База ГОСТовallgosts.ru » 07. МАТЕМАТИКА. ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ » 07.100. Микробиология

ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса

Обозначение: ГОСТ 20264.3-81
Наименование: Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса
Статус: Утратил силу в РФ

Дата введения: 06/30/1982
Дата отмены:
Заменен на: -
Код ОКС: 07.100.30, 65.120
Скачать PDF: ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса.pdf
Скачать Word:ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса.doc


Текст ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса



УДК 577.15:543.06:006.354    Группа С09

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТНЫЕ

Методы определения активности пектолитического комплекса

ГОСТ

20264.3-81

Взамен

Enzyme preparations.    гост 20264.3—74

Methods for determination of pectolytic complex activity

Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 15 апреля 1981 г. № 1973 срок действия установлен

с 01.07.82 до 01.07.87

Несоблюдение стандарта преследуется по закону

Настоящий стандарт распространяется на ферментные препараты микробного происхождения и устанавливает методы определения активности пектолитического комплекса.

1. МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ

1.1. Отбор проб — по ГОСТ 20264.0—74.

Издание официальное    Перепечатка воспрещена

Переиздание. Февраль 1985 г.

2. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕКТОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ (ПкС)

(интерферометрический метод)

2.1.    Сущность метода

Метод основан на определении пектолитических ферментов при каталитическом расщеплении пектина.

За единицу пектолитической активности должно быть принято количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 г пектина до продуктов, не осаждаемых сернокислым цинком при проведении гидролиза в строго бпределенных условиях: температура 30°С, время, гидролиза 1 ч, величина pH реакционной среды 4,0; соотношение фермент-субстрат в реакционной среде, обеспечивающее гидролиз 30 %-ного пектина, взятого на реакцию.

Пектолитическую активность выражают числом указанных единиц в 1 г испытуемого препарата.

Количество продуктов гидролиза пектина, не осаждаемых сернокислым цинком, определяют на интерферометре.

2.2.    Аппаратура, материалы, реактивы

Весы лабораторные аналитические 3-го класса точности любой марки.

Весы технические 2—3-го класса точности.

Мешалка любой марки.

Интерферометр типа ИТР-2 или ЛИР-2.

Прибор для измерения pH среды любой марки.

Термометры ртутные стеклянные лабораторные по ГОСТ 215—73.

Стаканы и колбы стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336—82.

Стаканчики для взвешивания (бюксы высотой 40—50 мм) по ГОСТ 25336—82.

Термостат водяной любой марки.

Воронки стеклянные по ГОСТ 25336—82.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026—76.

Приборы мерные лабораторные стеклянные, бюретки, пипетки по ГОСТ 20292—74.

Пробирки стеклянные по ГОСТ 25336—82.

Фильтры обеззоленные. Синяя лента.

Марля медицинская по ГОСТ 9412—77.

Пектин свекловичный со степенью метоксилирования не менее 35 % и содержанием основного вещества не менее 70 %.

Сахароза по ГОСТ 5833—75.

Цинк сернокислый по ГОСТ 4174—77, 15 %-ный раствор.

Аммиак водный по ГОСТ 3760—79.

Баня водяная.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709—72.

Все реактивы должны быть х. ч. или ч. д. а.

2.3. Подготовка к анализу

2.3.1. Приготовление основного ферментного раствора из очищенных порошкообразных препаратов

0,1 г (или 1 г) исследуемого препарата взвешивают на аналитических весах с погрешностью не более 0,0001 г в стаканчике вместимостью 25—30 см3. Навеску тщательно растирают стеклянной палочкой с небольшим количеством дистиллированной воды. Затем количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3 (500 см3), доводят водой до метки и перемешивают. С целью избежания адсорбции фермента на наполнителе необходимо процессы растворения и фильтрации проводить неразрывно: после растворения стандартизованных препаратов раствор сразу же фильтруют через беззольный фильтр. Из фильтрата отбирают определенное количество раствора в зависимости от активности препарата для проведения анализа в соответствии с табл. 1.

Таблица 1

Количество ед. активности в 1 г препарата (ед. ПкС)

Количество раствора, которое необходимо для вторичного разбавления, CM,J

Объем, до которого необходимо разбавить взятое количество раствора, см3

Количество препарата, содержащееся в 10 см3 ферментного раствора, взятое на анализ, г

2—5

Без разведения

Без разведения

0,02

5—10

20

50

0,008

10—20

10

50

0,004

20—40

5

50

0,002

40—100

2,5

50

0,001

100—200

2,5

100

0,0005

200—500

2,5

250

0,0002

2.3.2.    Приготовление основного ферментного раствора из поверхностной культуры гриба

1 г измельченной воздушно-сухой культуры гриба взвешивают на технических весах, переносят в стакан вместимостью 250 см3, заливают 100 см3 дистиллированной воды и выдерживают в течение 1 ч при 30 °С при периодическом перемешивании. Полученный ферментный экстракт фильтруют через бумажный фильтр и из фильтрата, в зависимости от активности культуры, в соответствии с табл. 2 отбирают определенное количество в колбу вместимостью 50 см3 и доводят водой до метки. Содержимое перемешивают и используют для определения пектолитической активности.

2.3.3.    Приготовление 1 %-ного раствора пектина (субстрат)

Навеску пектина, взятую с таким расчетом, чтобы в 250 см3

раствора было 2,5 г чистого пектина (см. обязательное приложение), тонкой струей всыпают при непрерывном перемешивании

на мешалке в .коническую колбу вместимостью 300 см3, куда предварительно наливают около 130 см3 дистиллированной воды. Раствор перемешивают в течение 3 ч на мешалке при комнатной температуре. По истечении этого времени в раствор добавляют при перемешивании определенное количество концентрированного раствора аммиака для установления pH 4,0. Затем объем раствора доводят дистиллированной водой до 250 см3, тщательно перемешивают и фильтруют через два слоя марли.

Таблица 2

Количество условных единиц активности в 1 г культуры

Количество фильтрата вытяжки, взятое для разбавления» см1

Количество культуры, содержащееся в 10 см3 ферментного раствора, взятое на анализ, г

0*4—1,0

0,1

1,0—2,5

20

0,04

2,5—5,0

10

0,02

5,0—10

5

0,01

Св. 10

2,5

0,005

Раствор пектина готовят не менее чем за 4 ч до проведения анализа. Окраска раствора должна быть светло-серой

Раствор пектина можно использовать в течение 2—3 сут при условии хранения в холодильнике.

2.3.4. Проверка интерферометра

Интерферометр проверяют 0,25%-ным раствором сахарозы В правую секцию кюветы интерферометра с длиной грани 4 см наливают дистиллированную воду, в левую — приготовленный раствор сахарозы.

Поправочный коэффициент (К) вычисляют по формуле

где 780 — показание прибора;

X—показание прибора при проверке 0,25 %-ным раствором сахарозы.

2.4. Проведение анализа

Для анализа берут несколько пробирок диаметром 2 см и высотой 18 см по количеству исследуемых проб. В каждую пробирку наливают по 20 см3 субстрата и ставят их в термостат с температурой (30±0,2)°С. В термостате пробирки выдерживают в течение 10 мин для того, чтобы растворы приняли постоянную температуру. Затем наливают в каждую по 10 см3 испытуемого ферментного раствора, предварительно подогретого до 30 °С, содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают и оставляют в термостате при 30 °С на 1 ч для проведения гидролиза.

По истечении этого времени в пробирки с реакционной смесью добавляют по 2 см3 15 %-ного раствора сернокислого цинка для инактивации фермента и осаждения продуктов гидролиза и вынимают из термостата.

Содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают путем встряхивания не менее 10 раз и фильтруют через фильтр.

Если фильтрат будет мутным, то его необходимо заново профильтровать через тот же фильтр до получения прозрачного раствора. Полученный раствор является исследуемым.

Одновременно готовят контрольный раствор. Для этого в пробирку наливают 2 см3 15 %-ного раствора сернокислого цинка, 10 см3 исследуемого ферментного раствора и 20 см3 субстрата.

Измерение проводят на интерферометре. Для этого исследуемый раствор наливают в левое отделение кюветы интерферометра с длиной грани 4 см, а контрольный раствор в правое отделение и измеряют величину смещения интерференционных полос, возникающую вследствие различия показателей преломления контрольного и исследуемого растворов. Отсчет ведут по шкале барабана прибора.

Для обеспечения точности анализа необходимо разведение ферментных препаратов подбирать таким образом, чтобы получать показания прибора от 400 до 1250.

2 5. Обработка результатов

Псктолнтичсскую активность (ПкС) в ед/г вычисляют по формуле

0,06425. /С.П+-19,62 т.1000    ’

где    п — показание прибора для данного разведе

ния;

т — количество ферментного препарата, содержащееся в 10 см3 ферментного раствора, взятого на определение, г;

0,06425, 19,62 и 1000 — постоянные коэффициенты, полученные

при математической обработке экспериментальных данных по изучению зависимости между количеством образующихся продуктов гидролиза пектина в условиях метода и количеством единиц активности фермента, взятого на анализ;

К — поправочный коэффициент.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое значение активностей, полученных при анализе двух навесок. Из каждой навески делают не менее трех разведений. Допускаемое расхождение между значениями активностей не должно превышать 5 %.

Вычисление проводят до 0,1.

3. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭКЗОПОЛИГАЛАКТУРОНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ |>кэо-ПгС) ПО УВЕЛИЧЕНИЮ КОЛИЧЕСТВА ВОССТАНАВЛИВАЮЩИХ АЛЬДЕГИДНЫХ ГРУПП

3.1. Сущность метода

Метод основан на учете количества прогидролизированных связей по увеличению конечных альдегидных групп.

За единицу экзополигалактуроназной активности принято количество фермента, которое в условиях определения при 30°С катализирует гидролиз 1 мкэкв. гликозидных связей в молекуле пектовой кислоты за 1 мин.

Экзополигалактуроназная активность выражается числом указанных единиц в 1 г препарата (или 1 см3 раствора).

3.2.    А п п а р ату р а, материалы, реактивы

Фотоэлектроколориметр любой марки,

Весы лабораторные аналитические 3-го класса точности любой марки.

Шкаф сушильный вакуумный любой марки.

Весы технические 2—3-го класса точности.

Термостат водяной любой марки.

Прибор для измерения pH среды любой марки.

Воронка Бюхнера.

Воронка стеклянная по ГОСТ 25336—82.

Баня водяная.

Бязь по ГОСТ 11680—76.

Марля медицинская по ГОСТ 9412—77.

Стаканы и колбы .стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336—82 вместимостью 100, 500, 1000 см3.

Термометры ртутные стеклянные лабораторные по ГОСТ 215_73.

Эксикатор по ГОСТ 25336—82.

Приборы мерные лабораторные стеклянные. Бюретки, пипетки по ГОСТ 20292—74.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026—76.

Кислота пектовая.

Спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300—72.

Калий йодистый по ГОСТ 4232—74.

Калий двухромовокислый по ГОСТ 4220—75.

Натрий серноватистокислый по СТ СЭВ 223—75, 0,05 н. раствор.

Пектин свекловичный со степенью метоксилирования не менее 35 % и содержанием основного вещества не менее 70 % •

Крахмал растворимый по ГОСТ 10163—76, 1 %-ный раствор.

Натрий углекислый по ГОСТ 83—79 1 М раствор.

Йод по ГОСТ 4159—79, 0,1 н. раствор.

Кислота серная по ГОСТ 4204—77, 2 М раствор.

Натрий гидроокись по ГОСТ 4328—77.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709—72.

Все реактивы должны быть марки х. ч. или ч. д. а.

3.3. Подготовка к анализу

3.3.1.    Приготовление пектовой кислоты (субстрат)

30 г свекловичного пектина, взвешенного на технических весах, заливают 600 см3 дистиллированной воды для набухания и растворения, оставляют в холодильнике на ночь. Затем к раствору пектина прибавляют 300 см3 0,5 н. раствора гидроокиси натрия для полного растворения пектина и снижения вязкости. Раствор фильтруют на воронке Бюхнера через два слоя марли, между которыми проложен слой ваты, и к фильтрату прибавляют еще 300 см3 0,5 н. раствора гидроокиси натрия.

Для омыления раствор оставляют на 1 ч в холодильнике. Затем осаждают пектовую кислоту прибавлением примерно 900 см3 0,5 н. раствора соляной кислоты. Выпавшую пектовую кислоту сразу же отжимают через бязь, помещают в стакан, заливают 70%-ным этиловым спиртом, тщательно перемешивают, растирая комки, и фильтруют на воронке Бюхнера через бязь. Промывают на воронке сначала 70 %-ным этиловым спиртом до отсутствия ионов хлора, а затем 50 см3 96 %-ным этиловым спиртом.

Полученную кислоту сушат на воздухе, затем в вакуумном сушильном шкафу при комнатной температуре.

Порошок отсеивают через сито с ячейками 0,25 мм (остаток на сите отбрасывают). Влажность продукта обычно 10—15%.

3.3.2.    Приготовление 1 %-ного раствора пектовой кислоты

Навеску пектовой кислоты, взятую с таким расчетом, чтобы

в 100 см3 раствора был 1 г пектовой кислоты, взвешивают с погрешностью не более 0,0001 г, медленно всыпают при тщательном перемешивании в стакан с дистиллированной водой и из бюретки по каплям при перемешивании добавляют 1 н. раствор гидроокиси натрия для доведения раствора до pH 4,0.

Полученный раствор пектовой кислоты количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят до метки дистиллированной водой, тщательно перемешивают и фильтруют через два слоя марли на воронке Бюхнера. Раствор используют в день приготовления.

3.3.3.    Приготовление основного раствора ферментного препарата — по пп. 2.3.1, 2.3.2 непосредственно перед применением.

3.4. Проведение анализа

3.4.1. 10 см3 1 %-ного раствора пектовой кислоты вносят в колбу вместимостью по 100 см3 и помещают в термостат с температурой 30 °С (303 К).

Через 10 мин в колбу вводят по 5 см3 ферментного раствора соответствующего разведения, растворы тщательно перемешива

ют, отмечают время и оставляют на 10, 20, 30 или 60 мин (в зависимости от ферментативной активности) для проведения гидролиза.

По истечении этого времени в эти же колбы добавляют по* 1,8 см3 1 М раствора углекислого натрия и по 10 см3 0,1 н. раствора йода.

3.4.2.    Для проведения анализа ферментных препаратов, величина активности которых неизвестна, необходимо взять 50 смраствора субстрата и от 1 до 25 см3 ферментного раствора (общий объем реакционной смеси 75 см3). Из этой реакционной смеси каждые 5—10 мин отбирают пробы по 15 см3 в колбы, куда предварительно налито 1,8 см3 1 М раствора углекислого натрия.

3.4.3.    Растворы тщательно перемешивают, закрывают стеклянными пробками и оставляют стоять 20 мин в защищенном от света месте. Затем вводят 2 см3 2 М раствора серной кислоты, интенсивно перемешивают и оттитровывают избытбк йода 0,05 н. раствором серноватистокислого натрия в присутствии крахмала, а результаты титрования выражают в см3 0,1 н. раствора серноватистокислого натрия.

Одновременно ставят контрольный опыт с таким же количеством всех реагентов, только ферментный раствор вводят после добавления углекислого натрия непосредственно перед добавлением раствора йода.

Разность при титровании между контролем и опытом должна быть от 0,5 до 2,5 см3.

3.5. Обработка результатов

Экзополигалактуроназную активность (экзо-ПгС) в ед/г вычисляют по формуле

гт    51.3 * о,

жзо~ПгС=—j- ,

t к 9

где 51,3 — число микроэквивалентов альдегидных групп, соответствующих 1 см3 0,1 н. раствора йода (или гипосульфита);

а — количество 0,1 н. раствора йода, израсходованное на окисление образовавшихся при гидролизе альдегидных групп (находят по удвоенной разности титрований 0,05 н. раствором гипосульфита контрольной и опытной проб), см3; t — время гидролиза, мин;

k — количество препарата в пробе, израсходованное на титрование, г.

Для обеспечения точности анализа необходимо разведение ферментных препаратов подбйрать таким образом, чтобы гидролиз пектовой кислоты не превышал 20 %.

Гидролиз пектовой кислоты (Л) в процентах формуле

А =

9,03-а т

•100,

вычисляют по

где а — количество 0,1 н. раствора йода, израсходованное на окисление образовавшихся при гидролизе альдегидных групп, см3;

9,03 — количество пектовой кислоты, соответствующее 1 см3 0,1 н. раствора йода, мг;

т — количество пектовой кислоты в реакционной смеси, мг;

100 — коэффициент перевода в проценты.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое значение активностей, полученных при анализе двух навесок. Из каждой навески делают не менее трех разведений. Допускаемое расхождение между значениями-активностей не должно превышать 5 %.

Вычисление ведут до 0,1.

4. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНДОПОЛИГАЛАКТУРОНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ (эндо-ПгС) (вискозиметрический метод)

4.1. Сущность метода

Метод основан на гидролизе пектина или пектовой кислоты исследуемым ферментным препаратом- с последующим контролем степени расщепления по снижению вязкости.

Эндополигалактуроназная активность характеризует способность фермента снижать вязкость 1 %-ного раствора пектина

За единицу эндополигалактуроназной активности принято такое количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 г пектина со снижением вязкости раствора на 30 % за 1 мин при 30 °С.

Эндополигалактуроназная активность выражается числом указанных единиц в 1 г ферментного препарата или 1 см3 ферментного раствора.

4.2.    Ап п а р а ту р а, материалы, реактивы

Баня водяная.

Вискозиметр Оствальда с капилляром диаметром 0,8—1,0 мм.

Термостат водяной любой марки.

Секундомер.

Воронка Бюхнера.

Пектин свекловичный со степенью метоксилирования не ниже 35 % с содержанием пектина не ниже 70 %.

Кислота пектовая.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026——76

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328—77.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709—72.

Все реактивы должны быть марки х. ч. или ч. д. а.

4.3.    Подготовка к анализу

4.3.1.    Приготовление основного ферментного раствора по пп. 2.3.1; 2.3.2.

4.3.2.    Приготовление 1 %-ного раствора пектина проводят по л. 2.3.3, I %-ного раствора пектовой кислоты по п. 3.3.2.

4.4.    Проведение анализа

В сухой вискозиметр, погруженный в термостат с температурой 30°С пипеткой вносят 10 см3 1 %-ного раствора пектина или пектовой кислоты.

Через 5 мин вводят раствор фермента (от 1 до 5 см3). Общий объем реакционной смеси в вискозиметре всегда должен быть равен 15 см3, поэтому, если на определение берут меньше 5 смферментного раствора, то непосредственно перед его добавлением вносят соответствующее количество дистиллированной воды. После введения фермента сразу по секундомеру отмечают время начала гидролиза и одновременно тщательно перемешивают содержимое вискозиметра воздухом при помощи груши, надетой на узкое колено вискозиметра. Через 2—3 мин (если использовался вискозиметр с диаметром 1,0 мм) или через 5 мин (если использовался вискозиметр с диаметром 0,8 мм) после введения фермента измеряют вязкость по времени истечения реакционной смеси.

Время отмечают вторым секундомером через каждые 2, 3, 5 мин, пока вязкость раствора не снизится на 30 % от исходной.

Время гидролиза не должно превышать 18 мин. Процент гидролиза пектина должен быть в пределах от 7 до 12. При отклонении от этой величины необходимо увеличить или уменьшить количество ферментного раствора.

Контрольное определение вязкости исходного раствора субстрата проводят аналогично опытному в том же вискозиметре, только без фермента с добавлением 5 см3 воды.

При анализе препаратов с низкой активностью контрольное определение следует проводить с ферментным раствором, инактивированным кипячением в водяной бане с обратным холодильником в течение 1 ч.

В большинстве случаев при анализе активных препаратов на определение берут разбавленные растворы, вязкость которых не отличается от вязкости воды.

4.5.    Обработка результатов

Снижение вязкости пектина (Б) в процентах вычисляют по формуле

5=Д^--юо,

где tK — время истечения контрольного раствора пектина с водой или инактивированным ферментным раствором, с; t — время истечения опытного раствора (после гидролиза), с; tB — время истечения воды, с.

Снижение вязкости вычисляют для всех произведенных определений. Для получения более точных результатов и сокращения длительности анализа снижение вязкости после 3—5 мин гидролиза должно находиться от 10 до 15 %.

По полученным данным строят график, где на оси абсцисс откладывают время гидролиза (1 мин— 10 мм), которое вычисляют прибавлением к времени начала измерения половины времени истечения реакционной смеси, поскольку ферментативный гидролиз продолжается в процессе определения.

На оси ординат откладывают соответствующее этому времени снижение вязкости (1 % — 1 мм).

Полученные точки соединяют прямой и интерполированием находят время, за которое израсходованное на анализ количество препарата снизило вязкость на 30 % от исходной.

Если прямая пересекает ось ординат выше 10 мм, то анализ повторяют.

Найденную величину (4о) используют для расчета активности (эндо-ПгС) ед/г по формуле

эндо-ПгС=-Щ—' ,

где 100 — количество пектина или пектовой кислоты во взятых на определение 10 мл 1 %-ного раствора субстрата, мг; т — количество ферментного препарата, введенного в реакционную смесь, мг;

i$o — найденное интерполированием время гидролиза в минутах, за которое т мг ферментного препарата снизили вязкость раствора пектина на 30 %.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое значение активностей, полученных при анализе двух навесок. Из каждой навески делают не менее трех разведений. Допускаемое расхождение между значениями активностей не должно превышать 5 %.

Вычисления проводят до 0,1.

5. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕКТИНЭСТЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ (ПэС)

5.1. Сущность метода

Метод основан на гидролизе раствора пектина исследуемым ферментным препаратом с последующим определением освободившихся в результате гидролиза карбоксильных групп.

Пектинэстеразная активность характеризует способность фермента катализировать гидролиз сложноэфирных связей в молекуле пектина с образованием метилового спирта и свободных карбоксильных групп.

За единицу активности пектинэстеразы принято количество' фермента, которое катализирует гидролиз 1 мкэкв сложноэфирных связей в молекуле пектина за 1 мин при 30 °С.

Пектинэстеразную активность (ПэС) выражают числом указанных единиц в 1 г (или 1 см3) исследуемого препарата.

Определяемая величина пектинэстеразной активности находится в непосредственной зависимости от степени этерификации пектина.

Сравнимые результаты при работе с различными субстратами можно получить только при пересчете полученных данных на субстрат со 100 %-ной степенью метоксилирования.

5.2.    А п па р ату р а, материалы, реактивы

Мешалка любой марки.

Весы лабораторные аналитические 3-го класса точности любой

марки.

Весы технические 2—3-го класса точности.

Прибор для измерения pH среды любой марки.

Термометры ртутные стеклянные лабораторные по ГОСТ 215—73.

Баня водяная.

Стекла часовые.

Воронка Бюхнера.

Воронки стеклянные по ГОСТ 25336—82.

Марля медицинская по ГОСТ 9412—77.

Вата медицинская гигроскопичная по ГОСТ 5556—81.

Микробюретка.

Стаканы и колбы стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336—82 вместимостью 100, 500 и 1000 см3.

Приборы мерные лабораторные стеклянные. Бюретки, пипетки по ГОСТ 20292—74.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026—76.

Пектин свекловичный со степенью метоксилирования не менее 80 % и содержанием пектина не менее 70 %.

Кислота серная по ГОСТ 4204—77.

Кислота щавелевая пб ГОСТ 22180—76.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328—77, 0,1 н. раствор.

Фенолфталеин по ГОСТ 5850—72.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709—72.

Все реактивы должны быть марки х. ч. или ч. д. а.

5.3.    Подготовка к анализу

5.3.1. Приготовление 1 %-ного раствора пектина (субстрат)

Навеску пектина, взятую с таким расчетом, чтобы в 100 см3 раствора был 1 г пектина (см. обязательное приложение), взвешивают с погрешностью не более 0,0001 г. Затем медленно всыпают при непрерывном перемешивании на мешалке в стакан с 70 см3 дистиллированной воды и оставляют на 2 ч при комнатной температуре для набухания и растворения, после чего помещают на ночь в холодильник.

На следующий день раствор нагревают до 20 °С, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают и фильтруют через два слоя марли с ватой на воронке Бюхнера. Раствор можно использовать в течение 2 сут при условии его хранения в холодильнике.

5.3.2.    Приготовление основного раствора ферментного препарата из очищенных порошкообразных препаратов

0,5 г исследуемого ферментного препарата взвешивают на аналитических весах с погрешностью не более 0,0001 г, тщательно растирают стеклянной палочкой в небольшом количестве дистиллированной воды, затем количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3 и объем раствора доводят до метки дистиллированной водой. Раствор фильтруют и используют в день приготовления.

5.3.3.    Приготовление основного раствора ферментного препарата из поверхностной культуры гриба

5 г исследуемой культуры взвешивают на технических весах, помещают в колбу вместимостью 200—300 см3, приливают пипеткой 100 см3 дистиллированной воды и настаивают 1 ч при комнатной температуре, перемешивая через каждые 10 мин, затем раствор фильтруют через складчатый фильтр.

5.3.4.    Приготовление инактивированного ферментного раствора

Для инактивации фермента, применяемого в контрольном опыте, берут 25 см3 основного ферментного раствора, помещают его в колбу вместимостью 50 см3, закрывают пробкой с воздушным холодильником и выдерживают в кипящей водяной бане 1 ч.

5.4.    Проведение анализа

В стаканы вместимостью по 50 см3 помещают по 20 см3 1 %-но-го раствора пектина, накрывают часовым стеклом и ставят с промежутками в 15 мин в термостат при температуре 30 °С. Через 15 мин в два стакана прибавляют по 10 см3 ферментного раствора, а в другие по 10 см3 раствора инактивированного фермента.

Общий объем реакционной смеси всегда равен 30 см3. Если для анализа берут менее 10 см3 ферментного раствора, то недостающий объем дополняют дистиллированной водой, которую вводят перед добавлением ферментного раствора.

Через час после введения фермента пробу вынимают из термостата и быстро титруют из микробюретки 0,1 н. раствором гид

роокиси натрия до pH 7,5, используя для этой цели потенциометр. Разность между контролем и опытом при титровании должна быть от 0,5 до 1,5.

5.5. Обработка результатов

Пектинэстеразную активность (ПэС) в ед/г вычисляют по формуле

^ п юо.а-100

t-rnc

где а — количество 0,1 н. раствора гидроокиси натрия, необходимое для титрования освободившихся в результате действия фермента карбоксильных групп (находят по разности между количеством гидроокиси натрия, израсходованным на титрование опытного и контрольного растворов), см3;

100 — число микроэквивалентов прогидролизованных сложноэфирных связей, соответствующее 1 см3 ОД н. раствора гидроокиси натрия; t — время гидролиза, мин;

т — количество ферментного препарата, взятое для испытания, г;

с — степень этерификации пектина, используемого в качестве субстрата;

100 — степень этерификации пектина, на которой ведется расчет.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое значение активностей, полученных при анализе двух навесок. Из каждой навески делают не менее трех разведений. Допускаемое расхождение между значениями активностей не должно превышать 5 %.

Вычисления проводят до ОД.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Обязательное

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕКТИНА (кальцийпектатный метод)

1. Сущность метода

Метод основан на получении соли пектана кальция в виде осадка.

2. Аппаратура, материалы, реактивы

Шкаф сушильный электрический любой марки.

Весы аналитические 3-го класса точности любой марки.

Мешалка любой марки.

Комплект ареометров.

Посуда мерная лабораторная стеклянная по ГОСТ 1770—74.

Колбы мерные вместимостью 100, 500, 1000 см3.

Стаканчики для взвешивания (бюксы высотой 40—50 мм) по ГОСТ

'25336—82.

Термометры ртутные стеклянные лабораторные по ГОСТ 215—73.

Эксикатор по ГОСТ 25336—82.

Приборы мерные лабораторные стеклянные. Пипетки вместимостью 20 и 50 см3 по ГОСТ 20292—74.

Пектин свекловичный со степенью метоксилирования не менее 30 % и содержанием основного вещества не менее 70 % •

Кальций хлористый по ГОСТ 4161—77, 2н. раствор.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328—77, 0,1 н. раствор.

Кислота уксусная по ГОСТ"61—75, 0,1 н. раствор.

Серебро азотнокислое по ГОСТ 1277—75.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709—72.

Фильтры обеззоленные, синяя лента.

Все реактивы должны быть марки х. ч. или ч. д. а.

3. Проведение анализа

0,15 г исследуемого свекловичного пектина, взвешенного на аналитических весах с погрешностью не более 0,002 г, растворяют в небольшом объеме дистиллированной воды при постоянном перемешивании на мешалке, затем количественно переносят в колбу вместимостью 100 см3, доводят дистиллированной водой до метки и оставляют до получения однородного раствора.

Затем берут 20 см3 этого раствора в колбу и к ним прибавляют 100 см3 0,1 н. раствора гидроокиси натрия. Смесь для полного омыления пектина в пек-товую кислоту оставляют на 7 ч (можно на ночь). Затем прибавляют 50 см1 н. раствора уксусной кислоты, а через 5 мин 50 см3 2 н. раствора хлористого кальция и оставляют на 1 ч.

После этого раствор кипятят 5 мин и фильтруют через обеззоленный фильтр, высушенный до постоянной массы. Осадок пектата кальция промывают горячей дистиллированной водой до исчезновения ионов хлора (реакция с 1 %-ным раствором азотнокислого серебра).

После промывки осадок с фильтра помещают в бюксу и высушивают при t05°C до постоянной массы.

4. Обработка результатов

Количество пектина формуле

(В) в граммах, взятое

В-

m*Va Vi •

на омыление,

вычисляют по

где т — масса пектина, взятая для приготовления раствора, г;

V\ — объем исходного раствора пектина, см3;

V2 — объем пектина, взятый на омыление, см3.

По разности масс между фильтром и осадком и фильтром без осадка определяют содержание пектата кальция.

Массовую долю пектина (П) в процентах вычисляют по формуле

■у т-0,92-100

где т — масса осадка пектата кальция, г;

В — количество пектина, взятого на омыление, г;

0,92 — пересчетный коэффициент, учитывающий содержание кальция в осадке; 100 — переводной коэффициент для выражения результатов, %.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое значение* пектина, полученное при анализе трех навесок пектина, допускаемое расхожде-» ние между ними не должно превышать 5 %.

Вычисление проводят до 0,01.

Группа С09

Изменение № 1 ГОСТ 20264.3—81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса

Утверждено и введено в действие Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 14.01.87 № 31

Дата введения 01.07.87

Под наименованием стандарта проставить код: ОКСТУ 9291.

Раздел 1 дополнить пунктом — 1.2: «1.2. Все весовые определения производятся на лабораторных весах общего назначения по ГОСТ 24104—80 1 и 2-го классов точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г. Допускается применение других весов с аналогичными техническими и метрологическими характеристиками»

Пункт 2.2 изложить в новой редакции: «2 2. Аппаратура, материалы, реактивы

Интерферометр типа ИТР-2 или ЛИР-2.

Мешалка любой марки.

Прибор для определения pH среды в интервале от 1 до 14 с погреш»

яостью измерения не более 0,05 pH.

Ультратермостат типа ТС-16А с пределом измерений 40 °С и погрешностью 1 %..или другой ультратермостат с аналогичными характеристиками.

Термометры 0—150 °С по ГОСТ 215—73 с ценой деления 1 °С.

Пробирки стеклянные диаметром 15—18 мм по ГОСТ 25336—8*2.

Стаканчики для взвешивания вместимостью 25—30 см3 по ГОСТ 25336—82. Колбы мерные 2—50, 500—2 (наливные) по ГОСТ 1770—74,

Стаканы и колбы стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336—82 вместимостью 250, 300, 500 см3.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026—76.

Фильтры обеззоленные. Синяя лента.

Пектин свекловичный со степенью метоксилирования не менее 35 % и содержанием основного вешества не менее 70 %.

Сахароза по ГОСТ 5833—75, раствор с массовой долей сахарозы 0,25 %. Цинк сернокислый по ГОСТ 4174—77, раствор с массовой долей сернокислого цинка 15 %.

(Продолжение см. с. 266)

Аммиак водный по ГОСТ 3760—79.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709—12.

Примечание. Все реактивы' должны быть квалификации х. ч. или ч. д. а>.

Пункт 2.3.1. Заменить слова: «ОД г (или 1 г) исследуемого препарата взвешивают на аналитических весах» на «ОДООО г (или 1,0000 г) исследуемого препарата взвешивают».

Пункт 2.3.2. Заменить слова: «1 г измельченной воздушно-сухой культуры гриба взвешивают на технических весах» на «1,00 г измельченной воздушно-су* хой культуры гриба взвешивают с погрешностью не более 0,01 г».

Пункт 2.3.3. Заменить слова: «Приготовление 1 %-ного раствора пектина (субстрат)» на «Приготовление раствора с массовой долей пектина I % (субстрат) »;

исключить слова: «Окраска раствора должна быть светло-серой».

Пункт 2.3.4. Исключить значение: 0,25 % -ным (2 раза).

Пункт 2.4. Исключить значение: 15 %-ного (2 раза).

Пункт 2.5. Экспликация к формуле. Заменить слова: «количество» на «масса», «Вычисление проводят до ОД» на «Результат округляют до первого десятичного знака»;

дополнить абзацем: «Предел возможных значений погрешности измерений пектолитической активности при доверительной вероятности Р=0,95 составляет 2,5 % ».

Пункт 3.2 изложить в новой редакции: «3.2. Аппаратура, материалы, реактивы

Шкаф сушильный вакуумный любой марки.

Ультратермостат типа ТС-16А с пределом измерений 40 °С и погрешностью 1 % или другой ультратермостат с аналогичными характеристиками,

Прибор для определения pH среды в интервале от 1 до 14 с погрешностью измерения не более 0,05 pH.

Воронка Бюхнера.

Стаканы и колбы стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336—32 вместимостью 100, 500, 1000 см3.

Термометры 0—<1150 °С по ГОСТ 215—73 с ценой деления 1 °С.

Бюретки любого исполнения, 2-го класса точности вместимостью 25 см* по ГОСТ 20292—74.

Пипетки 2—1—10 и 2—1—25 по ГОСТ 20292.—74.

Бязь по ГОСТ 11680—76.

(Продолжение см. с. 267)

Марля медицинская по ГОСТ 9412—77.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026—76.

Сито из проволочной сетки № 025 по ГОСТ 6613—73.

Кислота пектовая.

Спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300—72.

Натрий серноватистокислый по ГОСТ 27068—86,

Пектин свекловичный со степенью метоксилирования не менее 35 % и содер1 жанием основного вещества не менее 70 %.

Крахмал растворимый по ГОСТ 10163—76, раствор с массовой долей крахмала 1 %.

Натрий углекислый по ГОСТ 83—79, раствор концентрацией 1 моль/дм3.

Йод по ГОСТ 415Ф—79, раствор концентрацией 0,1 моль/дм3.

Кислота серная по ГОСТ 4204—77, раствор концентрацией 2 моль/дм3.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328—77.

Кислота соляная по ГОСТ 3118—77, раствор концентрацией 0,5 моль/дм3.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709—72.

Примечание. Все реактивы должны быть квалификации х. ч. или ч. д. а.».

Пункт 3.3.1. Заменить слова: «30 г свекловичного пектина, взвешенного на технических весах» на «30,00 г свекловичного пектина, взвешенного с погрешностью не более 0,01 г», «0,5 н. раствора гидроокиси натрия» на «раствора гидроокиси натрия концентрацией 0,5 моль/дм3 (0,5 н.)» (2 раза);

«0,5 н. раствора соляной кислоты» на «соляной кислоты».

Пункт 3.3.2. Заменить слова: «Приготовление 1 %-ного раствора пектовой кислоты» на «Приготовление раствора с массовой долей пектовой кислоты 1 %», «1 г пектовой кислоты» на «1,0000 г пектовой кислоты», «1 н. раствор гидроокиси натрия» на «раствор гидроокиси натрия концентрацией 1 моль/дм3 (I н.)».

Пункт 3i-4.1. Заменить слова: «1 %-ного раствора пектовой кислоты» на «раствора с массовой долей пектовой кислоты Ь %»;

исключить значения: 1 М и 0,1 н.

Пункт 3.4.2. Искючить значение: I М.

Пункт 3.4.3. Исключить значение: 2 М; заменить слова: «0,05 и. раствором серноватистокислого натрия» на «раствора серноватистокислого натрия концентрацией 0,025 моль/дм3 (0,05 н.)», «0,1 н. раствора серноватистокислого натрия» на «раствора серноватистокислого натрия концентрацией 0,05 моль/дма (0,1 н.)».

Пункт 3.5. Экспликация к формулам. Исключить значения: 0,1 н. (4 раза);

заменить слова: «0,05 н. раствором гипосульфита» на «раствором серноватистокислого натрия концентрацией 0,025 моль/дм3 (0,05 н.)», «Вычисление ведут до 0,1» на «Результат округляют до первого десятичного знака»;

дополнить абзацем: «Предел возможных значений погрешности измерений экзополигалактуроназной активности при доверительной вероятности Р=0,9Е составляет 5 %».

Раздел 4 исключить.

Пункт 5.2 изложить в новой редакции: «5,2. Аппаратура, материалы, реактивы

Прибор для определения pH среды в интервале от 1 до 14 с погрешностью измерения не более 0,05 pH.

Мешалка любой марки.

Ультратермостат типа ТС-16А с пределом измерений 40 °С и погрешностью 1 % или другой ультратермостат с аналогичными характеристиками.

Воронка Бюхнера.

Стаканчики для взвешивания вместимостью 25—30 см3 по ГОСТ 25336—82.

Стаканы и колбы стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336—82 вместимостью 50, 200, 250, 300 см3.

Колбы мерные 2—50, 100—2 (наливные) по ГОСТ 1770—74.

Пипетка 0-1—10, 20, 100 по ГОСТ 20292—74.

Микробюретка.

(Продолжение см. с. 268)

267

Марля медицинская по ГОСТ 9412—77,

Баня водяная.

Вата медицинская по ГОСТ 5556—81.

Пектин свекловичный со степенью метоксилирования не менее 80 % и со* держанием пектина не менее 70 %.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328—77, раствор концентрацией 0,1 моль/дм? (0,1 н.).

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709—72.

Примечание. Все реактивы должны быть квалификации х. ч. или ч. д. а.».

Пункт 5.3.1. Заменить слова: «Приготовление 1 %-ного раствора пектина (субстрат)» на «Приготовление раствора с массовой долей пектина 1 % (субстрат)», «1 г пектина» на «1,0000 г пектина».

Пункт 5.3.2. Заменить значение: 0,5 г на 0,5000 г.

Пункт 5.3.3. Заменить слова: «5 г исследуемой культуры взвешивают на технических весах» на «5,00 г измельченной культуры гриба, взвешенной с погрешностью не более 0,01 г».

Пункт 5.4. Исключить значения: 1 %-ного, 0,1 н.

Пункт 5.5. Экспликация к формуле. Исключить значение: 0,1 н.; заменить слова: «количество ферментного препарата» на «масса ферментного препарата», «Вычисление проводят до 0,1» на «Результат округляют до первого десятичного знака»;

дополнить абзацем: «Предел возможных значений погрешности измерений пектийэстеразной активности при доверительной вероятности Р=0,95 составляет 5 %».

Приложение. Раздел 2 изложить в новой редакции:

«2. Аппаратура, материалы, реактивы

Шкаф сушильный любой марки, обеспечивающий нагрев до 105 °С.

Мешалка любой марки.

Эксикатор по ГОСТ 25336—82.

Колбы мерные 1—100—2 или 2—100—2    (наливные) по ГОСТ 1770—74.

Пипетка 2—1—20 по ГОСТ 20292—74.

Цилиндр любого исполнения вместимостью 100 см3 по ГОСТ 1770—74.

Стаканчики для взвешивания любого типа . вместимостью 25—30 см3 пс ГОСТ 25336—82.

Фильтры обеззоленные. Синяя лента.

Пектин свекловичный со степенью метоксилирования не менее 30 % и содержанием основного вещества не менее 70 %.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4323—77, раствор концентрацией 0,1 моль/дм* (0,1 н.).

Кислота уксусная по ГОСТ 61—75, раствор концентрацией 0,1 моль/дм5 (1 н.).

Кальций хлористый по ГОСТ 4161—77, раствор концентрацией 1 моль/дм3 (2 и.).

Серебро азотнокислое по ГОСТ 1277—75, раствор с массовой долей серебра 1 %.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709—72.

Примечание. Все реактивы должны быть квалификации х. ч. или ч. д. а».

Раздел 3. Заменить значение: 0,15 г на 0,150 г;

исключить значения: 0,1 н., 2 н., «1 %-ным».

Раздел 4. Заменить слова: «Вычисление проводят до 0.01» на «Результат округляют до второго десятичного знака».

(ИУС № 4 1987 г.)