База ГОСТовallgosts.ru » 07. МАТЕМАТИКА. ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ » 07.100. Микробиология

ГОСТ Р 55302-2012 Ферментные препараты для пищевой промышленности. Метод определения ксиланазной активности

Обозначение: ГОСТ Р 55302-2012
Наименование: Ферментные препараты для пищевой промышленности. Метод определения ксиланазной активности
Статус: Действует

Дата введения: 01/01/2014
Дата отмены: -
Заменен на: -
Код ОКС: 07.100.30
Скачать PDF: ГОСТ Р 55302-2012 Ферментные препараты для пищевой промышленности. Метод определения ксиланазной активности.pdf
Скачать Word:ГОСТ Р 55302-2012 Ферментные препараты для пищевой промышленности. Метод определения ксиланазной активности.doc


Текст ГОСТ Р 55302-2012 Ферментные препараты для пищевой промышленности. Метод определения ксиланазной активности



ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

НАЦИОНАЛЬНЫЙ

СТАНДАРТ

РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

ГОСТР

55302-

2012

ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Метод определения ксиланазной активности

Издание официальное

Москва

Стенда ртинформ 2013

ГОСТ Р 55302—2012

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N9164-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0—2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения»

Сведения о стандарте

1    РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением «Всероссийский научно-исследова-тельский институт пищевой биотехнологии» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ «ВНИИЛБТ» Росссельхозакадемии)

2    ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 176 «Спиртовая, дрожжевая и ликероводочная продукция»

3    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. Ne 1509-ст

4    8ВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ, 2013

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

ГОСТ Р 55302—2012

Содержание

1    Область применения............................................1

2    Нормативные ссылки............................................1

3    Термины и определения..........................................2

4    Метод определения ферментативной активности ксиланаэы с субстратом ксилан..........3

5    Условия проведения измерений......................................9

в Требования к квалификации операторов.................................9

Библиография................................................10

in

Поправка к ГОСТ Р 55302—2012 Ферментные препараты для пищевой промышленности. Метод определения ксиланаэной активности

В каком месте

Напечатано

Должно быть

Наименование стандарта на английском языке

Enzyme preparations. Method of detection of xytanase activity

Enzyme preparations for food industry. Method for determination of xyianase activity

(ИУСМвЭ 2015 г.)

1

ГОСТ Р 55302—2012

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Метод определения ксиланазкой активности

Enzyme preparations. Method of detection of xylenase activity

Дета введения — 2014—01—01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения ксиланаэной активности ферментных препаратов (ФП) и ферментсодержащих смесей ксиланолитического действия, применяемых в пищевой промышленности.-

2    Нормативные ссылки

8 настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 12.1.019—2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ Р ИСО 5725-1—2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ Р ИСО 5725-2—2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандарного метода измерений

ГОСТ Р 53228—2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 12.0.004—90 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения

ГОСТ 12.1.004—91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005—88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007—76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.2.007.0—75 Система стандартов безопасности труда. Изделия электротехнические. Общие требования безопасности

ГОСТ 12.4.009—83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021—75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 12.4.103—83 Система стандартов безопасности труда. Одежда специальная защитная, средства индивидуальной защиты ног и рук. Классификация

ГОСТ 61—75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ 83—79 Реактивы. Натрий углекислый. Технические условия

ГОСТ 199—78 Реактивы. Натрий уксуснокислый 3-водный. Технические условия

Издание официальное

1

ГОСТ Р 55302—2012

ГОСТ 1770—74 (ИСО 1042—83, ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия ГОСТ 2603—79 Реактивы. Ацетон. Технические условия ГОСТ 3765—78 Реактивы. Аммоний молибденовокислый. Технические условия ГОСТ 4165—78 Реактивы. Медь (II) сернокислая 5-водная. Технические условия ГОСТ 4166—76 Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия ГОСТ 4201—79 Реактивы. Натрий углекислый кислый. Технические условия ГОСТ 4204—77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия ГОСТ 5845—79 Реактивы. Калий-натрий виннокислый 4-еодный. Технические условия ГОСТ 6038—79 Реактивы. D-глюкоза. Технические условия ГОСТ 6709—72 Вода дистиллированная. Технические условия ГОСТ 12026—76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия ГОСТ 13867—68 Продукты химические. Обозначение чистоты ГОСТ 18481—81 Ареометры и цилиндры стеклянные. Общие технические условия ГОСТ 20264.0—74 Препараты ферментные. Правила приемки и методы отбора проб ГОСТ 25336—82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 28498—90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29227—91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования— на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего годе, и по выпускам ежемесячно издаваемого информационного указателя «Национальные стандарты», опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение. в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1    гидролиз: Расщепление исходного соединения на более простые в присутствии молекул воды.

3.2    ферментативный гидролиз: Расщепление высокомолекулярных соединений при участии катализаторов белковой природы — гидролитических ферментов (гидролаз. класс 3 (1)).

3.3    субстрат: Соединение или вещество, на которое воздействует данный фермент.

3.4    ксилан: Высокомолекулярное соединение, полимер ксилозы, в котором остатки глюкозы соединены (И ,4-гликоэидными связями: с водой образует коллоидные растворы.

3.5    системные названия ферментов: Названия, указывающие природу химической реакции, катализируемой данным ферментом, в соответствии с современной классификацией (КФ). принятой Международной комиссией по ферментам.

Примечания

1    К ксилвназвм относится система ферментов, катализирующих расщепление р-гликозидных связей а р-кси-лвнах.

2    Системные названия ферментов:

-    1.4-р-О-хсиланксиланогидролаза (КФ 3.2.1.8)— эндо-1.4-ксиланаза. Фермент катализирует реакцию расщепления 1.4-р-ксилозидных связей в ксиланвх.

-    1.3-р-О-ксиланксиланогидролвза (КФ 3.2.1.32) — ксиланазв или эндо-1.3-р-ксиланаза. Фермент беспорядочно гидролитически расщепляет внутримолекулярные 1.3-р-гликозидные связи в — 1.3-р-0-ксилвнах;

-    1.4-р-О-хсиланксилогидролаза (КФ 3.2.1.37} — экзо-1.4-р-ксилозидаз. или ксилобивзв. или р-ксилозизвза. Гидролизует 1,4-р-О-ксилвкы путем последовательного отщепления с нередуцирующего конце молекулы полисахарида остатков О-ксилозы:

-    1.3-р-ксилвнксилогидролаза (КФ 3.2.1.72)— экзо-1.Э-р-ксилвзадвза. Фермент катализирует последовательное отщепление с нередуцирующего конца молекул 1.3-р-ксиланоа.

2

ГОСТ Р 55302—2012

4 Метод определения ферментативной активности ксиланазы с субстратом ксилан

4.1    Сущность метода

4.1.1    Метод основан на количественном определении редуцирующих (восстанавливающих) сахаров, образующихся в результате действия фермента ксиланазы на ксилан лри температуре 50 °С.

4.1.2    За единицу ксиланаэной активности принимают количество фермента, действующего на ксилан из березы с высвобождением 1 мкмоля восстанавливающих сахаров (в глюкозном эквиваленте). образующихся за 1 мин лри стандартных условиях (температура 50 *С и значение кислотности

5.0    ед. pH).

4.1.3    Содержание редуцирующих сахаров, образующихся в результате ферментативной реакции. определяют колориметрическим методом, основанным на взаимодействии сахаров с реактивом Шомоди— Нельсона (2]. В результате этой реакции образуется соединение голубого или бирюзового цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию редуцирующих сахаров, образовавшихся в процессе ферментативной реакции. Интенсивность окраски полученных растворов измеряют на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при длине световой волны 610 нм; активность выражается в ед. КС/г или ед. КС/см3 анализируемого препарата.

4.2 Требования безопасности

4.2.1    При выполнении анализов необходимо соблюдать требования техники безопасности лри работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007 и ГОСТ 12.4.103.

4.2.2    Помещение, где проводят работы с реактивами, должно быть оснащено приточно-вытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021.

4.2.3    Электробеэопасность при работе с электроустановками — по ГОСТ 12.2.007.0 и по ГОСТ Р 12.1.019.

4.2.4    Организация обучения работающих безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.

4.2.5    Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

4.2.6    Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005.

4.3 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы, материалы

4.3.1 Для определения ксиланаэной активности используют следующие средства измерений, вспомогательное оборудование, посуду, реактивы, материалы:

•    весы по ГОСТ Р 53226, обеспечивающие точность взвешивания с пределом допускаемой абсолютной погрешности не более ± 0.3 мп

. фотоэлектроколориметр (КФК-3) или спектрофотометр (СФ) любого типа, которые обеспечивают измерения при длине световой волны 610 нм с погрешностью измерения коэффициента пропускания не более 1 % (не более 0.01 единицы оптической плотности);

•    холодильник бытовой;

•    pH-метр любого типа для измерения в диапазоне от 0 до 14 ед. pH с пределом допускаемой погрешности в эксплуатации ± 0.1 ед. pH;

•    мешалку магнитную любой марки, которая обеспечивает скорость вращения до 800 мин-1;

•    ультратермостат или термостат водяной с точностью регулирования температуры ± 1 °С;

•    центрифугу лабораторную любого типа, которая обеспечивает скорость вращения не менее 7000 мин-1;

•    баню водяную любого типа, которая обеспечивает поддержание температуры (100 ± 1)*С;

•    секундомер с емкостью шкалы счетчика 1 мин. ценой деления 1 с и погрешностью ± 1.5 с;

•    пипетки автоматические вместимостью от 0.1 до 1.0 см3.1,0 см3, от 0.2 до 5.0 см3 и от 2,0 до

10.0    см3 с наконечниками;

•    встряхиватель V-3 типа Вортекс или аналогичный для перемешивания жидкости со скоростью вращения от 50 до 3400 об/мин;

•    термометры ртутные стеклянные лабораторные по ГОСТ 26498 от 0 °С до 50 °С и от О 9С до 100 'С. ценой деления 0,1 *С или 0.5 °С;

•    ареометры общего назначения по ГОСТ 18481;

•    стаканы и колбы стеклянные лабораторные В-1-150 ТС. В-1-800 ТС. Кн-1 -100-14/23 ТС по ГОСТ 25336;

з

ГОСТ Р 55302—2012

•    стаканчики для взвешивания (бюксы) СВ-19/9 по ГОСТ 25336;

•    воронки В-75-140 ХС по ГОСТ 25336;

-    пробирки П1-14-120 ХС или П1-16-150 ХС по ГОСТ 25336;

-    колбы мерные 1-25-2.1-50-2,1-100-2,1-200-2,1-250-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770;

-    цилиндры 1-25-2,1-50-2,1-100-2,1-250-2 по ГОСТ 1770;

-    пипетки стеклянные 1-2-2-1.1-2-2-2.1-2-2-5.1-2-2-10 по ГОСТ 29227:

•    бумагу фильтровальную лабораторную по ГОСТ 12026;

•    ксилан из березы, с массовой долей основного вещества не менее 90 %;

-    натрий уксуснокислый по ГОСТ 199;

•    кислоту уксусную ледяную по ГОСТ 61;

-    ацетон по ГОСТ 2603;

-    натрий углекислый по ГОСТ 83;

-    калий-натрий виннокислый 4-водный по ГОСТ 5845;

-    медь сернокислую 5-водную по ГОСТ 4165;

•    натрий углекислый кислый по ГОСТ 4201;

•    аммоний молибденовокислый 4-водный по ГОСТ 3765;

-    натрий сернокислый по ГОСТ 4166:

•    кислоту серную концентрированную для пробы Саеаля по ГОСТ 4204;

-    натрий кислый мышьяковокислый, с массовой долей основного вещества 98 %;

•    0{+>-глюкозу по ГОСТ 6038;

•    воду дистиллированную по ГОСТ 6709.

4.3.2    Все реактивы должны относиться к подгруппе чистоты 2 (х. ч.) или 3 (ч. д. а.) по ГОСТ 13667.

4.3.3    Допускается применение средств измерений, вспомогательного оборудования с аналогичными метрологическими и техническими характеристиками, а также реактивов по качеству не хуже вышеуказанных.

4.4 Подготовка к анализу

4.4.1    Приготовление ацетатного буферного раствора молярной концентрации 0,1 моль/дм3 с кислотностью 5,0 ед. pH из растворов уксуснокислого натрия и уксусной кислоты

4.4.1.1    Приготовление раствора уксуснокислого натрия молярной концентрации c(CH3COONa) = = 0.1 моль/дм3 (раствор А)

В мерную колбу вместимостью 1 дм3 помещают (8.20 ± 0,01) г безводного уксуснокислого натрия или (13,60 ±0,01) г CH3C00Na-3H20 и растворяют приблизительно в 300 см3 дистиллированной воды. Затем доводят до метки дистиллированной водой при 20 вС и перемешивают.

4.4.1.2    Приготовление раствора уксусной кислоты молярной концентрации с (СН3СООН) = = 0.1 моль/дм3 (раствор Б)

В мерную колбу вместимостью 1 дм3 вносят 5.72 см3 ледяной уксусной кислоты, разводят приблизительно 300 см3 дистиллированной воды. Объем доводят до метки дистиллированной водой при 20 *С и перемешивают.

4.4.1.3    Для приготовления ацетатного буферного раствора в колбе смешивают растворы уксуснокислого натрия (раствор А) и уксусной кислоты (раствор Б) в соотношении 2:1, создавая значение pH смеси, равное 5.0 ед. pH. При необходимости доводят кислотность раствора до 5.0 ед. pH одним из исходных растворов.

Срок хранения буферного раствора в закрытой стеклянной посуде при 4 *С — не более четырех недель.

4.4.2 Приготовление реактива Шомоди

4.4.2.1    Приготовление раствора В

(24.00 10,01) г безводного углекислого натрия и (12.00 ± 0.01) г виннокислого калий-натрия 4-вод-ного растворяют в стакане в 250 см3 дистиллированной воды. К этому раствору добавляют при перемешивании раствор сернокислой меди 5-водной, для чего (4,00 ±0,01) г CuS0420 растворяют в 40 см3 дистиллированной воды при 20 °С. Затем в полученную смесь вносят (16,00 ± 0.01) г безводного кислого углекислого натрия и содержимое стакана вновь перемешивают. Получают раствор В.

4.4.2.2    Приготовление раствора Г

В другом стакане растворяют (18.00 ± 0.01) г безводного сернокислого натрия в 500 см3 горячей (- 80 *С) дистиллированной воды и кипятят раствор на слабом огне 40 мин. после чего остужают. Получают раствор Г.

4.4.2.3    8 мерной колбе вместимостью 1 дм3 смешивают приготовленные растворы 8 и Г. доводят объем смеси до метки дистиллированной водой при температуре 20 *С.

ГОСТ Р 55302—2012

Срок хранения реактива Шомоди в стеклянной темной посуде при комнатной температуре — не более 3 мес.

4.4.3 Приготовление реактива Нельсона

4.4.3.1    Приготовление раствора Д

(50.0010.01) г безводного молибденовокислого аммония или (68,40 ±0.01)г 4-водного растворяют в стакане в 800 см3 горячей (*• 60 *С) дистиллированной воды. Раствор охлаждают до 5 ®С—10 °С.

4.4.3.2    Приготовление раствора Е

К (42,0010,02) г концентрированной серной кислоты добавляют (6,00 ± 0.01) г безводного кислого мышьяковокислого натрия (или 10 г Na2HAs0420).

4.4.3.3    Раствор Д переносят в мерную колбу вместимостью 1 дм3. К раствору Д при перемешивании осторожно добавляют раствор Е. Объем смеси доводят до метки дистиллированной водой. Полученную смесь инкубируют в течение 48 ч при температуре 40 *С, после чего при наличии осадка фильтруют через стеклянный фильтр.

Срок хранения реактива Нельсона в темном месте при температуре (20.0 ±0.2) вС — не более

3    мес.

4.4.4    Приготовление раствора ксилана с массовой долей 1,0 % (субстрат)

Субстратом является ксилан березовый. Ксилан массовой доли 1.0% готовят в 0.1 моль/дм3 ацетатном буфере (5.0 ед. pH). В стакан вместимостью 100 см3 вносят 0.5 г ксилана. добавляют 49.5 см3 ацетатного буферного раствора по 4.4.1 и непрерывно перемешивают около 1 ч на магнитной мешалке при комнатной температуре. Затем раствор ксилана помещают в кипящую водяную баню на 2—3 мин, периодически перемешивая, после чего содержимое охлаждают. Полученный раствор ксилана при необходимости центрифугируют в течение 7 мин при 6000 мин-’.

Срок хранения раствора в закрытой стеклянной посуде — не более 1 сут.

4.4.5    Приготовление градуировочных растворов глюкозы

4.4.5.1    Приготовление основного раствора глюкозы с массовой долей 1 мг/см3

8 мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают (0,1000 ± 0,0002) г глюкозы, растворяют в небольшом количестве ацетатного буферного раствора с кислотностью 5.0 ед. pH молярной концентрации 0.05 моль/дм3. получая его путем разведения ацетатного буферного раствора по 4.4.1 дистиллированной водой в соотношении 1:1. Раствор тщательно перемешивают и доводят объем до метки буферным раствором концентрации 0,05 моль/дм3.

Срок хранения основного раствора глюкозы в закрытой стеклянной посуде при 4 вС — не более

4    нед.

4.4.5.2    Приготовление рабочих градуировочных растворов глюкозы

Из основного градуировочного раствора глюкозы по 4.4.5.1 готовят серию разведений в соответствии с таблицей 1.

Таблица 1

Объем градуировочного раствора глюкозы массовой концентрации 1 мг/см3, еы3

Объем буферного раствора молярной концентрации 0,05 моль/ды3. см3

Массовая концентрация тюхозы в рабочем растворе, ыг/см3

0.10

4.90

0.02

0.20

4.80

0.04

0.30

4.70

0.06

0.40

4.60

0.08

0.50

4.50

0.10

Рабочие градуировочные растворы глюкозы готовят в день построения градуировочного графика. при этом берут по три параллельных разведения для приготовления каждой концентрации раствора глюкозы.

4.4.6 Построение градуировочного графика

8 каждую из пяти пробирок (16 х 150 мм) вносят по 1 см3 рабочих градуировочных растворов глюкозы различных концентраций в соответствии с таблицей 1. добавляют в каждую пробирку по 1 см3 реактива Шомоди. приготовленного по 4.4.2. перемешивают и помещают пробирки в кипящую водяную баню на 20 мин.

5

ГОСТ Р 55302—2012

Пробирки охлаждают в холодной воде, добавляют ло 1 см3 реактива Нельсона, приготовленного по 4.4.3. и выдерживают в течение 10 мин. периодически тщательно перемешивая, после чего вносят по 7 см3 дистиллированной воды, доводя объем содержимого пробирки до 10 см3.

Одновременно готовят контрольную пробу на реактивы по 4.6.2. Оптические плотности растворов глюкозы измеряют на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при длине световой волны 610 нм в кюветах с толщиной поглощающего светового слоя 10 мм в сравнении с контролем на реактивы.

Для построения каждой точки градуировочного графика вычисляют среднеарифметическое значение результатов оптической плотности трех параллельных измерений.

По полученным среднеарифметическим значениям результатов строят градуировочный график зависимости оптической плотности (поглощения) от массовой концентрации глюкозы (мг/см3). Рабочая зона градуировочного графика лежит в пределах от 0.10 до 1.1 единицы оптической плотности.

На оси абсцисс X откладывают массовую концентрацию глюкозы С в мг/см3; на оси ординат У — соответствующие значения оптической плотности D при X = 610 нм. На рисунке 1 приведен пример градуировочного графика. Величина, обратная тангенсу угла наклона калибровочной кривой, составляет. например. 0,098 (1/tg = 0.098), что является коэффициентом К, входящим в формулу расчета кси-ланаэной активности. Величина коэффициента может меняться в зависимости от приготовленных реактивов Шомоди и Нельсона. Таким образом, эта величина равна массовой концентрации глюкозы в рабочем растворе, отложенной на оси X. при оптической плотности на оси У. равной 1.0.

Оптическая плотность

Рисунок 1 — Пример градуировочного графика

Градуировочный график строят каждый раз при приготовлении новых реактивов Шомоди и Нельсона. а также при замене прибора.

4.5 Подготовка пробы

4.5.1    Отбор проб проводят по ГОСТ 20264.0.

Анализируемые пробы ферментных препаратов в форме порошка или жидком виде можно использовать без предварительной подготовки.

4.5.2    Приготовление основного раствора анализируемой пробы ферментного препарата В стаканчик для взвешивания помещают (0,1000 ± 0.0001) г сухого ферментного препарата или

(1.00 ± 0.01) г жидкого ферментного препарата и суспендируют в небольшом количестве дистиллированной воды. Суспензию количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят объем до метки дистиллированной водой при температуре 20 *С и тщательно перемешивают. Приготовленный раствор ферментного препарата является основным раствором анализируемого образца.

Срок хранения основного раствора ферментного препарата при температуре 20 °С — не более 1 ч.

4.5.3    Приготовление рабочего раствора анализируемого образца ферментного препарата Рабочий раствор анализируемого ферментного препарата готовят из основного раствора по 4.5.2

путем дальнейшего разведения его дистиллированной водой таким образом, чтобы при определении активности оптические плотности опытного и контрольного растворов находились в пределах рабочей зоны градуировочного графика по 4.4.6.

Количество фермента, взятого для анализа, должно быть рассчитано так. чтобы в реакционной смеси по 4.6.1.2 присутствовал избыток субстрата и чтобы измеряемые величины оптической плотное-

6

ГОСТ Р 55302—2012

ти Оф no 4.6.1.5 при колориметрировании в юовете с толщиной поглощающего светового слоя 10 мм лежали в диапазоне значений 0,8—1.1.

При отклонении оптической плотности от указанных значений необходимо подобрать разведение препарата таким образом, чтобы оптическая плотность окрашенных растворов Оф по 4.6.1.5 соответствовала указанным пределам диапазона.

Каждую пробу анализируют два раза в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-1 и ГОСТ Р ИСО 5725-2.

Раствор готовят в день определения. Длительность использования рабочего раствора ферментного препарата не должна превышать 1 ч с момента приготовления во избежание потерь его ферментативной активности.

4.6 Проведение анализа

4.6.1    Проведение ферментативной реакции

4.6.1.1    В две пробирки (16 * 150 мм) вносят по 0.5 см3 субстрата ксилаиа по 4.4.4. В пробирки добавляют по 0.3 см3 дистиллированной воды. Содержимое пробирок перемешивают и прогревают в ультратермостаге с температурой (50 ♦ 1) *С в течение 5 мин.

4.6.1.2    В пробирки добавляют по 0.2 см3 рабочего раствора анализируемой пробы ферментного препарата по 4.5.3. предварительно прогретого до температуры (50 ± 1) *С. и тщательно перемешивают. Реакционную смесь инкубируют при температуре (50 ± 1) *С в течение 10 мин. ведя отсчете момента начала ферментативной реакции.

4.6.1.3    По окончании реакции в пробирки вносят по 1 см3 реактива Шомоди по 4.4.2. тщательно перемешивают, закрывают стеклянными пробками, помещают в кипящую водяную баню на 20 мин.

4.6.1.4    Пробирки охлаждают в холодной воде, добавляют 1,0 см3 реактива Нельсона по 4.4.3. перемешивают и выдерживают 10 мин. периодически тщательно перемешивая. Полученные растворы приобретают синюю или бирюзовую окраску различной интенсивности. При образовании осадка или мути в пробирки добавляют по 1 см3 ацетона и перемешивают до полного их исчезновения. В этом случае ацетон добавляют в пробирки контрольного раствора на реактивы по 4.6.2 и раствора субстрата по 4.6.3.

4.6.1.5    Содержимое пробирок доводят до общего объема 10 см3 дистиллированной водой и измеряют оптическую плотность Оф на фотоэлектроколоримегре или спектрофотометре при длине световой волны Х»610 нм в кюветах с толщиной поглощающего светового слоя 10 мм против контрольного раствора на реактивы по 4.6.2. Значение оптической плотности должно быть в диапазоне 0.8—1.1.

4.6.1.6    Если значение оптической плотности опытной пробы £>ф находится за пределами рабочей зоны градуировочного графика и не укладывается в диапазон ее значения, определение активности следует повторить с рабочим раствором анализируемого образца, содержащим большее или меньшее количество фермента соответственно.

4.6.2    Определение оптической плотности контрольного раствора на реактивы

Измерение оптической плотности опытной пробы £>ф. раствора субстрата Ос и рабочего раствора

фермента 0о осуществляют против кюветы с контрольным раствором на реактивы. Контрольный раствор на реактивы готовят, внося в пробирку 0,5 см3 ацетатного буферного раствора по 4.4.1. 0.5 см3 дистиллированной воды и 1 см3 реактива Шомоди по 4.4.2. Содержимое пробирки перемешивают и инкубируют е кипящей водяной бане 20 мин. Дальнейшие операции осуществляют аналогично 4.6.1.4—4.6.1.5.

4.6.3    Определение оптической плотности раствора субстрата

В пробирку вносят по 0.5 см3 субстрата ксилан по 4.4.4. добавляют 0.5 см3 дистиллированной воды и 1 см3 реактива Шомоди по 4.4.2. Содержимое пробирки перемешивают и инкубируют в кипящей водяной бане 20 мин. Дальнейшие операции осуществляют аналогично 4.6.1.4—4.6.1.5. Показания оптической плотности раствора субстрата обозначают Dc.

4.6.4    Определение оптической плотности рабочего раствора фермента

8 пробирку вносят 0.5 см3 ацетатного буфера по 4.4.1. добавляют 0.3 см3 дистиллированной воды и 0.2 см3 рабочего раствора фермента по 4.5.3, затем добавляют 1 см3 реактива Шомоди по 4.4.2. Содержимое пробирки инкубируют в кипящей водяной бане 20 мин. Дальнейшие операции осуществляют аналогично 4.6.1.4—4.6.1.5. Показания оптической плотности рабочего раствора фермента обозначают как 00.

7

ГОСТ Р 55302—2012

4.7    Обработка результатов

4.7.1    Ферментативную активность кисланазы КС в анализируемой пробе, в ед. КС/г или ед. КС/см3. вычисляют ло формуле

КСаК.дО n-2.78-tf,    (1}

где/f— коэффициент ло 4.4.6;

ло = офс0:

£>ф — оптическая плотность анализируемого раствора;

Dc — оптическая плотность раствора субстрата;

D0 — оптическая плотность рабочего раствора фермента; п — масса ферментного препарата, взятая на гидролиз (расчет ведется на 1 см3 рабочего раствора анализируемой пробы ферментного препарата), г;

2.78 — коэффициент, учитывающий пятикратное разбавление рабочего раствора ферментного пре-парата непосредственно в реакционной смеси, время проведения ферментативной реакции (10 мин) и молекулярный вес глюкозы (0.18016 мг/мкмоль), т. е. 5/10 0.18016 - 2,78; d — плотность ферментного препарата (для жидких препаратов) по ГОСТ 18481. г/см3.

4.7.2    За окончательный результат определения принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости (2).

Границы относительной погрешности S- ± 7 % (соответствуют значению относительной расширенной неопределенности U095 при коэффициенте охвата к - 2).

Результат анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде

X ± д. при Р - 0.95.

где Р — доверительная вероятность;

X — среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, признанных приемлемыми (4.8.1), ед. КС/г (ед. КС/см3);

±д— значение границ абсолютной погрешности результатов определений ед. КС/г (ед. КС/см3), определяемое по формуле

±д= X 6 0.01 или±Д= 0.07 X.

где 6— границыотносительной погрешности результата анализа ксилаэной активности в анализируемой пробе при Р - 0.95.

Наименьшие разряды числовых значений результата измерения и численных показателей точности должны быть одинаковы.

Значащих цифр численных показателей точности измерений должно быть не более двух.

4.8    Сходимость и воспроизводимость результатов

4.8.1    Результаты измерений, полученные в условиях повторяемости (сходимости), признаются удовлетворительными, если выполняется условие приемлемости

|Х,-Х2|£0.01 г-Х.    (2)

где X, и Х2 — результаты двух параллельных определений, полученные в условиях повторяемости при Р - 0.95. ед. КС/г или ед. КС/см3;

0,01 — коэффициент для пересчета процентов в абсолютные значения; г— предел повторяемости (сходимости), равный 7 %;

X — среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, ед. КС/г или КС/см3 анализируемого препарата.

4.8.2    Результаты определений, полученные в условиях воспроизводимости по ГОСТ Р ИСО 5725-1, признаются удовлетворительными, если выполняется условие приемлемости

!Хз ~Х41.100йСР095.    (3)

X

где Х3 и Х4 — окончательные результаты определений, полученные в условиях воспроизводимости в двух лабораториях в точном соответствиис методикой, ед. КС/г или ед. КС/см3 анализируемого препарата;

8

ГОСТ Р 55302—2012

X —■ среднеарифметическое значение двух окончательных результатов измерений, получен* ных в условиях воспроизводимости, ед. КС/гилиед. КС/см3 анализируемого препарата; 100 — коэффициент для пересчета в проценты;

CD0 95 — критическая разность, равная 10 %.

5 Условия проведения измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны соблюдаться следующие условия:

•    температура окружающего воздуха.................(20 ± 1) вС;

•    относительная влажность воздуха.................(60 ±20)%;

•    атмосферное давление....................(84.0 +106.7) кЛа;

- напряжение в сети..........................(220 ± 10) В.

6 Требования к квалификации операторов

К проведению анализов допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже среднего технического образования, владеющие навыками работы в лаборатории, проведения анализов и изучившие инструкции по эксплуатации используемой аппаратуры.

9

ГОСТ Р 55302—2012

Библиография

[1]    Елгуте Nomenclature, recommendations of №е nomenclature Committee ofthelUB//N.Y.. Academic Press — 1984

[2]    Полыгалина Г.В.. Чередниченко В.С.. Римареее Л.В. Определение активности ферментов: Справочник. М. ДеЛи принт, 2003. 372 с.

10

ГОСТ Р 55302—2012

УДК 577.15:543.06:006.354    ОКС 07.100.30    Н09    ОКСТУ 9291

Ключевые слова: ферментные препараты, ксиланазная активность, метод определения с использоеа» нием субстрата ксилана, реактив Шомоди—Нельсона, условия проведения измерений, требования к квалификации операторов

11

Редактор М.Е. Никулине Технический редактор В.Н. Прусакоаа Корректор М.В. Вучная Компьютерная верстка Л.А. Круговой

Слано е пабов 13.06 2013. Подписано в печать 23.07.2013. Формат 60 к 84у£ Гарнитура Ариал Уел. печ. л. 1.86. Уч.-иэя л. 1.25. Тираж 116 эм.    За к 789.

ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ». 123995 Москва. Гранатный пер.. 4     in!o@90sbn!o ги

Набрано во ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» на ПЭВМ.

Отпечатано в филиале ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» — тип. «Московский печатник», 105062 Москва. Лялин пер., 6.

Изменение № 1 ГОСТ Р 55302—2012 Ферментные препараты для пищевой промышленности. Me* тод определения ксиланазной активности

Утверждено и введено в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29.09.2015 № 1403-ст

Дата введения — 2016—01—01

Пункт 4.3.1. Второй абзац. Заменить слова: «не более ± 0.3 мг» на «±0.5 мг»; двадцать третий абзац. Заменить слова: «ксилан из березы в на «ксилан иэ бука».

Пункт 4.4.4. Первый абзац. Заменить слова: «ксилан березовый» на «ксилан иэ бука».

Подпункт 4.4.5.1. Заменить значение: «(0,1000 ± 0.0002) г» на «(0,1000 ±0.0005) г».

Пункт 4.5.2. Заменить значение: «(0.1000 ±0.0001) г» на «{0.1000 ±0.0005) г».

Пункт 4.7.1. Первый абзац. Заменить слово: «кисланазы» на « ксилан азы»; формулу (1) изложить а новой редакции:

«КС

К JkD-Z78 d п

О)

где К — коэффициент по 4.4.6;

ДО — разность величин оптической плотности.

ДО = 0 -£> -О,

Оф — оптическая плотность анализируемого раствора:

D4 — оптическая плотность раствора субстрата:

D0 — оптическая плотность рабочего раствора фермента;

2.78 — коэффициент, учитывающий пятикратное разбавление рабочего раствора ферментного препарата непосредственно е реакционной смеси, время проведения ферментативной реакции (10 мин) и молекулярный вес глюкозы (0,18016 мг/мкмоль), т. е. 5/10 0,18016 = 2.78; d — плотность ферментного препарата (для жидких препаратов) по ГОСТ 18481. г/см3: л — масса ферментного препарата, взятая на гидролиз (расчет ведется на 1 см3 рабочего раствора анализируемой пробы ферментного препарата), г».

(ИУС Ne 1 2016 г.)

1