
Наименование: Молоко и молочная продукция. Методы определения Staphylococcus aureus
Статус: Действует

Дата введения: 09/01/2017
Дата отмены: -
Заменен на: -
Код ОКС: 67.100.10
Скачать PDF: ГОСТ 30347-2016 Молоко и молочная продукция. Методы определения Staphylococcus aureus.pdf
Скачать Word:ГОСТ 30347-2016 Молоко и молочная продукция. Методы определения Staphylococcus aureus.doc


Текст ГОСТ 30347-2016 Молоко и молочная продукция. Методы определения Staphylococcus aureus



МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ. МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION. METROLOGY AND CERTIFICATION

{ISC)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

ГОСТ

30347—

2016

МОЛОКО И МОЛОЧНАЯ ПРОДУКЦИЯ

Методы определения Staphylococcus aureus

Издание официальное

Москве

Стакдартимформ

2016

ГОСТ 30347—2016

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стан* дартизации установлены ГОСТ 1.0—2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения в и ГОСТ 1.2—2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосу* дарственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным научным учреждением «Всероссий* ский научно-исследовательский институт молочной промышленности» (ФГБНУ «8НИМИ»)

2    ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (про* токол от 25 октября 2016 г. № 92*П)

За принятие проголосоааги:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166)004-97

Код страны

по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Армения

AM

Минэкономики Республики Армения

Казахстан

КZ

Госстандарт Республики Казахстан

Киргизия

KG

Кыргызстандарг

Россия

RU

Росстандарг

4    Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 26 ноября 2016 г. Не 1826-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 30347—2016 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 сентября 2017 г.

5    ВЗАМЕН ГОСТ 30347—£7

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется а ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентстза по техническому регулированию и метрологии е сети Интернет ()

©Стандартинформ. 2016

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

и

ГОСТ 30347—2016

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

МОЛОКО И МОЛОЧНАЯ ПРОДУКЦИЯ Методы определения Staphylococcus aureus Milk and milk prodjcts. Methods for determination of Staphylococcus aureus

Дата введения — 2017—09—01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на молоко и молочную продукцию и устанавливает методы определения Staphylococcus aureus (S. aureus) в определенном объеме или навеске продукта — определение с предварительным обогащением и определение без предварительного обогащения.

2    Нормативные ссылки

в настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004—91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005—88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007—76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019—79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов эащи'ы*

ГОСТ 12.4.009—83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021—75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 5962—2013 Спирт этиловый ректификационный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 33951—2016 Молоко и молочная продукция. Методы определения молочнокислых микроорганизмов

ГОСТ 13928—84 Молоко и сгивки заготовляемые. Правила приемки, методы отбора проб и подготовка их к анализу

ГОСТ 26670—91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 26809.1—2014 Молоко н молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 1. Молоко, молочные, молочные составные и молокосодержащие продукты

ГОСТ 32901—2014 Молоко и продукты переработки молока. Методы микробиологического анализа

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту осыпку.

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019—2009

Издание официальное

1

ГОСТ 30347—2016

3    Термины и определения

В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующими определениями.

3.1    коагулазоположительные стафилококки: Грамположительные. каталаэоположительные микроорганизмы, которые образуют типичные и/или атипичные колонии на или в селективно-диагностической питательной среде, дающие положительную реакцию на коагулазу на кроличьей плазме.

3.2    Staphylococcus aureus (S. aureus): Коагулазоположительные стафилококки, образующие ацетоин и ферментирующие мальтозу в аэробных условиях при определении этих биохимических тестов по методам, приведенным в настоящем стандарте.

4    Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и реактивы

4.1    Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и реактивы — по ГОСТ 32901 со следующими дополнениями:

•    сухая плазма кроличья, цитратная;

•    контрольный штамм Staphylococcus aureus:

•    мембранные фильтры:

•    яйца куриные пищевые:

•    желточно-солевой агар:

•    солевой бульон:

•    молочно-солевой агар;

•    агар Байрд-Паркера;

•    питательный агар;

•    сухой питательный бульсн;

•    среда Кларка;

•    среда Гиса с мальтозой;

•    1-нафтол;

•    теллурит калия;

•    перекись водорода:

•    спирт этиловый ректификационный из пищевого сырья по ГОСТ 5962.

4.2    Допускается применять одноразовую посуду. Одноразовую посуду (Чашки Петри, флаконы, пипетки и др.) используют такии же образом, как и стеклянную посуду многоразового использования, если они имеют сходные технические характеристики (особенно по стерилизации).

5    Отбор проб

Отбор и подготовка проб — по ГОСТ 13928. ГОСТ 26809.1 и ГОСТ 32901.

6    Подготовка к проведению анализа

6.1    Подготовка посуды и материалов, приготовление разведений продуктов для посевов — по ГОСТ 32901.

6.2    Приготовление реактивов и питательных сред

Химические вещества, используемые для приготовления питательных сред, растворов реактивов, эмульсий должны быть аналитического качества.

Допускается при использовании готовой сухой питательной среды уточнение массы навески в соответствии с рекомендацией троиэводителя.

6.2.1    Приготовление гидрслизованного и стерильного обезжиренного молока — по ГОСТ 33951.

6.2.2    Приготовление желточно-солевого агара

Состав:

•    питательный агар    - 35.0 г;

•    натрий хлористый    - 75.0 г:

•    эмульсия желточная    - 50.0 см*:

- вода дистиллированная    - 1000 см3.

Все компоненты, кроме ж&тгочной эмульсии, вносят в колбу, перемешивают, нагревают до полного растворения, фильтруют, разливают в колбы или флаконы и стерилизуют при температуре (121 ± 1) *С

2

ГОСТ 30347—-2016

в течение (20 ± 1)мин. После стерилизации раствор охлаждают до температуры (45 ± 1} вС и добавляют 50 см3 предварительно подготовленной по 6.2.2.1 желточной эмульсии.

При использовании готовой питательной среды 100 г солевого агара вносят в колбу, добавляют 1000 см3 дистиллированной воды и нагревают, перемешивая, до полного растворения. Полученный раствор фильтруют, разливают в колбы или флаконы и стерилизуют при температуре (121 ♦ 1)*С в течение (20 ± 1) мин. По истечении времени смесь охлаждают до температуры (45 ± 1) ®С и добавляют 50 см3 предварительно подготовленной по 6.2.2.1 желточной эмульсии.

Смесь тщательно перемешиЕают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой хранят при температуре (4 ± 2) *С не более 5 сут.

6.2.2.1 Подготовка желточной эмульсии

Для приготовления желточной эмульсии свежее куриное яйцо моют проточной водой, протирают смоченной в спирте ватой и обсушивают. Отделяют желток и вносят его в 100 см3 стерильного раствора хлористого натрия, приготовленного по ГОСТ 32901. Смесь тщательно перемешивают, выдерживают на водяной бане при температуре (47± 1) *С в течение 2 часов, затем оставляют на (18-24) ч при температуре (3 ± 2) ®С для образования осадка.

Для использования собирают в асептических условиях в стерильную колбу надосадочную жидкость.

Подготовленную эмульсию хранят при температуре (4 ± 2) ®С не более 72 ч.

6.2.3    Приготовление солевого бульона

Состав:

-    натрий хлористый    - 7.5 г;

-    питательный сухой бульон    -1.5 г;

•    дистиллированная вода    -100.0 см3.

В 100 см3 дистиллированной воды вносят 1.5 г сухого питательного бульона, нагревают до полного растворения, фильтруют и добавляют 7.5 г хлорида натрия. Смесь перемешивают до полного растворения, устанавливают pH {6.9 ± 0,1), разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121 ± 1) *С в течение (10±1) мин.

При использовании готовой среды в 100 см3 дистиллированной воды вносят 10 г сухой среды, нагревают до полного растворения, фильтруют и устанавливают pH (6.9 1 0.1). Смесь разливают в пробирки или колбы и стерилизую* при температуре(121 i1)*Ceтечение (10± 1)мин.

6.2.4    Приготовление молочнс-солевого агара

Состав:

•    питательный агар    - 35.0 г;

•    натрий хлористый    - 75.0 г;

•    молоко обезжиренное    -100 см3:

•    вода дистиллированная    -1000 см3.

Dee компоненты, кроме обезжиренного молоке, вносят в колбу, перемешивают, нагревают до полного растворения, фильтруют и разливают еколбы илифлаконы. Смесь стерилизуют при температуре (121 ± 1)*С в течение (20 ± 1) мин. По истечении времени смесь охлаждают до температуры (4511) ‘С и добавляют 100 см3 стерильного обезжиренного молока по 6.2.1.

При использовании готовой питательной среды 100 г молочно-солевого агара вносят в колбу, добавляют 1000 см3 дистиллированной воды и нагревают при перемешивании до полного растворения. Смесь фильтруют, разливают в колбы или флаконы и стерилизуют при температуре (121 ± 1) *С е течение (2011) мин.

Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой хранят при температуре (4 ± 2) *С не более 5 сут.

6.2.5 Приготовление агара Байрд-Паркера Состав:

♦триптон

-10.0 г;

• дрожжевой экстракт

-1.0 г:

• мясной экстракт

- 5.0 г;

• литий хлористый, гексагидрат

- 5.0 г;

• теллурит калия

-1.0 г;

• пируват натрия

-Юг;

• глицин

-12.6 г;

• агар

-(12.0-20.0) г;

- вода дистиллированная

-1000 см3.

3

ГОСТ 30347—2016

Все компоненты питательной среды, кроме теллурита калия, вносят в колбу, нагревают, перемеши-еая, до полного растворения, при наличии осадка фильтруют. Охлаждают до температуры (50 ± 2) *С и устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации pH составил (7.2 ± 0.1) при температуре 25 *С, среду разливают по 90 см3 в бутылочки вместимостью 250 см3. Стерилизуют при температуре (121 ± 1) *С в течение (20 ± 1) мин.

При использовании готовой питательной среды 60 г сухой среды вносят в 1000 см3 дистиллиро-ванной воды, нагревают и перемешивают до полного растворения. При наличии осадка раствор фильтруют, охлаждают до температуры(50-60)*С, устанавливают pH (7.2±0,1}, разливаютеколбы или бутылочки по 90 см3 и стерилизуют при температуре (121 ± 1} °С в течение (20 ± 1) мин.

Готовую среду хранят при температуре (4 ± 2) *С не более 30 суток.

Перед использованием к расплавленной в колбе или бутылке среде в асептических условиях добавляют 1 см3 стерильного 1%-ного (или 0.5 см3 2 %-ного) раствора теллурита калия (6.2.13) и 5 смжелточной эмульсии (6.2.2.1). После тщательного перемешивания приготовленную среду разливают в чашки Петри.

Чашки со средой можно хранить не более 48 ч.

6.2.6    Приготовление питательного агара

50 г сухой питательной среды вносят в 1000 см3 дистиллированной воды, нагревают и перемешивают до полного растворения, при наличии осадка фильтруют. Смесь охлаждают до температуры (50 ± 2) *С и устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации pH составил (7.3 ± 0,1) при температуре 25 вС. Среду разливают в колбы или флаконы и стерилизуют при температуре (121 ± 1)вС в течение (20 ± 1) мин.

6.2.7    Приготовление среды Кларка

Состав:

-    пептон    - 5.0 г.

-    глюкоза    - 5.0 г.

-    фосфорнокислый двузамещенный калий (КгНР04)    - 5,1 г.

-    вода дистиллированная    -1000 см3.

Все компоненты питательной среды вносят в колбу, перемешивают, нагревают до полного растворения. Смесь охлаждают до температуры (50 ± 2) °С и устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации pH составил (7.2 ± 0.1) при температуре 25 вС. Среду разливают по (5 - 7) см3 в пробирки вместимостью 20 см- и стерилизуют при температуре (121 ± 1.0) *С в течение 15 мин или дробным методом — текучим паром по 30 мин 3 дня подряд.

При использовании готовой среды 20 г сухой питательной среды вносят в 1000 см3 дистиллированной воды, нагревают и перемешивают до полного растворения. Смесь охлаждают до температуры (50 ± 2) ®С и устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации pH составил (7.2 ± 0.1) при температуре 25 *С. Среду разливают по (5 — 7) см3 в пробирки вместимостью 20 см3 и стерилизуют при температуре (121 ± 1.0) вС в течение 15 мин или дробным методом — текучим паром по 30 мин 3 дня подряд.

6.2.8    Приготовление среды Гиса с мальтозой

Состав:

-    питательный агар    -6,62 г

-    натрия хлорид    -4,8 г

-динатрия фосфат обезвоженный    -0.3 г

-    Д(+)-мальтоэа    - 2.8 г

-    водный голубой    -0,05 г

-    розоловая кислота    - 0,03 г

-    агар микробиологический    - 0.4 г

-    вода дистиллированная    -1000 см3

Все компоненты питательной среды вносят в колбу, перемешивают и нагревают до полного растворения. Смесь охлаждают до температуры (50 ± 2) ®С и устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации pH составил (7.4 ± 0.1) при температуре 25 вС. Среду разливают по (4 — 5) см3 в пробирки вместимостью 20 см3 и стерилизуют при температуре (112 ± 1.0) вС в течение 12 мин.

Прииспользованииготовонсреды 15гсухойпитательной среды вносятв 1000см3 дистиллированной воды, нагревают и перемешивают до полного растворения, при наличии осадка фильтруют. Смесь охлаждают до температуры (50 ± 2) *С и устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации pH составил (7.4 ± 0.1) при температуре 25 *С. Разливают в стерильные пробирки по (4 — 5) см3 и стерилизуют при (112 ± 1.0) вС в течение 12 мин.

4

ГОСТ 30347—-2016

6.2.9    Приготовление раствора плазмы кроличьей иитратной

Содержимое ампулы с лиофилиэированной плазмой кроличьей цитратной растворить в 1 см3 или 2 см3 стерильного 0.9%-ного раствора хлористого натрия и развести из расчета 1:5 тем же раствором. Растворенный лреларат допускается хранить при температуре (4 ± 2) *С до 2 сут.

6.2.10    Приготовление растворов и реактивов для окраски препаратов — по ГОСТ 32901.

6.2.11    Приготовление раствора гидроокиси калия

Состав:

- гидроокись калия (КОН)    - 40,0 г:

-вода    -до 100 см3.

Навеску гидроокиси калия массой 40 г переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят объем до метки дистиллированной водой и растворяют.

6.2.12    Приготовление спиртового раствора 1-нафтола

Состав:

- 1-нафтол    - 5.0 г.

-    этиловый спирт (С2Н8ОН)    - до 100 см3.

5 г 1-нафтола, имеющего точку плавления 92.5 *С. вносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доливают этиловымслиртомсобъемной долей 96 % до метки. Раствор применяют свежеприготовленным и используют для проведения реакции Фогес Проскауера.

6.2.13    Приготовление раствора теллурита калия

Состав:

-    теллурит калия (KjTeOj)    - 1.0 г;

- вода    - 100 см3.

Примечание — Необходимо предварительно убедиться, что имеющийся в наличии теллурит калия пригоден для данного испытания.

Теллурит калия полностью растворяют в воде при минимальном нагревании. Если в воде присутствует белый нерастворимый осадок, то такой порошок не используют. Приготовленный раствор теллурита калия стерилизуют путей фильтрации через мембранный фильтр с размером пор 0.22 мкм. Раствор допускается хранить при температуре (3 ± 2) *С не более 1 мес. Если при хранении раствора образуется белый осадок, то такой раствор не используют.

6.2.14    Приготовление раствора перекиси водорода

10 см3 пероксида водорода с содержанием основного вещества 30 % (в случае, если пероксид водорода имеет другое содержанке основного вещества, то делается пересчет) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят объем до метки дистиллированной водой.

Раствор применяют для определения каталазной активности.

7 Условия проведения анализа

При выполнении анализа в лаборатории должны соблюдаться следующие условия:

температура окружающего всэдуха........(20 ± 5) *С;

относительная влажность воздуха.........от 30 % до 80 %;

атмосферное давление..................от 84 кПа до 106 кЛа.

8 Методы анализа

8.1    Метод определения количества S. aureus с предварительным обогащением

8.1.1    Сущность метода

Метод основан на высеве навески продукта и (или) его разведения в жидкую селективную среду, инкубировании посевов, учете положительных пробирок (колб), пересеве культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенныхтипичныхи(или)атипичныхколонийккоагулаэоположительным стафилококкам и S. aureus.

8.1.2    Проведение анализа

8.1.2.1 Выбор разведений для посева

Из навески продукта готовят ряд десятикратных разведений так. чтобы можно было определить наличие или отсутствие S. aureus в определенной массе (объеме), указанной в нормативном или техническом документе на конкретный продукт.

5

ГОСТ 30347—2016

8.1.2.2 Посев

Навеску продукта или его разведения засевают по 1 см3 в пробирки или колбочки с солевым бульоном (6.2.3). Соотношение между количеством высеваемого продукта или его эквивалентным разведением и питательной средой 1:10.

Пробирки и колбочки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) *С в течение (24 — 48) ч. Предположительное присутствие коагулаэоположительных стафилококков определяется по помутнению среды.

Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на солевом бульоне к коагула-эололожительным стафилококкам, для получения изолированных колоний делают пересев петлей из бульона на чашки Петри с подсушенными средами типа Байрд-Паркер (6.2.5). желточно-солевого агара (6.2.2) или молочно-солевого агара (6.2.4) по прошествии 24 ч инкубирования из предположительно положительных пробирок: все оставшиеся пробирки — после 48 ч.

Чашки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) вС в течение (24 — 48) ч. После термостатирования посевы просматривают и отмечают рост характерных колоний.

На желточно-солевом агаре колонии коагулазопаложительных стафилококков имеют форму плоских дисков диаметром (2 — 4) им белого, желтого, кремового, лимонного, золотистого цвета с ровными краями; вокруг колоний образуется радужное кольцо и зона помутнения среды.

На молочно-солевом агаре колонии коагулазоположительных стафилококков растут в виде непрозрачных крутых колоний, окрашенных от белого до оранжевого цвета, диаметром (2 — 4) мм. слегка выпуклых.

На среде Байрд-Паркера колонии коагулаэоположительных стафилококков растут в виде черных, блестящих, выпуклых колоний диаметром (1 — 1.5) мм. окруженных зоной просветления среды шириной (1 —3) мм.

8.1.3 Подтверждение принадлежности типичных и атипичных колоний

Для подтверждения принадлежности типичных и атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам отбирают не менее пяти типичных и/или атипичных колоний с каждой чашки Петри. Для подтверждения принадлежности отобранных типичных и атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам пересевают каждую отобранную колонию отдельно на поверхность скошенного питательного агара по 6.2.6.

Посевы инкубируют при температуре (37 ± 1) вС в течение (24 ± 3) ч.

Для подтверждения принадлежности к коагулазоположительным стафилококкам у выросших и отобранных микроорганизмов определяют отношение к окраске по Граму—по ГОСТ 32901: способность образовывать каталазу и способность коагулировать плазму крови кролика.

8.1.3.1    Коагулазоположительные стафилококки окрашиваются по Граму положительно (в темно-фиолетовый цвет), имеют шарообразную форму и располагаются чаще (но не всегда) в виде скоплений, напоминающих гроздья винограда.

8.1.3.2    Определение способности микроорганизмов образовывать каталазу

На колонию микроорганизмов, взятую с поверхности питательной среды или извлеченную из нее. помещенную на предметное стекло и выдержанную на воздухе в течение 30 мин. пипеткой наносят каплю 3 %-ного раствора лере<иси водорода (6.2.14). Если через (30 — 60) с на стекле появляются пузырьки газа, то считают, чтоони образовались в результате разложения перекиси водорода каталазой, образуемой микроорганизмами

Коагулазоположительные стафилококки образуют каталазу.

8.1.3.3    Определение способности коагулировать плазму крови кролика

Способность коагулировать плазму крови кролика определяют у микроорганизмов, окрашивающихся положительно и образующих каталазу.

В пробирку с 0.5 см3 разведенной кроличьей плазмы (6.2.9) вносят петлю суточной агаровой культуры и тщательно перемешивают. Одну пробирку с плазмой оставляют незасеянной, а в другую засевают контрольный штамм S. aureus (коагулаэоположительный стафилококк). Пробирки помещают в термостат и выдерживают при температуре (37 ± 1) *С в течение (3 — 6) ч. Если по истечении 6 ч коагуляции плазмы не произошло, то пробирки оставляют в термостате до 24 ч. Если через 24 ч плазма не свернулась, то испытуемую сультуру стафилококка относят к коагулазоотрицательной.

При определении коагулазной активности реакцию считают отрицательной, если в плазме не образуются отдельные нити или сгустки или если в плазме появились отдельные нити (реакцию плаз-мокоагуляции оценивают на один плюс).

6

ГОСТ 30347—2016

При определении коагулазной активности реакцию считают положительной, если:

+ ♦ ♦ ♦    - сгусток плотный:

+ ♦ ♦    - сгусток, имеющий небольшой отсек;

+ ♦    - сгусток в виде взвешенного мешочка.

Все три варианта являются положительным результатом. При получении положительной реакции считают, что в посевах обнаружен коагулазололожительный стафилококк.

8.1.3.4    Оценка результатов подтверждения принадлежности характерных колоний к коагулаэопо-ложительным стафилококкам

Если при испытании типичных и атипичных колоний в них обнаружены грамположительные кокки, образующие каталазу, способные коагулировать плазму крови, то считают, что выявленные микроорганизмы относятся к коагулазоположительным стафилококкам.

8.1.4    Подтверждение принадлежности выявленных коагулазоположительных стафилококков к 5. aureus

Принадлежность выявленных коагулазоположительных стафилококков к S. aureus проводят по определению их способности образовывать ацетоин и ферментировать мальтозу в аэробных условиях. Дифференциация видов и подвидов коагулазоположительных стафилококков — в соответствии с при* ложением А.

8.1.4.1    Определение способности образования ацетоика (реакция Фогес-Проскауера)

Культуру высевают в пробиржи со средой Кларка (6.2.7). Посевы инкубируют при температуре

(37 ± 1) °С в течение 48 ч.

После инкубирования посевов к 1 см3 отобранной культуральной жидкости прибавляют 0.6 см3 раствора («нафтола (6.2.12) и 0,2 см3 раствора гидроокиси калия (6.2.11). После добавления каждого реактива пробирку встряхивают. Появление розового окрашивания через (15 — 60) мин указывает на положительную реакцию. S.aureus образует ацетоин.

8.1.4.2    Определение способности ферментации мальтозы в аэробных условиях Исследуемые культуры высевают уколом петлей в среду Гисса с мальтозой (6.2.8) и инкубируют

при температуре (37 ± 1) *С в течение 48 ч. Изменение цвета среды указывает на положительную реакцию. S. aureus ферментирует мальтозу в аэробных условиях.

8.1.4.3    Представление результатов определения количества S. aureus выражают: «обнаружены» или «не обнаружены» в х см3 или в х г продукта.

8.2. Метод определения количества S. aureus без предварительного обогащения

8.2.1    Сущность метода

Метод основан на высеве продукта или его разведении на поверхность плотной селективной среды. инкубировании, подсчете типичных и (или) атипичных колоний, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных колоний к коагулазоположительным стафилококкам и S. aureus.

8.2.2    Проведение анализа

8.2.2.1    Выбор разведений для посева — по 8.1.2.1.

5.2.2.2    Посев

Навеску жидкого продукта или его разведения по 1 см3 засевают на поверхность питательной среды в одной чашке Петри диаметром 140 мм. либо наносят на поверхность питательной среды (6.2.2. 6.2.4. 6.2.5) в три чашки Петри диаметром 90 мм и тщательно растирают шпателем по поверхности. Чашки Петри с посевом инкубируют дном вверх при температуре (37 ± 1) *С в течение (24 — 48) ч. После термостатирования подсчитывают количество характерных типичных иУили атипичных колоний на каждой чашке Петри.

На желточно-солевом агаре колонии S. aureus имеют форму плоских дисков диаметром (2 — 4) мм белого, желтого, кремового, лимонного, золотистого цвета с ровными краями: вокруг колоний образуется радужное кольцо и зона помутнения среды.

На молочно-солевом агаре колонии коагулазоположительных стафилококков растут в виде непрозрачных. круглых колоний, окрашенных от белого до оранжевого цвета, диаметром (2 — 4) мм. слегка выпуклых.

На среде Байрд-Паркера колонии коагулазоположительных стафилококков растут в виде черных, блестящих, выпуклых колоний диаметром (1—1.5) мм. окруженных зоной просветления среды шириной (1 — 3) мм.

С каждой чашки Петри отбирают не менее 5 характерных и/или сомнительных колоний коагулаэо-положительных стафилококков (в случае роста менее пяти — все характерные колонии) и пересевают

7

ГОСТ 30347—2016

на поверхность скошенного питательного агара, разлитого в пробирки в соответствии с 6.2.6. Пробирки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) вС в течение 24 ч.

У выросших культур определяют отношение к окраске по Граму. способность коагулировать плазму кролика и образовывать каталазу в соответствии с 6.1.3.

8.2.3 Обработка результатов

8.2.3.1 Оценка результатов посевов на или в агариэоаанные селективно-диагностические среды

Число коагулазоположительных стафилококков для каждой чашки Петри, некоторой подсчитывали количество выросших колоний, рассчитывают по формуле:

где О, — число типичных колоний, в которых подтверждено наличие коагулазоположительных стафилококков;

В, — число атипичных колоний, отобранных для подтверждения;

N, — общее количество типичных копоний. подсчитанное на чашке Петри;

Ьа, — число атипичных колоний, в которых подтверждено наличие коагулазоположительных стафилококков;

Вл, — число атипичных колоний, отобранных для подтверждения;

N„ — общее количество атипичных колоний, подсчитанное на чашке Петри.

Результат округляют и записывают в соответствии с ГОСТ 26670.

Формула (1) относится в том числе к подсчету S.aureus, при зтом в расчет вносят следующие данные:

Ь, — число колоний коагулазоположительных стафилококков, в которых подтверждено наличие S. aureus;

В, — число колоний коагулазоположительных стафилококков, отобранных для подтверждения.

Nr — общее количество копоний коагулазоположительных стафилококков, подсчитанное на чашке Петри;

Ь„ — число атипичных колоний коагулазоположительных стафилококков, в которых подтверждено наличие S.aureus;

Ва, — число атипичных колоний коагулазоположительных стафилококков, отобранных для подтверждения;

ЫЛ1 — общее количество атипичных колоний коагулазоположительных стафилококков, подсчитанное на чашке Петри.

Рассчитанные значения используют для подсчета количества коагулазоположительных стафилококков или S.aureus в 1 г или 1 см3 продукта по формуле:

где 1а — сумма колоний коагулазоположительных стафилококков или S. aureus на всех чашках;

V— объем посевного материала, внесенного в каждую чашку Петри, см3;

л — число чашек Петри в разведении, выбранном для подсчета;

d — степень разведения соответствующая разведению выбранному для подсчета.

Согласно ГОСТ 26670 для подсчета отбирают чашки, на которых выросло не более 300 колоний, при зтом число типичных и (или1 атипичных колоний должно находиться в пределах (15 — 150) колоний. Если в двух последовательных разведениях количество выросших типичных и (или) атипичных колоний находится в пределах (15 — 150). то в зтом случае расчет количества коагулазоположительных стафилококков или S. aureus проводят по формуле:

(D

(2)

N~ v-{n, +0.1 ■ л2) б'

(3)

8

ГОСТ 30347—-2016

где la — сумма колоний коагулаэоположительных стафилококков или S. aureus на всех чашках;

V— объем посевного материала, внесенного е каждую чашку Петри, см3; лч — число чашек с посевами тервого разведения; п: — число чашек с посевами второго разведения;

d — степень разведения, соответствующая первому разведению (исходное разведение также учитывается).

Результаты определения количества коагулаэоположительных стафилококков или S. aureus на 1 г (см3) продукта округляют и записывают в соответствии с ГОСТ 26670.

Пример — Подсчет количества колоний коагулазоположитвльных стафилококков или S. aureus при посеве 0,1 см3 исследуемого продукта:

•    для первого выбранного разведения (102):140 типичных колоний и 125 типичных колоний, атипичных колоний нет;

•    для второго выбранного оазведения (103):16 типичных колоний и 15 типичных колоний, атипичных колоний нет.

Для подтверждения было отобрано следующее число колонии;

•    из 140 колоний взято пять колоний, подтвержденных как коагулазоположительные стафилококки, а * 140;

•    из 125 колоний взято пять колоний, три из которых подтверждены как коагу-лазоположительные стафилококки, а * 75;

•    из 16 колоний взято пять колоний, подтвержденных как коагулазоположительные стафилококки, а * 16;

•    из 15 колоний взято пять колонии, три из которых подтверждены как коагула-зоположительныв стафилококки, а * 9.

140+75+16+9 0.1 (2 + 0.1-2) -Юг*

* 109091

Результат после округления — 1,11(f.

8 2.3.2 Оценка малых количеств выросших колоний

Если на каждой их двух чашек Петри, соответствующих посеву навески исследуемой пробы (жидкие продукты) или исходной суспензии (продукты другой консистенции), обнаружено менее 15 колоний коагулаэоположительных стафилококков или S. aureus, то результат рассчитывают и выражают следующим образом;

а) при посеве жидких продуктов количество коагулаэоположительных стафилококков или S.aureus

на объем продукта (см3) рассчитывают по формуле:

2V

(4)

где 1а — сумма колоний коагулаэоположительных стафилококков или S. aureus на двух чашках Петри; V — объем посевного материала, внесенного в каждую чашку Петри:

б) при посеве продуктов другой консистенции количество коагулаэоположительных стафилококков или S. aureus на массу продукта (г; рассчитывают по формуле:

V-nd'

(5)

где 1а — сумма колоний коагулаэоположительных стафилококков или S. aureus на двух чашках Петри;

V— объем посевного материала, внесенного в каждую чашку Петри;

d— степень разведения исходной суспензии.

Если на двух чашках Петри при посеве 0.1 см3 исследуемой пробы жидкого продукта или исходной суспензии продукта другой консистенции не обнаружено колоний коагулазоположительных стафилококков или S. aureus, то результат выражгют следующим образом:

•    менее 10 КОЕ коагулаэополэжительных стафилококков или S. aureus в 1 см3 жидкого продукта;

•    менее 10/д КОЕ коагулаэоголожителькых стафилококков или S. aureus в 1 г продукта другой консистенции.

9

ГОСТ 30347—2016

Если высевали 1 см3 пробы, то результат выражают следующим образом:

•    менее 1 КОЕ коагулаэоположительных стафилококков или S. aureus в 1 см3 жидкого продукта:

•    менее 1 id КОЕ коагулаэоположительных стафилококков или S. aureus в 1 г продукта другой консистенции.

9 Требования, обеспечивающие безопасность

При выполнении работ необходимо соблюдать следующие требования:

•    помещение лаборатории должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией в соответствии с требованиями ГОСТ 12.4.021:

•содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005:

•    требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007:

- требования техники безопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ 12.1.019:

•    требования безопасности при работе в микробиологической лаборатории с микроорганизмами III—IV групп патогенности (опасности) в соответствии с положениями нормативного документа, действующего на территории государства, принявшего соответствующий стандарт.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.004 и быть оснащено средствами пожаротушения в соответствии с ГОСТ 12.4.009.

10

Приложение А (справочное)

ГОСТ 30347—2016

Дифференциация коагулазоположительных видов и подвидов стафилококков по двум признакам: образованию ацетоина и ферментации мальтозы в аэробных условиях

Таблица А. 1

Наименование

тестов

S. aureus

S

de/рЫт

S.

hyicus

S.

rntermedtus

S. scbtcHensubsp.coBgulans

subsp.

aoaetobius

subsp

aureus

Образование

ацетоина

-

+

-

-

-

+

Ферментация мальтозы в аэробных условиях

+

+

-

W

-

Примечания:

«+» означает, что 90 % или более штаммов положительные:

«-» означает, что 90 % или более штаммов отрицательные:

«w» означает, что реакция слабая:

«отсутствие обозначения» означает что определение показателя не проводилось.

11

ГОСТ 30347—2016

УДК 637.14.04Л07:006.354    МКС 67.100.10

Ключевые слова: молоко, молочная продукция, коагулазололожительные стафилококки. Staphylococcus aureus, метод определения количества S. aureus с предварительным обогащением, метод определения количества S. aureus без предварительного обогащения, отбор проб, требования, обеспечивающие безопасность

12

Редактор Н.Р. Пеыех Технический редактор В.Ю. Фотиева Корректор М.С.Квбашоеа Компьютерная верстка А.С. Тыртышноео

Сдано в набор 06.12.20)6. Подписано в печать 10.012017. Формат 60 * 64 '/а. Гарнитура Ариап. Усп. пен. я. 1 Лв. Уч.-изд. п. 1.68. Тираж 46 эк». Эак 25.

Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта

Издано и отпечатано во ФГУП кСТАНДАРТИНФОРМ». 123995 Москва. Гранатный лер., 4. www.90stinto.1u